CN102811732A - 免疫原、组合物及其用途和制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及融合蛋白、包含免疫原的药物组合物、疫苗和佐剂，所述融合蛋白包含相应于肝片形吸虫的成虫排泄-分泌的钙结合蛋白的片段的片段H的氨基酸序列、紧接其后的相应于无关蛋白质或蛋白质片段的氨基酸序列；涉及用于其制备的方法、用于产生抗体的另一种方法及其使用。本发明涉及通过添加肽序列而制备免疫原。因此，本发明对于产生免疫应答是有用的，其中血清中针对蛋白或其它抗原的特异性抗体效价升高，并且可特别地用于特异性多克隆抗体的产生、免疫疗法和免疫预防。通过产生包含多肽的重组蛋白或者通过添加或融合该多肽至靶抗原，将多肽添加至靶抗原，诱导了这些分子的免疫原性的显著增加，增强了通过在能产生抗体的物种中注射该分子所引发的免疫应答。

Description

免疫原、组合物及其用途和制备方法

技术领域

本发明涉及免疫原的制备、其制备方法以及其在表达系统中用于产生重组蛋白的用途。

本发明描述了通过缀合（通过化学或物理方法）添加至无关抗原或通过整合入重组抗原或整合在包含抗原的无关序列的质粒DNA链中而添加至无关抗原的序列，其目的在于产生针对所述无关抗原的免疫应答。

本发明描述了新的佐剂，其应用可导致免疫原（包括含有肽序列的重组蛋白）的产生，所述免疫原诱导免疫应答，其特征在于产生特异性抗体。在本申请中，无关片段产生（对于低免疫原性的抗原）免疫特性，其引起（仅通过向宿主施用）宿主产生免疫应答，特征特别地在于产生特异性免疫球蛋白。

发明概述

本发明的目的是描述因将肽（具有来源于肝片形吸虫的钙结合蛋白的被称作H片段的MPSVQEVEKLL序列）添加至无关抗原而产生免疫原的方法。所得的构建体具有以下免疫特性：当给个体施用时触发特征在于针对无关抗原的特定抗体的产生的免疫应答。

本发明对于目的在于通过施用由片段H和无关抗原组成的免疫原而由个体产生针对抗原的免疫应答的任何应用是有用的。

本发明描述了新型佐剂的应用，所述佐剂可在研究和开发或工业水平上用于下列领域：例如多克隆和单克隆抗体的产生、免疫疗法和免疫预防。

本发明代表目前佐剂的另一选择并且，当用于表达重组抗原的系统中时允许这样的蛋白质的产生，所述蛋白质具有在无任何其它添加剂的情况下导致能够产生免疫应答的个体产生免疫应答的免疫原性特征。目前，抗体的制备中的最大挑战之一是获得充足的免疫原性抗原来产生免疫应答。当抗原不具有免疫原性或免疫性较低时，抗原和佐剂的施用用于增强免疫应答。此类佐剂具有潜在毒性，可引起被注射的宿主的疼痛，从而其使用是被高度劝阻的，或者，许多佐剂甚至被禁用。本申请的有利方面在于现有技术中这一点上，因为其描述了允许获得具有在不使用佐剂的情况下产生免疫应答的免疫原性特征的经修饰的抗原的方法。

本发明的实施方式之一是由如下组成的免疫原的描述：

-来自由肝片形吸虫的成虫排泄/分泌的钙结合蛋白的氨基酸序列的部分，其与被称作片段H的SEQ ID NO 2具有相同的序列或具有至少90%的结构相似性;

-无关目标蛋白质或蛋白质片段。

本发明的另一个优选实施方式是目标蛋白质或目标蛋白质片段是病原性蛋白质例如病毒蛋白质、细菌蛋白质或来自原生动物的蛋白质。甚至更优选地，目标蛋白质或蛋白质片段可以是CWG、CD4、IL5、Pfsp、Ent、PAL、CP12、LEC、BG或Toxo蛋白或蛋白片段。

在其它优选实施方式中，上文中描述的免疫原可用作药剂。甚至更优选可用作疫苗或佐剂。我们注意到，在一些情况下甚至更优选，可用作疫苗，所述疫苗仅包含：

-来自由肝片形吸虫的成虫排泄/分泌的钙结合蛋白的氨基酸序列的部分，其与被称作片段H的SEQ ID NO 2具有相同的序列或具有至少90%结构相似性；

-目标无关蛋白质或蛋白质片段。

另一个优选实施方式是包含上述免疫原的组合物的描述，优选地组合物可以包含治疗有效量的免疫原和药理学上适当的媒介物例如赋形剂、佐剂等等。

在另一个优选实施方式中，组合物可仅包含100%的上述免疫原之一。

在甚至更优选地进行中，组合物可由下列成分构成：具有在100至1000μl的缓冲磷酸盐溶液(0.01M磷酸盐,0.1M NaCl,pH 7.2)中稀释的1至100μg的浓度的上述免疫原。

本发明的另一个实施方式是包含上述免疫原之一或上述药物组合物之一的佐剂的描述。

我们使用佐剂给小鼠施用，所述佐剂包含：添加至于100至1000μl体积的磷酸盐缓冲液-0.01M磷酸盐,0.1M NaCl,pH 7.2中稀释的1至100μg的片段CWG和CP12的片段H，该施用诱导其产生针对特定片段CWG和CP12的免疫应答的强度和速度上的增加。

本发明的另一个实施方案是包括上述免疫原之一或上述药物组合物之一的疫苗的描述。我们使用佐剂给小鼠施用，所述佐剂包含：添加至于100至1000μl体积的磷酸盐缓液-0.01M磷酸盐,0.1M NaCl,pH7.2中稀释的1至100μg的片段CWG、BG和CP12的片段H，该疫苗的施用减小了隐孢子虫属（Cryptosporidium）和贾第虫属（Giardia）的实验感染中发现的感染的强度。

在另一个优选实施方式中，我们开发了用于制备上述免疫原的方法，所述方法包括将无关片段H多肽在任何位置上添加在相应目标多肽的序列中，将片段H添加在目标多肽的起始位置、终止位置或其它位置。甚至更优先，可用于几种蛋白片段和/或蛋白质例如CWG、CD4、IL5、Pfsp、Ent、PAL、CP12、LEC、BG或Toxo。

在另一个优选实施方案中，描述了用于产生多克隆抗体（分离的和纯化的）或功能性片段的方法，所述抗体或功能性片段能够识别上述或通过上述方法获得的免疫原，其中用于获得抗体的所述方法包括下列步骤：

用上述任何免疫原或用上述组合物之一免疫非人哺乳动物受试者；

使用针对该目的描述的方法选择能够识别上述或通过免疫原的制备方法获得的免疫原的抗体。例如，使用偶联有免疫原的CNBr-Sepharose的柱子，其中通过亲和层析，分离识别免疫原的抗体。

因此，本发明对于产生免疫应答（血清中针对蛋白质或其它抗原的特定抗体水平升高）是有用的并且可特别地用于多克隆特定抗体的产生、免疫疗法和免疫预防、用于疫苗的产生、佐剂、诊断方法和通过特定免疫应答的产生直接获得的其它应用。

多肽靶至H片段SEQ ID NO.2的添加（通过包含所述多肽的重组蛋白的产生或通过该多肽与靶抗原的添加或融合），诱导了此类分子的免疫原性的显著增强，从而允许增强通过在易于产生抗体的受试者中注射该分子而引发的免疫应答。

发明背景

通常通过在动物中注射目标免疫原（通常与佐剂组合以增强免疫应答）来产生抗血清。应答可通过抗原的随后施用（利用或不利用佐剂）来增强。待施用以产生期望的应答的免疫原的量视使用的动物的物种和/或亚种、使用的佐剂、施用途径、注射频率和抗原自身的免疫原性而产生极大的变化。获得的抗体的质量和数量取决于免疫原的大小和条件。小的多肽和非蛋白质分子可能需要更大的蛋白质的组合以起始免疫应答。

佐剂类型物质的应用的一个领域将是疫苗学（vaccinology）。一般而言，数百种天然和合成化合物被鉴定为具有佐剂活性。此类化合物的毒性似乎是其使用的主要障碍，包括在人水平上。在多克隆抗体的产生中发生的大多数副作用，在严重度和持续时间上，源于佐剂的存在。

可将佐剂用于不同目的，包括：增强纯化或重组的免疫原性、减少诱导保护性免疫力所需的抗原的量或免疫次数以及提高疫苗在新生儿、老年人或具有免疫受损的系统的个体中的功效；用作抗原的递送系统或抗原通过粘膜的摄入的递送系统。将佐剂掺入任何制剂的益处必须与不利反应的风险平衡。佐剂的寻找中的最大挑战之一是增加能力并且使毒性降至最低。

由于大小、电荷和疏水性的作用（所述作用调节蛋白质在佐剂的制剂中的掺入），因此难以预测什么是特定蛋白质或肽的最有效的佐剂。除此以外，配制或组合中还可能发生表位的变化。在转运蛋白的情况下，针对该蛋白的免疫力的存在是主要限制。此外，每一种佐剂产生特征性免疫应答。

