CN102816714A - 一株甲醛降解菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株甲醛降解菌——甲基杆菌（Methylobacteriumsp.）XJLW及其应用，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCC NO：M2012065，保藏日期：2012年3月8日。本发明提供了对甲醛有较高降解能力的新菌株，并对其降解条件进行了优化，为生物法降解甲醛应用于室内空气净化提供了基础。

Description

一株甲醛降解菌及其应用

（一）技术领域

本发明涉及一株具有甲醛降解能力的新菌株——甲基杆菌（Methylobacterium sp.）XJLW及其应用。

（二）背景技术

甲醛是一种重要的室内空气污染物，可经呼吸道吸收，几乎对所有生物都有毒性。长期接触低剂量甲醛可引起人体慢性呼吸道疾病、妊娠综合症，引起新生儿体质降低、染色体异常，高浓度甲醛则对神经系统、免疫系统、肝脏等都有毒害。因其对人体极强的毒害作用，甲醛在我国有毒化学品优先控制名单中高居第二位。甲醛也是生物体一碳代谢过程中的关键性中间产物，几乎所有的生物对甲醛都有各自的解毒机制。由于微生物具有对污染物有较强降解能力、较快的适应能力等特点，利用微生物降解甲醛已成为近年来人们研究的重点。目前，发现有甲醛代谢能力的微生物主要为甲基营养型细菌，也有一些真菌和非甲基营养菌。国内关于甲醛降解菌的报道较少，如黄赛花（黄赛花，陈能场．一株甲醛降解真菌Aspergillusspp.H4的分离鉴定[J]．生态环境，2007，16(4):1175-1179．）等曾分离出一株甲醛降解真菌Aspergillus flavus H4，能在144h内降解99.7%的初始浓度为1.241g/L的甲醛。国外关于甲醛降解菌的文献报道则相对较多，如Adroer（ADROER N，CASAS C，DEMAS C，et al.Mechanism offormaldehyde biodegradation by Pseudomonas putida[J].Appl microbiolbiotechnol，1990，33(2):217-220）等分离出P.putida A2能在1.25h内降解380mg/L的甲醛；Yamazaki（YAMAZAKI T，TSUGAWA W，SSDE K.Biodegradation of formaldehyde by a formaldehyde-resistant bacteriumisolated from seawater[J].Biotechnol appl bioc，2001，91(3):213-217.）等分离的Methylobacterium sp.MF1能够在200h内降解1.2g/L的甲醛；Iwahara Masayoshi（IWAHARA M,FUKUDA R，NAKAHARA K，et al.Isolation and properties of Paecilomyces sp.No.5capable of degrading highconcentrations of formaldehyde[J].Biocontrol sci，2002，7(2):107-110）等分离的Paecilomyces sp.no.5是目前文献中甲醛耐受浓度最高的甲醛降解菌，能在甲醛初始浓度为20g/L的培养液中存活，并在20d内将其完全降解。

（三）发明内容

本发明目的是提供一株具有甲醛降解能力的菌株，并对其降解条件进行优化，为生物法降解甲醛应用于室内空气净化打下基础。

本发明采用的技术方案是：

一株甲醛降解菌——甲基杆菌（Methylobacterium sp.）XJLW，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCC NO：M2012065，保藏日期：2012年3月8日。

该菌株筛选至浙江台州黄岩污水处理厂的土壤，可以甲醛或甲醇为唯一碳源生长。

本发明还涉及所述甲基杆菌XJLW在微生物降解甲醛中的应用。

经实验发现，该菌株降解甲醛的最适温度为30℃，最适pH值为7.0。

该菌株优化后的培养基组成为：酵母膏1g/L，K₂HPO₄0.8g/L，KH₂PO₄0.7g/L，MgSO₄0.5g/L，微量元素母液200μL/L，溶剂为水，pH7.0。经驯化后，菌株XJLW对甲醛的耐受浓度提高为1.2g/L。在优化后的培养条件下，对初始浓度为0.6、0.9、1.2g/L的甲醛，52h的降解率分别为94%，39%，31%。在休止细胞的情况下，菌株XJLW能耐受并且降解极高初始质量浓度的甲醛，初始浓度分别为2、15、30、45、60g/L，8h的降解率分别为100%、96.8%、84.0%、26.5%、22.5%;56h的降解率分别为100%、100%、96.0%、29.5%、24.4%。

