CN101287752A - 抗原肽及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明一般涉及病原体肽抗原及其用途领域，所述用途例如用于制备一种针对所述病原体的疫苗。更具体地，本发明涉及一种源自于疟原虫物种序列的抗原肽，并包括其抗体和其生产和使用方法。
Description
技术领域
本发明一般涉及病原体肽抗原及其用途领域，所述用途例如用于制备一种针对所述病原体的疫苗。更具体地，本发明涉及一种源自于疟原虫物种序列的抗原肽，并且本发明还包括其抗体和其生产和使用方法。
背景技术
人恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)(Pf)是一个公共卫生问题。如今大约40％的世界人口(特别是那些居住在最贫穷国家的人)处于患疟疾的危险中。每年有超过3亿例急性疾病和至少一百万例死亡由疟疾引起。由疟疾引起的死亡有90％都发生在撒哈拉以南非洲国家，大部分是幼儿和孕妇(http://rbm.who.int)。
不幸地，如果保护性抗原不具有任何可以对它们进行鉴定的结构特征、物理化学特征或者序列相关特征，那么疫苗的发现就仍然是一个需要凭借经验的过程。对于其保护能力是由抗体介导的抗原而言，唯一的限制是它们接近抗体分子的能力。最初疫苗开发是使用完整的微生物或者蛋白进行的，这些微生物或者蛋白可以通过经典的纯化方法容易地获得。虽然引入分子生物学技术普遍地改善了所述抗原分离步骤，但是仍然难以产生毫克量的高度纯化的重组蛋白；这使得该方法非常昂贵并且不适合于高通量的筛选方法。另外，在许多情况下正确的蛋白折叠也是一个问题。因此，突破作为保护靶标的蛋白的生产和鉴定瓶颈是该科学领域的一个巨大的挑战。
在过去的20年中，在疟疾疫苗的开发上已进行了大量的工作，进行了超过40项I期和II期试验(Ballou et al，2004，Van de Perre and Dedet，2004)。现在有大约70种不同的候选疫苗正在被开发，并且至少有10种处于临床试验阶段。所使用的抗原来自于寄生虫生命周期的各个阶段(Genton and Corradin，2002，Ballouet al，2004)，采用了各种免疫方案(Dunachie and Hill，2003)并且结合了各种送递系统中配制的不同佐剂(Genton et al，2002；Taylor-Robinson，2003；Ballou et al，2004)。
从地方疫情中进行的临床试验获得的结果是令人鼓舞的并且显示出一定水平的保护(Bojang et al，1998，Bojang et al，2001，Gentonet et al，2002)，而其他的试验没有显示出保护作用(Nosten et al，1996，Valero et al，1996，Urdaneta et al，1998，Graves and Gelband，2004)。迄今为止，最先进的疟疾疫苗是RTS，S/AS02A。该疫苗包含环子孢子蛋白的免疫显性NANP重复序列的大部分和含T细胞表位的C-末端区域的一部分，所述疫苗与乙型肝炎表面抗原融合(Gordon et al，1995)，在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中共表达并与强佐剂AS02A配伍(Stoute et al，1997)。RTS，S/AS02A靶向红细胞前期肝阶段并且对幼儿的临床疟疾和寄生虫血症(Stoute et al，1997)以及成年男性的疟疾(Bojang et al，2001)都有保护，但保护有效时间较短。另外，最近在莫桑比克完成的学步期儿童的试验中获得了对临床疟疾更高水平的保护(Alonso et al，2004)。在受该疾病感染最为严重的儿童中有长达6个月的持续保护。
迄今为止使用的候选疫苗都不是根据它们的保护能力进行系统筛选得到的；大部分的寄生虫分子是根据它们被发现的时间的先后顺序进行以经验为主的优先次序的区分。虽然这样的方法被成功地应用于其他的病原体，但是还未能提供一种有效的疟疾疫苗。
例如，EP 03150185B1(申请人Behringwerke aktiengesellschaft)描述了通过利用抗41kDa蛋白的抗血清筛选两个不同的恶性疟原虫cDNA基因库并通过与以该方法获得的一个克隆的插入DNA相互杂交，来分离一个编码富含组氨酸/丙氨酸的蛋白的基因。该分离的蛋白保护夜猴免受恶性疟原虫的感染。不幸地是，可能由于这些猴子并不是模拟人对恶性疟原虫免疫应答的合适模型，这个方法并没有导致开发出一种对人有效的疫苗。
在尝试进行针对另一种病原体肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)的疫苗开发中，使用了针对肺炎球菌表面蛋白A(PspA)所产生的单克隆抗体的作图研究表明，主要的交叉反应表位存在于卷曲螺旋结构域的最后100个氨基酸中，所述卷曲螺旋结构域是一种存在于多组蛋白中的具有重要结构和较高生物学丰度的结构域(Chen and Parry，1986 and 1990)。
根据这个发现，国际专利申请WO00/37105(申请人Medimmune，Inc.)公开了用于预防肺炎链球菌所致感染的方法和疫苗组合物，所述疫苗组合物包括含三联组氨酸残基或者卷曲螺旋区域的多肽和多肽片段。
最近，国际专利申请WO01/96368(申请人Cytovax Biotechnologies，Inc.)公开了一种卷曲螺旋结构骨架用于产生结构特异性肽(包括合成肽)的用途。这些合成肽可以用作疫苗，或者用于刺激针对天然存在的肺炎球菌表面蛋白A和C的抗体产生或者细胞介导的免疫。
虽然在疟疾的治疗中已有一些进展，但是对于生活在疟疾流行区域的广大人群来说，安全而有效的疟疾疫苗的开发仍然是紧迫的、未满足的医学需求。
本发明通过提供一种源自于疟原虫物种的、包含至少一个卷曲螺旋区域的新抗原肽已经实现了这个目标。基于一种鉴定病原体基因组中是否存在编码至少一个卷曲螺旋区域的序列的新方法，根据产生一种用于制备抗所述病原体疫苗的抗原肽的方法，已经制备了该肽。
发明内容
从上文显而易见的上述目的或其他目的已通过提供一种新抗原肽实现，所述抗原肽源自于疟原虫物种，包含至少一个卷曲螺旋区域，其特征在于所述抗原肽选自SEQ ID No.1-132、SEQ ID No.134-SEQ ID No.153和SEQ IDNo.159-SEQ ID No.163的氨基酸序列、所述氨基酸序列的生物学活性片段、分子嵌合体、结合物和/或变体。
本发明的另一个目的是提供一种源自于疟原虫物种的混合抗原组合物。
本发明还考虑了源自于疟原虫物种的所述抗原肽或者所述混合抗原组合物在制备一种用于刺激哺乳动物免疫应答的疫苗组合物中的应用，以及所述疫苗组合物在制备治疗和/或预防疟疾的药剂中的应用。
本发明的另一目的是提供一种识别源自于疟原虫物种的所述抗原肽或者所述混合抗原组合物的抗体。
本发明还涉及包含编码源自于疟原虫物种的所述抗原肽的序列的纯化的和分离的核酸序列，包含所述纯化的和分离的核酸序列的至少一个拷贝的表达载体，以及包含所述纯化的和分离的核酸序列或所述表达载体的宿主细胞。
本发明还涉及生产一种用于制备抗病原体的疫苗组合物的抗原肽的方法。
本发明还考虑了用于确定所述抗原肽或者针对所述抗原肽的抗体是否存在的诊断工具。
通过阅读下文的具体描述并参照下面附图说明和随附的权利要求，本发明的其他目的和优点也应是本领域技术人员显而易见的。
附图说明
图1表示使用抗SEQ ID No.34(P1577)、SEQ ID No.4(P1574)、SEQ IDNo.133(MR198)和SEQ ID No.1(MR194)的亲和纯化的人抗体在感染的人红细胞上获得的免疫荧光数据。
具体实施方式
本发明涉及一种源自于疟原虫物种的、包含来自于疟原虫物种序列的至少一个卷曲螺旋区域的抗原肽。
所述术语“包含”通常用于表示包括的意思，就是说允许存在一个或多个特征或组分。
本文使用的术语“蛋白”、“多肽”、“多肽的”、“肽”和“肽的”在本文中可以互换使用，用于表示通过相邻残基的α-氨基和羧基之间的肽键连接的一系列氨基酸残基。
术语“抗原肽”是指一种被抗体识别的肽。通常，免疫应答会产生识别抗原肽或者其至少一部分的抗体。
在本文中，术语“源自于”是指所述抗原肽是从存在于所述疟原虫物种病原体序列的氨基酸序列中选出。
“卷曲螺旋区域”、“卷曲螺旋结构域”或“区域”通常由具有七氨基酸(abcdefg)重复的氨基酸序列构成，其中在所述a和b位置为非极性残基而其他残基通常为极性残基。通过不同折叠中的a和d位置之间的疏水相互作用可以稳定这些区域的结构(Hodges et al，1981；Hodges，1996)。
