CN102775320B - 阻断h5n1禽流感病毒入侵的右旋棉酚氨基酸钠盐衍生物、制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种阻断H5N1禽流感病毒入侵的右旋棉酚氨基酸钠盐衍生物、制备方法及其应用，制备方法为:将右旋棉酚溶于有机溶剂制备右旋棉酚的有机溶液；将氨基酸和NaOH溶于有机溶剂中得到氨基酸钠的有机溶剂；混合右旋棉酚的有机溶液和氨基酸钠的有机溶剂得到反应液，控制反应液pH=7.0~7.5，在氮气保护，反应液在回流条件反应后，蒸去有机溶剂后所得固体以丙酮重结晶，即得到右旋棉酚氨基酸钠盐衍生物。本发明右旋棉酚氨基酸钠盐衍生物对H5N1禽流感病毒有较强的抑制活性，强于金刚烷胺，而且其作用于H5N1病毒感染细胞的进入阶段，因此，本右旋棉酚氨基酸钠盐衍生物可作为预防或治疗H5N1禽流感药物中的有效成分。
Description
技术领域
本发明属于有机药物化学领域，具体涉及一种阻断H5N1禽流感病毒入侵的右旋棉酚氨基酸钠盐衍生物，同时还涉及该右旋棉酚氨基酸钠盐衍生物的制备方法及其应用。
背景技术
禽流感是一种人禽共患的高致病性和高死亡率传染性疾病，如今，全世界正面临着禽流感大流行的危险，尤其要警惕禽流感病毒的抗原性变异，或它与目前人群中流行的A型禽流感病毒发生基因重配，形成重配株，而造成人类流感暴发。
禽流感虽然影响大，但抗禽流感病毒药物发展缓慢，品种较少。A型禽流感病毒已对金刚烷胺产生了耐药性，进口的达菲是目前国内外治疗禽流感唯一有效的药物，但国外已出现了达菲耐药性的报道。因此寻找结构新颖、新靶点和高效低毒的抗禽流感病毒药物显得尤为迫切。
棉酚是锦葵科植物棉花的根、茎和种子所含的一种黄色多元酚类化合物，是一对具有手性的阻旋型旋光异构体。到目前为止，仅有少量文献[1-3]报道棉酚对某些流感病毒和副流感病毒有一定抑制作用。从结构上看，棉酚不同于目前临床使用的抗H5N1禽流感病毒药物，如金刚乙脘和达菲，具有新颖性，因此，棉酚对于解决禽流感病毒的耐药性是有帮助的。棉酚的甲酰基不是抗病毒活性的必需基团，但与棉酚的毒性有关，对其改造可降低毒性[4]。
通过进一步研究，发明人发现不同光学活性的棉酚抗H5N1禽流感病毒活性有一定的差异，右旋棉酚抗H5N1禽流感病毒活性强于左旋棉酚，右旋棉酚(半数抑制浓度IC50=0.97μg/ml，半数毒性浓度CC50=1.83μg/ml）抗H5N1禽流感病毒活性大约是左旋棉酚(半数抑制浓度IC50=1.74μg/ml，半数毒性浓度CC50=18.32μg/ml）的2倍，超过阳性对照药金刚烷胺，但右旋棉酚的细胞毒性几乎是左旋棉酚的10倍，选择性指数不理想。
发明人曾采用氨基酸修饰棉酚制备了一系列棉酚氨基酸衍生物，其中一些化合物显示了较强的抗H5N1病毒活性[5]。在前述工作基础上，为降低右旋棉酚毒性并增强其抗H5N1禽流感病毒活性，发明人进一步采用各种氨基酸修饰右旋棉酚，继而寻找抗H5N1禽流感病毒活性更强的新化合物，为寻找抗H5N1禽流感病毒新药提供新的思路。目前还没有关于右旋棉酚氨基酸钠盐衍生物抗H5N1禽流感病毒的研究报道。
文中涉及的参考文献如下：
[1]S.A.VIchkanova,L.V.Goryunova.Antibiotiki,1968,828.
[2]Baram,N.I.;Ismailov，A.I.;Ziyaev，Kh.L.;Rezhepov，K.Zh.Chem.Nat.Compd.2004,40,199-204.
[3]A.G.Rakhmanova,V.A.Isakov，Yu.I.Kiselev，E.V.Stepanova,V.V.Turtin.Interferon-92[Russian],S.V.Prozorovakii,ed.,Moscow(1992).
[4]Lin,T.S.;Schinazi,R.F.;Zhu,J.;Birks,E.;Carbone,R.;Si,Y.;Wu,K.;Huang,L.;Prusoff，W.H.Biochem.Pharmacol.1993,46,251-255.