本发明的有益效果主要体现在：提供了一株对甲醛有较高降解能力的新菌株，并对其降解条件进行了优化，为生物法降解甲醛应用于室内空气净化提供了基础。

（四）附图说明

图1为甲基杆菌XJLW的透射电镜图；

图2为细菌系统发育进化树；

图3为不同元素对Methylobacterium sp.XJLW降解甲醛的影响；

图4为不同pH（a）、温度（b）对Methylobacterium sp.XJLW降解甲醛的影响；

图5为不同浓度甲醛降解过程；

图6为菌株休止细胞对不同高浓度甲醛的降解过程。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

1材料与方法

1．1试剂与仪器

甲醛溶液（含量为37~40%，衢州巨化试剂有限公司），其余试剂均为分析纯。JEOL JEM-1230型透射电子显微镜（日本）。

1.2培养基

基本培养基：KH₂PO₄0.7g/L，K₂HPO₄0.85g/L，(NH₄)₂SO₄1.2g/L，MgSO₄·7H₂O0.1g/L，CaCl₂0.01g/L，FeSO₄·7H₂O0.001g/L，微量元素母液0.1mL/L，pH7.0，溶剂为水，115℃灭菌30min。

微量元素母液：H₃BO₃6g/L，CoCl₂·6H₂O4g/L，ZnSO₄·7H₂O2g/L，MnCl₂·4H₂O0.6g/L，Na₂MoO₄·7H₂O0.6g/L，NiCl₂·6H₂O0.4g/L，CuCl₂·2H₂O0.2g/L，溶剂为水。

乙酰丙酮溶液（GB13197-1991水质甲醛的测定乙酰丙酮分光光度法[S]）：50g乙酸铵、6mL冰乙酸及0.5mL乙酰丙酮试剂溶于100mL水中。

1.3方法

1.3.1甲醛测定方法

甲醛测定方法参照修订后的GB/T13197-1991。吸取适量样品于25mL具塞刻度管中，用水稀释至刻度线，加入2.5mL乙酰丙酮溶液颠倒数次混匀，60℃水浴15min，取出室温冷却1h后检测在波长414nm处的吸光度，以水为参比。

1.3.2菌株的筛选、分离纯化及驯化

取少量在黄岩污水处理厂收集的土壤样品，置于100mL无菌生理盐水中，加玻璃珠震荡15min，用针筒取15mL上清，用滤膜进行过滤，将滤膜取出置于基本培养基，加入0.1g/L的甲醛，180r/min和30℃摇床培养。平板涂布法分离得到单菌落，观察菌落形态并挑取单菌落做进一步鉴定。

将菌液加入新鲜的基本培养基中，逐步提高甲醛浓度驯化菌株，于30℃摇床中培养，测定样品及对照中的甲醛浓度。

1.3.3菌株的鉴定

菌株染色及生理生化分析，采用透射电镜观察菌株形态[10]。

提取该菌全基因组DNA，采用正向引物

5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCGA-3’和反向引物

5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’扩增16S rDNA，扩增产物由上海invitrogen公司测序，将该序列在NCBI数据库上BLAST比对。利用软件MEGA4.1构建系统发育树，并进行系统发育分析。