本文使用的“疟原虫物种”可以选自于如下的疟原虫株：Plasmodium agamae、Plasmodium atheruri、Plasmodium azurophilum、柏格鼠疟原虫(Plasmodium berghei)、巴西疟原虫(Plasmodium brasilianum)、金丝雀疟原虫(Plasmodium cathemerium)、夏氏鼠疫疟原虫(Plasmodiumchabaudi)、Plasmodium chiricahuae、柯式疟原虫(Plasmodium coatneyi)、Plasmodium cuculus、食蟹猴疟原虫(Plasmodium cynomolgi)、长角疟原虫(Plasmodium elongatum)、Plasmodium fairchildi、恶性疟原虫(例如恶性疟原虫(分离株311)、恶性疟原虫(分离株7G8)、恶性疟原虫(分离株CAMP/马来西亚)、恶性疟原虫(分离株CDC/洪都拉斯)、恶性疟原虫(分离株DD2)、恶性疟原虫(分离株FC27/巴布亚新几内亚)、恶性疟原虫(分离株FcB1/哥伦比亚)、恶性疟原虫(分离株FCBR/哥伦比亚)、恶性疟原虫(分离株FCH-5)、恶性疟原虫(分离株FCM17/塞内加尔)、恶性疟原虫(分离株FCR-3/冈比亚)、恶性疟原虫(分离株fid3/印度)、恶性疟原虫(分离株hb3)、恶性疟原虫(分离株IMR143)、恶性疟原虫(分离株K1/泰国)、恶性疟原虫(分离株KF1916)、恶性疟原虫(分离株LE5)、恶性疟原虫(分离株mad20/巴布亚新几内亚)、恶性疟原虫(分离株mad71/巴布亚新几内亚)、恶性疟原虫(分离株NF54)、恶性疟原虫(分离株NF7/加纳)、恶性疟原虫(分离株nig32/尼日利亚)、恶性疟原虫(分离株帕洛阿尔托/乌干达)、恶性疟原虫(分离株RO-33/加纳)、恶性疟原虫(分离株T4/泰国)、恶性疟原虫(分离株TAK 9)、恶性疟原虫(分离株thtn/泰国)、恶性疟原虫(分离株V1)、恶性疟原虫(分离株WELLCOME)、恶性疟原虫3D7)、费氏猴疟原虫(Plasmodium fieldi)、佛罗里达疟原虫(Plasmodiumfloridense)、脆弱疟原虫(Plasmodium fragile)、鸡疟原虫(Plasmodiumgallinaceum)、Plasmodium giganteum、岗氏疟原虫(Plasmodium gonderi)、广东疟原虫(Plasmodium guanggong)、异核疟原虫(Plasmodiumheteronucleare)、长臂猿疟原虫(Plasmodium hylobati)、猪尾猴疟原虫(Plasmodium inui)、联核疟原虫(Plasmodium juxtanucleare)、诺尔斯疟原虫(Plasmodium knowlesi)、鹇疟原虫(Plasmodium lophurae)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、三日疟原虫cf.(Plasmodium cf.malariae)、墨西哥疟原虫(Plasmodium mexicanum)、Plasmodium nucleophilum、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)、(疟原虫卵形疟原虫(malaria parasite P.ovale))、里氏疟原虫(Plasmodium reichenowi)、鸟疟原虫(Plasmodium relictum)、劳氏疟原虫(Plasmodium rouxi)、似卵形疟原虫(Plasmodium simiovale)、吼猴疟原虫(Plasmodium simium)、文氏鼠疟原虫(Plasmodium vinckei)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)(例如间日疟原虫(Belem株)间日疟原虫(Salvador I株))、约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)、未分类疟原虫种例如疟原虫种909413、疟原虫种909414、疟原虫种909415、疟原虫种909416、疟原虫种AP61、疟原虫种AP62、疟原虫种AP63、疟原虫种AP64、疟原虫种AP65、疟原虫AP66、疟原虫AP67、疟原虫种AP68、疟原虫种AP69、疟原虫种AP70、疟原虫种AP71、疟原虫种AP72、疟原虫种AP73、疟原虫种AP74、疟原虫种AP75、疟原虫种AP76、疟原虫种AP77、疟原虫种AP78、疟原虫种C1、疟原虫种C2、疟原虫种C3、疟原虫种COLL1、疟原虫种D1、疟原虫种DAJ-2004、疟原虫种E1、疟原虫种E2、疟原虫种ex Aplonis atrifusca、疟原虫种ex Aplonis tabuensis、疟原虫种ex Foulehaio carunculata、疟原虫种ex Halcyon chloris、疟原虫种ex Myzomela cardinalis、疟原虫种ex Ptilinopus porphyraceus、疟原虫种F1、疟原虫种1、疟原虫种GRW11、疟原虫种GRW2、疟原虫种GRW4、疟原虫种H1、疟原虫种ORW1、疟原虫种PA、疟原虫种PARUS2、疟原虫种PB、疟原虫种pBT6、疟原虫种pBT7、疟原虫种pBT8、疟原虫种pBT9、疟原虫种PC、疟原虫种pGRW9、疟原虫种PH、疟原虫种PI、疟原虫种PU1、疟原虫种SGS1、疟原虫种株KZ02、疟原虫种株LA09、疟原虫种株LA15、疟原虫种株OZ01A、疟原虫种株OZ04、疟原虫种株OZ08、疟原虫种株OZ14、疟原虫种株OZ25、疟原虫种株OZ35、疟原虫种株OZ35A、疟原虫种株OZ35B、疟原虫种株OZ36A、疟原虫种株OZ42、疟原虫种株OZ45、疟原虫种株OZ46、疟原虫种株PR01、疟原虫种SYAT24、类间日疟原虫种(Plasmodium vivax-like sp))。
优选地，所述抗原肽可源自于恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫和三日疟原虫。
通常，源自于疟原虫物种的包含至少一个卷曲螺旋的抗原肽可选自SEQID No.1-132、SEQ ID No.134-SEQ ID No.153和SEQ ID No.159-SEQ ID No.163的氨基酸序列、所述氨基酸序列的生物学活性片段、所述氨基酸序列的分子嵌合体、所述氨基酸序列的结合物和/或所述氨基酸序列的变体。
根据下文中描述的产生抗原肽的方法，申请人筛选出了SEQ IDNo.1-132、SEQ ID No.134-SEQ ID No.153和SEQ ID No.159-SEQ ID No.163，并示于表1中。所有这些肽序列都包含至少一个卷曲螺旋区域。
表1
在这163条肽序列中，随机选取95个卷曲螺旋片断(30-70个氨基酸长并且具有最高的卷曲螺旋分值)并且它们或者存在于相同蛋白中或者存在于不同蛋白中。这95个选取的抗原肽中的大部分可被一组生活在病区的供体的血清不同程度地识别(5-93％)(表2)。
表2
使用来自布基纳法索的37份成人血清、来自坦桑尼亚的42份成人血清和来自哥伦比亚的39份成人血清对95个合成肽进行的抗体反应。结果表示为％(值＞平均阴性对照+3SD)、比率(实验OD/平均OD阴性对照)和未测定(nd)。
因此，识别了长度为200-10,000个氨基酸的71个新蛋白。将这些蛋白中的两个包含抗原肽(SEQ ID No.38；147)的蛋白(蛋白PF14_0089；PFD0520c)经化学合成为单个多肽或者重叠多肽，并且用ELISA试验进行识别测试(见表2)。这些新的蛋白片段可被15-100％的来自布基纳法索、坦桑尼亚和来自哥伦比亚的成人血清识别。亲和纯化的抗体可识别感染寄生虫的红血细胞。另外，来自蛋白PF14_0089的片段还与坦桑尼亚儿童中的保护作用相关(数据未显示)。
“生物学活性片段”是指包含的氨基酸长度比本发明的肽序列长度短的序列的一部分。只要该序列表现出与其所来源的天然序列相同的性质，就可以使用该序列。优选地，该序列包含的氨基酸长度为本发明的相应肽序列的不到30％，优选地不到60％，特别地不到90％。另外优选地，那些序列包含长度为至少20、最优选25、更优选40、再更优选50个与本发明的肽序列相同的连续氨基酸。
可以通过本领域已知的各种方法和技术制备这些生物学活性片段，所述方法和技术例如化学合成(例如使用多通道肽合成仪)。
另外，由于天然肽(L-型)本身存在被天然蛋白酶降解的问题，可以制备的本发明的肽以使其包括D-型的所述肽和/或所述肽的“逆反异构体”。优选地，制备本发明的肽的截短部分、变体或者结合的逆反异构体。
“逆反异构体”的意思是与一个线性肽的序列方向相反并且每个氨基酸残基手性相反的异构体；因此，可以不存在末端基团的互补。