[5]Jian Yang*,Fang Zhang,Jurong Li,Gang Chen,Shuwen Wu,Wenjie Ouyang,Wei Pan,Rui Yu,Jingxiang Yang,Po Tien*.Synthesis and antiviral activities of novel gossypol derivatives.Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,2012,22:1415–1420.
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明通过氨基酸修饰右旋棉酚，寻找到了一种抗H5N1禽流感病毒活性更强、毒性更小的右旋棉酚氨基酸钠盐衍生物，并提供了该右旋棉酚氨基酸钠盐衍生物的制备方法及其应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：
本发明提供了一种阻断H5N1禽流感病毒入侵的右旋棉酚氨基酸钠盐衍生物，其结构式如下：
其中，RNH2为
本发明还提供了上述具有阻断H5N1禽流感病毒入侵的右旋棉酚氨基酸钠盐衍生物的制 备方法，包括步骤：
（1）将右旋棉酚溶于有机溶剂制备右旋棉酚的有机溶液；
（2）将氨基酸和NaOH溶于有机溶剂中，经搅拌得到氨基酸钠盐的有机溶液；
（3）将右旋棉酚的有机溶液和氨基酸钠盐的有机溶液混合得到反应液，在氮气保护下，控制所得反应液的pH=7.0～7.5，并将反应液在70～80℃回流条件下搅拌0.5～4h，经蒸去有机溶剂得到反应产物；
（4）对反应产物重结晶，即得到右旋棉酚氨基酸钠盐衍生物。
上述制备方法中所述的右旋棉酚与所述的氨基酸的摩尔比为1：2，所述的氨基酸与所述的NaOH的摩尔比为1:1。
上述氨基酸为中性氨基酸，所述的中性氨基酸为中性的α-氨基酸，所述的中性的α-氨基酸为L-丙氨酸、L-色氨酸、牛磺酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、2-异丁氨酸或L-苯甘氨酸。
上述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮中一种或多种的组合。
上述反应液的pH值采用NaOH的醇溶液来控制，所述的NaOH的醇溶液优选为NaOH的甲醇溶液或NaOH的乙醇溶液。
本发明中右旋棉酚氨基酸钠盐衍生物的合成反应式如下：
其中，RNH2为
发明人对本发明右旋棉酚氨基酸钠盐衍生物进行抗H5N1禽流感病毒活性研究，结果表明本发明提供的右旋棉酚氨基酸钠盐衍生物的细胞毒性较右旋棉酚大大降低，而且，在体外对H5N1禽流感病毒显示出较金刚烷胺更强的抑制活性。因此，本发明右旋棉酚氨基酸钠盐衍生 物可作为预防或治疗H5N1禽流感药物的有效成分。
本发明右旋棉酚氨基酸钠盐衍生物抑制H5N1禽流感病毒活性的机制是：作用于H5N1禽流感病毒感染细胞的进入阶段，是一种新型抗H5N1病毒进入抑制剂，其结构不同于已报道的抗H5N1禽流感病毒进入抑制剂。
本发明提出了一种抗H5N1禽流感病毒活性更强、毒性更小新型化合物－右旋棉酚氨基酸钠盐衍生物，该右旋棉酚氨基酸钠盐衍生物可作为抗H5N1禽流感病毒的先导化合物，能解决目前金刚烷胺、达菲等抗H5N1禽流感病毒药物已出现耐药性的问题，非常具有实用价值。
附图说明
图1为(+)-棉酚-L-丙氨酸钠希弗碱在不同时间阶段对H5N1禽流感病毒的抑制率。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1
(+)-棉酚-L-丙氨酸钠希弗碱的制备，具体步骤如下：
将100mg(1.930×10-4mol)(+)-棉酚（又称右旋棉酚）溶于10mL无水乙醇，得到右旋棉酚的有机溶液；将34.4mg（3.861×10-4mol）L-丙氨酸与15.4mg(3.861×10-4mol)氢氧化钠混合溶于10mL无水乙醇中，在室温搅拌30分钟得L-丙氨酸钠的乙醇溶液。将右旋棉酚的有机溶液加入到L-丙氨酸钠的乙醇溶液中得到反应液，在氮气保护下，采用氢氧化钠的甲醇溶液控制反应液的pH=7.0～7.5，将反应液在80℃回流搅拌4h，蒸去溶剂后所得固体以丙酮重结晶，依次经抽滤和真空干燥，制得(+)-棉酚-L-丙氨酸钠希弗碱，收率：82.8%。[α]20 D:+105°(c=0.04,CH3OH),mp:245-247℃。υmax(KBr)/cm-1:3500-3300(OH,NH),1611(C=C)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.33(s,2H,2×N16-H),9.78(s,2H,2×=CH-NH),8.54(s,2H,2×6-OH),7.39(s,2H,2×4-H),3.83(m,2H,2×17-H),3.67(sept,2H,2×-CH(CH3)2),1.93(s,6H,2×Ar-CH3),1.43(d,12H,2×-CH(CH3)2),1.38(d,6H,2×19-CH3).ESI-MS,m/z calcd.for C36H38N2Na2O10:704.23,[M-H]-found:703.6。