1.3.4培养条件对菌株降解能力的影响及降解过程的研究

分别选取有机氮源蛋白胨和酵母膏；无机氮源KNO₃，(NH₄)₂SO₄，尿素，测定甲醛降解率。在选择较佳氮源的基础上，再考察氮源添加量对该菌降解甲醛的影响，并且考察K₂HPO₄，MgSO₄，微量元素对该菌降解甲醛的影响。考察温度对该菌降解甲醛的影响，甲醛的挥发率与温度密切相关，所以每个温度都要设定对照。考察pH对该菌降解甲醛的影响。其他培养条件为0.4g/L甲醛，转速180r/min，30℃，降解时间为72h，以无菌的含0.4g/L甲醛的基本培养基为对照。

在优化后的降解条件下，以不同浓度甲醛作为碳源，每隔4h取样，测定甲醛浓度，绘制甲醛降解过程曲线。

1.3.5菌株休止细胞对甲醛的降解能力及降解过程的研究

无机盐培养基中添加甲醇，浓度为1％，养菌6d，离心重悬获得菌体，将菌接入新的无机盐培养基，添加不同浓度的甲醛，定时取样，测定甲醛浓度，绘制甲醛降解过程曲线。

2结果与分析

2.1菌株的筛选及分离纯化

采用以0.1g/L甲醛为唯一碳源的基本培养基，从黄岩污水处理厂的土壤中筛选到一株甲醛降解菌，菌株编号为XJLW。通过不断向培养基中添加甲醛进行驯化，该菌株对甲醛的耐受由0.1g/L提高至1.2g/L。

2.2菌株的鉴定

平板涂布分离得到的单个菌落呈粉色，圆形，突起，边缘整齐，表面光滑，革兰氏染色为阴性。通过透射电镜观察菌株，呈短杆状，有鞭毛，0.8~2.0μm（参见图1）。

对该菌株DNA进行PCR扩增，以细菌16S rDNA通用引物，扩增到1475bp的DNA片段，GenBank中登录号为GU586226。通过NCBI数据库进行BLAST比对，结果显示该菌株与甲基杆菌属（Methylobacterium）的序列同源性最高，采用MEGA4.1软件将该菌株的16S rDNA序列与Genbank中的若干个相关种的16S rDNA序列进行分析比对，以Microvirga aerophila（AB682367）为外群构建系统发育树，结果如图2所示，该菌株与Methylobacterium sp.MP3（EF015480）位于同一个系统发育的分支。

该菌株可以甲醛或甲醇为唯一碳源生长，对其多项生理生化指标进行测定，并与Methylobacterium的标准种Methylobacterium organophilum进行比较，结果如表1所示，该菌株除吲哚试验与木糖利用试验结果不同外，其余检测指标均相同。

根据该菌株形态特征和生理生化特征及16S rDNA序列分析，并参考《常见细菌鉴定手册》，该菌株与（Methylobacterium）特征相符，故将该菌株命名为Methylobacteriumsp.XJLW，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏日期2012年3月8日，保藏编号CCTCC No：M2012065。

表1：细菌生理生化分析结果

注：“+”为阳性；“—”为阴性。

2.3不同培养条件对菌株降解能力的影响

不同氮源对细菌降解甲醛能力的影响如图3（a）。由图3（a）可以看出，培养72h后添加有机氮源的菌株对甲醛的降解率接近100%，而添加无机氮源的菌株对甲醛的降解率仅为40%左右，可见有机氮源比无机氮源更有利于菌株降解甲醛。原因可能是细菌在有机氮源存在的条件下快速增殖，然后大量的细菌可同时降解甲醛，大大提高对甲醛的降解效率。在两种添加的有机氮源中，加入酵母膏的培养基中的甲醛降解效果比蛋白胨好。

不同浓度的酵母膏对细菌降解甲醛能力的影响如图3（b）。由图3（b）可以看出，随着酵母膏浓度的增长，甲醛降解率先升后降，原因可能是适量的酵母膏能在短时间内促进细菌大量繁殖，但是如果酵母膏太多，细菌优先利用酵母膏从而影响甲醛的利用，导致甲醛降解率不升反降，原因可能是在有过量有机氮源的生长环境中，细菌优先利用氮源，使其在短时间内大量繁殖。细菌大量利用氮源，从而影响甲醛的利用，导致甲醛的降解效率没有显著提高。酵母膏浓度为1.0g/L时降解效果最佳。酵母膏的添加能加快菌株生长和代谢速度，实验分别监测了48，60，72h的甲醛浓度，数据显示添加不同浓度酵母膏对甲醛的降解率在72h后都接近100%,没有显著性差异，所以取用60h的数据。

