JP2013513603A - 免疫原と、その調製方法及びポリクローナル抗体産生のシステムでの使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、肝蛭の成虫により排泄され又は分泌されたカルシウム結合タンパク質のフラグメントに対応するフラグメントＨのアミノ酸配列、それに続く無関係のタンパク質又はタンパク質のフラグメントに対応するアミノ酸配列を含む融合タンパク質、医薬組成物、免疫原を含むワクチン及びアジュバント、調製方法、抗体産生の他の方法及び使用に関する。本発明は、ペプチド配列の付加による免疫原の調製に関する。本発明は、タンパク質又は他の抗原に対する血清中の特異的抗体価の増加による免疫応答の産生に有用で、特に特異的ポリクローナル抗体の産生、免疫療法、免疫防御に適用できる。ポリペプチドを含む組換えタンパク質の産生か、又はポリペプチドの対象抗原との融合による対象抗原へのポリペプチドの付加は、抗体産生のため感染しやすい対象中への分子の導入により誘発される免疫応答を増幅する分子の免疫原性の優位な増加を誘導する。

Description

本発明は、免疫原の調製と、それらの調製方法と、組換えタンパク質の産生のための発現系におけるそれらの使用とに関する。

本発明は、無関係な抗原に対する免疫応答を発現させる（develop）ために、無関係な抗原に対して化学的若しくは物理的方法により接合することにより、又は、組換え抗原への組込み、若しくは、抗原に関する無関係な配列を含むプラスミドＤＮＡ鎖への組込みにより、付加された配列について記述する。

本発明は、そのアプリケーションが特定の抗体の産生により特徴づけられる免疫応答を誘導する免疫原（ペプチド配列を含有する組換えタンパク質を含む）の産生をもたらすことができる新規なアジュバントについて記述する。前記アプリケーションでは、無関係のフラグメントは、特定の特異的免疫グロブリンの産生によって特徴づけられる、宿主への投与のみによって宿主による免疫応答の発現をもたらすという免疫学的特徴を、（低い免疫原性抗原に対して）発現する。

抗血清は、通常、多くの場合、免疫応答を高めるためにアジュバントと組み合わせて、動物における目的の免疫原の注射により産生される。答えは、アジュバントの有無にかかわらず、それに続く抗原の投与により増加することがある。所望の応答を産生するために投与される免疫原の量は、使用される動物の種及び／又は亜種、使用されるアジュバント、投与経路、注射頻度、及び自己抗原の免疫原性によって大きく変化する。得られた抗体の質及び量は、免疫原の大きさ及び状態に依存する。小さなポリペプチド及び非タンパク質分子は、免疫応答をもたらすためにより大きなタンパク質の結合を必要とすることがある。

アジュバント型物質のアプリケーションのうちの一つの分野は、ワクチン論である。一般的に、数百もの天然化合物及び合成化合物が、アジュバント活性を有するものとして同定された。これらの毒性は、ヒトのレベルを含め、その使用に対する主な障害であるように思われる。重症度及び持続時間の両方の点で、ポリクローナル抗体の産生により引き起こされる大部分の副作用は、アジュバントの存在に起因する。

アジュバントは、精製又は組換えの免疫原性の増強と、防御免疫をもたらすために必要な抗原の量又は接種の回数の減少と、新生児、高齢者、又は、抗原若しくは粘膜を介して取り込まれた抗原の伝達システムを有する人へのワクチンの有効性の改良とを含む様々な目的で使用されることができる。任意の製剤にアジュバントを組み込む利便性は、副作用のリスクとバランスをとる必要がある。アジュバントの研究の最大の課題の一つは、効能を増加し、毒性を最小限に抑えることである。

アジュバントの製剤中にタンパク質の取り込みを調節するサイズ、電荷、及び疎水性の効果により、特定のタンパク質又はペプチドに対して最も効果的なアジュバントであることを予測することは困難である。さらに、抗原決定基における変化が、製剤又は配合中に発生する場合がある。輸送タンパク質の場合には、そのタンパク質に対する免疫の存在が重要な制限事項である。さらに、各アジュバントは、特徴的な免疫応答を生成する。

組換えサブユニットからなるワクチンの使用の増加は、処理の優先度の改善を必要としている。

米国特許出願公開第２００４／０３３５６４号明細書 国際公開第９７／００１６２７号 Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．：２００９１０００００５０３１

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〔発明の概要〕
本発明の目的は、肝蛭のカルシウム結合タンパク質由来であってフラグメントＨと呼ばれるＭＰＳＶＱＥＶＥＫＬＬ配列を有するペプチドを無関係な抗原へ付加することに起因する免疫原の産出のプロセスを記述することである。その結果得られた構造は、個体に投与されたときに免疫応答を引き起こし、無関係な抗原に対する特異的抗体の産生により特徴づけられる免疫原性特性を有する。

本発明は、フラグメントＨと無関係な抗原とからなる免疫原の投与により、個体による抗原に対する免疫応答の産出を目的とする幾つかのアプリケーションに対して有益である。本発明は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の産生、免疫療法、免疫学的予防等の領域における研究及び開発又は産業レベルの両方で、適用されうる新規なアジュバントのアプリケーションについて記述する。

本発明は、現在のアジュバントに代わるものを示し、そして、組換え抗原の発現系で使用されるときに、他の添加剤を用いることなく免疫学的特徴を有するタンパク質の産生を可能にし、そして、免疫応答の発現を可能とする個体の免疫応答の発現をもたらす。現在、抗体の開発における最大の課題の一つは、免疫応答を発現させるために十分な免疫原性抗原を得ることである。免疫原性がないか又は低い場合には、免疫応答を増強するためにアジュバントとともに抗原の投与が行われる。これらのアジュバントは、潜在的に有毒であり、注射された宿主に痛みを引き起こす可能性があり、したがって、その使用は強く思い止まらされるか、多くの場合アジュバントが禁止されさえしている。アジュバントを用いることなく免疫応答を発現するという免疫学的特徴を有する改変された抗原を得ることを可能にする方法について記述するので、現アプリケーションの利点は、技術の最先端のこの点に存在する。

本発明の成果の一つは、フラグメントＨと命名されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２と同一であるか、又は少なくとも９０％が該ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２に構造的に類似している配列を有し、肝蛭の成虫によって排泄され又は分泌されたカルシウム結合タンパク質由来のアミノ酸の配列の部分と、目的とは無関係のタンパク質又はタンパク質フラグメントとからなる免疫原の記述である。

本発明の別の優先的な実施は、目的のタンパク質又はタンパク質フラグメントが、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、原性動物からのタンパク質等の病原性タンパク質になりうるということである。さらに好ましくは、目的のタンパク質又はタンパク質フラグメントは、ＣＷＧ，ＣＤ４，ＩＬ５，Ｐｆｓｐ，Ｅｎｔ，ＰＡＬ，ＣＰ１２，ＬＥＣ，ＢＧ，Ｔｏｘｏタンパク質、又はタンパク質フラグメントである。

さらに優先的な実施では、上記の免疫原は、医薬品として使用することができる。さらに優先的には、上記の免疫原は、ワクチン又はアジュバントとして使用されることができる。さらに優先的なケースでは、フラグメントＨと命名されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２と同一であるか、又は少なくとも９０％が該ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２に構造的に類似している配列を有し、肝蛭の成虫によって排泄され又は分泌されたカルシウム結合タンパク質由来のアミノ酸の配列の部分と、目的とは無関係のタンパク質又はタンパク質フラグメントとのみからなるワクチンを使用することができることに注意する必要がある。

別の優先的な成果は、上述の免疫原を含む組成物の記述であり、好ましくは、組成物は、治療上有効な量の免疫原を含み、薬理学的に適した、特に、添加剤、アジュバント等の賦形剤を有していてもよい。

別の優先的な実施では、上記組成物は、上記の免疫原のうちの一つを１００％含むものとすることができる。

さらに優先的な実施では、上記組成物は、リン酸緩衝溶液（０．０１Ｍのリン酸、０．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で１００〜１０００μＬの容積に希釈された１〜１００μｇの濃度を有する上記の免疫原によって構成されてもよい。

本発明の別の成果は、上記免疫原の一つか、又は上記医薬組成物の一つのいずれかを含むアジュバントの説明である。

リン酸緩衝溶液（０．０１Ｍのリン酸、０．１ＭのＮａＣl、ｐＨ７．２）で１００〜１０００μＬの容積に希釈された１〜１００μｇの濃度を有するフラグメントＣＷＧ及びＣＰ１２に添加されたフラグメントＨを含むアジュバントがマウスに投与され、前記投与は、特定のフラグメントＣＷＣ及びＣＰ１２に対する免疫応答を発現する強度及びスピードの増加をもたらした。

本発明のさらに別の態様は、上述の免疫原の一つか又は上記医薬組成物の一つのいずれかを含むワクチンの説明である。リン酸緩衝溶液（０．０１Ｍのリン酸、０．１ＭのＮａＣl、ｐＨ７．２）で１００〜１０００μＬの容積に希釈された１〜１００μｇの濃度を有するフラグメントＣＷＧ、ＢＧ及びＣＰ１２に添加されたフラグメントＨ含むアジュバントを使用した。前記ワクチンの投与は、クリプトスポリジウム及びランブル鞭毛虫（Giardia）による感染実験で観察された感染の強度を減少させた。

さらに、別の優先的な実施では、目的のポリペプチドに対応する配列中の任意の位置への関連しないフラグメントＨポリペプチドの付加と、目的のポリペプチドの始端、末端又は他の位置へのフラグメントＨの付加とからなる、上記免疫原の調製のための方法を開発した。さらに優先的な実施は、幾つかのタンパク質フラグメント及び／又はＣＷＧ，ＣＤ４，ＩＬ５，Ｐｆｓｐ，Ｅｎｔ，ＰＡＬ，ＣＰ１２，ＬＥＣ，ＢＧ又はＴｏｘｏ等のタンパク質に使用することができる。

最も優先的な別の実施形態は、単離及び精製されたポリクローナル抗体、又は、上記の免疫原若しくは上記の方法により得られる免疫原を認識することができる機能的なフラグメントの産生方法を記述する。ここで、抗体を得るための方法は、上記免疫原の幾つか又は上記組成物の一つを有するヒト以外の哺乳類を対象とする接種の工程と、上記免疫原又はこの目的のために記載される方法を用いて免疫原の調製方法により得られた免疫原を認識することができる抗体の選択の工程からなる。例えば、ＣＮＢｒ−セファロースのカラムの使用は免疫原に結合され、（そこにおいて）親和性クロマトグラフィーにより免疫原を認識する抗体が単離される。

従って、本発明は、タンパク質又は他の抗原に対する血清中の特定の抗体レベルの上昇を伴う免疫応答を産生するのに有用であり、ポリクローナル特異的抗体の産生、免疫療法及び免疫学的予防、ワクチンの産生、アジュバント、診断方法、及び、特定の免疫応答の発現により直接得られる他のアプリケーションに特に適用することができる。

ポリペプチドを含む組換えタンパク質の産生、又は、対象となる抗原を有するこのポリペプチドの付加若しくは融合による、フラグメントＨ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２への対象となるポリペプチドの付加は、これらの分子の免疫原性の有意な増加をもたらす。前記これらの分子は、抗体産生の影響を受けやすい対象へのこの分子の注射によって誘発される免疫応答を増幅することができる。

〔発明の一般的な説明〕
本発明は、肝蛭の成虫から分泌され又は排泄された、カルシウム結合タンパク質からのアミノ酸配列の一部分と、無関係のタンパク質又は目的のタンパク質フラグメントとからなる構造を含む融合タンパク質に関する。

