WO2013044763A1 - 3-氟-5-(三氟甲基)-n-(2-(2-噻吩基)乙基)苯甲酰胺及其应用 - Google Patents

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ethyl
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刘叔文
朱志博
李润明
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南方医科大学
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    • C07D333/20—Radicals substituted by singly bound hetero atoms other than halogen by nitrogen atoms

Definitions

  • the present invention is in the field of compounds of benzamide, and more particularly to 3-fluoro-5-(trifluoromethyl)benzamides and their use.
  • Benzoylamides have a wide range of pharmaceutical activities, such as inhibition of histone deacetylase activity; inhibition of VEGFR-2, showing antitumor properties (Bioorg. Med. Chem. 2010, 20: 6653-6656); Antifungal activity (Der Pharma Chemica, 2010, 2: 304-314); inhibition of the action of mycobacteria, bacteria and fungi (Molecules, 2011, 16, 2414-2430).
  • the technical problem to be solved by the present invention is to provide a 3-fluoro-5-(trifluoromethyl)benzamide compound which has an excellent inhibitory effect on H5N1 type and H1N1 type influenza virus.
  • the technical solution adopted by the present invention is:
  • the benzamide compound of the present invention is synthesized by a conventional method in the art, for example, by reacting 3-fluoro-5-(trifluoromethyl)benzoyl chloride with thiophene-2-ethylamine.
  • the method recommended by the present inventors consists of the following steps: adding equimolar amounts of thiophene-2-ethylamine and 3-fluoro-5-(trifluoromethyl)benzoyl chloride to dichloromethane, and reacting at room temperature 5 h; After completion of the reaction, it is recrystallized from a mixed solvent of dichloromethane and ethyl acetate to obtain a white solid.
  • the white solid obtained by the above method is a compound of the above formula (I), and the compound is named 3-fluoro-5-(trifluoromethyl)-N-(2-(2-thienyl)ethyl) Benzoylamide.
  • Pharmacological experiments have found that 3-fluoro-5-(trifluoromethyl)-N-(2-(2-thienyl)ethyl)benzamide inhibits the activity of HIV and H5N1 influenza viruses, especially in inhibiting pathogenicity.
  • the H5N1 influenza virus is highly active and can be used to prepare anti-H1N1 and H5N1 influenza viruses.
  • the 5% by weight of the compound of the formula (I) is 0.5% by weight.
  • the 5% by weight of the compound of the formula (I) is 0.5% by weight. .
  • the medicament of the present invention is a dosage form commonly used in the art, such as a tablet, a capsule, a nasal drop or an injection, wherein the tablet is composed of the following raw materials by weight ratio: 3-fluoro-5- ( Trifluoromethyl)-N-(2-(2-thienyl)ethyl)benzamide 25%, starch 48%, dextrin 25%, tartaric acid 1% and magnesium stearate 1%;
  • the contents of the capsules of the present invention consist of the following weight ratio starting materials: 3-fluoro-5-(trifluoromethyl)-N-(2-(2-thienyl)ethyl)benzamide 60%, microcrystalline cellulose 20%, sodium carboxymethyl starch 15% and magnesium stearate 5%;
  • the injection is composed of the following weight ratio raw materials: 3-fluoro-5-(trifluoromethyl)-N-(2-(2-thienyl)ethyl)benzamide 10%, sodium chloride 0. 9% and water 89. 1%.
  • the benzamide compound of the invention can specifically act on the envelope protein of the H5N1 influenza virus, has good inhibitory activity against the highly pathogenic H5N1 influenza virus, and can be used for preparing anti-influenza virus drugs, and is more than 3- Fluor-5-(trifluoromethyl)-N-(2-(1-piperidinyl)ethyl)benzamide showed better inhibition.
  • DRAWINGS BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS Fig. 1 is a graph showing the drug concentration of a benzamide compound of the present invention and inhibition of the activity of a pseudovirus.
  • Fig. 2 is a graph showing the drug concentration of the benzamide compound of the present invention and the activity of inhibiting VSV-G pseudovirus.
  • the white powdery solid obtained in the first step was identified by ESI mass spectrometry, and the specific identification conditions and results were as follows:
  • This example is an experiment in which 3-fluoro-5-(trifluoromethyl)-N-(2-(2-thienyl)ethyl)benzamide inhibits the activity of H5N1 pseudovirus.