实施例2
(+)-棉酚-L-色氨酸钠希弗碱的制备，具体步骤如下：
将100mg(1.930×10-4mol)(+)-棉酚（又称右旋棉酚）溶于10mL无水乙醇，得到右旋棉酚的有机溶液；将78.8mg（3.861×10-4mol）L-色氨酸与15.4mg(3.861×10-4mol)氢氧化钠混合溶于10mL无水乙醇中，在室温搅拌30分钟得L-色氨酸钠的乙醇溶液。将右旋棉酚的有机溶液加入到L-色氨基酸钠的乙醇溶液中得到反应液，在氮气保护下，采用氢氧化钠的甲醇溶液控 制反应液的pH=7.0～7.5，将反应液在80℃回流搅拌4h，蒸去溶剂后所得固体以丙酮重结晶，依次经抽滤和真空干燥，制得(+)-棉酚-L-色氨酸钠希弗碱，收率:78.5%。[α]20 D:+135°(c=0.04,CH3OH),mp:245-249℃,υmax(KBr)/cm-1:3500-3400(OH,NH),1615(C=C).1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.31(s,2H,2×-N16H),10.89(s,2H,2×indole-NH),9.59(s,2H,2×=CH-NH),8.49(s,2H,2×6-OH),7.51(s,2H,2×4-H),7.36(s,2H,2×7′-H),7.19(d,2H,2×4′-H),7.09(s,2H,2×2′-H),6.86(t,4H,2×5′-H；2H,×6′-H),4.08(m,2H,2×17-H),3.67(sept,2H,2×-CH(CH3)2),3.17(d,4H,2×19-H),1.89(s,6H,2×Ar-CH3),1.42(d,12H,2×-CH(CH3)2).ESI-MS,m/z calcd.for C52H48N4Na2O10:934.32,[M+Na]+found:957.8。
实施例3
(+)-棉酚-牛磺酸钠希弗碱，具体步骤如下：
将100mg(1.930×10-4mol)(+)-棉酚（又称右旋棉酚）溶于10mL无水乙醇，得到右旋棉酚的有机溶液；将42.1mg（3.861×10-4mol）牛磺酸与15.4mg(3.861×10-4mol)氢氧化钠混合溶于10mL无水乙醇中，在室温搅拌30分钟得牛磺酸钠的乙醇溶液。将右旋棉酚的有机溶液加入到牛磺酸钠的乙醇溶液中得到反应液，在氮气保护下，采用氢氧化钠的甲醇溶液控制反应液的pH=7.0～7.5，将反应液在80℃回流搅拌4h，蒸去溶剂后所得固体以丙酮重结晶，依次经抽滤和真空干燥，制得(+)-棉酚-牛磺酸钠希弗碱，收率：87.9%.[α]20 D:+60°(c0.04,CH3OH),mp＞285℃.υmax(KBr)/cm-1:3500-3300(OH,NH),1628(C=C).1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.02(s,2H,2×-N16H),9.76(s,2H,2×=CH-NH),7.41(s,2H,2×4-H),3.97(sept,2H,2×-CH(CH3)2),3.80(m,4H,2×17-CH2),2.85(m,4H,2×18-CH2),1.94(s,6H,2×Ar-CH3),1.44(d,12H,2×-CH(CH3)2).ESI-MS,m/z calcd.for C34H38N2Na2O12S2:776.17,[M+Na-H]found:798.6。
实施例4
(+)-棉酚-L-缬氨酸钠希弗碱，具体步骤如下：