また、本発明の主題は、無関係のタンパク質フラグメントに対する動物の免疫応答の劇的な増加を可能にする、これらの融合タンパク質の調製のためのプロセスである。

無関係のタンパク質フラグメント又はタンパク質に対する、寄生虫肝蛭由来のカルシウム結合タンパク質（以降、フラグメントＨと命名されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２又は類似の配列であって、好ましくは少なくとも９０〜９５％一致し、さらに好ましくは９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，９９％又は１００％一致している）の小片の付加は、ポリペプチドの免疫原性のレベルの著しい増加をもたらす。

本発明の第１の態様は、無関係のタンパク質フラグメント又はタンパク質に構造的に類似したアミノ酸配列が後に続く、フラグメントＨの構造を有するアミノ酸配列からなる融合タンパク質に関する。

本発明の別の態様は、そのような融合タンパク質をエンコードするポリヌクレオチド配列からなることを特徴とする発現ベクターに関する。

本発明のさらに別の態様は、免疫応答の発現を可能とする動物に対する接種のための抗原の調製に関する。

本発明はまた、免疫応答を発現することができるであろう動物に対する組換え抗原の投与のための方法に関する。

本発明はまた、付加されたタンパク質又はタンパク質フラグメントに対する特定の特異的ポリクローナル抗体の産生のための融合タンパク質の使用に関する。

これらの融合タンパク質の産生は、付加されたフラグメント又はタンパク質の免疫原性を劇的に増加することができ、これにより、産業目的のための研究及び開発の使用を増大させる。

抗原に対する特異的免疫応答の誘導は、しばしば相反する活性を有する細胞及びメカニズムの広い多様性を含む複雑なプロセスである。ワクチン、診断、免疫療法等と同様に、重要な分野における産業レベルと同様の研究及び開発での潜在的なアプリケーションのために、より強い免疫応答を誘導可能な抗原の産生をもたらすことができる方法の開発は、進歩における不変のテーマであった。アジュバント等のいくつかの物質が対象となる抗原に対して産生される免疫応答を有意に増加させることはよく知られているけれども、それらの多くがそれらの使用を制限する副作用を持っている。一方で、対象となる抗原の免疫原性の内因性の増加を可能にするアプリケーションは、まだ開発されていない。

主な特徴として、ペプチド配列（フラグメントＨ）の付加により、対象となる分子の免疫原性の増加を可能とする発明について記述する。本発明のアプリケーションの実施例として、組換えタンパク質の産生において、対象となる抗原がこのタグを使用して産生されることについて記述する。この構造は、対象となる抗原の免疫原性の有意な増加を可能とする。

本発明は、肝蛭の成虫から分泌され又は排泄されたカルシウム結合タンパク質、特に、ＦＨ８又はfasciolin（ジェンバンクＮｏ．ＡＦ２１３９７０）と呼ばれるタンパク質に存在するアミノ酸配列と融合した抗原に関する。この手順は、フラグメントＨに融合している抗体の免疫原性レベルを増加することができ、この増加した免疫原性は、投与された個体による免疫応答の誘導における利益をもたらす。このシステムは、目的の抗原に対する特異的抗体の産生を含めて、投与された個体によるより強い免疫応答の発現を可能とする、目的の抗原の免疫原性のレベルを有意に増加することができる。このプロセスは、特異的免疫応答の発現をもたらしうるポリクローナル抗体及びワクチンの産生、免疫療法、他のアプリケーションにおいて、ペプチドを含む低い免疫原性抗原の使用を可能にする。

目的の抗原を有するＨフラグメントの付加に起因する抗原の免疫学的特性は、フラグメントＨに対する有意な応答の存在なしに、目的の抗原に対する特異的免疫応答の発現を可能にする。免疫応答は、他のアジュバントの存在を含む他の添加剤なしでの免疫原の注射後に生じ、抗原は、変性又は変性なしで投与されることができる。

本発明のサポートの結果は、タンパク質ＦＨ８の１１アミノ酸のアミノ末端フラグメントを用い、実施例として用いられる無関係のタンパク質又はフラグメントの免疫原性を増加させるデモンストレーションに言及する。しかしながら、これらの手順は、潜在的に任意のポリペプチドに拡張することができる。

記述されたデモンストレーションは、フラグメントＨに対応するＮ末端配列を含む組換えタンパク質の産生に基づく。化学的又は物理的手法によるペプチドの結合をもはや必要としていないので、アプリケーションのこのモデルは、発明の使用を増強させる。このアプリケーションは、特にポリクローナル抗体の産生及びワクチンの製造で用いられる組換え免疫原を産生するための組換え抗原産生システムの使用を増強させる。