因此，防止所述肽的天然蛋白水解可以提高所述特定的杂二价或者杂多价化合物的效力。因为免受天然蛋白酶的降解，可以预测逆反向的肽比非逆反向的类似物具有更高的生物活性。而且逆反向的肽已经显示出更高的稳定性和更低的免疫原性[Sela M.and Zisman E.，(1997)Different roles ofD-amino acids in immune phenomena-FASEB J.11，449]。
依照例如Sela and Zisman，(1997)中所述制备已知序列肽的逆反肽。
本发明还包括所述抗原肽的修饰(所述修饰通常不改变一级序列)，包括肽的体内或者体外化学衍生化，如乙酰化或者羧化。还包括糖基化修饰，例如通过在肽的合成和处理中或者在进一步的处理步骤中对所述肽进行糖基化模式的修饰(例如通过使所述肽与例如哺乳动物糖基化酶或去糖基化酶等影响糖基化的酶相接触)来实现的那些糖基化修饰。还包括具有磷酸化氨基酸残基的序列，所述磷酸化氨基酸残基例如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸或者磷酸苏氨酸。
本发明还包括本发明的抗原肽的分子嵌合体。“分子嵌合体”意欲指可以包含所述抗原肽的一个功能部分并且可以通过例如本领域技术人员已知的蛋白质化学技术获得的多核苷酸或者多肽序列。
本发明还考虑了所述抗原肽序列或者其片段或亚部分的特定结合。优选地，如实施例4中所公开的，所述结合抗原肽选自肽LR162(SEQ ID No.154)、LR162A(SEQ ID No.155)、LR179(SEQ ID No.156)、LR179A(SEQ ID No.157)和LR181(SEQ ID No.158)。
本发明还包括所述抗原肽的变体。术语“变体”指具有在某种程度上与天然序列多肽不同的氨基酸序列的多肽，即由一个或者多个氨基酸被其他氨基酸置换引起的不同于所述天然3D序列的氨基酸序列。所述变体可以是天然存在的(例如多态现象)也可以是合成的。变体具有在天然氨基酸序列的氨基酸序列中特定位置的置换、缺失和/或插入。氨基酸的置换在本文被定义为以下五组之一中的交换：
I.小脂肪族的、非极性或微极性残基：Ala，Ser，Thr，Pro，Gly
II.极性的、正电荷残基：His，Arg，Lys
III.极性的、负电荷残基：和它们的酰胺：Asp，Asn，Glu，Gln
IV.较大的、芳香族残基：Phe，Tyr，Trp
V.较大的、脂肪族的、非极性残基：Met，Leu，Ile，Val，Cys。
非天然氨基酸也可以通过化学合成引入。
本发明还涉及一种疟原虫物种的混合抗原组合物，所述组合物包含至少2种本发明的抗原肽或者其混合物。本申请人已经证明，由于对多种抗原(所述抗原可以参与相同或者不同的致病机制)同时发生免疫应答出人意料地会产生更强且持久的保护，利用本发明的混合抗原组合物可以提高疫苗的性能。所述抗原肽可以是游离的或者连接在一起。若所述抗原肽连接在一起，它们优选地通过一种例如PEG(聚乙二醇)的连接物连接起来。
优选地，所述混合抗原组合物选自SEQ ID No.1、2和3的结合，或者SEQID No.16、33、38和2的结合，或者SEQ ID No.35、27、4、34、24和37的结合。
本发明还包括本发明的抗原肽或者混合抗原组合物用于制备刺激哺乳动物免疫应答的疫苗组合物的用途。所述“哺乳动物”指任何归于哺乳动物类别的动物，包括人、家养和农场动物和动物园动物、运动用动物或宠物动物，例如狗、马、猫、牛、猴等等。优选地，所述哺乳动物为人。
为了促进刺激的免疫应答，优选地将肽SEQ ID NO：1-163或者所述混合抗原组合物与任何的载体分子或者载体蛋白偶联。可以使用各种蛋白、糖蛋白、碳水化合物或者亚单位载体，包括但不限于破伤风类毒素/毒素、白喉类毒素/毒素、假单胞菌突变载体、细菌外膜蛋白、水晶状细菌细胞表层、各种内毒素或外毒素、血清白蛋白、γ-球蛋白或钥孔傶血蓝蛋白、重组体、外毒素A、LT毒素、霍乱B毒素、克雷白氏肺炎菌OmpA、细菌鞭毛、艰难梭状芽胞杆菌重组毒素A、肽树枝状化合物(多重抗原肽)、泛DR表位(PADRE)、来自破伤风毒素的通用T细胞表位、共生细菌、噬菌体(在其表面展示肽和细菌噬菌体)、与IgG1重组体连接的肽和/或其他合适的组分。
另外，由于佐剂可以增加免疫保护抗体滴度或者增强细胞介导的免疫应答，所述SEQ ID NO：1-163的肽或者所述混合抗原组合物或者它们与载体蛋白的缀合物可以进一步地与佐剂混合以引发免疫应答。这种佐剂可包括但不限于MPL+TDM+CWS(SIGMA)、MF59(一种包括5％角鲨烯、0.5％失水山梨醇单油酸酯和0.5％失水山梨醇三油酸酯水包油乳剂Chiron)、不耐热毒素(HLT)、CRMig(白喉毒素的无毒遗传突变体)角鲨烯(IDEC PHARMACEUTICALS CORP.)、卵清蛋白(SIGMA)、Quil A(SARGEANT，INC.)、磷酸铝凝胶(SUPERFOS BIOSECTOR)、霍乱全毒素(CT LIST BIOLOGICAL LAB.)、霍乱毒素B亚基(CTB)、霍乱毒素A亚基-蛋白A D-片断融合蛋白、胞壁酰二肽(MDP)、Adjumera(聚磷腈，VIRUSRESEARCH INSTITUTE)、SPT(一种在pH 7.4磷酸盐缓冲盐水中含5％角鲨烯、0.2％吐温80、1.25％普卢兰尼克L121的乳剂)、阿夫立定(M6PHARMACEUTICALS)、Bay R1005(BAYER)、Calcitrol(SIGMA)、磷酸钙凝胶(SARGEANT INC.)、CRL 1005(嵌段共聚物P1205，VAXCEL CORP.)、DHEA(MERCK)、DMPC(GENZYME PHARMACEUTICALS and FINE CHEMICALS)。DMPG(GENZYME PHARMACEUTICALS and FINE CHEMICALS)、γ菊粉、Gerbu佐剂(CCBIOTECH CORP.)、GM-CSF、(IMMUNE CORP.)、GMDP(PEPTECH LIMITED)、咪喹末特(3M PHARMACEUTICALS)、ImmTher(ENDOREX CORPORATION)、ISCOMTM(ISCOTEC AB)、Iscoprep 7.0.3TM(ISCOTEC AB)、洛索立宾、LT-口服佐剂(不稳定的大肠杆菌肠毒素、原毒素，BERNA PRODUCTS CORP.)、MTP-PE(CIBA-GEIGY LTD)、Murametide，(VACSYN S.A.)、Murapalmitine(VACSYN S.A.)、普卢兰尼克L121(IDEC PHARMACEUTICALS CORP.)、PMMA(INSTITUT FURPHARMAZEUTISCHE TECHNOLOGIE)、SAF-1(SYNTEX ADJUVANT FORMULATIONCHIRON)、硬脂酰酪氨酸(BIOCHEM THERAPEUTIC INC.)、Theramidea(IMMUNOTHERAPEUTICS INC.)、苏氨酰基-MDP(CHIRON)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、氢氧化铝、溴化二甲基双十八烷基铵、Adjuvax(ALPHA-BETATECHNOLOGY)、注射明矾(PIERCE)、单磷酸类脂A(RIBI IMMUNOCHEMRESEARCH)、MPL+TDM(RIBI IMMUNOCHEM RESEARCH)、Titermax(CYTRX)、QS21、t Ribi佐剂系统、TiterMaxGold、QS21、Adjumer、Calcitrol、CTB、LT(大肠杆菌毒素)、LPS(脂多糖)、阿夫立定、CpG序列(Singh et al.、1999 Singh，M.and Hagum，D.，Nature Biotechnology 1999 17：1075-81)毒素、类毒素、糖蛋白、脂质、糖脂、细菌细胞壁、亚基(细菌的或病毒的)、糖部分(单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖和多糖)、各种脂质体制剂或者皂甙。各种佐剂的组合可以与所述抗原一起使用以制备免疫原制剂。也可以使用胃肠外给药或者诱导粘膜免疫的佐剂。
本发明还考虑了一种用于刺激哺乳动物免疫应答的疫苗组合物，其特征在于所述组合物包含一种抗原肽或者一种混合抗原组合物。
所述疫苗组合物可有各种不同的给药方式，所述给药方式包括血管内、腹膜内、肌内、皮内、皮下、口服、鼻部或者吸入给药。在一个实施方案中，所述组合物可以进一步地包含一种可药用的赋形剂和/或载体。
本发明中使用的“被给予”或者“给予”是指使一种药物、治疗剂、诊断剂或者药物组合物、治疗组合物、诊断组合物与所述受试者接触，所述受试者优选为人。
所述疫苗组合物的确切组成取决于具体的抗原肽或者抗原混合物或者肽-载体缀合物以及给药途径。
