CN102793911A

CN102793911A - 重组人Prx-6蛋白在治疗角膜损伤方面的用途

Info

Publication number: CN102793911A
Application number: CN2011101367071A
Authority: CN
Inventors: 李建远
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-05-24
Filing date: 2011-05-24
Publication date: 2012-11-28
Anticipated expiration: 2031-05-24
Also published as: EP2716300A1; WO2012159569A1; CN102793911B; US9585944B2; JP2014519500A; US20140147430A1; RU2013156536A; RU2573943C2; EP2716300A4; JP5913574B2; EP2716300B1

Abstract

本发明提供了重组人Prx-6蛋白在治疗角膜损伤方面的用途。具体的，本发明提供了人Prx-6蛋白在制备治疗角膜损伤的药物中的用途。本发明的实验表明，Prx-6蛋白在治疗角膜损伤过程中有抑制角膜新生血管的生成；修复受损的角膜上皮细胞；减轻角膜水肿，恢复角膜透明度及视力；清除自由基抗氧化，促进炎症病变组织恢复等作用。

Description

重组人Prx-6蛋白在治疗角膜损伤方面的用途

技术领域

本发明涉及生物技术和医学领域，具体地说，涉及重组人Prx-6蛋白在治疗角膜损伤方面的用途。

背景技术

眼睛是对紫外辐射最为敏感的部位。研究表明，波长230nm的紫外线可全部为角膜上皮吸收，280nm的紫外线对角膜损伤力最大。紫外线被角膜上皮细胞吸收后，会产生大量的氧自由基，发生脂质过氧化作用，引起细胞死亡，细胞溶解脱落后会释放大量炎症刺激因子，一般在暴露后6～10小时出现迅即加重的异物刺痛感和随之而来的畏光、流泪等症状，严重的会发生角膜上皮水肿、脱落、透明度下降等。

在紫外线辐射较强的地区，上述影响十分明显。如：在阳光照耀的海面上或沙漠中长期了望的士兵、海员，常有暗适应能力下降的现象出现；在空气稀薄的雪山高原上，工作人员因受雪面强烈反射的紫外反射的损伤，易患雪盲症；人们在雪地、沙漠或海面上暴露时间过长，因受紫外辐射影响较强，易患日光性眼炎；焊工直接暴露在电弧光下每天累计15分钟，即可发生上述病症，称为电光性眼炎。

目前治疗主要为对症、全身用止痛镇静药物，冷敷眼睑，包扎遮光，严重者可在结膜囊内滴入少量局部麻醉药0.5％地卡因，并用抗生素眼药水预防继发感染。大多都没有针对角膜上皮细胞损伤的修复、清除自由基等治疗措施。

Peroxiredoxins (Prxs)是新近发现的一类非硒依赖过氧化物酶家族蛋白，广泛存在于各种生物体内。根据Prxs蛋白保守cys个数的不同(1个或2个)，可分为1-Cys或2-Cys亚类。迄今，已在哺乳动物组织中发现了6种Prxs蛋白。其中Prx 1-5为2-Cys酶，以硫氧还蛋白作为电子供体；Prx-6蛋白是哺乳动物中唯一的1-Cys酶，以谷胱苷肽(GSH)为电子供体(还原剂)。

Prx-6蛋白首先是在牛眼睫状体中被分离获得的，又名LTW4、抗氧化蛋白2、Clara细胞蛋白26、p67吞噬细胞氧化酶(phox)结合蛋白、角质化细胞生长因子(KGF)调节基因1等，由224个氨基酸组成，分子量为25.1KDa。分析该蛋白的晶体结构，发现了一个由80个氨基酸组成的硫氧还蛋白折叠，其中包含四个β折叠和两个α螺旋。

大量研究表明，硫氧还蛋白折叠结构在一些参与氧化还原反应的蛋白(如硫氧还蛋白、谷氧还蛋白、GPx1蛋白、谷胱甘肽S-转移酶等)中普遍存在。另外，尽管Prx-6和GPx1蛋白的一级结构只有17%的同源性，但是它们的三级结构具有极高的同源性。这种结构上的相似性，预示着这两种蛋白在功能上的相关。