由重组亚基组成的疫苗的日益增加的使用已使得必需使改善处理成为优先事项。

附图说明

图1-钙结合蛋白FH8和肽片段H的表征。Fh8-FH8多肽的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO 1)，Frag H-被称作片段H的多肽的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO 2)。

图2-用于评估片段H在诱导免疫应答中的作用的亚克隆的示意图。

图3-利用包含片段CWG的构建体进行的范例的结果。A-利用考马斯蓝染色的SDS-PAGE Tris-Tricine。PM-标志物预染的SDS-PAGE标准(BioRad)。孔F1、F2-从柱子Ni-NTA收集的CWG的级分1、2；孔F4,F5-从柱子Ni-NTA收集的HCWG的级分1、2。孔F7、F8-从柱子Ni-NTA收集的FCWG的级分1、2。B-利用以CWG(组CWG)、HCWG(组HCWG)、FCWG(组FCWG)和无处理的CD1(组Neg)接种的CD1小鼠的血清进行的ELISA的光密度。值代表每一个组中使用的3只CD1小鼠的光密度的平均值。按照表2中描述的方案，定期接种CD1小鼠，并且定期收集血清，a)利用包含重组抗原CWG的平板获得的结果，b)利用包含重组抗原HCWG的平板获得的结果；C-利用从最后一次接种CWG(组CWG)、HCWG(组HCWG)、FCWG(组FCWG)和无处理的CD1(组Neg)后83天的CD1小鼠收集的血清进行的ELISA的光密度的结果。值代表每一个组中使用的3只CD1小鼠的光密度的平均值。D-利用含有重组抗原FCWG的硝酸纤维素膜进行的免疫印迹。FG-利用Schwartz溶液染色的硝酸纤维素膜抗原FCWG。PM-分子量。将以1/200稀释的来自阴性组(a和d)的血清汇合物、利用CWG接种的组(b和e)和利用接种的组HCWG(c和f)的血清汇合物（来自第5次IP(a、b和c)和第6次IP(d、e和f)后9天进行的收获）与含有抗原FCWG ON的NC的条带于4°C一起温育。g)和h)：利用阴性兔的血清(g)和利用抗原F免疫的兔(h)的血清（以1/100稀释的）进行的免疫印迹。作为缀合物，使用了蛋白G-HRP（以1/1000稀释的），使用4-氯-萘酚来显示。E-利用小鼠组HCWG的血清进行的兰伯贾第虫的免疫荧光。a)光学显微镜术，20x的放大倍数。b)UV显微镜，20x的放大倍数。箭头指示兰伯贾第虫的孢囊。

图4-利用包含片段CP12的构建体进行的范例的结果。A-利用考马斯蓝染色的SDS-PAGE Tris-Tricine凝胶。PM-标志物预染的SDS-PAGE标准(BioRad)。(a)从Ni-NTA柱收集的CP12的级分1、2和3。(b)从Ni-NTA柱收集的HCP12的级分1、2。(c)从Ni-NTA柱收集的FCP12的级分1、2。B-利用以CP12(CP12组)、HCP12(HCP12组)和无处理的CD1(组NEG)刺激的CD1小鼠的血清进行的ELISA的光密度。值代表每一个组中使用的3只CD1小鼠的光密度的平均值。按照表2中描述的方案，定期接种CD1小鼠，并且定期收集血清，a)利用包含重组抗原CP12的平板获得的结果，b)利用包含重组抗原HCP12的平板获得的结果；C-利用含有重组抗原FCP12的硝酸纤维素膜进行的免疫印迹。FC-利用Schwartz溶液染色的包含抗原FCP12的硝酸纤维素膜。PM-分子量。将以1/1000稀释的来自阴性组(g、h和i)的血清汇合物、利用CP12接种(d、e和f)和利用HCP12(a、b和c)接种的组的血清（来自第8次IP后的收获）与含有抗原FCP12ON的NC的条带于4°C一起温育。作为缀合物，我们使用以1/1000稀释的蛋白G-HRP，我们利用4-氯-萘酚进行显示。白色箭头指示利用以抗原F免疫的兔的血清进行的免疫印迹测定的抗原FCP12的定位。D-利用蛋白HCP12免疫的小鼠的血清中的小隐孢子虫的免疫荧光，20X的放大倍数。

图5-利用包含片段BG的构建体进行的范例的结果。A-利用考马斯蓝染色的SDS-PAGE Tris-Tricine凝胶。PM-标志物预染的SDS-PAGE标准(BioRad)。孔F1、F2-从柱子Ni-NTA收集的BG的级分1、2；孔F4,F5-从Ni-NTA柱收集的HBG的级分1、2。B–利用HBG(HBG组)和无任何处理的CD1(组NEG)接种的CD1小鼠血清进行的ELISA的光密度。值代表使用的3只CD1小鼠的光密度的平均值。按照表2中描述的方案，定期接种CD1小鼠，并且定期收集血清。C-利用含有重组抗原BG的硝酸纤维素膜进行的免疫印迹。BG-利用Schwartz溶液染色的包含抗原BG的硝酸纤维素膜。PM-分子量。将稀释至1/1000的来自阴性组（d、e和f）、利用HBG接种的组(a、b和c)的血清（第7次IP后收获的）与含有抗原BG ON的NC的条带在4°C一起温育。作为缀合物，我们使用以1/1000稀释的蛋白G-HRP，我们利用4-氯-萘酚进行显示。D-利用组HBG的小鼠的血清产生的兰伯贾第虫的免疫荧光。a)常规显微镜，40x的放大倍数。b)UV显微镜术，40x的放大倍数。箭头指示兰伯贾第虫的两个营养体（trophozoite）。

图6-利用包含片段Ent的构建体进行的范例的结果。A-利用以CD1HEnt(组HEnt)和无任何处理的CD1(组NEG)接种的小鼠的血清进行的ELISA的光密度。值代表使用的3只CD1小鼠的光密度的平均值。按照表2中描述的方案，定期接种CD1小鼠，并且我们定期收集血清。B-利用含有重组抗原Fent的硝酸纤维素膜进行的免疫印迹。Fent-利用Schwartz溶液染色的含有抗原FEnt的硝酸纤维素膜。PM-分子量。将稀释至1/1000的阴性组(a、b和c)和用HEnt接种的组(d、e和f)的血清（从第7次IP后收获的）与含有抗原FEnt ON的NC的条带于4°C一起温育。作为缀合物，我们使用以1/1000稀释的蛋白G-HRP，并且我们用4-氯-萘酚进行显示。白色箭头指示通过利用以抗原F免疫的兔的血清进行的FEnt免疫印迹测定的抗原的定位。C-使用以HENT免疫的小鼠的血清，利用溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)的营养体进行的免疫荧光，放大倍数为20x。

图7-利用包含片段Pfsp的构建体进行的范例的结果。A-利用以HPfsp接种的(组HPfsp)和无任何处理的CD1接种的（组NEG）CD1小鼠的血清进行的ELISA的光密度。值代表使用的3只CD1小鼠的光密度的平均值。定期接种CD1小鼠，我们按照表2中描述的方案定期进行血清收集。B-利用包含重组抗原FPfsp的硝酸纤维素膜进行的免疫印迹。将以1/200稀释的阴性组（c）、以HPfsp接种的组（d和f）[在第6次IP后收获的（d）和在第7次IP后14天收获的(f)]的血清汇合物与包含抗原FPfsp ON的NC的条带于4°C一起温育。b)利用稀释至1/100的阴性兔(a)和用抗原F免疫的兔(b)的血清进行的免疫印迹。作为缀合物，我们使用以1/1000稀释的蛋白G-HRP，并且我们利用4-氯-萘酚进行显示。

图8-利用包含片段IL5的构建体进行的范例的结果。A-利用以HIL5接种的(组HIL5)和无任何处理的CD1接种的（组NEG）CD1小鼠的血清进行的ELISA的光密度。值代表使用的3只CD1小鼠的光密度的平均值。按照表2中描述的方案，定期接种CD1小鼠，我们定期进行血清收集。B-利用包含重组抗原FIL5的硝酸纤维素膜进行的免疫印迹。FIL5-利用Schwartz溶液染色的含有抗原FIL5的硝酸纤维素膜。PM-分子量。将稀释至1/1000的来自阴性组（a、b和c）和用HIL5（d、e）接种的组的血清（第6次IP后收获的）与包含抗原FIL5ON的NC的条带于4°C一起温育。作为缀合物，我们使用以1/1000稀释的蛋白G-HRP，并且我们利用4-氯-萘酚进行显示。白色箭头指示通过利用以抗原F免疫的兔的血清进行的免疫印迹测定的FIL5抗原的定位。