  • the pseudovirus assay refers to a plasmid that expresses the envelope protein of H5N1 influenza virus and an HIV backbone plasmid pNL4-3. Luc. R-E-, which expresses the envelope protein of the luciferase reporter gene, and co-transfects 293T cells. , assembled into a H5N1 influenza pseudovirus with only one infection.
  • the virus experiment is a highly sensitive, objective and safe experimental system for simulating the entry of true viruses into target cells, and can be used to evaluate the activity of compounds to inhibit influenza virus entry into target cells.
  • 293T cells were digested with 0.25% trypsin, seeded into a six-well plate at a density of 5 x 105 cells per well, and cultured for 24 hours.
  • the six-well plate was further cultured for 48 hours, the supernatant was collected, centrifuged at 2000 rpm, and the supernatant was collected and stored at 80 °C.
  • MDCK cells were seeded at a cell density of 1 ⁇ 10 4 cells per well in a 96-well plate and cultured for 24 hours.
  • Compound inhibition rate (%) [1- (EN) / (PN) ] X 100, where E represents the chemiluminescence value of the experimental group, P represents the positive, that is, the chemiluminescence value of the virus plus no drug, and N represents the negative The chemiluminescence value of the control group.
  • the half-inhibitory concentration (IC50) of the compound was calculated as an indicator of the antiviral activity of the compound by Calcusyn software.
  • the compound of the present invention has a strong inhibitory activity against pseudovirus, and its inhibitory activity is higher than that of 3-fluoro-5-(trifluoromethyl)-N-(2-(1-piperidinyl)ethyl)benzamide salt. Strong acid salt.
  • Table 1 Inhibitory activity of the compounds of the present invention against H5N1 pseudoviral infection
  • 3-fluoro-5-(trifluoromethyl)-N-(2-(2-thienyl)ethyl)benzamide inhibits the activity of mm influenza virus.
  • Canine kidney cell (MDCK) cells were seeded in 96-well cell culture plates at 100 ⁇ l per well, and the number of cells was 1 ⁇ 10 5 cells/well. After 24 hours, the cells were grown into intact monolayers and treated with DMEM serum-free medium. Compounds were diluted to 10 different concentrations, 50 ⁇ M of guanidine compound was added to each well, and 50 ⁇ L of 100 TCID 5 was inoculated. The H1N1 FM1 influenza virus strain was further cultured in a 37 ° C, 5% C0 2 incubator. The degree of disease (CPE) was observed under an inverted microscope every day and recorded.
  • CPE degree of disease
  • Hemagglutination (HA) assays were performed on 96-well microplates. From left to right, add 50 ⁇ of normal saline to each well of a 96-well microplate. Add 50 virus solution to the first well on the left side, mix well, then suck 5 ( ⁇ L to the 2nd well, dilute to the 11th hole in turn, and aspirate 50 ⁇ ! ⁇ The 12th hole is the chicken red blood cell control. From right to Add 0. 5% chicken red cell suspension 50 ⁇ 1 ⁇ to each well, shake on a shaker, and let stand for 10 min at room temperature. The red blood cells of the control wells have been precipitated and the results can be observed. If the red blood cells are all agglutinated, they will sink.
  • the tile is meshed and judged to be 100% agglutination (++++), and the non-aggregator (-) erythrocytes sink to the bottom of the hole in a dot shape.
  • the maximum dilution of the virus with 100% agglutination is the virus.
  • the blood coagulation titer is an agglutination unit.
  • the compound of the present invention has an inhibitory activity against the H1N1 influenza virus, and the results are shown in Table 2.
  • the IC50 in the table is the concentration of the drug at half the viral hemagglutination titer.
  • Table 2 Inhibitory activity of the compounds of the invention against H1N1 influenza virus
  • This example is a specific experiment in which a compound of the present invention acts on an envelope protein of influenza virus.
  • the compound of the present invention inhibits the infection activity of the pseudovirus, but the pseudovirus expresses the envelope protein of the influenza virus on the viral membrane of HIV. Therefore, the skeleton of the pseudovirus is HIV.
  • the compounds of the invention specifically act on the envelope protein of H5N1, rather than acting as a backbone for HIV, we have used another pseudovirus, the expression of the vesicular stomatitis virus envelope protein G (VSV-G) in HIV. Skeletal virus VSV-G pseudovirus, as a negative control.