当使用多于一种的抗原肽(例如两种或者更多种)或者混合抗原组合物的时候，它们使用形式可以是可形成一种结合物的物理混合物形式，或者是两种或多种抗原肽的融合物形式。所述结合物的产生可以通过例如重组体技术、使用合适的连接物融合预先制备的抗原肽，或者在存在或不存在例如PEG(聚乙二醇)等的连接物的条件下共线性合成所述结合物来实现。
本发明还包括一种抗体，其特征在于它可以识别本发明的抗原肽或者本发明的混合抗原组合物。
本文使用的“抗体”是一种与特异性抗原反应的蛋白分子，并且根据结构特征属于如下五种不同类型的一种：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。所述抗体可以是单克隆抗体也可以是多克隆抗体。
本发明的抗体也可以被制备用于被动免疫治疗，用作诊断试剂，以及用作例如亲和色谱等其他方法中的试剂。
当本发明的抗体被应用于被动免疫治疗中的时候，可以将它包括在一种药物组合物中并给予哺乳动物。在一个实施方案中，所述药物组合物包括一种可药用的载体并且任选地可以包括可药用的赋形剂。所述药物组合物可以通过血管内、腹膜内、肌内、皮内、皮下、口服、鼻部或者气雾吸入给药。优选地，所述药物组合物通过血管内、肌内、口服、鼻部或者气雾吸入给药。
在一个实施方案中，本发明包括一种针对本发明的抗原肽或者混合抗原组合物的抗体，特别是一种单克隆抗体。具体而言，可根据已知的遗传工程方法(Winter G.，and Milstein C.，Nature，1991，349 293-299)，使用肽SEQ IDNO：1-163产生杂交瘤，使用这些杂交瘤可以制备重组体衍生抗体。优选地，如实施例2和表3所公开的，所述抗体选自α-8、α-9、α-11/12、α-13、α-14、α-27、α-86、α-102、α-99、α-68、α-41、α-110、α-78、α-135、α-136、α-138、α-146和α-151或者其混合物。
也可以利用本领域中已知的使抗体人源化或者产生人源化抗体的其他方法。这些方法可以包括但不局限于ABGENIX INC.开发的xenomouse技术(见美国专利No.6,075,181和6,150,584)和BIOVATION、BIOINVENT INTERNATIONALAB、PROTEIN DESIGN LABS、APPLIED MOLECULAR EVOLUTION INC.、IMMGENICSPHARMACEUTICALS INC.、MEDAREX INC.、CAMBRIDGE ANTIBODY TECHNOLOGY、ELAN、EOS BIOTECHNOLOGY、MEDIMMUNE、MORPHOSYS、UROGENSYS INC.、AVANIRPHARMACEUTICAL/XENEREX BIOSCIENCES、AFFIBODY AB、ALLEXION ANTIBODYTECHNOLOGIES、ARIUS RESEARCH INC.、CELL TECH、XOMA、IDEC PHARMACEUTICALS、NEUGENESIS、EPICYTE、SEMBIOSYS GENETICS INC.、BIOPROTEIN、GENZYMETHERAPEUTICS、KIRIN、GEMINI SCIENCES、HEMATECH开发的方法。
类似地，也可以应用本领域已知的其他方法筛选针对SEQ ID NO：1-163的人抗体分泌细胞。
本文使用的术语“人源化抗体”或者其他类似术语是指一种至少其一部分包含人蛋白序列的抗体。人蛋白序列的量可能根据所述抗体的制备方法而不同。
本文用术语“完全人源化的抗体”或者“人抗体”或者类似术语表示的抗体的制备可以通过例如上述xenomouse技术或者用EB病毒(Epstein Barrvirus)转化人B细胞(Traggiai et al，Nat.Med.2004，10(8)：871-5)实现。也可以通过例如噬菌体展示技术等其他方法来制备(Bradbury AR，MarksJD，J.immunol.Methods，2004，290(1-2)：29-49)。
术语“识别”是指本发明的抗体可针对本发明的抗原肽或者混合抗原组合物并且与之结合的。
当应用重组技术制备本发明的抗原肽的时候，优选地使用编码所述多肽的核酸分子或者其片段。
因此，本发明还涉及纯化的和分离的核酸序列，所述序列包括
i)编码本发明的一种抗原肽的核苷酸序列，
ii)与i)互补的核酸序列，
iii)i)或者ii)的简并核酸序列，
iv)在严格条件下能与i)、ii)或者iii)杂交的核酸序列，
v)编码本发明的抗原肽的截短物或者类似物的核酸序列，
vi)和/或编码本发明的所述抗原肽的生物活性片段的i)、ii)、
iii)、iv)或者v)的片段。
根据本发明，“纯化的和分离的核酸序列”是指为编码本发明的抗原肽的核酸分子或者编码该抗原肽的核酸的状态。核酸应游离于或基本上游离于与之天然相关的物质之外，所述物质例如为与所述核酸共存于天然环境或其制备环境(例如细胞培养)中的多肽或核酸，所述制备环境为通过重组核酸技术在体外或体内进行制备时的环境。
术语“核酸”意欲指DNA或者RNA。
若核酸为DNA，则本发明中可以使用的DNA可以是任何的多脱氧核苷酸序列，包括例如双链DNA、单链DNA、其中一条或两条链由两个或多个片段构成的双链DNA、其中一条或两条链具有连续的磷酸二酯主链的双链DNA、包含一个或多个单链部分和一个或多个双链部分的DNA、DNA链完全互补的双链DNA、DNA链仅部分互补的双链DNA、环状DNA、共价闭合DNA、线状DNA、共价交联DNA、cDNA、化学合成DNA、半合成DNA、生物合成DNA、天然分离的DNA、酶消化的DNA、剪切的DNA、标记的DNA(例如放射性标记的DNA和荧光标记的DNA)、包含一种或多种非天然存在的核酸种类的DNA。
可以通过例如磷酸三酯法等的标准化学技术或者通过自动合成方法和PCR方法合成编码本发明的抗原肽或其片段的DNA序列。
也可以通过酶技术制备编码本发明的抗原肽的纯化的和分离的DNA序列。因此，可以用限制酶(可在设定的识别序列处切割核酸分子)将核酸序列从包含该核酸序列的较大核酸分子中分离出来，所述核酸序列例如编码本发明的抗原肽或者其片段的DNA(或RNA)。
本发明还涵盖多核糖核苷酸(RNA)形式的核酸，包括例如单链RNA、双链RNA、其中一条或两条链由两个或多个片段构成的双链RNA、一条或两条链具有连续的磷酸二酯主链的双链RNA、包含一个或多个单链部分和一个或多个双链部分的RNA、RNA链完全互补的双链RNA、RNA链仅部分互补的双链RNA、共价交联RNA、酶消化的RNA、剪切的RNA、mRNA、化学合成的RNA、半合成的RNA、生物合成的RNA、天然分离的RNA、标记的RNA(例如放射性标记的RNA和荧光标记的RNA)、包含一种或多种非天然存在的核酸种类的RNA。
所述纯化的和分离的核酸序列(DNA或者RNA)也包括与编码本发明的抗原肽的核酸序列具有基本的序列同一性或同源性的纯化的和分离的核酸序列。优选地，所述核酸基本的序列同一性例如具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或者85％的核酸序列同一性；更优选90％的核酸序列同一性；最优选至少95％、96％、97％、98％或者99％的核酸序列同一性。
如本领域已知的那样，且为本文所使用的“同一性”是两个或多个氨基酸序列或者两个或多个核酸序列之间的关系，这可以通过比较所述序列来确定。“同一性”也指在氨基酸序列或者核酸序列之间序列相关的程度，视情况可以通过这些序列的字符串之间的匹配程度确定。同一性和相似性是本领域的技术人员熟知的术语并且可以通过常规的方法进行计算(例如参见ComputationalMolecular Biology，Lesk，A.M.ed.，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，PartI，Griffin，A.M.and Griffin，H.G.eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.AcadmeicPress，1987；and Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.eds.M.Stockton Press，New York，1991，Carillo，H.and Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.48：1073，1988)。