图9-利用包含片段Toxo的构建体进行的范例的结果。A-利用以HToxo接种的(组HToxo)和无任何处理的CD1接种的（组NEG）CD1小鼠的血清进行的ELISA的光密度。值代表使用的3只CD1小鼠的光密度的平均值。按照表2中描述的方案，定期接种CD1小鼠，我们定期进行血清收集。B-利用包含重组抗原Toxo的硝酸纤维素膜进行的免疫印迹。Toxo-利用Schwartz溶液染色的含有抗原BG的硝酸纤维素膜。PM-分子量。将稀释至1/1000的来自阴性组（a、b和c）和用HToxo（d、e和f）接种的组的血清（第4次IP后收获的）与包含Toxo抗原ON的NC的条带于4°C一起温育。作为缀合物，我们使用以1/1000稀释的蛋白G-HRP，并且我们利用4-氯-萘酚进行显示。

图10-利用包含片段CD4的构建体进行的范例的结果。A-利用以HCD4接种的(组HCD4)和无任何处理的CD1接种的（组NEG）CD1小鼠的血清进行的ELISA的光密度。值代表3只CD1小鼠的光密度的平均值。按照表2中描述的方案，定期接种CD1小鼠，我们定期进行血清收集。B-利用包含重组抗原CD4的硝酸纤维素膜进行的免疫印迹。CD4-利用Schwartz溶液染色的含有抗原CD4的硝酸纤维素膜。PM-分子量。将稀释至1/500的来自阴性组（a）和用HCD4接种的组（b）的血清汇合物（第7次IP后14天收获的）与包含CD4抗原ON的NC条带于4°C一起温育。作为缀合物，我们使用以1/1000稀释的蛋白G-HRP，并且我们利用4-氯-萘酚进行显示。

图11-利用包含片段PAL的构建体进行的范例的结果。A-利用以CD1HPAL接种的(组HPAL)和无任何处理的CD1接种的（组NEG）小鼠的血清进行的ELISA的光密度。值代表使用的3只CD1小鼠的光密度的平均值。按照表2中描述的方案，定期接种CD1小鼠，我们定期进行血清收集。B-利用包含重组抗原HPAL的硝酸纤维素膜进行的免疫印迹。HPAL-利用Schwartz溶液染色的含有抗原HPAL的硝酸纤维素膜。PM-分子量。将稀释至1/1000的来自阴性组（a、b和c）和用HPAL接种的组（d、e和f）的血清（在第4次IP后收获的）与包含抗原HPAL ON的NC条带于4°C一起温育。作为缀合物，我们使用以1/1000稀释的蛋白G-HRP，并且我们利用4-氯-萘酚进行显示。

图12-利用包含片段LEC的构建体进行的范例的结果。A-利用以HLEC接种的(组HLEC)和无任何处理的CD1接种的（组NEG）小鼠的血清进行的ELISA的光密度。值代表使用的3只CD1小鼠的光密度的平均值。按照表2中描述的方案，定期接种CD1小鼠，我们定期进行血清收集。B-利用包含重组抗原HLEC的硝酸纤维素膜进行的免疫印迹。HLEC-利用Schwartz溶液染色的含有抗原HLEC硝酸纤维素膜。PM-分子量。将稀释至1/1000的阴性组（a、b和c）和用HLEC接种的组（d、e）的血清（在第6次IP后收获的）与包含抗原HLEC ON的NC条带于4°C一起温育。作为缀合物，我们使用以1/1000稀释的蛋白G-HRP，并且我们利用4-氯-萘酚进行显示。

本发明的一般描述

本发明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包含结构：(1)来自由肝片形吸虫的成虫排泄/分泌的钙结合蛋白的氨基酸序列的部分，和无关目标蛋白质或蛋白质片段。

本发明的主题也是用于制备此类融合蛋白的方法，所述融合蛋白允许动物的针对无关蛋白质片段的免疫应答显著增强。

将来自蠕虫肝片形吸虫的钙结合蛋白的小片段-以下被称作片段H-(SEQ ID NO 2)或相似序列（优选具有至少90至95%的同源性，优选具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的相似性）添加至无关蛋白质片段或蛋白质导致多肽的免疫原性水平的显著升高。

本发明的第一方面涉及融合蛋白，所述融合蛋白包含具有片段H的结构的氨基酸序列、紧随其后的与无关蛋白质片段或蛋白质在结构上相似的氨基酸序列。

本发明的另一个方面涉及表达载体，其特征在于包含编码这样的融合蛋白的多核苷酸序列。本发明的另一个方面涉及用于注射入动物、能够产生免疫应答的抗原的制备。本发明还涉及给动物施用可产生免疫应答的重组抗原的方法。

本发明还涉及该融合蛋白用于产生特异于添加的蛋白质或蛋白质片段的多克隆抗体的用途。此类融合蛋白的产生可显著增加添加的片段或蛋白质的免疫原性，从而增强其用于研究和工业目的开发的用途。

针对抗原的特异性免疫应答的诱导是个复杂过程，包括许多种类的细胞和机制（通常具有冲突的活性（conflicting activity））。可导致能够诱导更强的免疫应答的抗原的产生的方法的开发，因所述抗原在R&D中以及在工业水平上、与疫苗、诊断剂、免疫疗法等的开发一样重要的领域内的潜在应用，一直都是发展的恒定主题。虽然已知几种物质例如佐剂显著增强产生的针对靶抗原的免疫应答，但它们中有许多具有限制其使用的副作用。在另一方面，允许靶抗原的免疫原性的内源性增加的应用还未开发出来。

我们描述了作为主要特征在于添加肽序列(片段H)后使得靶分子的免疫原性增强的发明。我们例如描述了本发明在产生重组蛋白中的应用，其中产生具有该标签的靶抗原。该构建体允许靶抗原的免疫原性显著增强。

本发明涉及与存在于由肝片形吸虫的成虫排泄-分泌的钙结合蛋白，具体地被称作FH8或成束蛋白（fasciolin）(Genbank号AF213970)中的氨基酸序列融合的抗原。该策略可升高融合至片段H的抗原的免疫原性水平，并且该增强的免疫原性导致对其施用了所述免疫原的个体的免疫应答的诱导的获得。该系统可显著升高目标抗原的免疫原性水平，从而允许对其施用了所述抗原的个体产生更强的免疫应答，包括针对目标抗原的特异性抗体的产生。该方法使得能够在多克隆抗体的产生、接种、免疫疗法或可因特异性免疫应答的产生而导致的其它应用中使用低免疫原性抗原，包括肽。

因添加H片段至目标抗原而产生的抗原的免疫学特征使得能够在针对片段H的显著应答不存在的情况下产生针对目标抗原的特异性应答。在注射了无其它添加剂（包括其它佐剂）的免疫原之后发生免疫应答，可将抗原变性或不变性地施用。支持本发明的结果是指使用蛋白FH8的11个氨基酸的氨基末端片段来增强无关蛋白质或蛋白质片段（用作实例）的免疫原性的范例。然而，此类方法可以被潜在地扩展至任何多肽。所述范例基于包含相应于片段H的N末端序列的重组蛋白的产生。该应用模型使本发明的使用成为可能，因为其不再要求肽的组合（通过化学或物理方法）。本申请还增强重组抗原产生系统产生重组免疫原（特别地用于产生多克隆抗体和制备疫苗）的效用。

发明详述

用于验证本申请的说明书是基于通常用于研究目的的载体pQE(QIAGEN)的使用。将各种构建体亚克隆入大肠杆菌（Escherichia coli）pQE(Qiagen)的表达载体，这导致在6个组氨酸的N末端序列后表达的重组蛋白的产生，在大肠杆菌M15(pREP4)(Qiagen)中进行的该产生，允许基于由制造商提供的方案(Castro,2001,Silva和al.,2004)，利用NINTA琼脂糖柱(Qiagen)通过亲和层析分离。使用该系统制备所有产物，我们在变性条件下进行重组抗原的分离以使得能够更有效地进行分离。

为了产生和分离目标蛋白质，可以使用任何表达系统和重组蛋白的分离，只要其不减少片段H对免疫系统的暴露。用于获得构建体的系统应当被视为在研究中用于获得实验范例所需的大量蛋白质的媒介物。

可将相同的方法用于蛋白质产生的其它系统，特别地真菌或真核生物系统。

结果是指使用来自FH8(SEQ ID NO 1和2)的片段H的实例。

本发明的原理之一是：利用分子生物学的方法将相应于FH8的N末端片段的序列的片段H(具体而言是SEQ ID NO 2的多肽)添加至期望用作免疫原的多肽序列之前。该构建体可通过利用分子生物学技术添加该序列来实现，包括使用适当的限制性酶将这些片段添加在适当的限制性位点，用于描述的范例中的方法，或通过其它方法例如将具有目标序列的DNA片段（接头）添加至PCR产物或其它方法。片段H的减小的幅度使得能够使用多种策略进行与目标多肽的融合。

用于构建的另一种可能是使用相应于待制备的多肽FH8的序列的多肽制备融合蛋白。可使用分子生物学的技术，包括使用限制性酶、范例的方法中使用的方法来实现插入下列FH8的过程。