  • VSV-G vesicular stomatitis virus envelope protein G
  • the compounds of the present invention have no inhibitory effect on the VSV-G pseudovirus, indicating that these compounds do not interfere with the function of the VSV-G envelope protein, It does not affect the activity of the HIV skeleton virus, and therefore these compounds are considered to be envelope proteins that specifically act on the H5N1 influenza virus.
  • 293T cells were digested with 0.25% trypsin, seeded into a six-well plate at a density of 5 x 105 cells per well, and cultured for 24 hours.
  • the six-well plate was further cultured for 48 hours, and the supernatant was collected, centrifuged at 2000 rpm, and stored at 80 °C.
  • MDCK cells were seeded at a cell density of 1 ⁇ 10 4 cells per well in a 96-well plate and cultured for 24 hours.
  • Compound inhibition rate (%) [ 1- (EN) / (PN) ] X 100, where E represents the chemiluminescence value of the experimental group, P represents the positive, that is, the chemiluminescence value of the virus plus no drug, and N represents the negative The chemiluminescence value of the control group.
  • the compounds of the present invention have no inhibitory effect on the VSV-G pseudovirus as shown in Figure 2.
  • the present invention has a 3-fluoro-5-(trifluoromethyl)benzamide compound 50 g, a starch 96 g, a dextrin 50 g, a tartaric acid 2 g, a 50% ethanol amount, and a magnesium stearate 2 go total 1000 tablets, each containing 50 mg of the compound.
  • the 3-fluoro-5-(trifluoromethyl)benzamide compound of the present invention has 60 g of the compound, 20 g of microcrystalline cellulose, 15 g of sodium carboxymethyl starch and 5 g of magnesium stearate.
  • the 5-fluoro-5-(trifluoromethyl)benzamide compound of the present invention 5 g, sodium chloride 9 g o is formulated into 1000 ml o [Preparation method]