无机盐在培养基中主要承担构成菌体成分、作为酶的组成成分、酶的激活剂或抑制剂等作用。实验考察了培养基中无机盐对细菌降解甲醛能力的影响，其中KH₂PO₄和K₂HPO₄是酸碱缓冲对，为培养液提供稳定的pH。在研究过程中，发现菌株XJLW降解甲醛过程中能积累甲酸，导致培养基pH下降，从而影响菌体生长，因此培养基中的KH₂PO₄与K₂HPO₄合适的比例是维持细菌稳定生长的必须因素。选择KH₂PO₄质量浓度为0.7g/L，考察不同K₂HPO₄质量浓度对该菌株降解甲醛能力的影响。由图3（c）可以看出，培养60h时当K₂HPO₄的质量浓度为0时，甲醛降解率仅为28.03%，而K₂HPO₄质量浓度在0.4~3.2g/L时，表现出较高的降解能力,均大于93%，当K₂HPO₄质量浓度为0.8g/L，甲醛降解率达到95.27%；随着K₂HPO₄质量浓度的改变，缓冲能力也在发生变化，K₂HPO₄质量浓度的上升在一定范围内能有效缓冲培养过程中的pH下降，在后续研究中通过添加CaCO₃来进一步提高对培养过程中pH下降的缓冲能力。此外，由图3（d）可知，培养48h后在一定范围内MgSO₄的质量浓度对细菌降解甲醛影响不明显。实验在确定了最优酵母膏和K₂HPO₄的质量浓度后，菌株生长和代谢速度更迅速，数据显示60h时甲醛降解率都接近100%,没有显著性差异，所以取用48h的数据。

微量元素母液中含有多种金属离子，其中某种离子可能是甲醛降解关键酶的辅因子，培养基中添加少量的微量元素母液能提高细菌对甲醛的降解效率，但是过多的微量元素反而会使甲醛降解效率降低。实验结果如图3（e）所示，微量元素母液的量为200μL/L时降解甲醛效果最优。

考察不同pH值和温度对细菌降解甲醛效率的影响，结果如图4所示。从图中可知，细菌降解甲醛的最适pH值为7.0，最适温度为30℃。

综合以上单因素实验结果得到优化后的降解条件为：酵母膏1g/L，K₂HPO₄0.8g/L，KH₂PO₄0.7g/L，MgSO₄0.5g/L，微量元素母液200μL/L、温度30℃，pH7.0。

2.4优化培养条件后菌株XJLW对甲醛的降解过程

菌株XJLW在不同初始甲醛浓度下的降解过程如图5。由图可知，对照中甲醛略有挥发，初始质量浓度分别为0.6，0.9，1.2g/L时，52h降解率分别为94%，39%，31%。在优化培养条件前，菌株XJLW对初始质量浓度为0.4g/L甲醛72h的降解率为51.03%，见图3（a）。可见经过优化后的菌株对甲醛的耐受浓度及降解效率大幅提高。不同的甲醛初始浓度可能会影响细菌进入对数期的时间，较高浓度的甲醛毒性较大，影响细菌的生长，进入对数生长期较慢，故降解曲线较平滑；而较低浓度的甲醛对细菌毒性较小，有利于菌体快速生长进入对数期，降解效果较理想。与前人的研究相比，如表2所示。

表2：不同菌株降解甲醛能力的比较

注：“—”为参考文献中没有提到。

表2中涉及的文献：

[1]ADROER N，CASAS C，DEMAS C，et al.Mechanism of  formaldehydebiodegradation by  Pseudomonas putida[J].Appl microbiol biotechnol，1990，33(2):217-220；