本发明已被用于各种具有不同免疫原性特征的片段和蛋白质，包括被描述为非免疫原性或具有低免疫原性的蛋白质或片段，如CWG、CD4，或由于其特征，包括其分子量的原因而具有较低的免疫原性的片段，例如IL5、Pfsp和Ent，被描述为免疫原性极高的蛋白质如PAL，以及具有中等免疫原性的蛋白质和蛋白片段，例如CP12和LEC，以及具有未知特征的其它靶例如BG和Toxo。我们还在整个实验中应用几种不同的方案（方案的差异在于给小鼠施用的蛋白质浓度以及施用之间的时间间隔不同）。这些不同的方案被用于证明本发明的通用性。我们还评估了在变性条件下施用抗原的可能性，如在LEC的情况下；或在非变性条件下的可能性，如在其余片段和蛋白质的情况下。对于所有进行的范例，我们使用小鼠作为实验模型并且通过腹膜内途径来进行抗原的施用。还使用皮下施用在兔中估计针对靶标CWP、IL5、Ent、Toxo、BG和CP12的抗体的产量，结果相似（未显示）。产生抗原，使用与NINTA琼脂糖树脂(QIAGEN)相同的条件在变性条件下分离抗原。在针对PBS透析并通过0.22μ滤器过滤灭菌后制备用于免疫的抗原。

为了证明由所述片段在免疫原性水平上产生的特异性效应，我们使用两种靶，即：

-CWG：兰伯贾第虫孢囊的CWP(孢囊壁蛋白)蛋白。在工作完成时，我们使用427bp的CWP2的一部分序列，原始序列具有1089bp并且待扩增的区域位于527bp至931bp(GenBank登录号XM_001710190)。利用PCR扩增片段，将其亚克隆入载体pQE(CWP)，还可使用包含片段H、紧随其后的CWP构建体(HCWP)和包含与CWP的序列融合的FH8的序列的构建体(Fh8CWP)来制备所述构建体。以表2中描述的间隔施用具有相同量的蛋白质(50μg)的接种物。结果显示在5次IP后仅在组HCWP中可见显著水平的抗-CWP产生，其在实验的后续阶段保持存在，包括最后一次施用蛋白质后83天。使用抗原Fh8CWG产生的印迹确认了ELISA的结果并且证明产生的抗体的特异性。利用寄生虫进行的免疫荧光测定显示产生的抗体识别存在于该结构的壁中的天然蛋白质。

-CP12：CP12是小隐孢子虫的表面蛋白质。用于本工作的片段CP12(GenBank No.XM_625821)具有213bp并且相应于不具有其跨膜结构域的蛋白质CP12的核苷酸序列。通过PCR扩增片段，将其亚克隆入载体pQE(CP12)，我们还制备包含片段H、紧随其后的CP12的构建体(HCP12)。产生抗原，使用与NINTA琼脂糖树脂(QIAGEN)相同的条件在变性条件下分离抗原。以表2中显示的周期施用具有相同量的蛋白质(20μg)的接种物。结果显示CP12与HCP12组之间的抗体的产生的显著增加（在强度和速度上），这些水平在整个实验过程中保持明显增加。利用Fh8CP12产生的印迹确认了ELISA的结果并且证明了产生的抗体的特异性。利用寄生虫进行的免疫荧光测定显示产生的抗体识别存在于该结构的壁中的天然蛋白质。

对于其余靶，已制备了用含有H标签的构建体免疫的组以显示免疫应答存在。对于下面描述的实例，除了由其它机构提供的片段LEC外，通过PCR扩增片段，并且将所述片段亚克隆入pQE载体：含有片段H、紧随其后的靶片段。用于获得此类片段的条件描述于表1中。

-BG：我们克隆了兰伯贾第虫的β-Giardina的基因的完整序列，其具有850bp的大小，具有缺失(691bp至787bp)(GenBank登录号X85985)，编码33kDa的蛋白质。我们以表2中显示的周期施用具有相同量的蛋白质(20μg)的接种物。结果显示在第3次IP后显著的增加，在第4次IP后保持所述水平。利用蛋白质BG产生的印迹确认了产生的抗体的特异性。甚至在最后一次接种后47天亦可检测到抗体效价的维持。利用寄生虫进行的免疫荧光测试显示产生的抗体识别存在于该结构的壁中的天然蛋白质。

-Ent：使用的扩增子具有163bp的大小，编码5kDa的蛋白质，并且为来自溶组织内阿米巴孢囊壁特异性糖蛋白Jacob的456bp的大小的基因(GenBank登录号XM_645825)的291bp至453bp之间的区域。以表2中显示的周期施用具有相同量的蛋白质(50μg)的接种物。结果显示在第4次IP后显著的增加。利用蛋白质Fh8Ent产生的印迹确认了产生的抗体的特异性。我们能够确认甚至在最后一次接种后90天抗体效价的维持。利用寄生虫进行的免疫荧光测试显示产生的抗体识别存在于该结构的壁中的天然蛋白质。

-Pfsp：在本研究中，我们使用falcipaina-1的小部分序列(165bp)，将其插入3D7恶性疟原虫营养体半胱氨酸蛋白酶前体的序列(1423bp-1587bp)(GenBank登录号XM_001348691.1)。以表2中显示的周期施用具有50μg的蛋白质的接种物。结果显示在第4次IP后显著的增加，在第7次IP后达到最大效价。我们可在最后一次接种后82天确认针对片段Pfsp的特异性抗体的存在。利用蛋白质Fh8Pfsp产生的印迹确认了产生的抗体的特异性。

-IL5：人白细胞介素5是造血生长因子，其具有编码134个氨基酸的816bp的核苷酸序列(GenBank No.BC069137.1).。用于评估IL5的片段是IL5的非常小的部分，由相应于IL5的5'末端的编码48个氨基酸的外显子的144bp组成。以表2中显示的周期施用具有相同量的蛋白质(20μg)的接种物。结果显示在第4次IP后显著的增加。利用蛋白质IL5产生的印迹确认了产生的抗体的特异性。

-Toxo：Toxo蛋白为鼠弓形虫的卵囊壁的蛋白质，具有编码499个氨基酸的1846bp(GenBank No.EU851867.1)。Toxo片段相应于位于2875与3238bp之间的外显子2。以表2中显示的周期施用具有相同量的蛋白质(20μg)的接种物。结果显示在第4次IP后显著的增加。利用蛋白质Toxo产生的印迹确认了产生的抗体的特异性。

-CD4：CD4蛋白是鲈鱼的淋巴细胞的壁的受体(GenBank No.AMB849812.1)。CD4片段相应于该受体的193与714bp之间的两个结构域。以表2中显示的周期施用含有30μg的蛋白质的接种物。结果显示在第4次IP后显著的增加。利用CD4蛋白产生的印迹确认了产生的抗体的特异性。

-PAL：嗜肺军团病杆菌（Legionella pneumophila）的PAL蛋白(肽聚糖结合的脂蛋白前体)是来自该细菌的壁的蛋白质(GenBank No.YP001250824)。PAL相应于完整蛋白质。我们以表2中显示的周期施用具有30μg蛋白质的接种物。结果显示在第2次IP后显著的增加。利用蛋白PAL产生的印迹确认了产生的抗体的特异性。

-LEC：来自面包果（Artocarpus incisa）的凝集素的DNA片段（具有846bp）包含酶Sac I和KpnI的切割位点。由于该抗原当以非变性形式存在时具有潜在的使红细胞凝聚的活性，因此我们在变性条件下制备蛋白质接种物。为了除去最大量的尿素(终浓度低于10mM)，我们针对PBS缓冲液透析50mM尿素，在制备样品时，我们将抗原于PBS中稀释，通过0.22μ过滤。我们以表2中显示的周期施用具有12.5μg蛋白质的接种物。结果显示在第4次IP后显著的增加。利用蛋白质HLEC产生的印迹确认了产生抗体的特异性。

在上述实例中，使用相应的抗原，通过ELISA进行反应的评估。在印迹法中，我们评估对抗原的反应(其产生更高效)。为了利用含有标签FH8的重组蛋白进行印迹，由于存在形成聚合物的可能性，因此我们利用特异于FH8的多克隆抗体定位重组蛋白。在大多数情况下，我们在印迹法中包括硝酸纤维素条，其含有具有片段H（通常地重组FH8）的抗原，以用于评估针对该片段的反应，并且除了在用Fh8CWP接种的组中获得的应答外，我们未检测到显著水平的抗H抗体的存在。

在上述实例中，除了其接种物包含PBS中的10mM尿素的HLEC外，接种总是仅利用在PBS中稀释的抗原进行的。

抗原及其片段FH8H的表征：

抗原FH8先前已被分离，并且通过发明人的列表中的性质元件来表征(Castro,2001,Silva等人,2004,Eguino等人,1999)(图1)。

通过筛选肝片形吸虫cDNA库(图1)进行Fh8的分离。所述克隆编码具有8kDa的理论分子量的69个氨基酸的多肽，其被命名为FH8或fasciolina(Genbank编号AF213970)。