通常优选那些被设计成可以产生所述序列之间最大匹配的方法。确定一致性和相似性的方法可以用可公开获得的计算机程序编码，所述计算机程序包括GCG程序包(Devereux J.et al.，Nucleic Acids Research 12(1)：387，1984)；BLASTP、BLASTN和FASTA(Atschul，S.F.et al.J.Molec.Biol.215：403-410，1990)。BLAST X程序可以从NCBI和其他来源公开地获得(BLASTManual，Altschul，S.et al.NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.et al.J.Mol.Biol.215：403-410，1990)。
本发明还涵盖与本发明的抗原肽互补的核酸序列。
由于存在遗传密码的简并性，序列不同于编码本发明的抗原肽的核酸序列或者其互补序列的简并核酸序列也在本发明的范围以内。由于存在遗传密码的简并性，这种核酸编码本发明的抗原肽的功能等价物，但是其序列却有所不同。这可能产生不影响所述氨基酸序列的沉默突变。任何的和所有的这类核酸变体都在本发明的范围以内。
另外，本发明还考虑了能够在严格条件下——优选高度严格条件下——与编码本发明的抗原肽的核酸序列以及它的互补或者简并核酸序列杂交的核酸序列。合适的促进DNA杂交的严格条件是本领域技术人员已知的，或者可以参见Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。例如，可以使用大约45℃的6.0X的氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，然后用50℃的2.0XSSC洗涤一次。可以根据清洗步骤中的使用的条件选择严格程度。例如，洗涤步骤中的盐浓度可以选择一种50℃的大约0.2XSSC的高严格度。另外，洗涤步骤中的温度可以处于高度严格条件，在大约65℃下。
本发明还包括编码本发明的抗原肽的纯化的和分离的核酸，所述核酸包括编码所述抗原肽的截短物或者类似物的核酸序列。
本发明还包括所公开的纯化的和分离的核酸序列的等位基因变体；即，所述分离的和纯化的核酸天然存在的其他形式，所述其他形式也编码与所述纯化的和分离的核酸序列所编码的抗原肽相同、同源或者相关的抗原肽。另外，可以通过诱变技术或者通过直接合成产生非天然存在的变体。
本发明还考虑了所公开的纯化的和分离的核酸序列的片段，所述片段是指所含核苷酸的长度比编码所述抗原肽的核酸序列短的序列、其互补核酸序列或者其简并核酸序列。只要该序列表现出与衍生它的天然序列相同的性质，就可以使用该序列。优选地，该序列包含的氨基酸的长度为所述抗原肽的相应的纯化的和分离的核酸序列的少于90％，优选地少于60％，特别地少于30％。
本发明的另一考虑为提供一种包含上述编码本发明抗原肽的纯化的和分离的核酸序列的表达载体。
为本领域所熟知，表达载体的选择直接取决于希望获得的功能特性，例如抗原肽表达和待转化或者转染的宿主细胞。
另外，所述表达载体可以进一步包含一种可操作地连接有本发明的纯化的和分离的核酸序列的启动子。这是指所连接的、编码本发明的抗原肽的所述分离的和纯化的核酸序列受到合适的调控序列的调控，所述调控序列使得所插入的分离的和纯化的核酸序列可以表达即转录并翻译。
本文使用的术语“启动子”表示本领域已知的任何其他调控序列，例如通常用于多肽表达的启动子和/或增强子、多腺苷酸化位点和剪接点，或者还可包括一个或多个分离的靶向序列，可任选地编码可筛选标记。只要启动子与宿主细胞相容就可以使用，可用的启动子例如有从例如多瘤病毒、腺病毒(例如2型腺病毒)、乳头状瘤病毒(例如牛乳头状瘤病毒)、鸟类肉瘤病毒、巨细胞病毒(例如鼠或人巨细胞病毒立即早期启动子)、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(例如SV 40早期和晚期启动子)等病毒基因组获得的启动子或者从异种哺乳动物启动子获得的启动子，例如肌动蛋白启动子或者免疫球蛋白启动子和热休克启动子。
可以使用的增强子例如有已知来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的增强子序列，或者例如SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤和腺病毒增强子等的来自真核细胞病毒的增强子。
许多的宿主/表达载体的组合都可用于表达本发明的核酸序列。例如，有用的表达载体可以包含染色体DNA序列区段、非染色体DNA序列区段和合成DNA序列区段。合适的载体包括SV40和已知的细菌质粒的衍生物，例如大肠杆菌质粒col E1、pCR1、pBR322、pMB9以及它们的衍生物、例如RP4的质粒；噬菌体DNA例如噬菌体X的衍生物(如NM989)和其他噬菌体DNA(如M13)和丝状单链噬菌体DNA；例如2μ质粒等的酵母质粒或者其衍生物；在真核细胞中有用的载体，例如在昆虫或者哺乳动物细胞中有用的载体；由质粒和噬菌体DNA组合产生的载体，例如为利用噬菌体DNA或者其他表达调控序利而修饰的质粒；等等。
本发明的另一考虑为提供一种包含本发明的纯化的和分离的核酸序列或者上述表达载体的宿主细胞(真核的或者原核的)。
通常，这种宿主细胞被转化或者转染有本发明的纯化的和分离的核酸序列或者本文描述的表达载体。
术语“转染的细胞”或者“转化的细胞”或者“转染/转化的细胞”的意思是被引入细胞外DNA并且因此含有所述细胞外DNA的细胞。可将所述DNA引入所述细胞中以使核酸可作为一种染色体整合部分复制或者作为染色体外部的元件复制。
通过本领域所熟知方法，可完成用包含本发明的纯化的和分离的DNA序利的表达载体对合适的真核或者原核宿主细胞进行的转化或者转染，所述熟知方法通常依据使用的载体类型而定。关于这些方法可参见例如Maniatis et al.1982，Molecular Cloning，A laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory和可以通过商业途径获得的方法。
许多单细胞宿主细胞可用于本发明的核酸序列的表达。这些宿主可以包括本领域熟知的真核和原核宿主，例如大肠杆菌、假单胞菌、芽胞杆菌、链霉菌、真菌(如酵母)的菌株和动物细胞例如CHO、YB/20、NSO、SP2/0、R1.1、B-W和L-M细胞、非洲绿猴肾细胞(如COS 1、COS 7、BSC1、BSC40和BMT10)、昆虫细胞(如Sf9)和组织培养的人细胞和植物细胞。优选地，所述宿主细胞为细菌细胞，更优选地为大肠杆菌细胞。
本发明还涉及一种用于治疗和/或预防疟疾的疫苗组合物，所述组合物至少包含本发明的抗原肽或者本发明的混合抗原组合物。
另一方面，本发明还涉及一种用于治疗和/或预防疟疾的核酸疫苗组合物，所述组合物至少包含本发明的纯化的和分离的核酸序列，或者一种表达载体，所述表达载体包含本发明的纯化的和分离的核酸序列的至少一个拷贝、所述纯化的和分离的核酸的片段、所述纯化的和分离的核酸的分子嵌合体、所述纯化的和分离的核酸的结合物和/或所述纯化的和分离的核酸的变体。
本发明的又另一方面是一种产生用于制备抗疟原虫物种的疫苗组合物的抗原肽的方法，其特征在于其包含以下步骤：
a)识别在所述疟原虫物种基因组中是否存在编码至少一个卷曲螺旋区域的序列，
b)选择所述编码至少一个卷曲螺旋区域的序列，
c)合成一种与步骤b)中选出的包含至少一个卷曲螺旋区域的序列相对应的抗原肽，
d)使合成的抗原肽与生活在病原体病区的至少一个供体的血清样品相接触；和
e)确定所述血清样品是否有至少一种抗体与所述合成的抗原肽结合。
可通过例如基于算法的计算机程序的生物信息学工具，识别是否存在编码所述疟原虫物种基因组中的至少一个卷曲螺旋区域的序列。
例如，恶性疟原虫3D7基因组被应用于生物信息学分析(Gardner，2002)。使用包含用于敏感的广义序列谱(sensitive generalized sequence profile)的程序的名为pftools的软件(Bucher et al.，1996)来寻找短α-螺旋卷曲螺旋区域。通过将氨基酸序列与相应的已知卷曲螺旋结构域进行比对，来构建卷曲螺旋谱。使用两个包含四个和五个七重复的谱进行分析。利用这种方法选择的卷曲螺旋区域也经过COILS程序的检测。
使用以下程序对选定的包含α-螺旋卷曲螺旋的蛋白进一步检测它们可能的表面定位和GPI锚定：鉴定潜在的信号肽(PSORT http://www.psort.org/psortb/、SignalP，http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、跨膜区域(TMPRED http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html和TMHMMhttp://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)和GPI-锚定蛋白http://mendel.imp.univie.ac.at/sat/gpi/gpi_server.html。