将100mg(1.930×10-4mol)(+)-棉酚（又称右旋棉酚）溶于10mL无水乙醇，得到右旋棉酚的有机溶液；将45.2mg（3.861×10-4mol）L-缬氨酸与15.4mg(3.861×10-4mol)氢氧化钠混合溶于10mL无水乙醇中，在室温搅拌30分钟得L-缬氨酸钠的乙醇溶液。将右旋棉酚的有机溶液加入到L-缬氨酸钠的乙醇溶液中得到反应液，在氮气保护下，采用氢氧化钠的甲醇溶液控制反应液的pH=7.0～7.5，将反应液在80℃加热回流搅拌4h，蒸去溶剂后所得固体以丙酮重结晶，依次经抽滤和真空干燥，制得(+)-棉酚-L-缬氨酸钠希弗碱，收率：81.8%.[α]20 D:+125°(c0.04,CH3OH)，mp:285℃(分解),υmax(KBr)/cm-1:3500-3300(OH,NH),1609(C=C).1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ13.30(s,2H,2×-N16H),9.66(s,2H,2×=CH-NH),8.55(broad s,2H,2×6-OH),7.41(s,2H,2×4-H),3.86(sept,2H,2×-CH(CH3)2),3.68(m,2H,2×17-H),2.24(m,2H,2×19-H),1.94(s,6H,2×Ar-CH3),1.43(d,12H,2×-CH(CH3)2),0.88(d,6H,2×20-CH3),0.87(d,6H,2×21-CH3).ESI-MS,m/z calcd.for C40H46N2Na2O10:760.29,[M+Na]+found:783.8。
实施例5
(+)-棉酚-L-异亮氨酸钠希弗碱，具体步骤如下：
将100mg(1.930×10-4mol)(+)-棉酚（又称右旋棉酚）溶于10mL无水乙醇，得到右旋棉酚的有机溶液；将50.8mg（3.861×10-4mol）L-异亮氨酸与15.4mg(3.861×10-4mol)氢氧化钠混合溶于10mL无水乙醇中，在室温搅拌30分钟得L-异亮氨酸钠的乙醇溶液。将右旋棉酚的有机溶液加入到L-异亮氨酸钠的乙醇溶液中得到反应液，在氮气保护下，采用氢氧化钠的甲醇溶液控制反应液的pH=7.0～7.5，将反应液在80℃回流搅拌4h，蒸去溶剂后所得固体以丙酮重结晶，依次经抽滤和真空干燥，制得(+)-棉酚-L-异亮氨酸钠希弗碱，收率：79.6%。[α]20 D:+100°(c0.04,CH3OH),mp:227-231℃(分解),υmax(KBr)/cm-1:3500-3300(OH,NH),1613(C=C).1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.28(d,2H,2×-N16H),9.68(d,2H,2×=CH-NH),8.53(s,2H,2×6-OH),7.40(s,2H,2×4-H),3.69(m,2H,2×17-H),3.63(sept,2H,2×CH(CH3)2),2.06(m,2H,,2×19-H),1.92(s,6H,2×Ar-CH3),1.55(m,2H,2×20a-H),1.40(d,12H,2×-CH(CH3)2),1.08(m,2H,2×20b-H),0.87(d,6H,2×21-CH3),0.84(d,6H,2×22-CH3).ESI-MS,m/z calcd.forC42H50N2Na2O10:788.33,[M+Na]+found:811.9。
实施例6
(+)-棉酚-2-异丁氨酸钠希弗碱，具体步骤如下：
将100mg(1.930×10-4mol)(+)-棉酚（又称右旋棉酚）溶于10mL无水乙醇，得到右旋棉酚的有机溶液；将39.8mg（3.861×10-4mol）2-异丁氨酸与15.4mg(3.861×10-4mol)氢氧化钠混合溶于10mL无水乙醇中，在室温搅拌30分钟得2-异丁氨酸钠的乙醇溶液。将右旋棉酚的有机溶液加入到2-异丁氨酸钠的乙醇溶液中得到反应液，在氮气保护下，采用氢氧化钠的甲醇溶液控制反应液的pH=7.0～7.5，将反应液在80℃回流搅拌4h，蒸去溶剂后所得固体以丙酮重结晶，依次经抽滤和真空干燥，制得(+)-棉酚-2-异丁氨酸钠希弗碱，收率：86.5%。[α]20 D:+92.5°(c0.04,CH3OH)),mp:282-284℃.υmax(KBr)/cm-1:3500-3300(OH,NH),1634(C=C).1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.90(d,2H,2×-N16H),9.81(d,2H,2×=CH-NH),8.49(s,2H,2×6-OH),7.35(s,2H,2×1-OH),7.16(s,2H,2×4-H),3.69(sept,2H,2×-CH(CH3)2),1.99(s,6H,2×Ar-CH3),1.42(d,12H, 2×-CH(CH3)2),1.26(s,6H,2×19-CH3),1.09(d,,6H,2×20-CH3).ESI-MS,m/z calcd.forC38H42N2O10Na2:732.26,[M+Na-H]found:754.7。