在具有载体pQE的大肠杆菌表达系统中以高蛋白质水平(>5mg/升的培养物)产生重组蛋白FH8。利用FH8突变体的研究产生以下假说：该抗原的N末端序列在蛋白质的稳定性中具有重要作用。该假说的证明产生了专利No.20091000005031中描述的发明。另一个特征是其高免疫原性，该特征扩展至另一个钙结合蛋白家族（存在于由肝片形吸虫的成虫排泄/分泌的提取物中），FH22家族(EMBL编号AJ003821,EMBL编号AJ003822)。两种抗原经证明能够以高特异性抗体效价诱导免疫应答(Castro,2001,Silva等人,2004)。这些结果也提出了其用作目的在于产生抗体的重组蛋白的产生的标签的用途。片段H是抗原的稳定性所必需的以及该片段至其它无关蛋白质或片段的添加使得能够增加蛋白质的产量（假定归因于融合蛋白的增加的稳定性）的证明，提出了以下假说：片段H的添加，因为相同的原因，可增加该抗原的免疫原性。该推断似乎来自这样的事实，即蛋白质的稳定性通常与其免疫原性相关。该假说通过上述范例来确认。

使用的株系

在本研究中，我们使用菌株大肠杆菌XL1Blue(Stratagene)和大肠杆菌M15[pREP4](QIAGEN)分别克隆质粒pGEM-T E asy(Promega)和质粒pQE30(QIAGEN)。

为了进行蛋白质表达，我们使用大肠杆菌菌株M15[pREP4]。

按照由制造商提供的说明书，利用来自Promega的试剂盒

Plus SV Minipreps DNA纯化系统从在37℃生长过夜的细菌培养物分离和纯化质粒DNA。

构建体

用于评估11个氨基酸的结构元件(片段H)作为诱导重组蛋白的免疫原性的因子的构件的概述示于图2中。

通过聚合酶链式反应（PCR）获得图2中显示的构建体，将其克隆入pGEM，随后克隆入pQE，如表1中显示的，如下文中指明的。

通过聚合酶链式反应（PCR）获得表示用于评估免疫应答的其它抗原的构建体，将其克隆入pGEM，随后克隆入pQE，如表1中显示的。

通过下文中描述的亚克隆技术获得其余构件。

PCR

用于PCR的引物描述于表1中。

为了获得包含限制酶切位点BamHI和SacI的片段H和Fh8RSac，我们使用包含编码多肽FH8的基因的pQE30载体(Castro,2001,Silva等人,2004)作为PCR反应的模板。PCR反应始于在95℃下进行1分钟变性的步骤，然后进行30个扩增循环：在94℃变性45秒，在50℃退火30秒以及在72℃聚合45秒。我们进行在72℃进一步聚合11分钟的步骤。通过PCR扩增片段(CWG、CP12、BG、Ent、PFSP、IL5、Toxo、CD4、PAL和LEC)，所述片段被选择用以评估通过将无关多肽与H片段融合而制备的重组蛋白产生免疫应答的能力，如通过测量针对所述蛋白质或片段的特异性抗体的出现所显示的。该PCR反应还将限制性酶SacI和KpnI添加至它们的片段中。

表1.用于获得用于评估片段H的活性的构建体、DNA样品、引物和PCR程序的PCR反应的列表

表2.方案的描述

在表1中描述的条件下进行用于制备不同片段的PCR反应，用于制备不同片段的DNA模板描述于表1中。关于基因组DNA的制备，按照制造商的方案使用来自QIAGEN的QIAamp DNA mini试剂盒提取DNA。用于所有PCR反应的热循环仪为My CyclerTM Thermal循环仪(BioRad)。

所进行的PCR反应的混合物由1μl样品(模板DNA)、2μl氯化镁、1μl dNTP(Roche)、1μl正向引物和1μl反向引物、5μl Taq聚合酶缓冲液(Thermo Scientific)、1个单位/反应的Taq聚合酶(Thermo Scientific)和蒸馏水（添加至达到50μl的终体积）组成。

利用描述的实例产生构建体：

将PCR产物克隆入pGEM载体，在用限制性酶SacI和KpnI消化后，将其亚克隆入载体pQE30，利用SacI和KpnI消化包含片段H(pQEH)的pQE30或包含片段FH8(pQEF)的pQE30。

从琼脂糖凝胶提取和纯化DNA

为了从凝脉电泳分离PCR产物和利用限制性酶消化产生的DNA条带，我们按照由制造商描述的方法，使用illustra^TM GFX PCR DNA&Gel Band Purification试剂盒(GE Healthcare)。

与载体pGEM连接

与载体pGEM-T Easy的结合反应为：将3μl DNA样品(PCR产物或利用限制性酶的消化)与1μl载体pGEM-T Easy(Promega)、5μl的酶缓冲液2X DNA连接酶(Promega)和1μl的酶T4DNA连接酶(Promega)混合至10μl的终体积。该反应在室温下进行过夜或在37℃下进行1.5小时。

通过利用限制性酶的消化来确认转化体

在与载体pGEM的连接反应后，我们利用该产物转化大肠杆菌XL1Blue。随后将细胞涂铺在LB/氨苄青霉素/X-Gal/IPTG的平板上，在37℃温育过夜。将转化的克隆用于在LB/氨苄青霉素中制备液体培养物，随后将其用于从大肠杆菌提取质粒DNA。

通过利用限制性酶EcoRI(Promega)消化来确认靶向DNA片段的存在，对于每一个反应，我们使用7μl质粒DNA、2μl H 10X缓冲液和1μl EcoRI，产生10μl的终体积。反应在37°C进行2至3小时，将消化的结果在具有适当的百分比(w/v)的琼脂糖凝胶上展示。

与载体pQE的连接

通过将6μl的插入物与2μl的载体pQE、1μl的10X连接酶缓冲液(Promega)和1μl酶T4DNA连接酶(Promega)混合来将利用限制性酶消化产生的插入物插入载体pQE、pQEH或pQEFh8。该反应在室温下进行过夜，或在37℃下进行1.5小时。

在将插入物连接于载体后，利用所产生的产物转化大肠杆菌M15[pREP4]。随后将细胞涂铺在LB/氨苄青霉素/卡那霉素的平板上，在37℃温育过夜。将转化体转移至LB/氨苄青霉素/卡那霉素的液体培养中，随后将其用于从大肠杆菌提取质粒DNA。

通过用限制性酶KpnI和BamHI(Promega)消化来确认转化体。首先，利用KpnI进行消化，将26μl的质粒DNA、3μl缓冲液J 10X(Promega)和1μl KpnI(Promega)混合，终体积为30μl。将10μl的消化物在琼脂糖凝胶上进行分析，之后我们利用BamHI进行第二消化，为了该目的，我们向剩余的第一反应中添加2μl 10X缓冲液K(Promega)和1μl BamHI(Promega)。将消化的结果显现在具有适当的百分比(w/v)的琼脂糖凝胶上。

产生的构建体的测序列

通过在Eurofins MWG Operon(Germany)上进行测序来确认利用pGEM和pQE载体中的插入物产生的所有构建体。

重组蛋白的表达和分离

在搅拌的条件下将200ml的预培养物于37℃培养过夜，通过放置100ml饱和培养物和900ml含有100g/ml氨苄青霉素、50g/ml卡那霉素和1mM IPTG的LB培养基来将其用于制备2升诱导的培养物。温育5小时之后，我们通过在4°C以4000rpm离心20分钟收集细胞。通过用40mL 8M尿素,pH 8.0温育细胞，在搅拌的条件下进行过夜来进行细胞裂解。在室温下以13,000rpm离心提取物15分钟，收集上清液。在回收后，利用玻璃棉柱过滤上清液，将其应用于利用8M尿素,pH8.0预平衡的Ni-NTA柱(Amersham Biosciences)。

使上清液通过重力通过柱子，用5CV(柱体积)的缓冲液8M尿素,pH 8.0洗涤柱子，然后利用5CV的含有10%甘油的缓冲液8M尿素,pH6.5洗涤柱子。利用缓冲液8M尿素,pH 4.5进行洗脱，收集4mL的级分。利用Bradford法定量洗脱的级分的蛋白质含量，如下文中所描述的，在SDS-PAGE Tris-Tricine上分析级分。

蛋白质定量

利用1:5稀释的蛋白质测定试剂(BioRad)通过Bradford法进行蛋白质定量，在595nm的波长处读取光密度。利用该试剂，通过在595nm处读取具有已知浓度的牛血清白蛋白(BSA)的溶液的光密度来获得标准曲线。

接种物的制备：

除HLEC外，在于8M尿素中的变性条件下分离用于所述范例的重组蛋白。在级分的蛋白质定量和分析后，针对利用无热原水制备的PBS缓冲液进行充分透析。在透析后，我们使用0.2u滤器过滤蛋白质（在非变性条件下）以进行灭菌。使用500ul无菌无热源PBS达到接种物的体积。施用的蛋白质的量在不同样品之间在10至50μg之间变化，如上文对于每一种情况所描述的。