  • the 3-fluoro-5-(trifluoromethyl)benzamide compound of the present invention is referred to as 5 g of sodium chloride and 9 g of sodium chloride.
  • the 3-fluoro-5-(trifluoromethyl)benzamide compound of the present invention is 100 g, and sodium chloride is 9 g. Formulated into 1000 ml. ⁇ Preparation ⁇
  • Intramuscular injection 10 ⁇ 15 mg/kg body weight, 2 times a day, continuous application 3 ⁇ 5 days.
  • Intravenous infusion Daily lg, intravenous infusion of 500 ml isotonic sodium chloride solution, continuous application for 3 to 5 days.

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Abstract

本发明属于有机化学领域，具体涉及苯甲酰胺类化合物，提供一种化学结构式为下式(I) 所示的3-氟-5-(三氟甲基)苯甲酰胺类化合物，该化合物具有抑制 H1N1和H5N1流感病毒的活性，可用于制备抗流感病毒药物。本发明所述的抗流感病毒药物是由式（I）所示的3-氟-5-(三氟甲基)苯甲酰胺类化合物和药学上可以接受的辅料组成，其中，式(I)所示的3-氟-5-(三氟甲基)苯甲酰胺类化合物的含量为0.5～60w%。本发明所述的药物是片剂、胶囊、滴鼻剂或注射剂等制剂。

Description

3-氟 -5- (三氟甲基) -N- (2- (2-噻吩基）乙基)苯甲酰胺及其应用 技术领域
本发明属于苯甲酰胺的化合物领域，特别是涉及 3-氟 -5- (三氟甲基)苯甲酰胺类化合物及 其应用。
背景技术
苯甲酰胺类化合物 （J Med. Chem. 2007, 50 : 5543- 5546) 具有较为广泛的药物活性， 例如抑制组蛋白去乙酰化酶活性； 抑制 VEGFR-2, 显示抗肿瘤性能（Bioorg. Med. Chem. 2010, 20 : 6653 - 6656)； 抗真菌活性 （Der Pharma Chemica, 2010, 2 : 304-314); 抑制分枝杆菌、 细菌和真菌的作用 (Molecules, 2011, 16, 2414-2430)。
1999年， St印 hen等人报道了 3- (三氟甲基) -N- (2- (1-哌啶基）乙基）苯甲酰胺 （CL61917) 能够抑制 HI和 H2型流感病毒 （J Virol, 1999, 73 : 140-151 ) ，认为其作用靶点是在血凝素亚 基 HA2, 分子对接研究显示酰胺基团的氧原子能与 HA2形成氢键。 2010年， Vander linden等合 成了 2-羟基 -N- (2， 8-二甲基 -3-氧 -1-硫 -4-氮杂螺十烷 -4-烷基苯甲酰胺，此化合物对 A/H1N1, A/H5N1, A/H7N2和 B型流感病毒没有抑制作用，但对 A/H3N2型流感病毒具有很强的抑制作用（J. Virol, 2010, 84 : 4277-4288)。
中国专利 200910042286. 9公布了 3_氟 _5_ (三氟甲基) _N_ (2- (1-哌啶基）乙基）苯甲酰胺 盐酸盐（CL385319)具有抑制 H5N1型流感病毒活性的作用， 能在病毒感染的早期阶段打断复 制的环节， 降低血浆病毒载量， 具有明显的优越性； 用该化合物制备的抗 H5N1型流感病毒药 物， 能有效地降低流感病毒的基因突变率。 由于该化合物的作用靶点是血凝素蛋白， 我们进 一步的研究表明其能稳定其中性构象，且 HA1上的 M24和 HA2上 F110两个氨基酸是影响其活 性的关键位点 (Eur J Pharmacol. 2011, 660 : 460-467)。 但是该化合物抑制 H5N1流感病毒 的活性仍不够理想。 发明内容
本发明的要解决的技术问题是， 提供一种 3-氟 -5- (三氟甲基)苯甲酰胺类化合物， 该化合 物对 H5N1型和 H1N1型流感病毒具有抑制效果好的优点。