然后，应用相同的计算机程序或者其他程序将选定的序列与所述病原体的转录组和蛋白质组数据库进行比较，以例如鉴定无性红内期中的蛋白(www.PlasmoDB.org)。如果该序列的卷曲螺旋度高并且如果它在所述转录组和所述蛋白质组数据库中都存在，则选择它以应用于后面的肽合成。
根据例如Fmoc固相合成法等本领域所熟知的技术进行肽合成。然后通过RP-HPLC或者任何其他纯化技术对所述肽粗制品进行纯化，并且用质谱法仪(MALDI-TOF)进行分析。
然后使合成肽与来自生活在疟疾病区并且被所述病原体感染的个体的一份血清或者一组血清相接触，以评估所述血清是否与所述合成抗原结合并因此产生阳性抗体反应。进一步分析这些反应以确定是否存在IgG1和IgG3亚类，所述亚类已经显示出在恶性疟原虫作为病原体的情况下，可通过一种抗体依赖性细胞毒性抑制(ADCI)机制减少Pf的生长从而发挥保护功能(Oeuvray et al，1994)。可采用ADCI和浸润抑制测定法(Okoyeh et al，1999，Haynes et al，2002)，通过亲和色谱法纯化的肽特异性抗体对抗体进行生物活性检测。
通常，所述病原体可以选自结核分枝杆菌、流感、弓形虫、埃博拉病毒、链球菌、恶性疟原虫、脑膜炎球菌(meningicoccus)和葡萄球菌(staphyloccoccus)。
若病原体是恶性疟原虫，从文献(Betts，2002，Florens et al，2002，Bozdech et al，2003)中获得的蛋白质组和转录组数据使得也可以评估这些分子是否存在于所述红内期中。
本发明还包括一种用于确定在样品中是否存在本发明的抗原肽或者混合抗原组合物的诊断工具，所述工具包括：
i)使所述样品与一种针对本发明的抗原肽或者混合抗原组合物的抗体相接触，并
ii)确定所述抗体是否与所述样品的一个组分结合。
本发明还包括一种用于确定样品中是否存在针对本发明的抗原肽或者混合抗原组合物的抗体的诊断工具，所述工具包括：
i)使所述样品与本发明的抗原肽或者混合抗原组合物接触，并
ii)确定是否有抗体与本发明的所述抗原肽的一个组分或者所述混合抗原组合物结合。
本文使用的“样品”是一种物质、材料或者种群的一个等份部分或者代表性部分。例如，样品可以是一个血液样品、生物组织样品、尿样或者粪便样品。优选地，所述样品为血液。
本文使用的“供体”是生活在病原体病区并且已经或者疑似感染了所述病原体的人类个体。
“组分”是指可被本发明的抗体识别的任何氨基酸、核酸、脂质或者基序。
本发明还包括一种包含获自疟原虫物种的至少一种抗原肽的蛋白，所述抗原肽包含至少一个卷曲螺旋区域。
优选地，所述蛋白包含选自SEQ ID No.1-132，SEQ ID No.134-SEQ IDNo.153和SEQ ID No.159-SEQ ID No.163氨基酸序列的序列、所述序列的生物学活性片段、所述序列的分子嵌合体、所述序列的结合物和/或所述序列的变体。最优选地，所述蛋白是PF14_0089(包含SEQ ID No.38)或者蛋白PFD0520c。
通常，可化学合成包含本发明的至少一种抗原肽的蛋白并且用ELISA测定对其进行识别检测。但是也考虑了使用任何其他的重组技术或回收方法，例如在一个宿主细胞中，由编码所述蛋白的核苷酸序列表达所述蛋白。
本发明还包括一种可用于刺激哺乳动物的免疫应答的包含一种含有至少一种本发明的抗原肽的蛋白的疫苗组合物，以及所述疫苗组合物的用途。
本发明还包括一种识别含有至少一种本发明的抗原肽的蛋白的抗体，以及所述抗体在诊断工具中的应用。
本发明还包括纯化的和分离的核酸序列，所述序列包括：
i)编码本发明的蛋白的核苷酸序列，
ii)与i)互补的核酸序列，
iii)i)或者ii)的简并核酸序列，
iv)在严格条件下能与i)、ii)或者iii)杂交的核酸序列，
v)编码本发明的蛋白质的截短物或者类似物的核酸序列，
vi)和/或i)、ii)、iii)、iv)或者v)的片段。
本发明还涉及包含编码本发明蛋白的所述纯化的和分离的核酸序列的至少一个拷贝的表达载体，以及一种包含所述纯化的和分离的核酸序列或者所述表达载体的宿主细胞。
本发明范围内还涵盖一种试剂盒，所述试剂盒包含本文描述的疫苗组合物，任选地还包含使用试剂和/或说明书。
备选地或者另外地，所述试剂盒还可以包括商业上和用户方面所需的其他物质，所述物质包括缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。
本申请说明书通篇引用了各种参考文献，每篇参考文献通过引用的方式全部纳入本文中。
通过参考以下的实施例可以更充分地理解前面的说明。然而，这些实施例为实施本发明的方法的示例，并不是意欲限制本发明的范围。
实施例
实施例1
材料
合成中使用的化学药品和溶剂购自Fluka(Buchs，Switzerland)和Novabiochem(Laufelfinger，Switzerland)。坦桑尼亚混合人血清、布基纳法索和坦桑尼亚成人个体血清和裂殖子切片获自于瑞士热带研究所(STI，Basel，Switzerland)。子胞子切片从Nijmegen(Holland)获得。
肽合成
在瑞士洛桑大学(University of Lausanne，Switzerland)生物化学系，使用Advanced ChemTech(Hatley St George，UK)AC T348 Omega多通道合成仪和Applied Biosystem合成仪431A(Foster City，CA)，采用Fmoc固相合成法来合成所述所有的肽。由于已经预测蛋白PF14_0089的1-46残基片段包含一个前导序列和一个跨膜序列(plasmodb.org；2004年9月)，因此合成该蛋白的47-186残基。使用RP-HPLC(C18制备柱)纯化肽粗制品并且通过质谱法(MALDI-TOF；Applied Biosystem)进行分析。
ELISA
96孔微量滴定板(Maxisorp F96，Nunc，Denmark)用浓度为5μg/ml的肽(50μl/孔)在4℃包被过夜(O/N)。用含0.05％的吐温20(PBS-T；Sigma，St-Louis，MO，USA)的磷酸盐缓冲盐溶液洗涤该板，并用含5％脱脂奶粉的PBS-T溶液在室温(RT)下封闭1个小时。将个体小鼠血清或者个体人血清用PBS-T-2.5％脱脂奶粉(PBS-T-乳)从1/200开始进行连续稀释，并加到所述板上，在RT下孵育1个小时。经过洗涤之后，加入用PBS-T-乳稀释(1/1000)的碱性磷酸酶(Sigma，St-Louis，MO，USA)偶联的山羊抗小鼠或山羊抗人多价免疫球蛋白，并将该板孵育1小时。洗涤板，并且用对硝基苯磷酸酯(Sigma，St-Louis，MO，USA)显示酶的存在。使用MultiskanAscent Reader测定405nm下的吸光度。将样品吸光度(OD)大于阴性对照(正常小鼠血清或者来自未患病供体的人血清)的平均吸光度(OD)值+3倍标准差(SD)的最高稀释度确定为所述测试样品的滴度。
实施例2：使用亲和色谱法纯化特异性抗体
抗原-琼脂糖偶联体的制备
将5mg的抗原稀释在1mL的偶联缓冲液中(含0.5M NaCl的0.1MNaHCO3，pH 8.0)。用1mM HCl溶胀CNBr-琼脂糖4B(Amersham BioscienceAB，Uppsala，Sweden)，然后用偶联缓冲液洗涤该凝胶。将抗原溶液加至凝胶中并在室温下将该混合物搅拌1小时。偶联反应之后，用偶联缓冲液洗掉多余的抗原。在室温下用乙醇胺(0.25M；pH 8.0)处理30分钟以封闭剩余的活性基团。然后先用醋酸钠缓冲液(0.1M；pH 4.0)洗涤凝胶，之后再用偶联缓冲液洗涤。抗原-琼脂糖偶联体可以立即使用或者在4℃下保存于含1mM的叠氮化物的PBS(1x)中。
特异性抗体的分离
用含0.5M氯化钠的PBS(1x)将混合人血清稀释四倍并且与抗原-琼脂糖偶联体混合。然后将该混合液在4℃下轻轻地旋转搅拌过夜。离心后收集人血清并且在-20℃保存备用。用5mL的三羟甲基氨基甲烷(trizmabase)TRIS(20mM，含0.5M NaCl，pH 8.0)洗涤抗原-琼脂糖偶联体，然后用5mL的TRIS(20mM，pH 8.0)洗涤。用甘氨酸(0.1M，pH 2.5)洗脱结合的抗体。收集到的级分用TRIS(1M，pH 8)中和。
间接荧光抗体试验(IFAT)
在室温下将用Pf子胞子包被的玻片干燥30分钟，用100％的丙酮在4℃下固定10分钟，用PBS-T洗涤2次，小心地干燥，并用含5％胎牛血清(FCS)的PBS封闭30分钟(20μL/孔)。用100％的丙酮将用Pf裂殖子包被的玻片在-20℃下固定15分钟，并在室温下干燥过夜。使用PBS 1x-2.5％脱脂奶粉制备适当稀释的抗体或血清稀释液，并加到玻片上(10μL/孔)，并在恒湿箱中于室温下孵育1小时(子孢子)或者37℃下孵育30分钟(裂殖子)。用PBS-T洗涤以后，加入以1/50稀释于伊文思蓝溶液中的与Alexafluor 488(Molecular Probes，Oregon，USA)偶联的山羊抗小鼠多价免疫球蛋白(1/50000)(400μL/玻片)，并且在避光的条件下在恒湿箱中于室温下孵育50分钟(子孢子)或者37℃下孵育30分钟(裂殖子)。洗涤后用50％的甘油覆盖玻片、密封并用Zeica 200显微镜读数。