实施例7
(+)-棉酚-L-苯甘氨酸钠希弗碱，具体步骤如下：
将100mg(1.930×10-4mol)(+)-棉酚（又称右旋棉酚）溶于10mL无水乙醇，得到右旋棉酚的有机溶液；将58.3mg（3.861×10-4mol）L-苯甘氨酸与15.4mg(3.861×10-4mol)氢氧化钠混合溶于10mL无水乙醇中，在室温搅拌30分钟得L-苯甘氨酸钠的乙醇溶液。将右旋棉酚的有机溶液加入到L-苯甘氨酸钠的乙醇溶液中得到反应液，在氮气保护下，采用氢氧化钠的甲醇溶液控制反应液的pH=7.0～7.5，将反应液在80℃回流搅拌4h，蒸去溶剂后所得固体以丙酮重结晶，依次经抽滤和真空干燥，制得(+)-棉酚-L-苯甘氨酸钠希弗碱，收率：80.3%。[α]20 D:+52.5°(c0.04,CH3OH),mp245℃(分解).υmax(KBr)/cm-1:3500-3200(OH,NH),1616(C=C).1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.53(d,2H,2×-N16H),10.17(d,2H,2×=CH-NH),8.52(s,2H,2×6-OH),7.36(t,4H,2×21-H，2×23-H),7.27(d,4H,2×20-H，2×24-H),7.19(t,2H,2×22-H),7.15(s,2H,2×4-H),3.63(sept,2H,2×-CH(CH3)2),3.39(m,2H,2×17-H),1.88(s,6H,2×Ar-CH3),1.44(d,12H,2×-CH(CH3)2).ESI-MS,m/z calcd.for C46H42N2O10Na2:828.26,[M+Na-H]found:850.7。
上述实施例1～8中，反应液的反应温度在70～80℃范围内均是可以得到右旋棉酚氨基酸钠盐衍生物。
实施例8
右旋棉酚氨基酸钠盐衍生物抗H5N1禽流感病毒实验
1.实验材料
（1）病毒：H5N1毒株是A/VietNam/1194/2004，测得其效价为5×109PFU/ml，感染时用培养基稀释，即80PFU/孔，由武汉大学病毒学国家重点实验室提供。
（2）细胞：MDCK细胞(中国典型培养物保藏中心来源，MDCK细胞是流感病毒噬斑实验的经典细胞)，武汉大学病毒学国家重点实验室提供。
（3）阳性对照药：金刚烷胺，武汉大学病毒学国家重点实验室提供。
（4）样品处理：金刚烷胺和本发明化合物用DMSO配成10mg/ml的母液，使用时用DMSO稀释成相应梯度。
2.实验方法
2.1细胞毒性实验（MTT分析法）
MTT分析法以活细胞代谢物还原剂MTT为基础。MTT全称为3-(4,5-Dimethyl-2-Thiazolyl)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide；汉语化学名为3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑；商品名为噻唑蓝。
5mg/ml MTT的配制：称取0.5g MTT粉末，溶于100ml磷酸盐缓冲液(PBS)或者无酚红培养基中，用0.22um滤膜过滤除菌，4℃避光保存。MTT最好现配现用，4℃避光保存两周内有效。或者于-20℃长期冻存，分装成小管，避免反复冻融。
三联甲臜溶解液的配制：25g十二烷基磺酸钠(SDS)、250ul浓度为11.6mol/l的盐酸和12.5ml异丁醇，加去离子水定容至250ml即得到三联甲臜溶解液，该溶解液中十二烷基磺酸钠(SDS)的质量百分比为10%、盐酸摩尔浓度为0.012mol/l、丁醇的质量百分比为5%。
本细胞毒性实验步骤依次如下：
（1）将MDCK细胞株消化后用DMEM完全培养基稀释成2×105个/ml，铺入96孔板，100μl/孔，置37℃、5%CO2细胞培养箱培养4小时，使细胞充分贴壁；
（2）将受试本发明化合物母液（10mg/ml）用DMSO梯度稀释，终浓度分别为33.33μg/ml、6.66μg/ml、3.33μg/ml、0.33μg/ml和0.03μg/ml，加入96孔版中，每孔1μl。每个浓度设三个平行孔。对照孔同样设三个平行孔，每孔加1μl DMSO。另将阳性对照药做同样处理作为对照；