为了解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案是：
一种 3-氟 -5- (三氟甲基)苯甲酰胺类化合物， 其化学结构式为下式（I)所示，
Figure imgf000003_0001
( 1 )。
本发明所述的苯甲酰胺类化合物采用本领域常规方法合成， 如， 将 3-氟 -5- (三氟甲基) 苯甲酰氯和噻吩 -2-乙基胺进行反应得到。本发明人推荐的方法由以下步骤组成： 将等摩尔数 的噻吩 -2-乙基胺和 3-氟 -5- (三氟甲基)苯甲酰氯加入二氯甲烷中， 在常温下反应 5 h; 反应 结束后， 再在二氯甲烷和乙酸乙酯混合溶剂中重结晶， 纯化得到白色固体即可。
上述方法所得到的白色固体即为上式 （I ) 所示化合物， 该化合物的名称为 3-氟 -5- (三 氟甲基) -N- (2- (2-噻吩基）乙基)苯甲酰胺。 药理实验发现， 3-氟 -5- (三氟甲基) -N- (2- (2-噻 吩基）乙基)苯甲酰胺具有抑制 Him和 H5N1流感病毒的活性，特别是抑制致病性 H5N1流感病 毒的活性较高， 可用于制备抗 H1N1和 H5N1流感病毒的药物。
本发明所述的抗 H1N1和 H5N1流感病毒的药物由式（I )所示化合物和药学上可以接受的 辅料组成， 其中式 （I ) 所示化合物的质量百分比含量为 0. 5%— 60%。
本发明所述的药物是本领域常用的剂型， 如片剂、 胶囊剂、 滴鼻剂或注射剂， 其中， 所述的片剂由下述重量配比的原料组成： 3-氟 -5- (三氟甲基) -N- (2- (2-噻吩基）乙基)苯 甲酰胺 25%、 淀粉 48%、 糊精 25%、 酒石酸 1%和硬脂酸镁 1%;
本发明所述的胶囊剂的内容物由下述重量配比的原料组成： 3-氟 -5- (三氟甲 基) -N- (2- (2-噻吩基）乙基)苯甲酰胺 60%、 微晶纤维素 20% ， 羧甲基淀粉钠 15%和硬脂酸镁 5%；
所述的滴鼻剂由下述重量配比的原料组成： 3-氟 -5- (三氟甲基) -N- (2- (2-噻吩基）乙基) 苯甲酰胺 0. 5%、 氯化钠 0. 9%和水 98. 6%；
所述的注射剂由下述重量配比的原料组成： 3-氟 -5- (三氟甲基) -N- (2- (2-噻吩基）乙基) 苯甲酰胺 10%、 氯化钠 0. 9%和水 89. 1%。
本发明所述的苯甲酰胺类化合物可特异性地作用于 H5N1流感病毒的包膜蛋白，对高致病 性 H5N1流感病毒具有良好的抑制活性， 可用于制备抗流感病毒药物， 且较 3-氟 -5- (三氟甲 基) -N- (2- ( 1-哌啶基）乙基)苯甲酰胺显示出更好的抑制效果。 附图说明 图 1是本发明所述的苯甲酰胺类化合物的药物浓度与抑制讓假病毒活性的曲线图。 图 2是本发明所述的苯甲酰胺类化合物的药物浓度与抑制 VSV-G假病毒活性的曲线图。 具体实施方式 例 1
1、 3-氟 -5- (三氟甲基) -N- (2- (2-噻吩基）乙基)苯甲酰胺的合成 称取 0. 127g (lmmol) 噻吩 _2_乙基胺加入到装有 10 mL二氯甲烷 （经无水处理） 溶液中， 搅拌； 取 0. 226g (lmmol) 3-氟 -5- (三氟甲基)苯甲酰氯溶于 5ml的二氯甲烷中，用常压滴液漏 斗在 10分钟之内滴入 N-氨基吡咯烷溶液中， 搅拌， 在常温下反应 5 h. 反应完毕，旋干，然后 用二氯甲烷和乙酸乙酯混合溶剂重结晶， 得白色粉末状固体 0. 307g， 产率 97%。
2、 ESI质谱鉴定
将步骤 1所得白色粉末状固体进行 ESI质谱鉴定， 具体鉴定条件和结果如下：
m. p. 86〜88°C.
MS (ESI) m/z : 316. 10 (M+H)―，
¾NMR (CDC13, 400 MHz) δ： 3· 16〜3· 20 (m, 2Η, J=13. 2Hz, CH2)， 3. 73-3. 77 (m, 2H, J=18. 8Hz, CH2)， 6· 88〜6· 89 (m, 1H， J=3. 2Hz, CH) , 6. 97-6. 99 (m, 1H， J=8. 8Hz, CH) , 7· 19〜7· 20 (d, H, J=l. 2Hz, CH) , 7. 20〜7. 21 (d， 1H， J=l. 2Hz, ArH) , 7. 45〜7. 47 (d， 1H， J=8. 0Hz, ArH) , 7. 62〜7· 64 (d， 1H， J=8. 4Hz, ArH) , 7. 75 (s, H, NH)； 13CNMR (CDC13, 400 MHz) δ ： 29. 7, 41. 6, 117. 8, 118. 0, , 119. 5, 124. 3, 125. 7, 127. 3, 137. 9 , 140. 8， 163. 7， 164. 9ο