从初期细胞实验到近年来动物体内实验，越来越多的研究证明了Prx-6蛋白具有抗氧化损伤功能。细胞水平的研究表明，过表达Prx-6蛋白能明显减少脂质过氧化作用，降低细胞质膜损伤；抑制Prx-6蛋白的表达，可观察到明显的脂质过氧化、脂膜损伤及细胞凋亡。活体水平研究表明，Prx-6转基因小鼠对高氧损伤有显著的保护作用；Prx-6敲除小鼠的抗氧化损伤能力明显降低。

我们在研究人类精子成熟时，发现Prx-6蛋白由人附睾分泌到附睾管腔液中，能够结合在精子赤道、顶体后和主段（编号为HEL-S-128m，已注册于国际人类组织基因库GenBank，登录号：EU794652），具有较强的保护精子细胞抗过氧化损伤的功能，论文发表在美国杂志Mol Cell Proteomics. 2010. 9(11): 2517-2528。

鉴于Prx-6自身的生物学特性，我们将其用于烧烫伤的治疗，取得了良好的疗效，并已申请专利（申请号：201010573594.7）。我们推测Prx-6在治疗其他与氧化损伤相关的疾病中也有重要的作用。以往的研究主要是关于Prx-6蛋白在心脏、肺或皮肤组织中的抗氧化损伤作用，并未涉及到Prx-6蛋白在治疗角膜损伤方面的用途。

据对青藏高原武警官兵眼晶状体混浊度调查显示，驻拉萨市武警官兵（年龄25岁以上的志愿兵、机关和基层干部），眼晶状体混浊发病率高达39.56%，并且发病率与被调查者进藏的时间增长成正比。可见紫外线对我军官兵的眼睛健康造成了严重的威胁（http://www.ynnw.gov.cn/Modules/Document/infoShow1.aspx?kid=80375）。但目前还没有理想有效的治疗药物，为此我们根据Prx-6蛋白的功能，首次进行了保护和治疗紫外线损伤眼睛的治疗性研究，获得了显著疗效。

综上所述，本中心首次将Prx-6蛋白用于治疗紫外线造成的角膜损伤并取得了良好疗效，填补了针对角膜损伤病因的治疗药物空白。

发明内容

本发明的目的是提供重组人Prx-6蛋白在治疗角膜损伤方面的应用。

在本发明的第一方面，提供了一种Prx-6蛋白在制备治疗角膜损伤的药物中的用途。

在另一优选例中，所述的Prx-6蛋白是人Prx-6蛋白。

在另一优选例中，所述的Prx-6蛋白是重组蛋白。

在另一优选例中，所述的Prx-6蛋白包括氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示的蛋白或其与表达标签(如6×His)形成的融合蛋白。

在本发明的第二方面，提供了一种用于治疗角膜损伤的药物组合物，所述的药物组合物含有Prx-6蛋白以及药学上可接受的载体，并且所述的药物组合物为眼用制剂。

在另一优选例中，所述的Prx-6蛋白是人Prx-6蛋白。

在另一优选例中，所述的Prx-6蛋白是重组蛋白。

在另一优选例中，所述的眼用制剂是滴眼液、眼用凝胶或眼膏。

在本发明的第三方面，提供了一种治疗角膜损伤的方法，包括步骤：对需要治疗的对象，将Prx-6蛋白或本发明第二方面中所述的药物组合物滴入或涂入结膜囊内。

在另一优选例中，所述的治疗包括：抑制角膜新生血管的生成；修复受损的角膜上皮细胞；减轻角膜水肿，恢复角膜透明度及视力；清除自由基抗氧化，促进炎症病变组织恢复。

在另一优选例中，所述的对象是哺乳动物(包括人)。

在另一优选例中，所述的施用包括滴入或涂入。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了Prx-6基因PCR扩增结果。泳道1：空白对照;泳道2：Prx-6 ; M：分子量标准品。

图2显示了 Prx-6 蛋白亲和纯化色谱图。峰1：杂蛋白；峰2：Prx-6目的蛋白。

图3显示了Prx-6蛋白纯化电泳图(12%SDS-PAGE)。泳道1：蛋白分子量标准品(Fermentas);泳道2：亲和层析纯化并脱盐后的Prx-6蛋白；泳道3：峰1；泳道4：上样穿出蛋白；泳道5：破菌上清(上样的样品)。