小鼠免疫
从Harlan(Horst，Holland)购买五周龄至七周龄的雌性CB6F1小鼠。将用PBS(1x)或水溶解并且用Montanide ISA720乳化的20μg肽从尾基部皮下注射至小鼠。用不同肽的混合物或者Ma16P1.37的片段和PfB0145c和PfD0110w的片段而言，注射量分别为10μg/小鼠和5μg/小鼠。在3周和6周后，对动物注射抗原进行加强免疫。在每次加强后的第十天，对小鼠取血以通过ELISA评估是否存在特异性抗体。如果进行阳性IFAT，可以根据Winter and Milstein(Nature，1991，349 293-299)分离单克隆抗体。结果见表7。
间接荧光抗体试验(IFAT)
在室温下将用Pf子胞子包被的玻片干燥30分钟，用100％的丙酮在4℃下固定10分钟，用PBS-T洗涤2次，小心地干燥，并用含5％胎牛血清(FCS)的PBS封闭30分钟(20μL/孔)。用100％的丙酮将用Pf裂殖子包被的玻片在-20℃下固定15分钟并且在室温下干燥过夜。用PBS 1x-2.5％脱脂奶粉制备适当稀释的抗体或血清稀释液，并加到玻片上(10μL/孔)，并在恒湿箱中于室温下孵育1小时(子孢子)或者37℃下孵育30分钟(裂殖子)。用PBS-T洗涤以后，加入以1/50稀释于伊文思蓝溶液的与Alexa fluor488(Molecular Probes，Oregon，USA)偶联的山羊抗小鼠多价免疫球蛋白(1/50000)或者山羊抗人IgG(Fc特异性)FITC偶联物(Sigma)(400μL/玻片)，并且在避光的条件下在恒湿箱中于室温下孵育50分钟(子孢子)或者37℃下孵育30分钟(裂殖子)。洗涤后用50％的甘油覆盖玻片、密封并且用Zeica 200显微镜读数。
寄生虫
在添加了0.5％albumax I(GibcoBRL-Invitrogen)的RPMI-1640中培养乌干达帕洛阿尔托株(Uganda Palo Alto strain)(FUP/C)。为了进行ADCI测定，将血液阶段的寄生虫培养物在1％的A型猪皮明胶(Sigma-Aldrich)上浮集24小时使其成熟后，再至少经过连续两次的山梨糖醇处理，使所述各血液阶段寄生虫培养物同步化。
人血清
用于亲和纯化的巴布亚新几内亚(PNG)成人混合血清是在1992年7月在受美国国际发展局支持的疟疾疫苗流行病学和评价项目(MVEEP)框架内(5)的一次截面调查过程中从东塞皮克省的Maprik区收集得到。该区域是疟疾的高发流行区。从PNG医学研究咨询委员会(Medical ResearchAdvisory Committee)获得了对于MVEEP的伦理学许可。通过静脉穿刺取血至含EDTA的管中。
从位于首都瓦加杜古以北15-50km的乌布里滕加省摩西高原中部的Goundry村收集所述血清。其气候具有苏丹大平原区域的特征，从十一月至次年五月为旱季，从六月至十月为雨季。疟疾传播在所述雨季高发并且具有显著的季节性。从布基纳法索的卫生部获得伦理学许可。在1998年疟疾低传播季节的截面调查过程中，在获得父母和监护人的知情同意之后，收集各种肝素静脉血样品。
在一项受Colombian Research Council(COLCIENCIAS)资助的项目的框架下，于2002年二月至五月进行的一次截面调查过程中，在获得人知情同意之后，在位于哥伦比亚太平洋海岸的主要港口Buenaventura收集血清。所述区域存在恶性疟原虫(P.falciparum)和间日疟原虫(P.vivax)两种疟疾的不稳定传播。从Universidad del Valle的伦理委员会(Institutional Review Board)获得对人志愿受试者取血的伦理学许可。通过静脉取血至含EDTA的管中，并且将血清分装并冰冻储存备用。
从生活在病区的免疫的个体制备混合的非洲人免疫球蛋白(PIAG)，并且从1000名以上没有疟疾病史的法国成年供体的混合群中得到阴性对照IgG(N-IgG)。简而言之，使用尺寸排阻Trisacryl GF05M(Pall BioSepra)柱并且接着使用离子交换DEAE Ceramic HyperD F柱(Pall BioSepra)纯化阳性和阴性对照中的IgG级分。然后用RPMI对纯化的IgG进行全面的透析，4℃保存备用。
人血单核细胞的制备
从没有过往疟疾史的健康血液供体(Lecourbe Blood Bank，Paris，France)的细胞单采法样品制备血单核细胞(MN)。使用Ficoll密度梯度(JPrep，Techgen)分离外周血单核细胞(PBMC)并且用10mM HEPES缓冲的无Ca2+和Mg2+的HBSS(二者都来自GibcoBRL-Invitrogen)洗涤。然后把细胞分配到聚苯乙烯96孔平底培养板(TPP，Switzerland)上并通过在5％CO2的潮湿气氛中在37℃孵育2小时以选择贴附的MN。通过非特异性酯酶测试(α-醋酸萘酯酶；Sigma Aldrich)估计，这种方法获得的贴附细胞中超过90％是MN。在ADCI测试之前检测来自每个供体的MN，并且只有那些没有直接抑制效应的MN才被应用于测定中。
实施例3
结果
使用序列谱进行的所述Pf基因组筛选，识别出几个包含推定的α-螺旋卷曲螺旋区域的蛋白。存在于蛋白质组和转录组数据库中并且具有最高的卷曲螺旋度的区域被选择用于后续的肽合成。通过从所述文献(Betts，2002，Florens et al，2002，Bozdech et al，2003)中获得的蛋白质组和转录组数据，本申请人评估了这些分子是否存在于红内期。分析/评价的结合识别了152个卷曲螺旋区域。选出存在于同一蛋白或者不同蛋白中的95个卷曲螺旋区段(30-70氨基酸长，具有最高的卷曲螺旋度)。大部分选出的抗原被一组生活在病区的供体血清在不同程度上识别(5-93％)(表2)。
因此，识别到71个长度为200-10,000氨基酸的新蛋白。
特异性针对许多肽的、亲和色谱纯化的抗体也从生活在坦桑尼亚的成年供体获得(表2)。这些抗体可对感染的红细胞染色(图1、表3)。另外，化学合成这些蛋白的其中之一(PF14_0089)，并且用ELISA测定中进行识别检测(表2)。这个新蛋白被78-100％的来自布基纳法索和坦桑尼亚的成人血清识别。亲和纯化的抗体可以识别寄生虫感染的红细胞。另外，该蛋白也与对坦桑尼亚儿童的保护作用有关。这些肽在小鼠体内也具有免疫原性并且特异性血清在IFAT中呈阳性(表7)。还分离了在IFAT中呈阳性的单克隆抗体。
表3
使用亲和纯化的对大部分识别肽特异的抗体在寄生虫生命周期的不同阶段进行间接荧光抗体试验(IFAT)。结果表示为弱阳性(+/-)和阳性(+)。在裂殖体晚期进行抑制测定以评估染色特异性。结果表示为观测到的抑制(+)、非抑制(-)和部分抑制(+/-)作用。
体外ADCI测定
向含2x105的按以上描述纯化的MN的孔中加入50μl的0.5％寄生虫血症和4％的血细胞比容的未同步化的寄生虫培养物。然后在孔中补加测试Ab和对照的Ab，并且用培养液将总体积调至100μl。在48小时和72小时之后，向每个孔中加入50μl的培养基，并且在96小时之后终止ADCI测定，并且通过光学显微镜检查Giemsa染色的涂片，红细胞计数≥50,000的涂片被确定为最终的寄生虫血症。对于每个测试抗体(Ab)都有两个包括如下对照的孔1)非特异的单核细胞抑制(对MN+寄生虫和MN+N-IgG+寄生虫两者)和2)通过对照或测试IgG直接抑制(对N-IgG+寄生虫和测试Ab+寄生虫两者)。使用终浓度为1mg/ml的PIAG和N-IgG，并分别作为阳性和阴性对照。使用浓度为15μg/ml的免疫纯化测试Ab。考虑到由于测试Ab与MN的协同效应引起的寄生虫生长抑制，特异性生长抑制指数(SGI)的计算如下：SGI＝100×[1-(％MN和测试Ab的寄生虫血症/％测试Ab的寄生虫血症)/(％MN和N-IgG的寄生虫血症/％N-IgG的寄生虫血症)]。
表4
ADCI实验，结果表示为特异性生长抑制指数(SGI)。使用的阳性对照(SGI＝100％)是从高度免疫的非洲成年人混合血清中纯化的IgG级分，在以前已发现所述级分在输入到非免疫的患者中的时候提供被动保护作用。α-8、α-9、......的意思是分别针对SEQ ID No.8或者No.9的抗体。
| 亲和纯化的抗体 | SGI(％) |
| α-8 | 0 |
| α-9 | 60 |
| α-11/12 | 未检测 |
| α-13 | 37 |
| α-14 | 46 |
| α-27 | 127 |
| α-86 | 0 |
| α-102 | 未检测 |