Anal. cal. for C14HuF4N0S： C 52. 99， H 3. 49， N 4. 41， S 10. 11 ; found C 52. 89， H 3. 47， N 4. 45， S 10. 18。
上述鉴定数据说明制备的白色粉末状固体为化合物 3-氟 -5- (三氟甲基) -N- (2- (2-噻吩基) 乙基)苯甲酰胺。 例 2
本例为 3-氟 -5- (三氟甲基) -N- (2- (2-噻吩基）乙基)苯甲酰胺抑制 H5N1假病毒的活性实 验。 假病毒实验是指将表达 H5N1流感病毒包膜蛋白的质粒和表达荧光素酶（Luciferase)报 告基因的包膜蛋白缺陷的 HIV骨架质粒 pNL4-3. Luc. R— E—， 共转染 293T细胞， 组装成只具有 一次感染性的 H5N1流感假病毒。 由于流感病毒进入靶细胞的过程由包膜蛋白所介导， 因此假 病毒实验是一个高度敏感、 客观、 安全的模拟真病毒进入靶细胞的实验体系， 可用于评价化 合物抑制流感病毒进入靶细胞的活性。
实验方法：
1、 制备高致病性 H5N1流感病毒的假病毒
1 ) 用 0. 25%的胰蛋白酶消化 293T细胞， 以每孔 5xl05个细胞密度接种到六孔板， 培养 24小时。
2)等六孔板细胞长到 60— 70%汇合时， 以每孔为单位， 混合 2 g pHA质粒， 1 μ g pNA 质粒， 3 μ g pNL4-3. Luc. R— E—质粒， 用磷酸钙方法转染到 293T细胞上。 本实验所用的 pHA质 粒能在病毒膜上表达 A/Anhui/1/2005毒株病毒包膜上的血凝素蛋白， pNA质粒能在病毒膜上 表达 A/Thai land/Kan353/2004毒株的神经氨酸酶蛋白。
3) 六孔板继续培养 48小时， 收集上清， 2000 rpm离心， 收集上清液， 一 80°C保存。
4) 用 HIV-1 p24 的酶联免疫试剂盒 （ELISA) 对上清液中的假病毒进行定量。
2、 检测化合物对 H5N1流感假病毒的抑制作用。
1) 以每孔 1X104个细胞密度接种 MDCK细胞于 96孔板， 培养 24小时。
2) 2倍稀释化合物到不同浓度， 50 μ ΐ化合物与假病毒 （1 ng/p24每孔） 在 37°C孵育 30分钟。 阳性对照药物为 3-氟 -5- (三氟甲基) -N- (2- (1-哌啶基）乙基)苯甲酰胺盐酸盐。
3)往 96孔板中加入化合物和假病毒的混合物， 在 37°C的细胞培养箱继续培养 48小时。
4)吸走培养上清， 用 PBS洗两次细胞， 每孔加 50 μ ΐ裂解液， 轻轻摇晃， 继续静置 30 分钟，待细胞裂解完毕，吸取 40 μ 1裂解物到白板，加入荧光素酶显色底物（Promega, Madison, WI, US), 在多功能酶标仪 （Genios Pro, Tecan, US) 上检测化学发光值， 判断药物抑制病 毒进入的活性。 化合物抑制率 （％) = [1- (E-N) / (P-N) ] X 100, 其中 E代表实验组的化学发光 值， P代表阳性也就是不加药物只加病毒的化学发光值， N代表阴性对照组的化学发光值。 化 合物的半数抑制浓度 （IC50) 作为化合物抗病毒活性的指标， 通过 Calcusyn软件计算得出。 实验结果：
本发明化合物对 讓 假病毒具有很强的抑制活性， 其抑制活性比 3-氟 -5- (三氟甲 基) -N- (2- (1-哌啶基）乙基)苯甲酰胺盐酸盐强。 结果见表 1及附图 1。 表 1 : 本发明化合物对 H5N1假病毒感染的抑制活性
(Mean ± SD， μΜ)
3-氟 -5- (三氟甲基) -Ν- (2- (2-噻吩基）乙基）苯甲酰胺 0. 10±0. 01
3-氟 -5- (三氟甲基) -N- (2- (l-哌啶基）乙基)苯甲酰胺盐酸盐 0. 37 ±0. 12 例 3
本例为 3-氟 -5- (三氟甲基) -N- (2- (2-噻吩基）乙基)苯甲酰胺抑制 mm流感病毒的活性 实验。
实验方法：