[2]YAMAZAKI T，TSUGAWA W，SSDE  K.Biodegradation  offormaldehyde by a formaldehyde-resistant bacterium isolated fromseawater[J].Biotechnolappl bioc，2001，91(3):213-217；

[3]TETSUYA K，YUTAKA M，NAOHIRO H，et al.Purification andcharacterization of formate oxidase from a formaldehyde-resistantfungus[J].FEMS microbiol lett，2002，214:137-142；

[4]IWAHARA M，FUKUDA R，NAKAHARA K，et al.Isolation andproperties of Paecilomyces sp.No.5capable of degrading high concentrationsof formaldehyde[J].Biocontrol sci，2002，7(2):107-110；

[5]RYOJI M,MASAHIRO O，HIDEAKI K，et al.Formaldehyde-LimitedCultivation of a Newly Isolated Methylotrophic Bacterium，Methylobacteriumsp.MF1:Enzymatic Analysis Related to C1 Metabolism[J].J bioscibioeng，2005，99(1):18-22；

[6]SAEED M，AFSANEH R，POONEH K，et al.Isolation of bacteria able tometabolize high concentrations of formaldehyde[J].World J microb biot，2005，21:1299-1301；

[7]徐云，金晶，郑重，等.高活性高耐受甲醛降解菌株的分离鉴定及降解条件研究[J].环境科学，2010，31(10):2481-2486；

[8]MARTA E，CHRISTIAN K，MANAC V.Formaldehyde biodegradationand its inhibitory，effect on nitrification[J].J chem technol biot，2004，79:499-504；

[9]肖波，谭周亮，刘庆华,等．Application of an efficientformaldehyde-degrading bacterial strain in treatment of accidently pollutedwater[J].Chin J appl environ biol，2011，17(1):114-117。

2.5菌株XJLW休止细胞对甲醛的降解过程

用CaCO₃法调控pH，菌株XJLW休止细胞对甲醛的降解能力如图6。菌体量为0.5g/L。由图可知，该菌休止细胞对甲醛的耐受浓度可达60g/L。甲醛初始质量浓度分别为2，15，30，45，60g/L，8h后甲醛质量浓度分别为0，0.5，4.6，33.1，45.7g/L，降解率分别为100%，96.8%，84.0%，26.5%，22.5%；56h后甲醛质量浓度分别为0，0，1.2，31.8，44.7g/L，降解率分别为100%，100%，96.0%，29.5%，24.4%，具备较高的降解能力。

3结论

以甲醛为唯一碳源，从土壤中筛选到了一株有甲醛降解能力的菌株XJLW，对其进行了显微形态、生理生化分析及16S rDNA序列分析，与Methylobacterium特征相符，将该菌株命名为Methylobacterium sp.XJLW。对该菌株降解甲醛条件进行了优化，优化后的培养条件为：酵母膏1g/L，K₂HPO₄0.8g/L，KH₂PO₄0.7g/L，MgSO₄0.5g/L，微量元素母液200μL/L，温度30℃，pH7.0。经驯化后，菌株XJLW对甲醛的耐受浓度提高为1.2g/L。在优化后的培养条件下，对初始质量浓度为0.6，0.9，1.2g/L的甲醛，52h的降解率分别为94%，39%，31%。在休止细胞的情况下，菌株XJLW能耐受并且降解极高初始质量浓度的甲醛。初始质量浓度分别为2，15，30，45，60g/L，8h的降解率分别为100%，96.8%，84.0%，26.5%，22.5%；56h的降解率分别为100%，100%，96.0%，29.5%，24.4%。

Claims (3)

1.一株甲醛降解菌——甲基杆菌（Methylobacterium sp.）XJLW，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCC NO：M2012065，保藏日期：2012年3月8日。

2.如权利要求1所述的甲基杆菌XJLW在微生物降解甲醛中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述降解在30℃、pH7.0条件下进行。

Images