| α-99 | 0 |
| α-68 | 0 |
| α-41 | 未检测 |
| α-110 | 83 |
| α-78 | 0 |
| α-135 | 0 |
| α-136 | 未检测 |
| α-138 | 0 |
| α-146 | 70 |
| α-151 | 0 |
实施例4
构建抗原肽的结合物
使用Fmoc合成法和Applied Biosystem合成仪431A共线性合成包含不同肽组合(表)的结合抗原肽构建体。为了避免新抗原肽的形成，通过一个连接物——例如在表中示出的免疫沉默连接物聚乙二醇(PEG01-63-0141；NovaBiochem/Merck)——将单个的抗原肽连接起来。
表5
| 肽 | SEQ ID No. | 蛋白 | 序列 |
| LR162 | 154 | MAL6P1.37(PEG)PFB0145c(PEG)PF14_0089 | KKRNVEEELHSLRKNYNIINEEIEEIT(PEG)TISSLSNKIVNYESKIEELEKELKEVK(PEG)NITNINKNIENIKNDMSNLNNMNDSNQ |
| LR162A | 155 | PFA0170c(PEG)MAL6P1.37(PEG)PFB0145c(PEG)PF14_0089 | VNNLDSTVNYMNSTGNNINNI(PEG)KKRNVEEELHSLRKNYNIINEEIEEIT(PEG)TISSLSNKIVNYESKIEELEKELKEVK(PEG)NITNINKNIENIKNDMSNLNNMNDSNQ |
| LR179 | 156 | MAL13P1.304(PEG)PF08_0048 | EKLKKYNNEISSLKKELDILNEKMGKCT(PEG)GGLKNSNHNLNNIEMKYNTLNNNMNSINK |
| LR179A | 157 | PFB0145c(PEG)MAL13P1.304(PEG)PF08_0048 | LDENEDNIKKMKSKIDDMEKEIKYR(PEG)EKLKKYNNEISSLKKELDILNEKMGKCT(PEG)GGLKNSNHNLNNIEMKYNTLNNNMNSINK |
| LR181 | 158 | PFD0520c(PEG)PF08_0048(PEG)MAL6P1.37 | TKKLNKELSEGNKELEKLEKNIKELEETNNTLENDIKV(PEG)EKLKKYNNEISSLKKELDILNEKMGKCT(PEG)KKRNVEEELHSLRKNYNIINEEIEEIT |
表6
利用37个布基纳法索成人血清、42个坦桑尼亚成人血清和39个哥伦比亚成人血清，进行针对与表5的肽的抗体应答。结果表示为％(值＞平均阴性对照+3SD)、比例(实验OD/平均OD阴性对照)和未测定(nd)。
用混合抗原组合物的一种抗原肽免疫CB1小鼠
使用特异性针对不同的肽和混合抗原组合物的亲和纯化的抗体，在寄生虫生命周期的不同阶段进行免疫荧光抗体试验(IFAT)。结果表示为弱阳性(+/-)和阳性(+)。
表7
实施例5
生物信息学筛选
恶性疟原虫3D7基因组被用来进行生物信息学分析(Gardner，2002)。包含用于敏感的广义序列谱的程序的名为pftools的软件(Bucher et al.，1996)被应用于寻找短α-螺旋卷曲螺旋区域。通过将氨基酸序列与相应的已知卷曲螺旋区域比对来构建所述卷曲螺旋谱。使用两个包含四个和五个七重复的谱进行分析。利用这种方法选择的卷曲螺旋区域也经过COILS程序的检测。使用以下程序对选定的包含α-螺旋卷曲螺旋的蛋白进一步检测它们的可能的表面定位和GPI锚定：鉴定潜在的信号肽(PSORT，http://www.psort.org/psortb/，SignalP，http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、跨膜区域(TMPREDhttp://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html和TMHMMhttp://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)和GPI-锚定蛋白http://mendel.imp.univie.ac.at/sat/gpi/gpi_server.html。此外，还使用恶性疟原虫在无性的红内期发育阶段的转录组和蛋白质组的公开数据(www.PlasmoDB.org)，检查该阶段提否存在所鉴定的蛋白。
Claims (19)
1.一种源自于疟原虫物种的、包含至少一个卷曲螺旋区域的抗原肽，其特征在于所述抗原肽选自SEQ ID No.1-132、SEQ ID No.134-SEQ ID No.153和SEQ ID No.159-SEQ ID No.163的氨基酸序列、所述氨基酸序列的生物学活性片段、所述氨基酸序列的分子嵌合体、所述氨基酸序列的结合物和/或所述氨基酸序列的变体。
2.权利要求1的抗原肽，其特征在于所述抗原肽的结合物选自SEQ IDNo.154、155、156、157和158。
3.一种源自于疟原虫物种的混合抗原组合物，包含至少2种权利要求1或者2的抗原肽。
4.权利要求3的混合抗原组合物，其特征在于所述组合物选自下列的结合：
i)SEQ ID No.1、2和3，或
ii)SEQ ID No.16、33、38和2或
iii)SEQ ID No.35、27、4、34、24和37。
5.权利要求1-2的抗原肽或者权利要求3-4的混合抗原组合物在制备用于刺激哺乳动物的免疫应答的疫苗组合物中的应用。
6.一种用于刺激哺乳动物免疫应答的疫苗组合物，其特征在于所述疫苗组合物包含权利要求1-2的抗原肽或者权利要求3-4的混合抗原组合物。
7.一种抗体，其特征在于所述抗体识别权利要求1-2的抗原肽或者权利要求3-4的混合抗原组合物。
8.权利要求7的抗体，其特征在于所述抗体选自α-8、α-9、α-11/12、α-13、α-14、α-27、α-86、α-102、α-99、α-68、α-41、α-110、α-78、α-135、α-136、α-138、α-146和α-151或者它们的混合物。
9.一个纯化的和分离的核酸序列，所述序列包括
i)编码权利要求1或2的抗原肽的核苷酸序列，
ii)与i)互补的核酸序列，
iii)i)或者ii)的简并核酸序列，
iv)在严格条件下能与i)、ii)或者iii)杂交的核酸序列，
v)编码权利要求1或2的抗原肽的截短物或者类似物的核酸序列，
vi)和/或编码权利要求1或2的所述抗原肽的生物活性片段的i)、ii)、
iii)、iv)或者v)的片段。
10.一种表达载体，所述表达载体包含权利要求9的纯化的和分离的核酸序列的至少一个拷贝。
11.一种宿主细胞，所述细胞包含权利要求9的纯化的和分离的核酸序列或者权利要求10的表达载体。
12.权利要求6的疫苗组合物在制备用于治疗和/或预防疟疾的药剂中的应用。
13.一种产生用于制备抗疟原虫物种疫苗组合物的抗原肽的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
a)识别是否存在编码至少一个所述疟原虫物种基因组中的卷曲螺旋区域的序列，
b)选择编码至少一个卷曲螺旋区域的所述序列，
c)合成一种与步骤b)中选出的包含至少一个卷曲螺旋区域的序列相对应的抗原肽，
d)合成的抗原肽与生活在疟原虫物种病区的至少一个供体的血清样品相接触；并
e)确定所述血清样品是否有至少一种抗体与所述合成的抗原肽结合。
14.根据权利要求13的方法，其特征在于所述步骤a)用一种生物信息学工具进行。
15.一种诊断工具，所述诊断工具用于确定在一个样品中是否存在权利要求1-2的抗原肽或者权利要求3-4的混合抗原组合物，所述诊断工具包括：
i)使所述样品与一种针对权利要求1-2的抗原肽或者权利要求3-4的混合抗原组合物的抗体相接触，并且
ii)确定所述抗体是否结合所述样品中的一个组分。
16.一种诊断工具，所述诊断工具用于确定在一个样品中是否存在权利要求1-2的肽的抗体或者权利要求3-4的一种混合抗原组合物的抗体，所述诊断工具包括：
i)使所述样品与权利要求1-2的抗原肽或者权利要求3-4的混合抗原组合物相接触，并且
ii)确定是否有抗体结合权利要求1-2的抗原肽的一个组分或者权利要求3-4的混合抗原组合物。
17.一种蛋白质，其特征在于所述蛋白质包括至少一种权利要求1的抗原肽。
18.权利要求17的蛋白质，其特征在于所述蛋白质是包含SEQ ID No.38的PF14_0089或者是包含SEQ ID No.147的蛋白质PFD0520c。
19.一种试剂盒，所述试剂盒包括权利要求6的疫苗组合物，任选地还包括反应试剂和/或使用说明书。
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