将犬肾细胞 （MDCK) 细胞接种于 96孔细胞培养板， 每孔 100 μ 1， 细胞数为 1 X 105个 /孔， 待 24小时后长成完整单层， 用 DMEM无血清培养基将化合物稀释成 10个不同浓度， 每孔加入 50 μ ΐ化合物， 同时接种 50 μ ΐ的 100 TCID5。的 H1N1 FM1流感病毒株， 置于 37°C、 5% C02温箱中 继续培养。每天在倒置显微镜下观察病变程度（CPE)并记录。当病毒对照孔细胞病变出现 ++〜 +++ ( 50%-75%) 时停止培养， 收集培养液上清， 将上清液进行血凝实验， 检测病毒的毒性。
血球凝集（HA)试验在 96孔微量反应板上进行。 自左至右往 96孔微量反应板各孔加 50 μΐ 生理盐水。 于左侧第 1孔加 50 病毒液， 混合均匀后， 吸 5(^L至第 2孔， 依次倍比稀释至第 11 孔， 吸弃 50μ!^ 第 12孔为鸡红细胞对照。 自右至左依次向各孔加入 0. 5%鸡红细胞悬液 50μ1^， 在振荡器上振荡， 室温下静置 10 min, 待对照孔鸡红细胞已沉淀即可进行结果观察。 若红细 胞全部凝集， 会沉于孔底， 平铺呈网状， 判定为为 100%凝集 （++++) ， 不凝集者 （-) 红细 胞沉于孔底呈点状。 以 100%凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝效价， 即为一个凝集单位。 实验结果：
本发明化合物对 H1N1流感病毒具有抑制活性， 结果见表 2。 表中 IC50为降低病毒血凝 效价一半时的药物浓度。 表 2: 本发明化合物对 H1N1流感病毒的抑制活性
化合物 IC6„ (μΜ)
3-氟 -5- (三氟甲基） -N- - (2- (2-噻吩基）乙基)苯甲酰胺 62. 5
3-氟 -5- (三氟甲基） -N- (2- - (1-哌啶基）乙基)苯甲酰胺盐酸盐 3. 1 例 4
本例为本发明化合物作用于流感病毒包膜蛋白的特异性实验。 本发明化合物能抑制讓假病毒的感染活性，但该假病毒是将流感病毒的包膜蛋白表达 在 HIV的病毒膜上。因此，该假病毒的骨架为 HIV。为确定本发明化合物是特异性作用于 H5N1 的包膜蛋白， 而不是作用与作为骨架的 HIV, 我们采用了另外一个假病毒， 即将水泡口炎病 毒包膜蛋白 G (VSV-G) 表达在 HIV骨架病毒的 VSV-G假病毒， 作为阴性对照。 如果本发明的 化合物对 VSV-G假病毒是没有抑制作用， 表明这些化合物即不干扰 VSV-G包膜蛋白的功能， 也不影响 HIV骨架病毒的活性，因此可以认为这些化合物是特异性地作用于 H5N1流感病毒的 包膜蛋白。
实验方法：
1、 构造 VSV-G假病毒
1 ) 用 0. 25%的胰蛋白酶消化 293T细胞， 以每孔 5xl05个细胞密度接种到六孔板， 培养 24小时。
2 )等六孔板细胞长到 60 70 %汇合时， 以每孔为单位， 混合 2 μ g pVSV-G质粒， 3 μ g PNL4-3. Luc. R— E—质粒， 用磷酸钙方法转染到 293T细胞上。
3 ) 六孔板继续培养 48小时， 收集上清， 2000 rpm离心， 80°C保存。
4) 用 HIV-1 p24 的酶联免疫试剂盒 （ELISA) 对假病毒进行定量。
2、 检测化合物对 VSV-G假病毒的抑制作用。
1) 以每孔 1X104个细胞密度接种 MDCK细胞于 96孔板， 培养 24小时。
2) 2倍稀释化合物到不同浓度， 50 μ ΐ化合物与假病毒 （1 ng/p24每孔） 在 37°C孵育 30分钟。
3)往 96孔板中加入化合物和假病毒的混合物， 在 37°C的细胞培养箱继续培养 48小时。 吸走培养上清， 用 PBS洗两次细胞， 每孔加 50 μ ΐ裂解液， 轻轻摇晃， 继续静置 30分 钟，待细胞裂解完毕，吸取 40 μ 1裂解物到白板，加入荧光素酶显色底物（Promega, Madison, WI, US ), 在多功能酶标仪 （Genios Pro, Tecan, US ) 上检测化学发光值， 判断药物抑制病 毒进入的活性。 化合物抑制率 （％) = [ 1- (E-N) / (P-N) ] X 100, 其中 E代表实验组的化学发光 值， P代表阳性也就是不加药物只加病毒的化学发光值， N代表阴性对照组的化学发光值。 实验结果：
本发明化合物对 VSV-G假病毒没有抑制作用见附图 2。
例 5 (应用例）