图4显示了重组Prx-6蛋白对HEF细胞的抗氧化保护作用(P<0.05)。

图5显示了重组Prx-6蛋白对H9C2细胞的抗氧化保护作用(P<0.05)。

图6显示了用裂隙灯显微镜观察重组Prx-6蛋白治疗大鼠角膜损伤的结果。图中，各图片从左至右依次为：对照组(2只)；Prx-6组(2只)。从上至下依次为：紫外线照射前；紫外线照射后；治疗4天；治疗8天；治疗12天。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，除了发现Prx-6蛋白具有抗氧化作用可保护HEF等细胞之外，还首次发现Prx-6蛋白具有修复紫外线造成的角膜损伤的作用。在此基础上完成了本发明。

具体地，本发明的重组人Prx-6蛋白可直接滴入结膜囊内，能有效的抑制角膜新生血管的生成；清除紫外线产生的大量氧自由基，修复受损的角膜上皮细胞，促进炎症病变组织恢复，减轻疼痛；减轻角膜水肿，恢复角膜透明度及视力。具有刺激性小、可有效控制感染、疗程短等优点。

Prx-6蛋白

如本文所用，术语“本发明蛋白”、“Peroxiredoxins蛋白” “prdx6蛋白”、“Prx-6蛋白”“过氧化氧化还原蛋白”等可互换使用，都指具有人Prx-6氨基酸序列的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始的甲硫氨酸。应理解，这些术语既包括人(源)的蛋白，也包括在其他哺乳动物(如狗、牛、羊、猴、啮齿动物(如小鼠))中的具有同种功能的同系物或同源蛋白。此外，该术语包括野生型和突变型Prx-6蛋白。

人prx-6基因的cDNA 序列GenBank登录号：NM_004905.2，如SEQ ID NO: 1所示。人Prx-6的氨基酸序列的登录号为NP_004896，如SEQ ID NO: 2所示。

应理解，由于人等哺乳动物的prdx6蛋白的核酸序列和氨基酸序列都是已知的，可以用本领域常规的DNA重组技术而获得其蛋白。

一类特别优选的蛋白是Prx-6类似物，即在其他哺乳动物(如牛、羊、兔、狗、猴、鼠等)中Prx-6的同源蛋白。这些其他物种的同源蛋白的编码序列，可根据prdx6的序列，通过杂交或扩增的方法而获得，进而通过常规重组方法获得这些同源蛋白。

药物组合物和施用方法

本发明还提供了药物组合物，它含有安全有效量的本发明prx-6蛋白和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：生理盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、泊洛沙姆、卡波姆及其组合。

例如，可将本发明蛋白配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为6-8，较佳地pH约为6.8-7.6，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。

配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：局部给药、结膜下注射等。一种优选的方式是直接滴入或涂入结膜囊内。

药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成滴眼液、眼用凝胶或眼膏的形式，宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

此外，本发明的蛋白还可与治疗角膜损伤的其他治疗剂一起使用。

在优选例中，可将本发明蛋白按0.05-0.2mg/次的用量直接滴入或涂入结膜囊内。

本发明的主要优点包括：

(1) 开发了人Prx-6蛋白新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。紫外线照射照成的角膜损伤，在滴入或涂入Prx-6蛋白后，能有效的抑制角膜新生血管的生成；清除紫外线产生的大量氧自由基，修复受损的角膜上皮细胞，促进炎症病变组织恢复，减轻疼痛；减轻角膜水肿，恢复角膜透明度及视力。具有刺激性小、可有效控制感染、疗程短等优点。

(2) Prx-6蛋白是源自人的蛋白，使用安全无毒副作用，有很好的药用前景。

(3)人Prx-6蛋白做成滴眼液、眼用凝胶或眼膏等，使用方便。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则份数和百分比按重量计。

实施例1 pET32b(+)/Prx-6表达载体构建

根据编码Prx-6成熟蛋白的基因序列设计并合成了一对特异引物(上游引物：5’- tatccatatgcccggaggtctgcttc–3’(SEQ ID NO: 3)，下游引物：5’- ttactcgagaggctggggtgtgtagcg–3’(SEQ ID NO: 4))，酶切位点分别为NdeI及XhoI，