在8M尿素中制备重组蛋白HLEC，将其针对利用无热源水制备的含有50mM尿素的PBS缓冲液进行透析，然后使用具有3kDa的截留值的centricon(Amicon)膜浓缩抗原。通过将浓缩的蛋白质稀释于适当体积的无菌无热原PBS中来临时制备接种物，以确保尿素的浓度低于10mM，并且将接种物通过0.2μ的致热滤器过滤。

小鼠中的测试：

在获自Charles River SA Barcelona的CD1小鼠的模型中进行本工作中进行的实验。将动物圈养并维持于随意获取食物和饮水的条件下。按照现有指导原则进行动物的养护。

每一组由3只小鼠组成，按照表2中描述的方案定期腹膜内施用接种物，按照表2中描述的方案，定期在尾静脉上进行血液取样。在收集血液后，通过以2500rpm离心10分钟获得血清，于-20℃保存。

聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE Tris-Tricine中的电泳

用于分析收集的级分的Tris-Tricine凝胶基于

,H.和Jagow,G.(1987)的Tris-Tricine系统和Laemmli(1970)的SDS-PAGE。因此，所采用的系统由两种凝胶组成：一种是15%的分离胶（resolventgel），另一种是4%的浓缩胶（packaging gel）。分离胶包含3.3mL 30%丙烯酰胺、2.205mL凝胶、705mL甘油、367.5mL水、150μl PSA 10%和9μl TEMED。浓缩胶包含700μl 30%丙烯酰胺、1.25mL凝胶、3mL水、200μl 10%PSA和5μl TEMED。

使用的电泳系统由其中分别放置阴极缓冲液和阳极缓冲液的两个储液池（较高的（离凝胶）和底部的）组成。我们向浓缩胶应用100V的电势差（DDP），向分离胶应用150伏的ddp。

在应用于凝胶之前，用样品缓冲液Tris-Tricine 1X处理样品(在非变性或变性条件下)。也将非变性条件下的样品置于100℃的水浴中进行2分钟，然后变成4℃直至装载在凝胶上。

用考马斯蓝对凝胶进行染色。

转移至硝酸纤维素膜

我们将2张滤纸、硝酸纤维素膜、其中进行蛋白质电泳的SDS-PAGE以及装配夹层所需的海绵浸没在转移缓冲液(25mM Tris,0.2M甘氨酸,100ml甲醇)中。在于缓冲液中浸渍后，我们装配夹层，使用系统TE 80(Hoefer)进行转移。转移在转移缓冲液中发生，在80V的恒定电势差下进行1小时。

免疫印迹

在转移后，用PBS-牛奶5%在室温饱和0.45μm的硝酸纤维素膜(Schleicher&Schell)，进行1小时。用2X PBS-0.3%Tween(PBS-T)洗涤膜。在4℃利用于PBS-牛奶中稀释的具有适当浓度的血清过夜温育所述膜。我们用PBS-T洗涤膜3次。添加缀合物蛋白G-过氧化物酶(BioRad)以在PBS-牛奶中稀释至1/1000，在室温温育2小时。我们用PBS-T洗涤膜3次，利用15mg溶解在5ml的冷甲醇、20ml PBS和25μl 30%H₂O₂中的4-氯-1-萘酚进行显示。

利用ELISA进行的免疫测定

在4°C利用100μl/孔的抗原包被聚苯乙烯微量培养板(Nunc)，抗原为10μg/ml，在0.1M pH 9.5ON的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中。用PBS-T 0.3%洗涤孔，随后在保湿室中在37℃用200μl PBS-0.1%明胶/孔饱和30分钟，再次用PBS-T洗涤。我们向每一个孔中添加100μl于PBS-T中以1/400稀释的血清，将其置于保湿室中在4℃温育过液。用PBS-T洗涤板3次。我们向每一个孔中添加100μl于PBS-T以1/2000稀释的蛋白G-偶联的过氧化物(Biorad)，将其置于保湿室中于37℃温育1小时。用PBS-T洗涤孔3次。底物的反应物包含1mg OPD/ml 0.2M磷酸盐pH 5.6。对于每1ml的该溶液，我们添加1μl H₂O₂ 30%。每孔添加100μl底物，利用100μl的3M HCl/孔终止反应。

在ELISA plate Model 680(Biorad)中在490nm处读取光密度。

免疫荧光

在小隐孢子虫(CP12)和兰伯贾第虫(CWG)的情况下，从水样品和粪便获得用于免疫荧光测试的生物材料，对于溶组织内阿米巴(ENT)，从供应商Biomérieux diagnosis获得载玻片，在β-Giardina(BG)的情况下，我们使用营养体的无菌培养物。

为了利用寄生虫材料制备载玻片，将寄生虫的样品添加至载玻片的每一个孔中以用于免疫荧光，使其在烘箱中干燥直至沉淀物保持固定；添加两滴丙酮至完全干燥。让其在室温干燥并于37℃的烘箱中再干燥5分钟。为了进行免疫荧光，我们在相应稀释物中添加10μl的的血清(一抗)，并在保湿室中于37℃放置约1小时，然后用PBS洗涤3次。

将于PBST中稀释的用FITC(Sigma)标记的缀合物抗-小鼠IgG添加至载玻片，在37℃于保湿室中温育1小时。洗涤载玻片。我们加入造影(伊文斯蓝)溶液，随后加入10μl封固介质。在显微镜NikonOptiphot免疫荧光下观察载玻片。

实施例

为了更容易地理解本发明，在下列本发明的申请的优选实施例中描述本发明，然而，所述实施例无意限制本发明的范围。

在本工作的研究下的重组抗原的特征在于诱导可通过特异性多克隆抗体的产生评估的免疫应答。研究先前已显示片段H在抗原FH8的稳定性和免疫学特征中起着至关重要的作用：其序列H被缺失的来源于FH8的抗原显示了它们的稳定性和免疫原性的显著降低。

策略已被提出，作为这些假定的起始点，选择片段以在其来源、性质和免疫学特征以及不同应用方案方面广泛地变化，以用于评估本申请在不使用除抗原本身外的另一种成分（佐剂）的情况下诱导特定免疫应答的用途。为此，我们在佐剂存的情况下其免疫学特征先前已被评估的片段，例如已被证明具有低免疫原性的CD4和片段CWG，经显示具有中等免疫原性特征的片段CP12和LEC，或PAL（其为具有极高免疫原性的抗原），或片段，如片段Ent、IL5和Pfsp，它们的生物化学特征（包括家族蛋白质、分子量和氨基酸序列）决定它们将具有低免疫原性或无免疫原性。最终我们也使用免疫学特征完全未知的片段，例如Toxo和BG。为了评估片段H对添加至其的抗原的免疫原性的实际影响，我们进行在片段H不存在和存在的情况下评估片段CWG和CP12诱导免疫应答的能力的范例。

实施例1-具有片段CWG的构建体产生的蛋白质的免疫应答的评估

在获得b构建体pQECWG、pQEHCWG和pQEFCWG后，我们在变性条件下产生和分析各个重组抗原(图3A)。

在SDS-PAGE Tris-Tricine凝胶的分析中(图3A)，我们可看到，蛋白CWG具有如所预期的16kDa的分子量，而融合蛋白HCWG具有约17kDa的分子量，重组抗原FCWG具有约24kDa的分子量。

通过IP定期施用（表2），以50μg抗原CWG、HCWG和FCWG接种3组CD1小鼠来显示片段H的存在对于抗CWG的特异性免疫应答的诱导的影响。也使用一组3只未接受接种的具有相同特征的CD1。定期收集血液(表2)以进一步评估Ig抗-CWP的存在。利用包含抗原CWG(图3B.a)、HCWG(图3B.b)和FCWG的平板，通过ELISA进行特异性抗体反应的存在的评估。从第4次接种以后出现大量免疫球蛋白G(IgG)抗-CWG，但仅在组HCWG中出现。在组FCWG中，我们验证了IG抗-FH8的存在，但未确认抗片段CWG的特异性IgG的存在(数据未显示)。甚至在最后一次施用后83天检测到Ig G抗-CWG在HCWG组中的存在，这表明该抗原的特异性记忆（specific memory）的存在。

为了评估多克隆抗体的特异性，我们使用FCWG作为抗原进行印迹法。利用以1/100稀释的产生的抗FH8的抗血清(图3D.i)进行重组蛋白FCWG以及可能的聚合物的定位，所述抗血清使得能够观察聚合物FCWG。通过使用以1/200稀释的在第5次IP后和第6次IP后9天获得的阴性组、CWG组和HCWG组的血清的汇合物，相应于FCWG的沉淀出现。使用抗原FH8(以评估IgG抗-片段H的产生)利用相同的稀释度进行的免疫印迹的实现未显示任何沉淀的出现。所有这些结果显示由组HCWG产生的抗体对于片段CWG是特异性的。未观察到与大肠杆菌的抗原的显著交叉反应的存在或Ig抗-片段H的存在。