1、 片剂：
【制剂处方】
本发明所述的 3-氟 -5- (三氟甲基)苯甲酰胺类化合物 50 g， 淀粉 96 g， 糊精 50 g， 酒 石酸 2 g, 50 %乙醇适量， 硬脂酸镁 2 g o 共制 1000片， 每片含该化合物 50 mg。
【制备方法】
称取本发明所述的 3-氟 -5- (三氟甲基)苯甲酰胺类化合物 50g、 淀粉 96 g、 糊精 50 g混 合均匀。 另将 lg酒石酸溶于 50 %乙醇中， 按适宜量一次加入混合粉末中， 制成软材， 通过 18-20 目尼龙筛制成湿粒， 60°C以下干燥， 整粒， 与过筛的 lg硬脂酸镁混匀， 压片 （每片 0. 2 g)， 质检、 包装， 即得。
【用法用量】
每次 3片， 每日 3次
【适用人群】
适用各种健康人及流感病毒感染者。
2、 胶囊剂：
【制剂处方】
本发明所述的 3-氟 -5- (三氟甲基)苯甲酰胺类化合物所述化合物 60 g、微晶纤维素 20 g， 羧甲基淀粉钠 15 g和硬脂酸镁 5 g o
【制备方法】
称取本发明所述的 3-氟 -5- (三氟甲基)苯甲酰胺类化合物 60 g、 微晶纤维素 20 g ， 羧 甲基淀粉钠 15 g和硬脂酸镁 5 g， 混匀， 包胶囊 （每粒 0. 2 g), 质检， 即得。
【用法用量】
每次 3粒， 每日 3次
【适用人群】
适用各种健康人及流感病毒感染者。
3、 滴鼻剂：
【制剂处方】
本发明所述的 3-氟 -5- (三氟甲基)苯甲酰胺类化合物 5 g， 氯化纳 9 g o 配成 1000 ml o 【制备方法】
称本发明所述的 3-氟 -5- (三氟甲基)苯甲酰胺类化合物 5 g， 氯化钠 9 g。 加水配成 1000 ml , 浓度为 0. 5%， 常法制成滴鼻剂 （120°C热压蒸汽灭菌 20 - 30min) ， 20 ml/支。
【用法用量】
每小时滴鼻 1次， 每次每侧鼻孔 1〜2滴。
【适用人群】
适用各种健康人及流感病毒感染者。
4、 注射剂：
【制剂处方】
本发明所述的 3-氟 -5- (三氟甲基)苯甲酰胺类化合物 100 g， 氯化纳 9 g。 配成 1000 ml。 【制备方法】
称取本发明所述的 3-氟 -5- (三氟甲基)苯甲酰胺类化合物 100 g， 氯化钠 9 g。 加水配成 1000 ml , 浓度为 100 mg/ml , 常法制成注射剂（120°C热压蒸汽灭菌 20 - 30min) ， 分装 1 ml/ 支。
【用法用量】
肌内注射： 10〜15 mg/kg体重， 每日 2次， 连续应用 3〜5日。
静脉滴注： 每日 lg， 加入 500ml等渗氯化钠溶液中静脉滴注， 连续应用 3〜5日。
【适用人群】
适用各种健康人及流感病毒感染者。

Claims

权 利 要 求 书 WO 2013/044763 PCT/CN2012/081798
1. 一种 3-氟 -5- 三氟甲基)苯甲酰胺类化合物， 其化学结构式为下式（I)所示，
Figure imgf000010_0001
( I ) 。
2. 权利要求 1所述的 3-氟 -5- (三氟甲基）苯甲酰胺类化合物在制备抗 H1N1和 H5N1流感病 毒药物中的应用。
3. 根据权利要求 2所述的应用， 其特征是， 所述的药物中含有质量百分比为 0. 5%_60%的 权利要求 1所述的 3-氟 -5- (三氟甲基)苯甲酰胺类化合物。
4. 根据权利要求 3所述的应用， 其特征是， 所述的药物是片剂、 胶囊剂、 滴鼻剂或注射 剂。
5. 根据权利要求 4所述的应用， 其特征是， 所述的片剂由下述重量配比的原料组成： 权利要求 1所述化合物 25%、 淀粉 48%、 糊精 25%、 酒石酸 1%和硬脂酸镁 1%。
6. 根据权利要求 4所述的应用， 其特征是， 所述的胶囊剂的内容物由下述重量配比的原 料组成：
权利要求 1所述化合物 60%、 微晶纤维素 20% ， 羧甲基淀粉钠 15%和硬脂酸镁 5%。
7. 根据权利要求 4所述的应用， 其特征是， 所述的滴鼻剂由下述重量配比的原料组成： 权利要求 1所述化合物 0. 5%、 氯化钠 0. 9%和水 98. 6%。
8. 根据权利要求 4所述的应用， 其特征是， 所述的注射剂由下述重量配比的原料组成： 权利要求 1所述化合物 10%、 氯化钠 0. 9%和水 89. 1%。
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