（3）培养48小时后，去除上清液，单细胞层用灭菌的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗三次；
（4）每孔加入100μl的MTT与新鲜培养基混合液（MTT终浓度0.5mg/ml），在37℃孵育4小时，使MTT还原为甲臢；
（5）除去上清液，每孔加100μl三联甲臜溶解液，37℃孵育4小时，使甲臢全部溶解；
（6）以655nm处的光吸收值为背景，在570nm处测定光吸收值。
完成上述实验后，按照以下公式计算细胞死亡率：
细胞死亡率（%）＝[1-（加化合物细胞OD值／对照细胞OD值）]×100；
本发明化合物、阳性对照药的半数毒性浓度（CC50)的计算方法为：以化合物浓度为横坐标，细胞死亡率为纵坐标作图，然后得到50％死亡率时候的化合物浓度，就是CC50，计算结果如表1所示。
2.2抗H5N1活性实验
将MDCK细胞培养于24孔板中，待细胞长到100％满时，用PBS洗涤2次，按照以下不同方式处理病毒和细胞，每组4个复孔：1.阳性对照孔：将阳性对照药与病毒混匀后直接加入细胞中；2.病毒感染对照：将病毒悬液加入细胞中；3.细胞对照：用DMEM与细胞孵育；4.新化合物处理孔：用本发明化合物和病毒在300μl培养基中混匀后直接加入细胞中。 所用培养基不含血清，加入终浓度10μg/ml的胰酶催进感染。本发明化合物用DMSO配成10mg/ml的母液，使用时用DMSO梯度稀释，本发明化合物终浓度分别为33.33μg/ml、6.66μg/ml、3.33μg/ml、0.33μg/ml和0.03μg/ml，每孔加1μl。另将阳性对照药做同样处理作为对照。
37℃感染2h后弃上清，用PBS洗涤2次，加入无酚红DMEM培养基和1％琼脂糖的混合液（预先融化且于37℃保温以避免凝固），该混合液中DMEM和琼脂糖的体积比为1：1，再加入终浓度10μg/ml的胰酶促进感染。正面向上室温放置20-40min，待凝固后倒置于37℃、5％CO2培养箱培养2-4天。待噬斑大而清晰时，用0.5%的结晶紫染色，130μl／孔，避光染色6-8h后用肉眼计数噬斑，每孔计数2遍，结果相同时计数有效，不同时重复计数，直至两遍完全相同时记为有效。每组的噬斑数为3个孔的平均值。
完成上述实验后，采用以下公式计算本发明化合物、阳性对照药对病毒感染的抑制率：抑制率（％）＝［（病毒感染对照组的噬斑数－加化合物组的噬斑数）／病毒感染对照组的噬斑数］×100。
本发明化合物、阳性对照药的半数抑制浓度（IC50）的计算方法为：以化合物浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，得到50％抑制率时候的化合物浓度，就是IC50,SI为选择性指数，其值为CC50/IC50。上述计算结果见表1。
从表1可知，右旋棉酚虽然抗H5N1病毒活性强于金刚烷胺，但细胞毒性大和选择性指数较差。而用氨基酸修饰右旋棉酚后，右旋棉酚氨基酸钠盐衍生物细胞毒性比右旋棉酚细胞毒性大大减少，选择性指数明显改善，其中，(+)-棉酚-L-丙氨酸钠希弗碱，(+)-棉酚-L-色氨酸钠希弗碱，(+)-棉酚-L-缬氨酸钠希弗碱，(+)-棉酚-L-异亮氨酸钠希弗碱和(+)-棉酚-2-异丁氨酸钠希弗碱的抗禽流感病毒（H5N1）活性明显增强，强于金刚烷胺。
表1 右旋棉酚氨基酸钠盐衍生物抗H5N1禽流感病毒活性结果
实施例9
右旋棉酚氨基酸钠盐衍生物加药时间与加药顺序对H5N1禽流感病毒的抑制实验
以(+)-棉酚-L-丙氨酸钠希弗碱为例来考察右旋棉酚氨基酸衍生物作用于病毒感染细胞的阶段，本实施例采用时间与加药顺序对病毒进行抑制实验（Time-of-Addition Assay），本实验采用的病毒和细胞同实施例8中的病毒和细胞，样品溶液指(+)-棉酚-L-丙氨酸钠希弗碱溶液，其配制同实施例8中样品溶液的配制方法，具体实验步骤如下：
首先将MDCK细胞加入至24孔板中，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养24小时，直至培养长满单层后，弃除DMEM生长液，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗两次。然后在24孔板中先向各孔中加入500μlA/VietNam/1194/2004(H5N1)病毒的悬浊液（病毒量约80PFU/孔），在病毒与细胞吸附完成后的0h、2h、4h和8h时向24孔板中分别加入500μl的20μg/ml样品溶液，将24孔板再静置于37℃恒温箱中继续培养观察。对于不同时间段分别加入的(+)-棉酚-L-丙氨酸钠希弗碱样品溶液都设一个病毒对照，即不加样品溶液，让病毒与细胞充分作用。余下的具体实验步骤同实例8中的抗H5N1活性实验，实验结果见图1。