为了评估产生的Ig是否能够识别存在于贾第虫属孢囊的壁中的天然蛋白质，我们利用来自组HCWG的血清实现免疫荧光，显示荧光在壁结构中的存在(图3E)。

实施例2-具有CP12片段的构建体的蛋白质的免疫应答的评估

在获得构建体pQECP12和pQEHCP12后，我们在变性条件下产生和分析各个重组抗原（图4A）。

在SDS-PAGE Tris-Tricine凝胶的分析中(图3A)，我们可看到，CP12蛋白具有如所预期的9kDa的分子量，而融合蛋白HCP12具有约10kDa的分子量，重组抗原FCP12呈现为具有约29kDa的分子量的抗原。考虑到重组抗原的计算的PM，29kDa的条带可能是聚合物FCP12。

通过IP定期施用（表2），用20μg抗原CP12和HCP12接种2组CD1小鼠来显示片段H的存在对抗CP12的特异性免疫应答的诱导的影响。我们也使用一组3只未接受接种的具有相同特征的CD1。定期收集血液(表2)以进一步评估Ig抗-CP12的存在。利用包含CP12抗原(图4B.a)、HCP12(图4B.b)的平板，通过ELISA评估特异性抗体反应的存在。从第4次接种以后在组HCP12出现抗-CP12，从第6次IP以后也在CP12组中看见Ig抗-CP12的出现。在两个组中，Ig抗-CP12的效价在整个实验过程中渐增。在本实施例中，可通过存在于组HCP12中的早期免疫应答和较高量的IgG抗-CP12来观察免疫原性的增强。

为了评估产生的多克隆抗体的特异性，我们使用FCP12作为抗原进行印迹法。利用以1/100稀释的Fh8特异性抗血清(图4C)进行重组蛋白FCP12的定位，所述抗血清使得能够观察FCP12聚合物，其定位由箭头指示。通过使用以1/1000稀释的在第8次IP后收获的阴性组、CP12组和HCP12组的血清，相应于利用血清抗-FH8鉴定的蛋白质的沉淀出现。当与CP12组相比较时，存在于HCP12组中的最高强度确认了组HCP12中发生的免疫应答的增强。使用抗原FH8利用相同血清进行的免疫印迹未显示任何沉淀的出现。所有这些结果显示由组HCP12产生的抗体对于CP12片段是特异性的，因为观察到与大肠杆菌的抗原的显著交叉反应的存在或Ig抗-片段H的存在。

为了评估产生的Ig是否能够识别存在于隐孢子虫卵囊的壁中的天然蛋白质，我们利用来自组HCP12的血清实现免疫荧光，其显示荧光在壁结构中的存在(图4D)。

实施例3-由具有片段H的构建体产生的蛋白质或片段的免疫应答的评估

对于每一个描述的片段，我们通过IP定期施用（表2），以相应的抗原接种3组CD1小鼠来显示免疫应答的产生。我们还使用一组3只未接受接种的具有相同特征的CD1。定期收集血液(表2)以进一步评估针对靶抗原的Ig的存在。

蛋白质BG：关于该片段的免疫学特征是未知的。在获得构建体pQEHBG后，我们产生和分析各个重组抗原(图5A)。已通过用20μg的抗原HBG接种一组3只CD1小鼠小鼠来显示片段H的存在对抗BG的特异性免疫应答的诱导的影响。利用包含抗原HBG(图5B)的平板，通过ELISA进行特异性抗体反应的存在的评估。从第3次接种以后出现Ig G抗-BG。抗体水平在第4次IP后达到稳定期，该稳定期甚至在最后一次接种后47天一直得到维持。

为了评估产生的多克隆抗体的特异性，我们使用BG作为抗原进行印迹法。通过使用以1/1000稀释的在第7次IP后收获的阴性和HBG组的血清，出现相应于BG的沉淀。未检测到与大肠杆菌的抗原的显著交叉反应的存在。

为了评估产生的Ig是否能够识别存在于贾第虫属的壁中的天然蛋白质，我们考虑利用来自组HBG的血清实现免疫荧光，其显示免疫荧光在这些结构的壁中的存在。

蛋白质片段Ent：由于该多肽的低分子量(7Kda)的原因和由于其仅代表蛋白质的部分，因此片段具有与低免疫原性相关的特征。

在获得构建体pQEHEnt后，我们产生和分析它们的重组抗原。通过用50μg HEnt抗原接种3只CD1小鼠显示免疫应答的产生。利用包含抗原HEnt(图5B)的平板，通过ELISA进行特异性抗体反应的存在的评估。从第5次接种以后出现Ig G抗-Ent。抗体水平在第5次IP后达到稳定期，该稳定期甚至在最后一次接种后90天一直得到维持。

为了评估产生的多克隆抗体的特异性，我们使用FEnt作为抗原进行印迹法。使用以1/100稀释的特异性抗血清抗FH8（图6B）进一步鉴定重组蛋白FEnt，所述抗血清允许观察FEnt聚合物，其定位由箭头指示。通过使用以1/1000稀释的在第7次IP后收获的阴性和HEnt组的血清，在HEnt组中出现相应于FEnt的沉淀。使用抗原FH8利用相同血清进行的免疫印迹未显示沉淀的出现。所有这些结果显示由组HEnt产生的抗体对于片段Ent是特异性的，因为未检测到与大肠杆菌的抗原的显著交叉反应的存在或抗-Ig片段H的存在。

为了评估产生的Ig是否能够识别存在于内阿米巴属营养体的壁中的天然蛋白质，我们利用来自组Hent的血清实现免疫荧光，其显示荧光在壁结构中的存在(图6C)。

蛋白质片段PFSP：由于该肽的低分子量(7Kda)的原因和由于其仅代表蛋白质的部分，因此该片段具有与低免疫原性相关的特征。

在获得构建体pQEHPfsp后，我们在变性条件下产生和分析各个重组抗原。通过用50μg HPfsp抗原接种CD1小鼠显示免疫应答的产生。利用包含抗原HPfsp(图7B)的平板，通过ELISA进行特异性抗体反应的存在的评估。从第4次接种以后出现Ig G抗-Pfsp。抗体水平在第7次IP后达到稳定期，该稳定期甚至在最后一次接种后82天一直得到维持。

为了评估产生的多克隆抗体的特异性，我们使用FPfsp作为抗原进行印迹法。使用以1/100稀释的特异性抗FH8抗血清（图7B.a）定位重组蛋白，所述抗血清允许观察FPfsp聚合物。通过使用以1/200稀释的在第6次IP后和在第7次IP后14天收获的HPfsp组的血清汇合物和阴性组的血清汇合物，我们观察到相应于FPfsp的沉淀出现。

使用抗原FH8利用相同血清进行的免疫印迹未显示沉淀的出现。所有这些结果显示由组HPfsp产生的抗体对于片段Pfsp是特异性的，因为未检测到与大肠杆菌的抗原的显著交叉反应的存在或抗-Ig片段H的存在。

IL5蛋白片段：由于该肽的低分子量(7Kda)的原因和由于其仅代表与5只小鼠的IL具有高同源性的蛋白质的部分并且已被描述为非免疫原性的，因此该片段具有与低免疫原性相关的特征。

在获得构建体pQEHIL5后，我们在变性条件下产生和分析各个重组抗原。通过用约20μg HIL5（表2）接种CD1小鼠显示免疫应答的产生。利用包含抗原HIL5(图8A)的平板，通过ELISA进行特异性抗体反应的存在的评估。从第4次IP以后出现Ig G抗-IL5。抗体水平在整个研究过程中因接种而逐渐升高。

为了评估产生的多克隆抗体的特异性，我们使用FIL5作为抗原进行印迹法。通过使用稀释至1/100的特异性抗-FH8抗血清进行重组蛋白FIL5的定位，所述抗血清允许观察FIL5聚合物（如箭头指示的）。通过使用稀释至1/1000的在第6次IP后获得的HIL5组和阴性组的血清，发现相应于FIL5的沉淀出现。

使用抗原FH8利用相同血清进行的免疫印迹未显示沉淀的出现。所有这些结果显示由组HIL5产生的抗体对于片段IL5是特异性的，因为未检测到与大肠杆菌的抗原的显著交叉反应的存在或抗-Ig片段H的存在。

蛋白Toxo：关于该片段的免疫学特征是未知的。在获得构建体pQEHToxo后，我们产生和分析它们的重组抗原。

已通过用20μg的抗原HToxo（表2）接种CD1小鼠来显示免疫应答的产生。利用包含抗原HToxo(图9A)的平板，通过ELISA进行特异性抗体反应的存在的评估。从第4次接种以后出现Ig G抗-Toxo。

为了评估产生的多克隆抗体的特异性，我们使用Toxo作为抗原进行印迹法。通过使用以1/1000稀释的在第4次IP后收获的血清，在组HToxo中出现相应于重组Toxo的沉淀。未观察到与大肠杆菌的抗原的显著交叉反应的存在。