カルシウム結合タンパク質ＦＨ８の特性及びペプチドフラグメントＨの特性である。Ｆｈ８は、ポリペプチドＦＨ８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １）の推定アミノ酸配列であり、ＦｒａｇＨは、フラグメントＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２）といわれるポリペプチドの推定アミノ酸配列である。 免疫応答の誘導におけるフラグメントＨの効果を評価するために使用されるサブクローニングの模式図である。 フラグメントＣＷＧを含むコンストラクトを用いて行われたデモンストレーションの結果である。図３−Ａは、クマシーブルーで染色された、トリス−トリシンのＳＤＳ−ＰＡＧＥである。ＰＭは、予め染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ標準（バイオラッド社）マーカーである。ウェルＦ１，Ｆ２は、カラムＮｉ−ＮＴＡから回収されたＣＷＧのフラクション１，２である。ウェルＦ４，Ｆ５は、カラムＮｉ−ＮＴＡから回収されたＨＣＷＧのフラクション１，２である。ウェルＦ７，Ｆ８は、カラムＮｉ−ＮＴＡから回収されたＦＣＷＧのフラクション１，２である。図３−Ｂは、ＣＷＧ，ＨＣＷＧ，ＦＣＷＧが接種されたＣＤ１マウス（ＣＷＧ群、ＨＣＷＧ群、ＦＣＷＧ群）及び無接種のマウス（無接種群）から採取された血清を用いたＥＬＩＳＡの吸光度である。値は、各群で使用された３匹のＣＤ１マウスにおける吸光度の平均値を示す。ＣＤ１マウスは、定期的に接種され、表２に記載されたプロトコルに従って、定期的に血清の採取が行われた。ａ）組換え抗原ＣＷＧを含むプレートで得られた結果である。ｂ）組換え抗原ＨＣＷＧを含むプレートで得られた結果である。図３−Ｃは、ＣＷＧ，ＨＣＷＧ，ＦＣＷＧの最終接種後８３日後のＣＤ１マウス（ＣＷＧ群、ＨＣＷＧ群、ＦＣＷＧ群）及び無接種のＣＤ１マウス（無接種群）から採取された血清を用いたＥＬＩＳＡの吸光度の結果である。値は、各群で使用された３匹のＣＤ１マウスにおける吸光度の平均値を示す。図３−Ｄは、組換え抗原ＦＣＷＧを含むニトロセルロース膜で行った免疫ブロット法の結果である。ＦＣＷＧ抗原を含むＦＧ−ニトロセルロース膜は、シュワルツ溶液で染色された。ＰＭは、分子量を示す。無接種群（ａ及びｄ）、ＣＷＣが接種された群（ｂ及びｅ）、及びＨＣＷＧが接種された群（ｃ及びｆ）であって、５回目のＩＰ後の９日後に採取され（ａ，ｂ及びｃ）、又は６回目のＩＰ後に採取され（ｄ，ｅ及びｆ）、１／２００に希釈された血清を、抗原ＦＣＷＧを含むニトロセルロースストリップとともに４℃で一晩処理した。ｇ及びｈ）免疫ブロット法は、無接種のウサギ（ｇ）を、１／１００に希釈された抗原Ｆで免疫したウサギ（ｈ）から採取された血清で行われた。１／１０００に希釈されたプロテインＧ−ＨＲＰ複合体を使用して、４−クロロナフトールに曝露した。図３−Ｅは、ＨＣＷＧ群のマウスからの血清を有するランブル鞭毛虫の免疫蛍光である。ａ）は倍率２０倍での光学顕微鏡による観察であり、ｂ）は、倍率２０倍での紫外線顕微鏡による観察である。矢印は、ランブル鞭毛虫の嚢胞を示す。 フラグメントＣＰ１２を含むコンストラクトを用いて行われたデモンストレーションの結果である。図４−Ａは、クマシーブルーで染色された、トリス−トリシンゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥである。ＰＭは、予め染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ標準（バイオラッド社）マーカーである。（ａ）ＣＰ１２のフラクション１，２及び３は、Ｎｉ−ＮＴＡカラムから回収された。（ｂ）ＨＣＰ１２のフラクション１及び２は、Ｎｉ−ＮＴＡカラムから回収された。（ｃ）ＦＣＰ１２のフラクション１及び２は、Ｎｉ−ＮＴＡカラムから回収された。図４−Ｂは、ＣＰ１２，ＨＣＰ１２が接種されたＣＤ１マウス（ＣＰ１２群、ＨＣＰ１２群）及び無接種のマウス（無接種群）から採取された血清を用いたＥＬＩＳＡの吸光度である。値は、各群で使用された３匹のＣＤ１マウスにおける吸光度の平均値を示す。ＣＤ１マウスは、定期的に接種され、表２に記載されたプロトコルに従って、定期的に血清の採取が行われた。ａ）組換え抗原ＣＰ１２を含むプレートで得られた結果である。ｂ）組換え抗原ＨＣＰ１２を含むプレートで得られた結果である。図４−Ｃは、組換え抗原ＦＣＰ１２を含むＦＣ−ニトロセルロース膜で行った免疫ブロット法の結果である。抗原ＦＣＰ１２を含むニトロセルロース膜は、シュワルツ溶液で染色された。ＰＭは、分子量を示す。無接種群（ｇ，ｈ及びｉ）、ＣＰ１２が接種された群（ｄ，ｅ及びｇ）、ＨＣＰ１２が接種された群（ａ，ｂ及びｃ）であって、８回目のＩＰの後に採取された血清を、１／１０００に希釈し、抗原ＦＣＰ１２を含むニトロセルロースストリップとともに４℃で一晩処理した。１／１０００に希釈されたプロテインＧ−ＨＲＰ複合体を使用して、４−クロロナフトールに曝露した。白い矢印は、抗原Ｆに対して免疫を有したウサギからの血清を用いた免疫ブロット法により決定された抗原ＦＣＰ１２の位置を示す。図４−Ｄは、倍率２０倍でのタンパク質ＨＣＰ１２の免疫を有するマウスの血清中のクリプトスポリジウムの免疫蛍光である。 フラグメントＢＧを含むコンストラクトで行われたデモンストレーションの結果である。図５−Ａは、クマシーブルーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥトリス−トリシンゲルである。ＰＭは、予め染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ標準（バイオラッド社）マーカーである。ウェルＦ１，Ｆ２は、カラムＮｉ−ＮＴＡから回収されたＢＧのフラクション１，２である。ウェルＦ４，Ｆ５は、カラムＮｉ−ＮＴＡから回収されたＨＢＧのフラクション１，２である。図５−Ｂは、ＨＢＧが接種されたＣＤマウス１（ＨＢＧ群）及び無接種のマウス（無接種群）から採取された血清で行われたＥＬＩＳＡの吸光度である。値は、３匹のＣＤ１マウスの吸光度の平均値を示す。ＣＤ１マウスは、定期的に接種され、表２に記載されたプロトコルに従って、定期的に血清の採取が行われた。図５−Ｃは、組換え抗原ＢＧを含むニトロセルロース膜を用いて行った免疫ブロット法の結果である。抗原ＢＧを含むＢＧ−ニトロセルロース膜は、シュワルツ溶液で染色された。ＰＭは、分子量を示す。無接種群（ｄ，ｅ及びｆ）、ＨＢＧが接種された群（ａ，ｂ及びｃ）の７回目のＩＰ後に採取され、１／１０００に希釈された血清を、抗原ＢＧを含むニトロセルロースストリップとともに４℃で一晩処理した。１／１０００に希釈されたプロテインＧ−ＨＲＰ複合体を用い、４−クロロナフトールに曝露した。図５−Ｄは、ＨＢＧ群のマウスの血清を用いたランブル鞭毛虫の免疫蛍光である。ａ）は倍率４０倍での通常の顕微鏡による観察であり、ｂ）は倍率４０倍での紫外線顕微鏡による観察である。矢印は、ランブル鞭毛虫の２つの栄養体を示す。 フラグメントＥｎｔを含むコンストラクトで行われたデモンストレーションの結果である。図６−Ａは、ＨＥｎｔが接種されたＣＤ１マウス（ＨＥｎｔ群）及び無接種のマウス（無接種群）から採取された血清で行われたＥＬＩＳＡの吸光度である。値は、３匹のＣＤ１マウスの吸光度の平均値を示す。ＣＤ１マウスは、定期的に接種され、表２に記載されたプロトコルに従って、定期的に血清の採取が行われた。図６−Ｂは、組換え抗原Ｆｅｎｔを含むニトロセルロース膜で行った免疫ブロット法の結果である。抗原Ｆｅｎｔを含むＦｅｎｔ−ニトロセルロース膜は、シュワルツ溶液で染色された。ＰＭは、分子量を示す。無接種群（ａ，ｂ及びｃ）及びＨＥｎｔを接種した群（ｄ，ｅ及びｆ）から採取され１／１０００に希釈された血清を、抗原ＦＥｎｔを含むニトロセルロースストリップとともに４℃で一晩処理した。１／１０００に希釈されたプロテインＧ−ＨＲＰ複合体を用い、４−クロロナフトールに曝露した。白い矢印は、抗原Ｆに対する免疫を有するウサギからの血清を用いたＦＥｎｔ免疫ブロット法により決定された抗原の位置を示す。図６−Ｃは、倍率２０倍での、ＨＥＮＴで免疫されたマウスの血清を用いた赤痢アメーバの栄養体での免疫蛍光である。 フラグメントＰｇｓｐを含むコンストラクトで行われたデモンストレーションの結果である。図７−Ａは、ＨＰｆｓｐを接種したＣＤ１マウス（ＨＰｆｓｐ群）及び無接種のマウス（無接種群）から採取された血清で行われたＥＬＩＳＡの吸光度である。値は、３匹のＣＤ１マウスの吸光度の平均値を示す。ＣＤ１マウスは、定期的に接種され、表２に記載されたプロトコルに従って、定期的に血清の採取が行われた。図７−Ｂは、組換え抗原ＦＰｆｓｐを含むニトロセルロース膜で行われた免疫ブロット法の結果である。無接種群（ｃ）及びＨＰｆｓｐが接種された群（ｄ及びｆ）であって、６回目のＩＰ後に採取され（ｄ）又は７回目のＩＰ後１４日後に採取され（ｆ）、１／２００に希釈された血清を、抗原ＦＰｆｓｐを含むニトロセルロースストリップとともに４℃で一晩処理した。ｂは、無接種のウサギから採取された血清で行われた免疫ブロットであり、ａは、１／１００に希釈された抗原Ｆ（ｂ）に対する免疫を有したウサギからの血清で行われた免疫ブロットである。１／１０００に希釈されたプロテインＧ−ＨＲＰ複合体を用いて、４−クロロナフトールに曝露した。 フラグメントＩＬ５を含むコンストラクトで行われたデモンストレーションの結果である。図８−Ａは、ＨＩＬ５を接種したＣＤ１マウス（ＨＩＬ５群）及び無接種のマウス（無接種群）から採取された血清で行われたＥＬＩＳＡの吸光度である。値は、３匹のＣＤ１マウスの吸光度の平均値を示す。ＣＤ１マウスは、定期的に接種され、表２に記載されたプロトコルに従って、定期的に血清の採取が行われた。図８−Ｂは、組換え抗原ＦＩＬ５を含むニトロセルロース膜で行われた免疫ブロット法の結果である。抗原ＦＩＬ５を含むＦＩＬ５−ニトロセルロース膜は、シュワルツ溶液で染色された。ＰＭは、分子量を示す。無接種群（ａ，ｂ及びｃ）及びＨＩＬ５を接種した群（ｄ及びｅ）から採取され、１／１０００に希釈された血清を、抗原ＦＩＬ５を含むニトロセルロースストリップとともに４℃で一晩処理した。１／１０００に希釈されたプロテインＧ−ＨＲＰ複合体を用いて、４−クロロナフトールに曝露した。白い矢印は、抗原Ｆに対する免疫を有するウサギからの血清で行われた免疫ブロット法で決定された、抗原ＦＩＬ５の位置を示している。 フラグメントＴｏｘｏを含むコンストラクトで行われたデモンストレーションの結果である。図９−Ａは、Ｔｏｘｏを接種したＣＤ１マウス（ＨＴｏｘｏ群）及び無接種のマウス（無接種群）から採取された血清で行われたＥＬＩＳＡの吸光度である。値は、３匹のＣＤ１マウスの吸光度の平均値を示す。ＣＤ１マウスは、定期的に接種され、表２に記載されたプロトコルに従って、定期的に血清の採取が行われた。図９−Ｂは、組換えＴｏｘｏ抗原を含むニトロセルロース膜で行われた免疫ブロット法の結果である。抗原ＢＧを含むＴｏｘｏ−ニトロセルロース膜は、シュワルツ溶液で染色された。ＰＭは、分子量を示す。無接種群（ａ，ｂ及びｃ）及びＨＴｏｘｏを接種した群（ｄ，ｅ及びｆ）から採取され、１／１０００に希釈された血清を、抗原ＴｏｘｏＯＮを含むニトロセルロースストリップとともに４℃で一晩処理した。１／１０００に希釈されたプロテインＧ−ＨＲＰ複合体を用いて、４−クロロナフトールに曝露した。 フラグメントＣＤ４を含むコンストラクトで行われたデモンストレーションの結果である。図１０−Ａは、ＨＣＤ４を接種したＣＤ１マウス（ＨＣＤ４群）及び無接種のマウス（無接種群）から採取された血清で行われたＥＬＩＳＡの吸光度である。値は、３匹のＣＤ１マウスの吸光度の平均値を示す。ＣＤ１マウスは、定期的に接種され、表２に記載されたプロトコルに従って、定期的に血清の採取が行われた。図１０−Ｂは、組換え抗原ＣＤ４を含むニトロセルロース膜で行われた免疫ブロット法の結果である。抗原ＣＤ４を含むＣＤ４−ニトロセルロース膜は、シュワルツ溶液で染色された。ＰＭは、分子量を示す。無接種群（ａ）及びＨＣＤ４を接種した群（ｂ）から７回目のＩＰ後１４日後に採取され、１／５００に希釈された血清を、抗原ＣＤ４を含むニトロセルロースストリップとともに４℃で一晩処理した。１／１０００に希釈されたプロテインＧ−ＨＲＰ複合体を用いて、４−クロロナフトールに曝露した。 フラグメントＰＡＬを含むコンストラクトで行われたデモンストレーションの結果である。図１１−Ａは、ＨＰＡＬを接種したＣＤ１マウス（ＨＰＡＬ４群）及び無接種のマウス（無接種群）から採取された血清で行われたＥＬＩＳＡの吸光度である。値は、３匹のＣＤ１マウスの吸光度の平均値を示す。ＣＤ１マウスは、定期的に接種され、表２のプロトコルに従って、血清の採取が定期的に行われた。図１１−Ｂは、組換え抗原ＨＰＡＬを含むニトロセルロース膜で行われた免疫ブロット法の結果である。抗原ＨＰＬＡを含むＨＰＡＬ−ニトロセルロース膜は、シュワルツ溶液で染色された。ＰＭは、分子量を示す。無接種群（ａ，ｂ及びｃ）及びＨＰＡＬを接種した群（ｄ，ｅ及びｆ）から４回目のＩＰ後に採取され、１／４０００に希釈された血清を、抗原ＨＰＡＬを含むニトロセルロースストリップとともに４℃で一晩処理した。１／１０００に希釈されたプロテインＧ−ＨＲＰ複合体を用いて、４−クロロナフトールに曝露した。 フラグメントＬＥＣを含むコンストラクトで行われたデモンストレーションの結果である。図１２−Ａは、ＨＬＥＣを接種したＣＤ１マウス（ＨＬＥＣ群）及び無接種のマウス（無接種群）から採取された血清で行われたＥＬＩＳＡの吸光度である。値は、３匹のＣＤ１マウスの吸光度の平均値を示す。ＣＤ１マウスは、定期的に接種され、表２のプロトコルに従って、血清の採取が定期的に行われた。図１２−Ｂは、組換え抗原ＨＬＥＣを含むニトロセルロース膜で行われた免疫ブロット法の結果である。抗原ＨＬＥＣを含むＨＬＥＣ−ニトロセルロース膜は、シュワルツ溶液で染色された。ＰＭは、分子量を示す。無接種群（ａ，ｂ及びｃ）及びＨＬＥＣを接種した群（ｄ及びｅ）から６回目のＩＰ後に採取され、１／１０００に希釈された血清を、抗原ＨＬＥＣを含むニトロセルロースストリップとともに４℃で一晩処理した。１／１０００に希釈されたプロテインＧ−ＨＲＰ複合体を用いて、４−クロロナフトールに曝露した。

〔発明の詳細な説明〕
アプリケーションを検証するために記述された記載は、一般的な研究目的に使用されるベクターｐＱＥ（キアゲン社）の使用に基づくものである。種々のコンストラクトは、大腸菌ｐＱＥ（キアゲン社）における発現ベクターにサブクローニングされ、６つのヒスチジンのＮ末端配列に続いて組換えタンパク質が発現され産生される結果となる。この産生は、大腸菌Ｍ１５［ｐＲＥＰ４］（キアゲン社）で行われ、製造業者（カストロ、２００１年、シルバら、２００４年）によって提供されたプロトコルに基づいて、ＮＩＮＴＡアガロースのカラム（キアゲン社）を用いた親和性クロマトグラフィーによるその単離を可能とする。全ての産生物がこのシステムを用いて作られ、より効果的な単離を可能とするために変性条件下で、組換え抗原の単離が行われた。

目的のタンパク質の産生及び単離のために、免疫系へのフラグメントＨの露出を危うくすることのない、組換えタンパク質の任意の発現系及び単離を使用することができる。コンストラクトを取得するために使用される系は、実験的なデモンストレーションに必要とされる大量のタンパク質を得るために研究で使用される手段と見なされるべきである。

同様の方法論は、タンパク質産生の他の系、特に特定の菌類又は真核生物の系で使用することができる。

その結果は、ＦＨ８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １及び２）からのフラグメントＨを用いる実施例に言及する。

本発明の原理の一つは、具体的には、ポリペプチドの配列が免疫原として使用されるようとする前に、ＦＨ８のＮ末端フラグメントの配列に対応するフラグメントＨの付加、分子生物学のプロセスによるポリペプチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２の付加により特徴づけられる。この構造は、分子生物的手法によってこの配列を含有することにより行うことができる。前記分子生物的手法は、適切な制限酵素認識部位でこれらのフラグメントを付加するための適切な制限酵素の使用、記述されるデモンストレーションで使用される方法、ＰＣＲ産生物への、目的の配列（リンカー）を有するＤＮＡフラグメントの付加等の他のプロセス、又は他のアプローチを含む。フラグメントＨの縮小された増幅物（reduced amplitude）は、目的のポリペプチドとの融合のための種々の手順（strategies）に使用することができる。