以实验室制备的人附睾cDNA文库为模板，进行PCR扩增。结果见图1，检测到与理论值相符的688bp的扩增片段。

用胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收目的片段，用NdeI及XhoI进行双酶切。然后，将经过双酶切的片段连接到已用NdeI和XhoI切成线性的pET32b(+)表达载体(购自Novagen)中，转化常规的大肠杆菌TOP10F’(购自Invitrogen)。通过菌落PCR的方法筛选阳性克隆，并测序进一步证实序列及表达阅读框的正确性，得到重组表达质粒pET32b(+)/Prx-6。该表达载体所表达的Prx-6蛋白在C端附加8个氨基酸LEHHHHHH，以便于分离纯化。

实施例2 Prx-6蛋白的表达

将质粒pET32b(+)/Prx-6转化大肠杆菌Origami B(DE3)(购自Novagen)，将阳性克隆接种于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇床培养过夜。次日按1：100转接于含100μg /ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇床培养至菌密度OD₆₀₀=0.6～0.8后，加入IPTG至终浓度0.4mM以诱导目的蛋白Prx-6的表达，3-4h后离心收集菌体。

实施例3 Prx-6蛋白的纯化

将离心收集的菌体重悬于缓冲液A中(20mM 磷酸盐缓冲液，150mM 氯化钠，pH7.2)，冰浴中超声破碎，20000g低温(4℃)离心15min取上清为待纯化的样品。使用缓冲液A平衡镍亲和层析柱后，将样品上柱，然后用含50mM 咪唑的缓冲液A冲洗柱子去除杂蛋白(峰1)，用含300mM咪唑的缓冲液A将目的蛋白洗脱下来(峰2)(见图2)。

最后用G-25脱盐柱将洗脱的蛋白置换于缓冲液A中以去除咪唑，SDS-PAGE电泳检测。经分析，获得了纯度在95%以上Prx-6蛋白，分子量约26.1kD。(见图3)。

实施例4 蛋白的抗氧化活性(HEF细胞氧化损伤实验)

HEF细胞为常用的人胚胎成纤维细胞(Zavada et al., Nature New Biology, 240: 124-125 (1972)；或US 7,811,817)。用培养基(高糖DMEM+5%FBS)复苏细胞，培养48h，待细胞长至90%汇合后，按照下面实验方法先将实施例3中获得的Prx-6蛋白(Prdx-6-His融合蛋白)加入培养体系中，再加入H₂O₂，作用30min后，MTT方法检测细胞存活率。

实验设计：

H₂O₂浓度(1mM、0.5 mM、0.25 mM、0.125 mM、0 mM)

Prdx-6-His浓度(0.5mg/ml、0.25 mg/ml、0.125 mg/ml、0 mg/ml)

各实验组的H₂O₂和Prdx-6-His浓度如表1所示。

表1

结果如表1和图4所示。

H₂O₂对细胞有很强的毒性作用，当其浓度为0.125mM时，细胞存活率仅2.47%。随着H₂O₂浓度上升，造成的损伤也越大。

当体系中同时有Prx-6-His蛋白存在时细胞存活率显著增加。如果只有缓冲液存在时，细胞活率与Prx-6-His蛋白组相比显著降低。以H₂O₂浓度为0.125mM的各组为例，添加了0.25mg/ml、0.5 mg/ml Prx-6蛋白，可使得存活率从约2.5%大幅上升到65%。

另外，仅用表达标签6His不能起到保护作用。

上述结果表明：Prx-6-His蛋白对H₂O₂的过氧化损伤有抵抗作用。0.25mg/ml的蛋白能使HEF细胞在一定程度上抵御0.125mM浓度的H₂O₂损伤。

实施例5 Prx-6蛋白的抗氧化活性(H9C2细胞氧化损伤实验)

试验方法：

H9C2细胞为常用的大鼠心肌细胞(US 7,482,320)。用培养基(高糖DMEM+10%FBS)复苏细胞，培养48h，待细胞长至90%汇合后，按照下面实验方法先将实施例3中获得的Prx-6蛋白(Prdx-6-His融合蛋白)加入培养体系中，再加入H₂O₂，作用30min后，MTT方法检测细胞存活率。