从图1可以看到，在A/VietNam/1194/2004(H5N1)病毒感染MDCK细胞的不同时间阶段分别加入(+)-棉酚-L-丙氨酸钠希弗碱时，发现病毒感染细胞在0时其抑制率最强；病毒感染细胞2小时后加入，其抑制活性开始下降；而在4小时后加入和8小时后加入，则几乎没有抑制活性，表明该化合物作用于病毒感染细胞的进入阶段。即一旦病毒进入靶细胞，(+)-棉酚-L-丙氨酸钠希弗碱不能抑制病毒感染的后续过程。
实施例10
右旋棉酚氨基酸钠盐衍生物对H5N1禽流感病毒血凝影响试验
以(+)-棉酚-L-丙氨酸钠希弗碱为例来考察右旋棉酚氨基酸钠盐衍生物对H5N1禽流感病毒血凝影响。
1.试剂配制
1.125倍PBS溶液
称量2.76g Na2HPO4·12H2O和0.79g NaH2PO4·2H2O固体颗粒于烧杯中，分次加入蒸馏水溶解混匀至100ml定容，即得到25倍PBS溶剂。
1.21倍PBS溶液
量取上述25倍PBS溶液40ml于烧杯中，再加入8.5g NaCl颗粒，分次倒入蒸馏水定容 至1000ml，再用NaOH稀溶液或HCl稀溶液调节pH值至7.0-7.2；最后在69KPa条件下，高压灭菌约二十分钟后，取出溶液冷却待用。
1.3阿氏液
分别称取葡萄糖固体颗粒2.05g、柠檬酸钠固体颗粒0.8g、柠檬酸固体颗粒0.055g以及氯化钠固体粉末0.42g于烧杯中，加入蒸馏水使其各组分溶解后，将溶液定容至100ml并且调节pH值至6.1，然后在69Kpa、15min高压灭菌，2～8℃保存备用。
1.41%鸡红细胞悬液
采集健康公鸡的血液30ml并且与等体积阿氏液混合，用上述1倍PBS溶液洗涤后，将其以1500rpm/min的转速离心5min，然后弃掉上清液，重复此操作三次，最后将洗涤后的鸡血红细胞用1倍PBS配成1%（V/V）红细胞悬液，2～8℃保存备用。
1.5抗原溶液
H5N1禽流感病毒血凝抑制试验抗原与阳性血清，购自北京康农兴牧科技发展中心。将1ml冻干抗原或1ml阳性血清分别用2毫升1倍PBS溶液溶解后-20℃保存备用。相关溶液可参照说明书配制。
2.血凝试验
首先在V型微量反应板中选择第一排孔标记为1-12，在1-12孔的每孔中加入0.025ml1倍PBS溶液，在第l孔中还加入0.025ml的抗原溶液，反复抽打3～5次使其混和均匀。然后从第1孔中吸取0.025ml的溶液加入至第2孔中，反复抽打3～5次使其混和均匀。从第2孔中吸取0.025ml的溶液加入至第3孔中，反复抽打3～5次使其混和均匀。如此依次进行对倍稀释至第11孔，最后从第11孔中吸取0.025ml溶液弃去。向1-12孔中的每孔依次加入0.025ml的1倍PBS溶液，震荡混合均匀后，再依次向每孔中加入0.025ml1%的鸡红细胞悬液。最后将V型微量反应板在振荡器上震荡1～2分钟，使反应体系充分混合均匀，最后在室温（20～25℃）下静置30分钟在对照孔红细胞显著呈钮扣状时判定结果。其中1-11孔作为抗原实验组，第12孔则为鸡红细胞对照孔。当孵育反应完成后，将V型微量反应板倾斜约60度，将1-11孔与第12孔对照观察，当红细胞完全无泪珠样流淌(100%凝集)的现象时，此时所对应的抗原最高稀释倍数则为血凝效价。结果判断标准和试验结果分别见表2和表3。
根据上面的血凝HA试验步骤所观察得到的效价为28，故通过HA实验所得效价256除以4即为含4HAU抗原的稀释倍数，即26倍。该H5阳性抗原的血凝价为1:256，则1:256为1个血凝单位，1:64为4个血凝单位，即1:64稀释的病毒液为4个血凝单位。
表2血凝影响试验结果判断方法
表3血凝影响试验结果
3.(+)-棉酚-L-丙氨酸钠希弗碱对血凝试验影响
首先在V型微量反应板1-12个孔中每个孔中加入0.025ml的1倍PBS溶液。向第1孔中加入100μg/ml的样品溶液各0.025ml，这里的样品溶液为(+)-棉酚-L-丙氨酸钠希弗碱溶液，其配制方法同实施例8中样品溶液的配制方法，充分鼓吹混匀后，依次吸取第1孔中的0.025ml溶液加入至第2孔中，轻轻鼓吹混和均匀后；从第2孔中吸取0.025ml的溶液加入至第3孔中，经混合均匀；按照同样的操作过程，如此依次进行对倍稀释至第11孔，最后从每个样品行的第11孔中吸取0.025ml溶液弃去。然后，依次向每个样品行的第1～11孔中加入0.025ml的4HAU抗原的1倍PBS溶液，轻轻震荡混合均匀后，在室温（20～25℃）下静置30分钟使样品溶液与抗原溶液充分混合均匀。孵育完成后，向各样品行的第1-12孔中每孔加入1%鸡红细胞悬液0.025ml，待轻轻震荡混和均匀后，将V型微量反应板静置于室温（20～25℃） 下孵育20～30分钟。其中，1-11孔为(+)-棉酚-L-丙氨酸钠希弗碱实验组，12孔为鸡红细胞对照孔。采用上述血凝试验中的判断方法和表2中提供的判断标准对试验结果进行判断，结果见表4。