コンストラクトのためのもう一つの可能性は、製造されるポリペプチドＦＨ８の配列に対応するポリペプチドを用いた融合タンパク質の調製である。ＦＨ８への挿入のプロセスは、制限酵素の使用を含む分子生物学的手法、特に、デモンストレーションのプロセスで使用される方法論を用いて行うことができる。

本発明は、異なる免疫原性的特徴を備える種々のフラグメント及びタンパク質に適用される。フラグメント及びタンパク質は、ＣＷＧ、ＣＤ４のような免疫原性が全く無いか乏しいものとして記述されるフラグメント又はタンパク質、又は、その特徴により、ＩＬ５、Ｐｆｓｐ及びＥｎｔのようなその分子量が免疫原性であるものより小さいものを含むフラグメント、ＰＡＬのように非常に免疫原性であるとして記述されるタンパク質、ＣＰ１２及びＬＥＣのように中程度の免疫原性であるタンパク質及びタンパク質フラグメント、同様にＢＧ及びＴｏｘｏのような未知の特徴を備える他の対象物を含む。また、実験を通して、マウスに投与するタンパク質濃度、投与の間隔を変化させた、種々の異なるプロトコルを適用した。これらの種々のプロトコルは、発明の汎用性を実証するために使用された。また、ＬＥＣの場合には変性条件下で、残りのフラグメント及びタンパク質の場合には非変性条件下で、抗原を投与する可能性を評価した。行われた全てのデモンストレーションで、実験モデルとしてマウスを使用し、腹腔内への抗原の投与を行った。対象となるＣＷＰ，ＩＬ５，Ｅｎｔ，Ｔｏｘｏ，ＢＧ及びＣＰ１２に対する抗体の産生もまた、ウサギでの皮下投与によって評価され、同様の結果を得た（図示せず）。抗原は、ＮＩＮＴＡアガロース樹脂（キアゲン社）により同一の条件を用いる変性条件下で、産生され単離された。抗原は、ＰＢＳに対して透析され、０．２２μフィルターでの濾過により滅菌された後に、接種のために調製された。

免疫原性のレベルでフラグメントにより発揮される特定の効果を実証するために、２つの対象物を用いた。

ＣＷＧ：ＣＷＧは、ランブル鞭毛虫嚢胞のＣＷＰタンパク質（嚢胞壁タンパク質）である。作業の完了時に、元の配列は１０８９ｂｐを有していて、増幅される領域が５２７ｂｐ〜９３１ｂｐの領域である４２７ｂｐのＣＷＰ２の配列の一部を使用した（ジェンバンクアクセスＮｏ．ＸＭ＿００１７１０１９０）。フラグメントは、ＰＣＲにより増幅され、ベクターｐＱＥ（ＣＷＰ）にサブクローニングされた。ＣＷＰが後に続くフラグメントＨを含むとともに、ＣＷＰの配列に融合されたＦＨ８の配列（Ｆｈ８ＣＷＰ）を含むコンストラクトを調製した。接種材料は、表２−Ａ、表２−Ｂ、表２−Ｃ及び表２−Ｄ（以下、表２と略記する）に示す間隔で同量のタンパク質（５０μｇ）とともに投与された。その結果、５回目のＩＰ後、ＨＣＷＰ群においてのみ可視的に抗ＣＷＰの有意なレベルの産生が示され、その存在はタンパク質の最終接種後８３日間を含む実験の残りの期間を通して維持された。抗原Ｆｈ８ＣＷＧを用いて行われたブロットは、ＥＬＩＳＡの結果を裏付け（confirm）、産生された抗体の特異性を実証する。寄生虫を用いた免疫蛍光検査法は、産生された抗体がこの構造の細胞壁に存在する天然タンパク質を認識することを示した。

ＣＰ１２：ＣＰ１２は、クリプトスポリジウム・パルバムの表面タンパク質である。本発明で使用したフラグメントＣＰ１２（ジェンバンクＮｏ．ＸＭ＿６２５８２１）は、２１３ｂｐを有していて、膜貫通領域を有していないタンパク質ＣＰ１２の塩基配列に対応する。フラグメントは、ＰＣＲにより増幅され、ベクターｐＱＥにサブクローニングされる。ＣＰ１２が後に続くフラグメントＨを含むコンストラクトを調製した。抗原は、ＮＩＮＴＡアガロース樹脂（キアゲン社）により同一の条件を用いる変性条件下で、産生され単離された。接種材料は、表２に示す間隔で同量のタンパク質（２０μｇ）とともに投与された。結果は、ＣＰ１２群及びＨＣP１２群における抗原の産生において、抗原の産生での有意な増加を示し、強度及び速度において、これらのレベルは実験の期間を通して、有意に増加した。Ｆｈ８ＣＰ１２を用いて行われたブロットは、ＥＬＩＳＡの結果を裏付け、産生された抗体の特異性を示している。寄生虫を用いた免疫蛍光検査法は、産生された抗体が、この構造に存在する天然タンパク質を認識することを示した。

残りの対象物は、免疫応答の存在を実証するためにＨタグを含むコンストラクトで免疫される群が準備された。例えば、以下のように、フラグメントは、他の機関により提供されたフラグメントＬＥＣを除いてＰＣＲにより増幅されていて、対象物のフラグメントが後に続くフラグメントＦを含むｐＱＥベクターにサブクローニングされた。そのようなフラグメントを得るための条件を、表１−Ａ、表１−Ｂ及び表１-Ｃ（以下、表１と略記する）に示す。

ＢＧ：サイズが８５０ｂｐであって（６９１ｂｐ〜７８７ｂｐの欠失）（ジェンバンクアクセスＮｏ．Ｘ８５９８５）、３３ｋＤａのタンパク質をエンコードする、ランブル鞭毛虫のβ−Ｇｉａｒｄｉｎａ遺伝子（ジェンバンクアクセスＮｏ．Ｘ８５９８５）の完全な配列をクローニングした。接種材料は、表２に示す間隔で同量のタンパク質（２０μｇ）とともに投与された。その結果は、３回目のＩＰ後に有意な増加を示し、４回目のＩＰ以降で一定になった。タンパク質ＢＧで行われたブロットは、産生された抗体の特異性を裏付ける。抗体価の維持は、最終接種後４７日後であっても検出された。寄生虫を用いた免疫蛍光試験は、産生された抗体がこの構造の細胞壁に存在する天然タンパク質を認識することを示した。

Ｅｎｔ：実験のアンプリコンは、５ｋＤａのタンパク質をエンコードする１６３ｂｐのサイズを有していて、赤痢アメーバ嚢胞壁の特定の糖タンパク質ヤコブ（Jacob）由来の（from）４５６ｂｐのサイズを有する遺伝子（ジェンバンクアクセスＮｏ．ＸＭ＿６４５８２５）の２９１ｂｐ〜４５３ｂｐの領域である。接種材料は、表２に示す間隔で同量のタンパク質（５０μｇ）とともに投与された。その結果は、４回目のＩＰ以降で有意な増加を示した。タンパク質Ｆｈ８Ｅｎｔで行われたブロットは、産生された抗体の特異性を裏付ける。また、最終接種後９０日後であっても抗体価の維持を確認することができた。寄生虫を用いた免疫蛍光検査法は、産生された抗体がこの構造の細胞壁に存在する天然タンパク質を認識することを示した。

Ｐｆｓｐ：本試験では、ｆａｌｃｉｐａｉｎａ−１配列のごく一部分（１６５ｂｐ）を用いた。前記ｆａｌｃｉｐａｉｎａ−１は、３Ｄ７熱帯熱マラリア原虫栄養体のシステインプロテアーゼ前駆体（１４２３ｂｐ〜１５８７ｂｐ）（ジェンバンクアクセスＮｏ．ＸＭ＿００１３４８６９１．１）の配列に挿入される。接種材料は、表２に示す間隔で同量のタンパク質（５０μｇ）とともに投与された。その結果は、４回目のＩＰ以降で有意な増加を示し、７回目のＩＰで最大値を示した。最終接種後８２日後に、フラグメントＰｆｓｐに対する特異的抗体の存在を確認することができる。タンパク質Ｆｈ８Ｐｆｓｐで行われたブロットは、産生された抗体の特異性を裏付ける。

ＩＬ５：ヒトインターロイキン５は、１３４アミノ酸（ジェンバンクＮｏ．ＢＣ０６９１３７．１）をコードする８１６ｂｐの塩基配列を有する、造血成長因子である。ＩＬ５の評価に使用されるフラグメントは、ＩＬ５のごく一部分であり、前記ＩＬ５は、４８アミノ酸をコードするＩＬ５の５’末端のエクソンに対応する、１４４ｂｐから成る。接種材料は、表２に示す間隔で同量のタンパク質（２０μｇ）とともに投与された。その結果は、４回目のＩＰ以降で有意な増加を示した。タンパク質Ｆｈ８ＩＬ５で行われたブロットは、産生された抗体の特異性を裏付ける。

Ｔｏｘｏ：Ｔｏｘｏタンパク質は、４９９アミノ酸（ジェンバンクＮｏ．ＥＵ８５１８６７．１）をコードする１８４６ｂｐのトキソプラズマ原虫のオーシストの細胞壁のタンパク質である。Ｔｏｘｏフラグメントは、２８７５ｂｐ〜３２３８ｂｐの間のエクソン２に対応している。接種材料は、表２に示す間隔で同量のタンパク質（２０μｇ）とともに投与された。その結果は、第４のＩＰ以降で有意な増加を示した。タンパク質Ｔｏｘｏで行われたブロットは、産生された抗体の特異性を裏付ける。

ＣＤ４：ＣＤ４タンパク質は、ヨーロピアンシーバス（Dicentrarchus labrax）のリンパ球の細胞壁の受容体である（ジェンバンクＮｏ．ＡＭＢ８４９８１２．１）。ＣＤ４フラグメントは、１９３ｂｐ〜７１４ｂｐの間のこの受容体の２つのドメインに対応している。接種材料は、表２に示す間隔で同量のタンパク質（３０μｇ）とともに投与された。その結果は、４回目のＩＰ以降で有意な増加を示した。タンパク質ＣＤ４で行われたブロットは、産生された抗体の特異性を裏付ける。

ＰＡＬ：レジオネラニューモフィラのＰＡＬタンパク質（ペプチドグリカン関連リポタンパク質前駆体）は、この細菌の細胞壁由来のタンパク質である（ジェンバンクＮｏ．ＹＰ００１２５０８２４）。ＰＡＬは、完全タンパク質に対応している。接種材料は、表２に示す間隔で同量のタンパク質（３０μｇ）とともに投与された。その結果は、２回目のＩＰ以降で有意な増加を示した。タンパク質ＰＡＬで行われたブロットは、産生された抗体の特異性を裏付ける。

ＬＥＣ：８４６ｂｐを有し、Artocarpus incisa由来のレクチンのＤＮＡフラグメントは、酵素ＳａｃＩ及びＫｐｎＩで切断される部位を含んでいた。この抗原は、非変性の状態であるときに潜在的な赤血球凝集活性であるので、変性条件下でタンパク質の接種材料の調製を進めた。最大量の尿素（最終濃度１０ｍＭ未満）を除去するために、５０ｍＭの尿素を含むＰＢＳに対して透析し、サンプル調製時に、抗原をＰＢＳで希釈し、０．２２μのフィルターで濾過した。接種材料は、表２に示す間隔で同量のタンパク質（１２．５μｇ）とともに投与された。その結果は、４回目のＩＰ以降で有意な増加を示した。タンパク質ＨＬＥＣで行われたブロットは、産生された抗体の特異性を裏付ける。