片段CD4：已显示该片段具有低免疫原性。在获得构建体pQEHCD4后，我们在变性条件下产生和分析各个重组抗原。

通过用30μg的抗原HCD4（表2）接种CD1小鼠显示免疫应答的产生。利用包含抗原HCD4(图10A)的平板，通过ELISA进行特异性抗体反应的存在的评估。从第4次IP以后出现抗-CD4。抗体水平在第4次IP后达到稳定期，该稳定期在最后一次接种后82天仍然得到保持。

为了评估产生的多克隆抗体的特异性，我们使用重组CD4作为抗原进行印迹法。通过使用以1/500稀释的在第7次IP后14天收获的血清的汇合物，在组HCD4中观察到相应于CD4的沉淀出现（图10B）。

PAL蛋白：已显示该蛋白质具有极高免疫原性。在获得构建体pQEHPAL后，我们产生和分析它们的重组抗原。通过用30μg抗原HPAL（表2）接种CD1小鼠来显示免疫应答的产生。利用包含抗原HPAL(图11A)的平板，通过ELISA进行特异性抗体反应的存在的评估。从第2次接种以后出现Ig G抗-PAL。

为了评估产生的多克隆抗体的特异性，我们使用HPAL作为抗原进行印迹法。通过使用以1/4000稀释的在第4次IP后收获的血清，在组HPAL中出现相应于重组PAL的沉淀（图11B）。

LEC蛋白：该蛋白质因其凝血清性（当以天然形式存在时）而被认为具有中等免疫原性，我们已在变性条件下开发了针对所述抗原的特异性抗体。

我们在变性条件下产生和分析重组抗原HLEC。

通过用12.5μg抗原HLEC接种CD1小鼠显示免疫应答的产生。利用包含抗原HLEC(图12A)的平板，通过ELISA进行特异性抗体反应的存在的评估。从第4次接种以后出现Ig G抗-LEC。抗体水平在第4次IP后达到稳定期，该稳定期在观察期间一直得到维持。

为了评估产生的多克隆抗体的特异性，我们使用HLEC作为抗原进行印迹法。通过使用以1/1000稀释的在第6次IP后收获的血清，在组HLEC中出现相应于HLEC的沉淀（图12B）。

对于片段CWG和CP12所描述的范例显示片段H在重组蛋白中的存在可显著增强由小鼠产生的特异性免疫应答。因此，免疫原性的增强是与重组抗原相关的特征，所述重组抗原允许特异性多克隆抗体产生，即使在一些提取物包括HEnt、HIL5、HPfsp、HLEC中，大肠杆菌污染物的存在是明显的。因此尽管具有来自大肠杆菌的蛋白质的污染，产生的抗体对于靶片段仍然是基本上特异的。

抗重组抗原的多克隆抗体的开发可与宿主的保护相关，其中它们产生针对包含所述相应抗原的感染性生物体的抗体。这取决于许多因素：特别是该抗原的作用或重要性具有感染传染性生物的机制。在用蛋白HCP12、HCWG和HBG接种的小鼠的情况下，此类抗原在隐孢子虫属(CP12)和贾第虫属(CWG和BG)的感染机制中代表在向宿主生物的侵入或细胞粘附中的关键作用，从而如文献中所描述的，为用于疫苗产生的靶候选物。抗此类抗原的抗体的开发已在文献中被描述为保护免于感染性试剂的感染(Tellez等人,2003,Jenkins等人,1998,Abdul-Wahid等人2007)。

在与先前文献中描述的方式非常相似的方式中，为了评估利用HCP12、HCWG、HBG注射的小鼠面临寄生虫隐孢子虫属和贾第虫属的感染的保护作用，我们证明了在用此类抗原预接种的小鼠中存在抗感染的保护作用。

由可溶性蛋白质组成的接种物的使用消除了许多由佐剂引起的不期望的作用。在所述实验中使用的小鼠中，未检测到可因抗原的接种而导致的副作用。我们还在兔模型中在大腿内侧使用皮下接种产生了抗上述片段的一些片段(HCWG、HCP12、HToxo、HIL5、Hent和HBG)的多克隆血清，并且如在小鼠中一样，我们未观察到来自抗原的施用的任何副作用。如在鼠模型中一样，兔子产生了非常显著的抗目标抗原的多克隆抗体。在所有评估的靶中，我们可通过显示特异性Ig的产生来证明显著的免疫应答的存在。

另一个非常重要的特征（特别地在抗HCWG、HCD4、HPfsp、Hent和HBG的反应的情况下观察到的）是在最后一次免疫后长达3个月，可以检测到特异性反应，这表明记忆细胞的产生，这是疫苗开发所必需的特征。

虽然提供的实施例是基于用于产生重组蛋白的模型（产生包含片段H的抗原融合物），但可通过其它方法将该片段添加至靶。显示的活性应当包括在佐剂领域中，它们可用于不同的制剂以提高或增加因靶抗原的应用而产生的免疫应答的强度和特异性。

参考文献

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Tellez,A.,Winiecka-Krusnell,J.,Paniagua,M.,Linder,E.(2003).Antibodies in mother's  milk protect children against giardiasis.Scandinavian Journal of Infectious Diseases.35:322-325

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序列表

<110>HITAG

<120>用于多克隆抗体产生系统的免疫原及制备方法

<130>PAT 41093

     3

<210>SEQ ID NO 1

<211>69

<212>PRT

<213>肝片形吸虫

<400>1

Met Pro Ser Val Gln Glu Val Glu Lys Leu Leu His Val Leu Asp Arg

1                 5                     10                    15

Asn Gly Asp Gly Lys Val Ser Ala Glu Glu Leu Lys Ala Phe Ala Asp

            20                      25                    30

Asp Ser Lys Cys Pro Leu Asp Ser Asn Lys Ile Lys Ala Phe Ile Lys

         35                    40                     45

Glu His Asp Lys Asn Lys Asp Gly Lys Leu Asp Leu Lys Glu Leu Val

    50                    55                    60

Ser Ile Leu Ser Ser

65

<210>SEQ ID NO 2

<211>11

<212>PRT

<213>肝片形吸虫

<400>2

Met Pro Ser Val Gln Glu Val Glu Lys Leu Leu

1                5                      10

Claims (14)

1.一种免疫原，其由如下部分组成：

a.由肝片形吸虫的成虫排泄/分泌的钙结合蛋白的氨基酸序列的部分，其与被称作片段H的SEQ ID NO 2具有相同的序列或具有至少90%的结构相似；

b.无关的目标蛋白质或蛋白质片段。

2.权利要求1的免疫原，其特征在于目标蛋白质或蛋白质片段是病原性蛋白质，例如病毒蛋白质、细菌蛋白质或来自原生动物的蛋白质。

3.权利要求1的免疫原，其特征在于目标蛋白质或蛋白质片段是CWG、CD4、IL5、Pfsp、Ent、PAL、CP12、LEC、BG或Toxo。

4.前述权利要求的任一项的免疫原，其特征在于用作药剂。

5.一种组合物，其特征在于包含权利要求1-4中描述的任何免疫原。

6.权利要求5的组合物，其特征在于以治疗有效量包含免疫原以及还包含药理学上适当的媒介物。

7.权利要求5的组合物，其特征在于由100%的所述免疫原之一组成。

8.权利要求5的组合物，其特征在于由如下组成：稀释于磷酸盐缓冲液-0.01M磷酸盐,0.1M NaCl,pH 7.2中的浓度为100至1000μl的体积中l至100μg的权利要求1-4中描述的免疫原。

9.一种佐剂，其特征在于包含权利要求1-4的任一项中描述的免疫原或权利要求5-8中描述的药物组合物的任一种。

10.一种疫苗，其特征在于包含权利要求1-3的任一项中描述的免疫原或权利要求5-8中描述的任何药物组合物。

11.一种用于制备免疫原的方法，其特征在于使用权利要求1-4中描述的免疫原，包括将片段H在相应于待用作免疫原的多肽的序列的任何适当的位置处添加至无关的多肽。

12.权利要求11的方法，特征在于使用多个片段和蛋白质例如CWG、CD4、IL5、Pfsp、Ent、PAL、CP12、LEC、BG或Toxo。

13.一种用于产生分离的和纯化的多克隆抗体或功能性片段的方法，所述抗体或功能片段的特征在于能够识别权利要求1-4所述的免疫原或通过权利要求11-12中所述的方法获得的免疫原，其中该方法包括下列步骤：

用权利要求1-4中描述的任何免疫原或利用权利要求5-8中描述的任何组合物免疫非人哺乳动物受试者;

使用为此目的描述的方法选择能够识别根据权利要求1-4描述的免疫原或根据权利要求11-12获得的免疫原的抗体。

14.权利要求1-4中描述的免疫原和权利要求5-8中描述的组合物的用途，其特征在于，用于产生多克隆抗体特异性免疫疗法、免疫预防、产生疫苗、佐剂、诊断剂和通过特异性免疫应答的产生而直接获得的其它应用。

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