从表4看出，加入不同浓度的(+)-棉酚-L-丙氨酸钠希弗碱，对H5N1阳性抗原的血凝试验没有影响，说明(+)-棉酚-L-丙氨酸钠希弗碱不是作用于HA的HA1亚基，而很可能作用于HA的HA2亚基。
表4 (+)-棉酚-L-丙氨酸钠希弗碱对H5N1禽流感病毒血凝影响试验结果
Claims (7)
1.一种阻断H5N1禽流感病毒入侵的右旋棉酚氨基酸钠盐衍生物，其特征在于，其结构式如下：
其中，RNH为
2.根据权利要求1所述的具有阻断H5N1禽流感病毒入侵的右旋棉酚氨基酸钠盐衍生物的制备方法，其特征在于，包括步骤：
(1)将右旋棉酚溶于有机溶剂制备右旋棉酚的有机溶液；
(2)将氨基酸和NaOH溶于有机溶剂中，经搅拌得到氨基酸钠盐的有机溶液；
(3)将右旋棉酚的有机溶液和氨基酸钠盐的有机溶液混合得到反应液，在氮气保护下，控制所得反应液的pH＝7.0～7.5，并将反应液在70～80℃回流条件下搅拌0.5～4h，经蒸去有机溶剂得到反应产物；
(4)对反应产物重结晶，即得到右旋棉酚氨基酸钠盐衍生物。
3.根据权利要求2所述的具有阻断H5N1禽流感病毒入侵的右旋棉酚氨基酸钠盐衍生物的制备方法，其特征在于：
所述的右旋棉酚与所述的氨基酸的摩尔比为1：2，且，所述的氨基酸与所述的NaOH的摩尔比为1:1。
4.根据权利要求2或3所述的具有阻断H5N1禽流感病毒入侵的右旋棉酚氨基酸钠盐衍生物的制备方法，其特征在于：
所述的氨基酸为L-丙氨酸、L-色氨酸、牛磺酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、2-异丁氨酸或L-苯甘氨酸。
5.根据权利要求2所述的具有阻断H5N1禽流感病毒入侵的右旋棉酚氨基酸钠盐衍生物的制备方法，其特征在于：
所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮中一种或多种的组合。
6.根据权利要求2所述的具有阻断H5N1禽流感病毒入侵的右旋棉酚氨基酸钠盐衍生物的制备方法，其特征在于：
所述反应液的pH值采用NaOH的醇溶液来控制。
7.权利要求1所述的具有阻断H5N1禽流感病毒入侵的右旋棉酚氨基酸钠盐衍生物作为制备预防或治疗H5N1禽流感药物的应用。
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| Jian Yang，et al..Synthesis and antiviral activities of novel gossypol derivatives.《Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters》.2011,第22卷(第3期),1415-1420. * |
| Jian Yang,et al..Synthesis and antiviral activities of novel gossypol derivatives.《Bioorganic & * |
| Medicinal Chemistry Letters》.2011,第22卷(第3期),1415-1420. * |
| PiotrPrzybylski et al..Synthesis * |
| Reaction Chemistry of Gossypol and Its Derivatives;James A.Kenar;《JAOCS》;20060430;第83卷(第4期);269-302 * |
| Synthesis, crystal structures and antibacterial activity studies of aza-derivatives;Piotr Przybylski, et al.;《European Journal of Medicinal Chemistry》;20090612;第44卷(第11期);4393-4403 * |
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