上述の実施例では、応答の評価は、対応する抗原を用いて、ＥＬＩＳＡにより行われた。ブロットの手順では、その産生がより効率的であった抗原に対する応答を評価する。ポリマーを形成する可能性があるので、タグＦＨ８を含む組換えタンパク質を用いて行われるブロットでは、ＦＨ８に対する特異的ポリクローナル抗体を用いて、組換えタンパク質の位置決めを行った。ほとんどの場合、このフラグメントに対する応答の評価のために、フラグメントＨ（通常は、組換えＦＨ８）を有する抗原を含むニトロセルロースストリップを、ブロットに含めた。そして、Ｆｈ８ＣＷＰを接種した群で得られた応答を別にすれば、抗Ｈ抗体（antibodies anti-H）の有意なレベルでの存在を検出しなかった。

上記実施例では、１０ｍＭ尿素を含むＰＢＳで接種を行ったＨＬＥＣを除いて、接種は、常にＰＢＳのみで希釈された抗原によって行われた。

〔抗原及びフラグメントＦＨ８ Ｈの特性評価〕
抗原ＦＨ８は、予め単離され、本発明者のリスト（非特許文献２、非特許文献９及び非特許文献３参照）（図１）中の要素により特徴づけられた。

Ｆｈ８の単離は、肝蛭ｃＤＮＡバンク（図１）のスクリーニングにより実施された。クローンは、８ｋＤａの計算分子量を有する６９アミノ酸のポリペプチドをコードしていて、ＦＨ８又はｆａｓｃｉｏｌｉｎａと命名されている（ジェンバンクＮｏ．ＡＦ２１３９７０）。

組換えタンパク質ＦＨ８は、ベクターｐＱＥを有する大腸菌発現系で、高レベルのタンパク質（培養液１Ｌ当たり５ｍｇより多い）で産生される。ＦＨ８突然変異体を用いた研究は、この抗原のＮ−末端配列は、タンパク質の安定性において重要な役割を果たすという仮説を導いた。この仮説の実証は、特許文献３に記載された発明に由来する。もうひとつの特徴はその高い免疫原性であった。この機能は、肝蛭の成虫から分泌され又は排泄された抽出物中に存在するカルシウム結合タンパク質、ＦＨ２２のファミリー（ＥＭＢＬ番号ＡＪ００３８２１、ＥＭＢＬ番号ＡＪ００３８２２）のもう一つの条件に拡張される。両方の抗原は高い特定の抗体価を有する免疫応答を誘導することができることが判明した（非特許文献２及び非特許文献９参照）。これらの結果は、抗体産生を目的とした組換えタンパク質産生のためのタグとしての利用を示唆した。フラグメントＨが抗原の安定性に不可欠であり、他の無関係なタンパク質又はフラグメントへのこのフラグメントの付加はタンパク質の産生を増加することができるというデモンストレーションは、おそらく、融合タンパク質の安定性を向上させることによるものであり、同じ理由で、フラグメントＨの付加は抗原の免疫原性を増加させるという仮説を示唆した。この推定は、タンパク質の安定性は、多くの場合、その免疫原性に関連しているという事実から明らかになる。この仮説は、上述のデモンストレーションで裏付けられた。

〔使用された菌株〕
本研究では、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ（プロメガ社）及びプラスミドｐＱＥ３０（キアゲン社）のクローニングに、それぞれ、大腸菌ＸＬ１ Ｂｌｕｅ（ストラタジーン社）及び大腸菌Ｍ１５［ｐＲＥＰ４］（キアゲン社）を用いた。

タンパク質発現のために、大腸菌Ｍ１５［ｐＲＥＰ４］を用いた。

プラスミドＤＮＡは、キットウィザード（登録商標）プラスＳＶミニプレップＤＮＡ精製システム（プロメガ社）により、３７℃で一晩で成育された細菌培養液から、製造元から提供された指示に従って、単離され精製された。

〔コンストラクト〕
組換えタンパク質の免疫原性の誘導因子としての１１アミノ酸（フラグメントＨ）の構成要素を評価するために用いられた使用される構造の配列（layout of buildings）を、図２に示す。

図２に示されるコンストラクトは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により得られ、以下に示すように、表１に示されるｐＧＥＭ及びｐＱＥにクローニングされた。

免疫応答を評価するために使用される他の抗原を生じるコンストラクトは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得られ、表１に示されるｐＧＥＭ及びｐＱＥにクローニングされた。

残りのコンストラクトは、後述のサブクローニングの手法により得られた。

〔ＰＣＲ〕
ＰＣＲに用いたプライマーは、表１に記載されている。

制限部位ＢａｍＨＩ及びＳａｃＩを含むフラグメントＨ及びＦｈ８ＲＳａｃを得るために、ＰＣＲ反応のテンプレートとして、ポリペプチドＦＨ８をコードする遺伝子を含むｐＱＥ３０ベクターを用いた（非特許文献２及び非特許文献９参照）。ＰＣＲ反応は、９５℃１分間の変性を行い、これに続いて、９４℃４５秒間の変性、５０℃３０秒間のアニーリング、７２℃４５秒間の重合を伴う増幅処理を３０サイクル行った。さらに、７２℃１１分間の重合を行った。

免疫応答を産生するためのＨフラグメントを有する無関係なポリペプチドの融合によって調製された組換えタンパク質の能力を、課題のタンパク質又はフラグメントに対する特異的抗体の出現を尺度として評価するために選択されたフラグメント（ＣＷＧ，ＣＰ１２，ＢＧ，Ｅｎｔ，ＰＦｓｐ，ＩＬ５，Ｔｏｘｏ，ＣＤ４，ＰＡＬ及びＬＥＣ）は、ＰＣＲにより増幅された。このＰＣＲ反応はまた、制限酵素ＳａｃＩ及びＫｐｎＩをそれらのフラグメントに付加した。

種々のフラグメントの調製に用いられるＤＮＡテンプレートと同様に、ＰＣＲ反応は、表１に記載の条件下で行われた。ゲノムＤＮＡを調製するために、ＤＮＡを抽出するためのキット、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡミニキット（キアゲン社）が、製造業者のプロトコルに従って、用いられた。全てのＰＣＲ反応に用いられるサーマルサイクラーは、Ｍｙ Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）サーマルサイクラー（バイオラッド社）であった。

実施されたＰＣＲ反応の混合物は、サンプル１μＬ（テンプレートＤＮＡ）と、塩化マグネシウム２μＬと、ｄＮＴＰ（ロシュ社）１μＬと、フォワードプライマー１μＬと、リバースプライマー１μＬと、Ｔａｑポリメラーゼバッファー（サーモサイエンティフィック社）５μＬと、１反応あたり１ユニットのＴａｇポリメラーゼ（サーモサイエンティフィック社）と、最終体積を５０μＬにするための蒸留水とからなる。

〔記載された実施例で作成されたコンストラクト〕
ＰＣＲによる産物は、ｐＧＥＭベクターにクローニングされ、制限酵素ＳａｃＩ及びＫｐｎＩを用いた酵素処理の後に、ベクターｐＱＥ３０にサブクローニングされた。ｐＱＥ３０は、ＳａｃＩ及びＫｐｎＩで酵素処理されるフラグメントH（ｐＱＥＨ）又はフラグメントＦＨ８（ｐＱＥＦ）を含んでいる。

〔アガロースゲルからのＤＮＡの抽出及び精製〕
ゲル電気泳動で得られた制限酵素を用いた酵素処理を行うことにより得られたＰＣＲによる産物及びＤＮＡバンドを単離するために、製造元によって記載されている手順に従って、ｉｌｌｕｓｔｒａＴＭ ＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ＆ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ精製キット（ＧＥヘルスケア社）を用いた。

〔ベクターｐＧＥＭへの連結反応〕
ベクターｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙへの結合反応は、ＤＮＡサンプル（ＰＣＲによる産生又は制限酵素による酵素処理）３μＬと、ベクターｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ（プロメガ社）１μＬと、酵素バッファー２Ｘ ＤＮＡ リガーゼ（プロメガ社）５μLと、酵素Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼ（プロメガ社）１μＬとを混合する（最終体積１０μＬ）ことにより行われた。この反応は、室温で一晩又は３７℃１時間３０分で行った。

〔制限酵素を用いた酵素処理による形質転換体の裏付け〕
ベクターｐＧＥＭへのリガーゼ反応の後、産生物を有する大腸菌ＸＬ１ Ｂｌｕｅを形質転換させた。菌体を、Ｌ培地／アンピシリン／Ｘ−Ｇａｌ／ＩＰＴＧのプレート上に塗布し、３７℃で一晩培養した。形質転換されたクローンは、Ｌ培地／アンピリシンの液体培地を調製するために、その後、大腸菌からのＤＮＡプラスミドを抽出するために使用された。

対象とされるＤＮＡフラグメントの確認は、制限酵素ＥｃｏＲＩ（プロメガ社）を用いた酵素処理により行われた。各反応のために、プラスミドＤＮＡ７μＬと、Ｈ １０Ｘ バッファー２μＬと、ＥｃｏＲＩ１μＬとを含み、最終体積が１０μＬである混合物を用いた。前記反応は、３７℃２〜３時間で起こり、酵素処理の結果は、適切なパーセンテージ（ｗ／ｖ）のアガロースゲルで示された。

〔ベクトルｐＱＥへの連結反応〕
制限酵素を用いた酵素処理によって生じる挿入物は、ベクターｐＱＥ２μＬと、１０Ｘリガーゼバッファー（プロメガ社）１μＬと、酵素Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（プロメガ）１μＬとを混合することにより、ベクターｐＱＥ，ｐＱＥＨ又はｐＱＥＦｈ８へ挿入された。この反応は、室温で一晩又は３７℃１時間３０分間で起こった。

ベクターに挿入物を連結した後、大腸菌Ｍ１５［ｐＲＥＰ４］を反応生成物で形質転換した。その後、菌体を、Ｌ培地／アンピシリン／カナマイシンのプレート上に塗布し、３７℃で一晩培養した。形質転換体を、Ｌ培地／アンピシリン／カナマイシンの液体培地に移し、その後、大腸菌からプラスミドＤＮＡを抽出するのに使用した。

形質転換体の確認は、制限酵素ＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩ（プロメガ社）を用いた酵素処理により行われた。まず、ＫｐｎＩを用いた酵素処理を行った。酵素処理は、プラスミドＤＮＡ２６μＬと、Ｊ １０Ｘバッファー（プロメガ社）３μＬと、ＫｐｎＩ（プロメガ社）１μＬとを最終体積３０μＬになるように混合することにより行われた。酵素処理物１０μＬをアガロースゲルで分析し、その後、最初の反応の残部に、１０XバッファーＫ（プロメガ社）とＢａｍＨＩを付加することにより、ＢａｍＨＩを用いた第２の酵素処理を行った。酵素処理の結果は、適切なパーセンテージ（ｗ／ｖ）のアガロースゲルで視覚化する。

〔コンストラクトの配列決定〕
ｐＧＥＭ及びｐＱＥベクターへの挿入により得られたコンストラクトは、Eurofins MWG Operon（ドイツ）による配列決定により確認された。

〔組換えタンパク質の発現及び単離〕
前培養液２００ｍＬは、撹拌しながら３７℃で一晩培養され、飽和培養液１００ｍＬと、１００ｇ／ｍＬのアンピシリン、５０ｇ／ｍＬのカナマイシン及び１ｍＭのＩＰＴＧを含むＬＢ培地９００ｍＬとを含む人工培養液２Ｌを準備するのに用いられた。５時間培養した後、４℃で２０分間、４０００ｒｐｍで遠心分離を行うことにより、菌体を採集した。菌体溶解は、ｐＨ８．０の８Ｍ尿素４０ｍＬとともに一晩中撹拌しながら、菌体を処理することにより行われた。抽出物は、室温で１５分間、１３，０００ｒｐｍで遠心分離され、上清が集められた。取得後、上清はガラスウールカラムにより濾過され、ｐＨ８．０の８Ｍ尿素で予め平衡化された、Ｎｉ−ＮＴＡ（アマシャムバイオサイエンス社）のカラムに入れられた。