实验设计：

H₂O₂浓度(0.5mM、0.25 mM、0.125 mM、0.0625 mM、0 mM)

Prx-6-His浓度(0.5mg/ml、0.25 mg/ml、0.125 mg/ml、0 mg/ml)

各实验组的H₂O₂和Prdx-6-His浓度如表1所示。

表2

结果如表2和图5所示。

H₂O₂对细胞有很强的毒性作用，当体系中同时有Prx-6-His蛋白存在时细胞存活率显著增加,且随着Prx-6蛋白的浓度增加，存活率也相应增加。例如在H₂O₂浓度为0.0625mM的条件下，随着Prx-6浓度的增加(从0～0.5mg/ml)，细胞的存活率增加(从1.4%～97.38%) 。

这表明Prx-6-His蛋白对H₂O₂的过氧化损伤有抵抗作用。0.5mg/ml的Prx-6蛋白能使H9C2细胞在一定程度上抵御0.0625 mM浓度的H₂O₂损伤。

实施例6 Prx-6蛋白对角膜损伤的治疗作用

6.1 动物来源

6周龄SD大鼠，烟台毓璜顶医院实验动物中心。

6.2 药物

实验组：实施例3中制备的Prx-6蛋白；

对照组：生理盐水。

6.3 角膜损伤模型制备

5%水合氯醛（7ml/kg体重）腹腔内注射，麻醉后选择双星明和新福林眼液作为散瞳剂，每2min 1次，1滴/次，20min后，瞳孔散大后用棉签小心吸除角结膜的散瞳剂，置于300nm紫外线灯下，固定大鼠与紫外线灯的相对位置高度，并用紫外照射计测定辐射照度，控制在1×10³ Uw/cm²，每天累计辐射剂量9KJ/m²，连续3天，造成大鼠角膜损伤模型，用裂隙灯显微镜观察。

6.4 治疗方法

实验包括：对照组(滴生理盐水)、Prx-6蛋白治疗组(滴2mg/ml Prx-6蛋白)。角膜损伤后2天开始用药，每天用药4次，每次将2滴（约30μl）药品滴入大鼠眼内。

6.5 实验结果

紫外线照射后2天，大鼠角膜发生水肿，透明度明显降低。治疗第4天，对照组的角膜有较多新生血管生成，炎症反应严重，而Prx-6蛋白治疗组仅有少量新生血管生成，并且水肿明显减轻；治疗第8天，对照组角膜的水肿稍减轻，透明度部分恢复，Prx-6蛋白治疗组角膜透明度大部分恢复；治疗第12天，对照组角膜透明度仍未完全恢复，Prx-6蛋白治疗组大鼠角膜基本恢复，水肿消除(图6)。(注：图中从左至右依次为：对照组(2只)；Prx-6治疗组(2只))。

实施例7 用于治疗角膜损伤的药物组合物

将重组人Prx-6蛋白制备成凝胶剂，各成分含量如下：Prx-6蛋白1-4g，6g卡波姆941，尼泊金甲酯 0.5g，加20mM磷酸盐缓冲液（pH7.0）至1000g。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种Prx-6蛋白在制备治疗角膜损伤的药物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的Prx-6蛋白是人Prx-6蛋白。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的Prx-6蛋白是重组蛋白。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的Prx-6蛋白包括氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示的蛋白或其与表达标签形成的融合蛋白。

5.一种用于治疗角膜损伤的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有Prx-6蛋白以及药学上可接受的载体，并且所述的药物组合物为眼用制剂。

6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述的Prx-6蛋白是人Prx-6蛋白。

7.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述的Prx-6蛋白是重组蛋白。

8.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述的眼用制剂是滴眼液、眼用凝胶或眼膏。

9.一种治疗角膜损伤的方法，其特征在于，包括步骤：对需要治疗的对象，将Prx-6蛋白或权利要求5所述的药物组合物滴入或涂入结膜囊内。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的治疗包括：抑制角膜新生血管的生成；修复受损的角膜上皮细胞；减轻角膜水肿，恢复角膜透明度及视力；清除自由基抗氧化，促进炎症病变组织恢复。