上清は、重力でカラムを通過せしめられ、前記カラムは、５ＣＶ（カラムボリューム）のｐＨ８．０の８Ｍ尿素緩衝液により洗浄された。溶出は、ｐＨ４．５の８Ｍ尿素緩衝液で行われ、画分（fraction）４ｍＬが採取された。溶出画分のタンパク質含有量を、ブラッドフォード法により定量し、以下のように、画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥトリス−トリシンで分析した。

〔タンパク質の定量〕
タンパク質の定量は、１：５に希釈されたタンパク質アッセイ試薬（バイオラッド社）を用いたブラッドフォード法により行われ、波長５９５ｎｍでの吸光度を測定した。検量線は、この試薬を含むウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の既知濃度の溶液における波長５９５ｎｍでの吸光度を測定することにより得られた。

〔接種の準備〕
ＨＬＥＣを除き、記述されるデモンストレーションに使用される組換えタンパク質は、８Ｍ尿素中の変性条件下で単離された。画分のタンパク質の定量及び分析の後、非発熱性水（nonpyrogenic water）で調製されたＰＢＳバッファーに対して透析を行った。透析の後、滅菌のために０．２μフィルターを用いて（非変性下で）タンパク質を濾過した。接種量は、滅菌非発熱性ＰＢＳ５００μＬとした。タンパク質の量は、異なるサンプル間で、それぞれの場合について、上述のように１０〜５０ｇの範囲で変化させて投与した。組換えタンパク質ＨＬＥＣは、８Ｍ尿素で調製され、そして、非発熱性水で調製された５０ｍＭ尿素を含むＰＢＳバッファーに対して透析され、その後、抗原は、３ｋＤａのカットオフを行うセントリコン（アミコン社）膜を用いて濃縮された。接種は、尿素濃度が１０ｍＭ未満であることを保証するために、濃縮されたタンパク質を適切な容積の非発熱性滅菌ＰＢＳで希釈することにより準備され、そして、０．２μ発熱性フィルターを用いて接種成分の濾過を行った。

〔マウスのテスト〕
本研究で行った実験は、チャールス・リバー社（バルセロナ）のＣＤ１マウスのモデルで行った。前記動物は、収容され、食べ物や飲み物を自由に摂取させた。動物の維持及びケアは、既存の指示に従って行った。

各群は３匹のマウスからなり、表２に記載されたプロトコルに従って、定期的に腹腔内投与を行った。表２に記載されたプロトコルに従って、尾静脈での採血が定期的に行われた。血液を採取した後、１０分間２５００ｒｐｍの遠心分離を行い、血清を得て、−２０℃に維持した。

〔ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥトリス−トリシンの電気泳動〕
採取した画分を分析するために用いられるトリス−トリシンゲルは、非特許文献８のトリス−トリシン系と、非特許文献５のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１９７０）とに基づく。前記系は、１５％分離ゲル（resolvent gel）と４％濃縮ゲル（packing gel）との２つのゲルが適用された。分離ゲルは、３０％アクリルアミド３．３ｍＬと、ゲル２．２０５ｍＬと、グリセロール７０５ｍＬと、水３６７．５ｍＬと、１０％ＰＳＡ１５０μＬと、ＴＥＭＥＤ９μＬとからなる。濃縮ゲルは、３０％アクリルアミド７００μＬと、ゲル１．２５ｍＬと、水３ｍＬと、１０％ＰＳＡ２００μＬと、ＴＥＭＥＤ５μＬとかなる。

使用した電気泳動システムは、ゲルから高い容器と低い容器との２つの容器（reservoirs）から構成されていて、各容器には、カソードバッファーとアノードバッファーがそれぞれ配置されていた。濃縮ゲルに対する電位差（ＤＤＰ）を１００Ｖとし、分離ゲルに対するＤＤＰを１５０Ｖとした。

ゲルに適用される前に、サンプル（未変性条件又は変性条件下にある）は、サンプルバッファートリス−トリシン１Ｘで処理された。自然条件下にあるサンプルは、ゲル上に載せられるまで４℃に維持された後、１００℃槽中に２分間置かれた。ゲルは、クマシーブルーで染色された。

〔ニトロセルロース膜への転写〕
２枚の濾紙と、ニトロセルロース膜と、タンパク質が泳動されるＳＤＳ−ＰＡＧＥと、サンドイッチ構造の組み立てに必要なスポンジとを、転写バッファー（２５ｍＭトリス、０．２Ｍグリシン、１００ｍＬメタノール）に浸漬した。バッファーに浸漬した後、サンドイッチ構造を組み立て、システムＴＥ８０（フォーファー社）を用いて転写を行った。転写は、転写バッファー中で、１時間、定電位８０Ｖで行われた。

〔免疫ブロット法〕
転写後、０．４５μｍニトロセルロース膜（シュライヒャー＆シュエル社）がＰＢＳ-５％ｍｉｌｋで室温で１時間飽和された。そして、前記膜を、ＰＢＳ−０．３％Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ−Ｔ）で２回洗浄した。適切な濃度にＰＢＳ−ｍｉｌｋで希釈した血清を用いて、前記膜を４℃で一晩処理した。そして、前記膜をＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。ＰＢＳ−ｍｉｌｋで１／１０００に希釈するために、プロテインＧ−ペルオキシダーゼ複合体（バイオラッド社）を添加し、室温で２時間処理した。前記膜をＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、冷メタノール５ｍＬ、ＰＢＳ２０ｍＬ及び３０％過酸化水素２５μＬに溶解した４−クロロ−１−ナフトール１５ｍｇに曝露した（revealed）。

〔ＥＬＩＳＡ法による免疫測定法〕
４℃で一晩、ｐH９．５の０．１Ｍ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液に１０μｇ／ｍＬの抗原を溶解させて、ポリスチレンコーティングマイクロプレート（ヌンク社）に１ウェル当たり１００μＬの抗原を被覆した。前記ウェルを０．３％のＰＢＳで洗浄し、湿室中、３７℃で３０分間、ウェル当たりＰＢＳの０．１％ゼラチン溶液２００μＬで飽和させた。各ウェルに、ＰＢＳ−Ｔで１／４００に希釈された血清１００μＬを添加し、湿室中、４℃で一晩処理した。前記プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。各ウェルに、ＰＢＳ−Ｔで１／２０００に希釈されたプロテインＧ−結合ペルオキシダーゼ（バイオラッド社）１００μＬを添加し、湿室中、３７℃で１時間処理した。前記ウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。基質の反応は、０．２Ｍリン酸（ｐＨ５．６）１ｍＬ当たりＯＰＤ１ｍｇを含んでいた。この溶液１ｍＬに対して、３０％過酸化水素１μＬを添加した。基質１００μＬを各ウェルに添加し、１ウェル当たり３ＭＨＣｌ１００μＬを添加して反応を停止させた。

吸光度は、ＥＬＩＳＡプレートモデル６８０（バイオラッド社）で４９０ｎｍで測定した。

〔免疫蛍光〕
免疫蛍光検査のための生物学的物質は、液体サンプル及び糞便から得られ、クリプトスポリジウム（ＣＰ１２）、ランブル鞭毛虫（ＣＷＧ）、赤痢アメーバ（ＥＮＴ）のスライドの場合には、Biomerieux diagnosisから得られた。β−Ｇｉａｒｄｉｎａ（ＢＧ）の場合には、栄養体の無菌培養液を用いた。寄生虫材料（parasitary material）のスライドを準備するために、寄生虫のサンプルが、免疫蛍光法用のスライドの各ウェルに添加され、完全に乾燥させるためにアセトンが２滴添加されて、オーブンで乾燥させて堆積物（sediment）を固定した。室温で乾燥させ、さらに３７℃のオーブンで５分間以上乾燥させた。免疫蛍光検査のために、血清（一次抗体）１０μＬを、対応する希釈液に添加し、湿室中、３７℃で１時間保持し、ＰＢＳを用いて３回洗浄した。ＰＢＳＴで希釈されたＦＩＴＣ（シグマ社）を用いて標識化された抗マウス抗体ＩｇＧ複合体が、スライドに添加され、湿室中、３７℃で１時間処理された。スライドは洗浄された。対照（エバンスブルー）溶液を添加した後、封入剤１０μＬを添加した。スライドは、顕微鏡（ニコン社、Ｏｐｔｉｐｈｏｔ）下で免疫蛍光が観察された。

〔実施例〕
以下に記載された本発明の理解を容易にするために、本発明のアプリケーションの好ましい実施例を示すが、本発明の範囲の限定を目的とするものではない。

本研究の組換え抗原は、特異的ポリクローナル抗体の産生によって評価することができる免疫応答を誘導することを特徴としている。研究では、フラグメントＨは、抗原ＦＨ８の安定性と免疫学的特性とについて重要な役割を果たすことが以前に示されている。配列Ｈが削除されているＦＨ８由来の抗原は、その安定性と免疫原性が大幅な減少を示した。

提示された手順は、これらの仮定の出発点として、抗原それ自体以外の他の成分（アジュバント）を使用せずに、特異的免疫応答の誘導において、このアプリケーションの使用を評価しようとする、異なるアプリケーションのプロトコルと同様に、承継起源（heir origin）、性質及び免疫学特性を大きく変化させるために選択されたフラグメントを持っていた。この目的のために、それの免疫学的特性が前もって評価されているアジュバントの存在下でフラグメントの選択を行った。前記フラグメントは、例えば、免疫原性が低いことが証明されたＣＤ４及びＣＷＧフラグメント、中程度の免疫原性特性を有することが示されたＣＰ１２及びＬＥＣフラグメント、高い免疫原性抗原であるＰＡＬ、タンパク質ファミリー、分子量、アミノ酸配列を含む生物学的特徴から不完全又は非免疫原性であると判断された、フラグメントＥｎｔ，ＩＬ５及びＰｆｓｐ等のフラグメント等である。最後に、また、免疫学的特性が完全に未知であるＴｏｘｏ及びＢＧ等のフラグメントを用いた。付加されている抗原の免疫原性でのフラグメントＨの実際の影響を評価するために、フラグメントＨの存在下及び非存在下でのフラグメントＣＷＧ及びＣＰ１２による免疫応答を誘導する能力を評価するデモンストレーションを行った。

〔実施例１：フラグメントＣＷＧを有するコンストラクトの結果として得られるタンパク質の免疫応答評価〕
ｂのコンストラクトｐＱＥＣＷＧ，ｐＱＥＨＣＷＧ及びｐＱＥＦＣＷＧを得た後に、変性条件下でそれぞれの組換え抗原の産生及び分析を行った（図３−Ａ）。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥトリス−トリシンゲルの分析（図３−Ａ）によれば、予想通り、タンパク質ＣＷＧの分子量は１６ｋＤａであり、一方、融合タンパク質ＨＣＷＧの分子量は、約１７ｋＤａであり、組換え抗原ＦＣＷＧの分子量は約２４ｋＤａであることを明らかである。

ＣＷＧに対する特異的免疫応答の誘導におけるフラグメントＨの存在の影響のデモンストレーションが、ＣＤ１マウスの３つの群に対する抗原ＣＷＧ，ＨＣＷＧ及びＦＣＷＧの５０μｇずつの接種（表２に示す定期的なＩＰ投与）により行われた。無接種群と同じ特性を有するＣＤ１マウスの３つの群についても行った。抗ＣＷＰＩｇの存在を評価するために、定期的な採血（表２）を行った。特異的抗原応答の存在の評価は、抗原ＣＷＧ（図３−Ｂのａ）、ＨＣＷＧ（図３−Ｂのｂ）及びＦＣＷＧを含むプレートを用いたＥＬＩＳＡにより行われた。ＨＣＷＧ群だけでなく、４回目の接種以降で有意な抗ＣＷＧ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）が出現した。ＦＣＷＧ群では抗ＦＨ８ＩＧの存在が確認されたが、フラグメントＣＷＧに対する特異ＩｇＧの存在は確認できなかった（データなし）。ＨＣＷＧ群では、最終接種後８３日後であっても、この抗原に対する特異的メモリーの存在を示す、抗ＣＷＧＩｇＧの存在を検出できた。ポリクローナル抗体の特異性を評価するために、抗原としてＦＣＷＧを用いてブロットを行った。組換えタンパク質ＦＣＷＧと可能なポリマーとの位置決めは、ポリマーＦＣＷＧの確認を可能にするＦＨ８に対して産生され、１／１００に希釈された抗血清（図３−Ｄのｉ）で行われた。５回目の接種及び６回目の接種後９日後に無接種群、ＣＷＧ群、ＨＣＷＧ群から採取され、１／２００に希釈された血清のプール（pool）を用いて、ＦＣＷＧに対応する沈殿物が出現した。（抗フラグメントＨＩｇＧの産生を評価するために）抗原ＦＨ８を用いた同じ希釈での免疫ブロット法の認識は、沈殿物の出現を全く示さなかった。これらの全ての結果は、ＨＣＷＧ群で産生された抗体は、フラグメントＣＷＧに特異的であることを示している。大腸菌の抗原の有意なクロス反応（cross-reactions）の存在又はＩｇ抗フラグメントＨの存在は、いずれも確認されなかった。産生されたＩｇがランブル鞭毛虫（Giardia）の嚢子の細胞壁に存在する天然タンパク質を認識できるか否かを評価するために、ＨＣＷＧ群の血清を用いて免疫蛍光の認識を行い、蛍光壁構造（図３−Ｅ）の存在が明らかになった。

〔実施例２：ＣＰ１２フラグメントを有するコンストラクトのタンパク質に対する免疫応答の評価〕
コンストラクトｐＱＥＣＰ１２及びｐＱＥＨＣＰ１２を得た後に、変性条件下でそれぞれの組換え抗原の産生及び分析を行った（図４−Ａ）。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥトリス−トリシンゲルの分析（図３−Ａ）により、予想通り、ＣＰ１２タンパク質の分子量は９ｋＤａであるが、融合タンパク質ＨＣＰ１２の分子量は約１０ｋＤａであり、組換え抗原ＦＣＰ１２は約２９ｋＤａの分子量の抗原を示すことが判明した。組換え抗原のために計算されたＰＭを考慮すると、２９ｋＤａのバンドはポリマーＦＣＰ１２であろう。ＣＰ１２に対する特異的免疫応答の誘導においてフラグメントＨの存在による効果のデモンストレーションを、それぞれ抗原ＣＰ１２及びＨＣＰ１２の２０μｇを２つの群のＣＤ１マウスに接種（表２に示す定期的なＩＰ投与）することにより行った。無接種と同じ特性を有するＣＤ１マウスの３つの群についても行った。抗ＣＰ１２Ｉｇの存在をさらに評価するために、定期的な採血を行った（表２）。特異的抗体応答の存在の評価は、ＣＰ１２抗原（図４−Ｂのａ）及びＨＣＰ１２（図４−Ｂのｂ）を含むプレートを用いたＥＬＩＳＡにより行われた。ＨＣＰ１２の４回目の接種以降で抗ＣＰ１２が出現し、６回目の接種以降でＣＰ１２群で抗ＣＰ１２抗体の出現が視覚化された。両方の群で、Ｉｇ抗ＣＰ１２の値（title）は、実験を通じて大きくなっている。この実験では、ＨＣＰ１２群における、より早い免疫応答及び大量の抗ＣＰ１２ＩｇＧの存在によって、免疫原性の増加が観察された。

産生されたポリクローナル抗体の特異性を評価するために、抗原としてＦＣＰ１２を用いたブロットを行った。組換えタンパク質ＦＣＰ１２の位置決めが、１／１００に希釈されたＦｈ８特異的抗血清を用いて行われ（図４−Ｃ）、矢印でその位置が示されるように、ＦＣＰ１２ポリマーを確認することができる。無接種群、ＣＰ１２群及びＨＣＰ群から８回目のＩＰ投与の後に採取され、１／１０００に希釈された血清を用いて、タンパク質に対応する沈殿物の出現が、抗ＦＨ８により同定された。ＣＰ１２群と比較して、最も高い強度がＨＣＰ１２群で確認され、ＨＣＰ１２群で発生した免疫応答の増加が確認された。抗体ＦＨ８を用いて同一の血清により行われた免疫ブロットでは、沈殿物の出現は見られなかった。これら全ての結果は、大腸菌の抗原との有意なクロス反応の存在又は抗ＩｇフラグメントＨの存在が観察されていることにより、ＨＣＰ１２群によって発現された抗体がＣＰ１２フラグメントに対して特異的であることを示している。産生されたＩｇが、クリプトスポロリジウムオーシストの細胞壁中に存在する天然タンパク質を認識するか否かを評価するために、ているＨＣＰ１２群の血清での免疫蛍光の現実化を行い、壁構造での蛍光の存在が明らかにされた。（図４−Ｄ）。

〔実施例３：フラグメントＨを有するコンストラクトに起因するタンパク質及びフラグメントの免疫応答の評価〕
記述された各フラグメントについて、定期的な間隔（表２）でのＩＰ投与によって、対応する抗原を有するＣＤ１マウスの３つの群の接種による免疫応答のデモンストレーションを行った。無接種と同じ特性を有するＣＤ１マウスの３つの群についても行った。対象となる抗原に対して指示するＩｇの存在をさらに評価するために、定期的な採血を行った（表２）。

タンパク質ＢＧ：このフラグメントの免疫学的機能は未知であった。コンストラクトｐＱＥＨＢＧを得た後に、それぞれの組換え抗原の産生及び分析を行った（図５−Ａ）。ＢＧに対する特異的免疫応答の誘導において、フラグメントＨの存在による効果のデモンストレーションが、ＣＤ１マウスの３つの群に対して２０μｇの抗原ＨＢＧを接種することにより、行われた。特異的抗体応答の評価は、抗原ＨＢＧを含むプレートを用いたＥＬＩＳＡにより行われた（図５−Ｂ）。３回目の接種以降でＩｇＧ抗ＢＧが出現している。抗体レベルは、４回目の接種以降、最終接種から４７日後であっても維持されていて、水平状態に達している。

産生されたポリクローナル抗体の特異性を評価するために、抗体としてＢＧを用いてブロットを行った。７回目のＩＰ後に無接種群及びＨＢＧ群から採取され、１／１０００に希釈された血清を用いて、ＢＧに対応する沈殿物が出現した。大腸菌の抗原での有意なクロス反応は観察されなかった。産生されたＩｇがランブル鞭毛虫（Giardia）の細胞壁に存在する天然タンパク質を認識するか否かを評価するために、壁構造での免疫蛍光の存在が明らかにされているＨＢＧ群の血清での免疫蛍光の現実化を行った。

タンパク質フラグメントＥｎｔ：このポリペプチドの分子量が小さい（７ｋＤａ）ことと、タンパク質の一部分のみを示すこととから、このフラグメントは、低い免疫原性に関連付けられた特性を有していた。

コンストラクトｐＱＥＨＥｎｔを得た後に、それらの組換え抗原の産生及び分析を行った。免疫応答の産生のデモンストレーションが、５０μｇのＨＥｎｔ抗原を３匹のＣＤ１マウスに接種することにより行われた。特異的抗体応答の存在の評価は、抗原ＨＥｎｔを有するプレートを用いたＥＬＩＳＡにより行われた（図５−Ｂ）。５回目のＩＰ以降でＩｇＧ抗Ｅｎｔが出現した。抗体レベルは、５回目のＩＰ以降、最終接種から９０日後であっても維持されていて、水平状態に達している。

産生されたポリクローナル抗体の特異性を評価するために、抗原ＦＥｎｔを用いてブロットを行った。組換えタンパク質ＦＥｎｔは、さらに、１／１００に希釈された特異的抗血清ＦＨ８で同定され（図６−Ｂ）、その位置が矢印で示されるように、ＦＥｎｔポリマーを可視化した。７回目のＩＰ後に無接種群及びＨＥｎｔ群から採取され、１／１０００に希釈された血清を用いて、ＦＥｎｔに対応するＨＥｎｔ群で沈殿物が出現した。抗体ＦＨ８を用いた同一の血清を用いて行われた免疫ブロットでは、沈殿物は見られなかった。これら全ての結果は、ＨＥｎｔ群により発現された抗体は、大腸菌の抗原の有意なクロス反応の存在又は抗ＩｇフラグメントＨが検出されていないことにより、フラグメントＥｎｇに対して特異的であることを示している。

産生されたＩｇがエントアメーバ属（Entamoeba）の栄養体の細胞壁に存在する天然タンパク質を認識することができるか否かを評価するために、Ｈｅｎｔ群から得られた血清を用いて免疫蛍光を行い、壁構造での蛍光の存在が明らかにされた（図６−Ｃ）。

タンパク質フラグメントＰＦＳＰ：ポリペプチドの分子量が小さい（７ｋＤａ）ことと、タンパク質の一部分のみを示すこととから、このフラグメントは、低い免疫原性に関連付けられた特性を有していた。

コンストラクトｐＱＥＨＰｆｓｐを得た後に、変性条件下でそれぞれの組換え抗原の産生及び分析を行った。

免疫応答の産生のデモンストレーションは、５０μｇの抗原ＨＰｆｓｐをＣＤ１マウスに接種することにより行われた。特異的免疫応答の存在の評価は、抗原ＨＰｆｓｐを有するプレートを用いたＥＬＩＳＡにより行われた（図７−Ｂ）。４回目のＩＰ以降で抗ＦＰｆｓｐＩｇＧが出現した。抗体レベルは、７回目のＩＰ以降、最終接種から８２日後であっても維持されていて、水平状態に達している。

産生されたポリクローナル抗体の特異性を評価するために、抗原としてＦＰｆｓｐを用いてブロットを行った。組換えタンパク質は、１／１００に希釈された特異的抗ＦＨ８抗血清で位置決めされ（図７−Ｂのａ）、ＦＰｆｓｐポリマーを可視化する。６回目のＩＰ及び７回目のＩＰ後１４日後にＨＰｆｓｐ群及び無接種群から採取され、１／２００に希釈された血清を用いて、ＦＰｆｓｐに対応する沈殿物の出現が確認された。

抗原ＦＨ８を用いた同一の血清を用いて行われた免疫ブロットは、沈殿物の出現を示さなかった。これらの全ての結果は、ＨＰｆｓｐ群により発現された抗体は、大腸菌の抗原を用いた有意なクロス反応の存在又は抗ＩｇフラグメントＨが観察されていないことにより、フラグメントＰｆｓｐに対して特異的であることを示している。

ＩＬ５タンパク質フラグメント：ポリペプチドの分子量が小さい（７ｋＤａ）ことと、マウスのＩＬ５と高い相同性を有するタンパク質の一部分のみを示し、非免疫原性と記載されていることとから、このフラグメントは、低い免疫原性に関連付けられた特性を有していた。

コンストラクトｐＱＥＨＩＬ５を得た後に、変性条件下で組換え抗原の産生及び分析を行った。

免疫応答の産生のデモンストレーションが、約２０μｇのＨＩＬ５（表２）をＣＤ１マウスに接種することにより行われた。特異的抗体応答の存在の評価は、抗原ＨＩＬ５を含むプレートを用いたＥＬＩＳＡにより行われた（図８−Ａ）。４回目のＩＰ以降でＩｇＧ抗ＩＬ５が出現した。抗体レベルは、実験期間を通じて接種に起因して増加した。

産生されたポリクローナル抗体の特異性を評価するために、抗原としてＦＩＬ５を用いてブロットを行った。組換えタンパク質ＦＩＬ５の位置決めが、１／１００に希釈された特異的抗ＦＨ８抗血清を用いて行われ、矢印で示されたＦＩＬ５ポリマーを可視化する。６回目のＩＰ後に無接種群及びＨＩＬ５群から採取され、１／１０００に希釈された血清を用いて、ＦＩＬ５に対応する沈殿物の出現が確認された（図８−Ｂ）。

抗原ＦＨ８を用いた同一の血清を用いて行われた免疫ブロットは、沈殿物の出現を示さなかった。これらの全ての結果は、ＨＩＬ５群により発現された抗体は、大腸菌の抗原を用いた有意なクロス反応の存在又は抗ＩｇフラグメントＨが観察されていないことにより、フラグメントＩＬ５に対して特異的であることを示している。

タンパク質Ｔｏｘｏ：このフラグメントの免疫学的機能は、未知であった。コンストラクトｐＱＥＨＴｏｘｏを得た後に、組換え抗原の産生及び分析を行った。

免疫応答の産生のデモンストレーションが、２０μｇの抗原ＨＴｏｘｏ（表２）をＣＤ１マウスに接種することにより行われた。特異的抗体応答の存在の評価は、抗原ＨＴｏｘｏを含むプレートを用いたＥＬＩＳＡにより行われた（図９−Ａ）。４回目のＩＰ以降で抗ＴｏｘｏＩｇＧが出現する。

ポリクローナル抗体の特異性を評価するために、抗原Ｔｏｘｏを用いてブロットを行った。４回のＩＰで得られ、１／１０００に希釈された血清を用いて、ＨＴｏｘｏ群で得られた組換えＴｏｘｏに対応する沈殿物の出現が確認された。

フラグメントＣＤ４：このフラグメントは、免疫原性が低いことが示された。コンストラクトｐＱＥＨＣＤ４を得た後に、変性条件下で組換え抗原の産生及び分析を行った。

免疫応答の産生のデモンストレーションが、３０μｇの抗原ＨＣＤ４をＣＤ１マウスに接種することにより行われた。特異的免疫応答の存在の評価は、抗原ＨＣＤ４を有するプレートを用いたＥＬＩＳＡにより行われた（図１０−Ａ）。４回目のＩＰ以降で抗ＣＤ４が出現した。抗体のレベルは、４回目のＩＰ以降、最終接種から８２日後であっても維持されていて、水平状態に達している。

産生されたポリクローナル抗体の特異性を評価するために、抗原として組換えＣＤ４を用いてブロットを行った。７回目のＩＰの後１４日後に得られ、１／５００に希釈された血清を用いて、ＣＤ４に対応する沈殿物の出現がＨＣＤ４群で得られた確認された（図１０−Ｂ）。

ＰＡＬタンパク質：このタンパク質は、非常に免疫原性であることが示された。コンストラクトｐＱＥＨＰＡＬを得た後に、組換え抗原の産生及び分析を行った。

免疫応答の産生のデモンストレーションが、３０μｇの抗原ＨＰＡＬ（表２）をＣＤ１マウスに接種することにより行われた。特異的抗体応答の存在の評価は、抗原ＨＰＡＬを含むプレートを用いたＥＬＩＳＡにより行われた（図１１−Ａ）。２回目の接種以降で抗ＰＡＬＩｇＧが出現する。

産生されたポリクローナル抗体の特異性を評価するために、抗原としてＨＰＡＬを用いてブロットを行った。４回目のＩＰの後に得られ、１／４０００に希釈された血清を用いて、組換えＰＡＬに対応する沈殿物がＨＰＡＬ群に出現する（図１１−Ｂ）。

ＬＥＣタンパク質：このタンパク質は、免疫原性が中程度であると考えられていたが、未変性ではその赤血球凝集活性ことにより、変性条件下の抗原に対する特異的抗体を発現した。

変性条件下で組換え抗原ＨＬＥCの産生及び分析を行った。

免疫応答の産生のデモンストレーションが、１２．５μｇの抗原ＨＬＥＣをＣＤ１マウスに接種することにより行われた。特異的抗体応答の存在の評価は、抗原ＨＬＥＣを含むプレートを用いたＥＬＩＳＡにより行われた（図１２−Ａ）。４回目の接種以降で抗ＬＥＣＩｇＧが出現する。抗体のレベルは、４回目のＩＰ以降観察期間中ずっと、水平状態に達している。

産生されたポリクローナル抗体の特異性を評価するために、抗原としてＨＬＥＣを用いてブロットを行った。６回目のＩＰの後に得られ、１／１０００に希釈された血清を用いて、ＨＬＥＣに対応する沈殿物がＨＬＥＣ群に対して出現する（図１２−Ｂ）。

フラグメントＣＷＧ及びＣＰ１２に関して記述されたデモンストレーションは、組換えタンパク質中のフラグメントＨの存在は、マウスによって発現された免疫応答を有意に増加させることを示した。したがって、ＨＥｎｔ，ＨＩＬ５，ＨＰｆｓｐ及びＨＬＥＣを含む抽出物の一部において、大腸菌混入物の存在が重要であったとしても、免疫原性の増加は、特異的ポリクローナル抗体を産生することができる組換え抗原に関連した特性である。大腸菌由来のタンパク質の混入物であるにもかかわらず、産生された抗体は、本質的に対象となるフラグメントに対して特異的である。

組換え抗原に対するポリクローナル抗体の発現は、対応する抗原を含む感染性微生物に対する抗体を産生する宿主の保護に関連づけられるだろう。これは、多くに要因に依存し、特に、この抗原の役割又は重要性は、感染性微生物の感染のメカニズムを有している。タンパク質ＨＣＰ１２，ＨＣＷＧ及びＨＢＧを接種されたマウスの場合には、これらの抗原は、クリプトスポリジウム（ＣＰ１２）及びランブル鞭毛虫（Giardia）（ＣＷＧ及びＢＧ）による感染のメカニズムでは、宿主生物への侵入又は細胞接着において重要な役割を果たしていて、したがって、文献に記載されているように、ワクチン開発の対象物候補である。これらの抗原に対する抗体の発現は、感染源による感染から保護するように、文献に記載されている（非特許文献１０、非特許文献４及び非特許文献１参照）。

従来の文献に記載されたものと非常によく似た方法で、寄生虫クリプトスポリジウム及びランブル鞭毛虫（Giardia）による感染に直面して、ＨＣＰ１２，ＨＣＷＧ及びＨＢＧを接種したマウスの保護を評価するために、これらの抗原を予め接種したマウスでは、感染に対する保護の効果があることを指摘している。

可溶性タンパク質からなる接種材料の使用は、アジュバントによって引き起こされる望ましくないひどい影響を除外する。記載された実験で使用されたいずれのマウスにおいても、抗原の接種に起因する副作用は検出されなかった。マウスのときのように、内側大腿部への皮下接種に用いるウサギにおいて、上記のフラグメント（ＨＣＷＧ，ＨＣＰ１２，ＨＴｏｘｏ，ＨＩＬ５，Ｈｅｎｔ及びＨＢＧ）に対するポリクローナル血清の産生を行ったところ、抗原の投与に起因する副作用は検出されなかった。マウスのときのように、ウサギは、目的の抗原に対して非常に重要なポリクローナル抗体の証拠を産生した。

評価された全ての対象物において、特異的Ｉｇの産生を示すことにより、有意な免疫応答の存在を示すことができる。特に、ＨＣＷＧ，ＨＣＤ４，ＨＰｆｓｐ，Ｈｅｎｔ及びＨＢＧに対する応答の場合に観察された他の非常に重要な機能は、最終接種後最大３ヶ月間は、特異的応答を検出することが可能であったということであり、このことは、ワクチン開発にとって不可欠な特性である、メモリー細胞の発現を示唆している。

今回の実施例は、フラグメントＨを含む抗原融合を産生する組換えタンパク質の産生のモデルに基づくものであるが、このフラグメントは他のプロセスを通して対象物に付加することができる。示される活性は、アジュバントの分野に含まれるべきであり、対象となる抗原のアプリケーションに起因する免疫応答の強度及び特異性を改善又は向上させるための種々の製剤に利用することができる。

Claims (14)

1. ａ．肝蛭の成虫から排泄され又は分泌され、フラグメントＨと命名されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２と同一であるか又は構造的に少なくとも９０％類似している配列を有するカルシウム結合タンパク質由来のアミノ酸配列の一部分と、
   ｂ．目的とは無関係のタンパク質又はタンパク質フラグメントと、
   からなることを特徴とする免疫原。
2. 目的のタンパク質又はタンパク質フラグメントは、ウイルス性タンパク質、細菌性タンパク質、又は原生動物由来のタンパク質等の病原性タンパク質であることを特徴とする請求項１記載の免疫原。
3. 目的のタンパク質又はタンパク質フラグメントは、ＣＷＧ，ＣＤ４，ＩＬ５，Ｐｆｓｐ，Ｅｎｔ，ＰＡＬ，ＣＰ１２，ＬＥＣ，ＢＧ又はＴｏｘｏであることを特徴とする請求項１記載の免疫原。
4. 医薬として用いられることを特徴とする請求項１〜３記載の免疫原。
5. 請求項１〜４記載の免疫原を含むことを特徴とする組成物。
6. 治療上有効な量の免疫原と、さらに薬理学的に適した賦形剤とを含むことを特徴とする請求項５記載の組成物。
7. 記載された免疫原の１つを１００％含むことを特徴とする請求項５記載の組成物。
8. ０．０１Ｍのリン酸と、０．１ＭのＮａＣｌとからなり、ｐＨ７．２のリン酸緩衝液で１００〜１０００μＬの容積当たり１〜１００μｇの濃度に希釈された請求項１〜４記載の免疫原を含むことを特徴とする請求項５記載の組成物。
9. 請求項１〜４記載の免疫原又は請求項５〜８記載の医薬組成物を含むことを特徴とするアジュバント。
10. 請求項１〜３記載の免疫原又は請求項５〜８記載の医薬組成物を含むことを特徴とするワクチン。
11. 免疫原として利用されるポリペプチドに対応する配列の正当な位置に、無関係のポリペプチドへのフラグメントＨの付加を含み、請求項１〜４記載の免疫原を使用することを特徴とする免疫原の調製方法。
12. ＣＷＧ，ＣＤ４，ＩＬ５，Ｐｆｓｐ，Ｅｎｔ，ＰＡＬ，ＣＰ１２，ＬＥＣ，ＢＧ又はＴｏｘｏ等の複数のフラグメント及びタンパク質を用いることを特徴とする請求項１１記載の方法。
13. 請求項１〜４のいずれか１項記載の免疫原又は請求項５〜８のいずれか１項記載の組成物を用いるヒト以外の哺乳類の対象物の免疫化と、
    請求項１〜４にしたがって記載される免疫原を認識することができるか、又はこの目的のために記載される方法を使用して請求項１１〜１２にしたがって得ることができる抗体の選択とを含む方法であって、
    請求項１〜４のいずれか１項記載の免疫原を認識することができるか、又は請求項１１〜１２のいずれか１項記載の方法により得られることを特徴とする単離され精製されたポリクローナル抗体又は機能的フラグメントの調製方法。
14. 特異的免疫療法、免疫防御、ワクチンの産生、アジュバント、診断学及び特異的免疫応答の発現を通して直接的に得られる他のアプリケーションに、ポリクローナル抗体の産生物を適用することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載の免疫原及び請求項５〜８のいずれか１項記載の組成物の使用。