CN102764429A

CN102764429A - 一种用于上调动物体内调节性t细胞的组合物及其用途

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Publication number: CN102764429A
Application number: CN2011101146346A
Authority: CN
Inventors: 谢彦晖; 马洁娴
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-05-04
Filing date: 2011-05-04
Publication date: 2012-11-07

Abstract

本发明公开了一种用于上调动物体内调节性T细胞的组合物及其用途。所述的用于上调动物体内调节性T细胞的组合物，其特征在于，所述的组合物含有：20-50×10⁴I.U.的白介素2；和0.05-10.5mg糖皮质激素。

Description

一种用于上调动物体内调节性T细胞的组合物及其用途

技术领域

本发明涉及免疫医学领域，尤其涉及一种用于上调动物体内调节性T细胞的组合物及其用途。

背景技术

CD4+CD25+FOXP3+T细胞(Treg细胞)是自然发生的发挥免疫抑制作用的T细胞亚群。通过抑制CD4+CD25-T细胞、CD4-CD8+T细胞、B细胞等效应细胞，在自身免疫性疾病、炎症性病变的发展、外周T细胞内环境的稳定和移植耐受过程中起重要调节作用。

气道过敏性炎症性疾病长期以来困扰着众多的患者及临床医生，一直没有针对病因，彻底治愈疾病的药物和治疗方案出现。有不少研究发现上调机体的调节性T细胞(Treg)能够治疗过敏性哮喘等疾病，而且过敏性哮喘患者体外扩增调节性T细胞再回输也可以使这类患者的病患减轻。

异基因造血干细胞移植目前已经成为治疗血液系统恶性肿瘤的重要手段。但移植物抗宿主病是造血干细胞移植成功的主要障碍。在小鼠异基因造血干细胞移植中，去除移植物中的CD4⁺CD25⁺调节T细胞会加速移植物抗宿主病(GVHD)的发生，而大量供者来源的新鲜分离的CD4⁺CD25⁺Treg细胞的植入能非常有效地诱导免疫耐受。在对Treg防治GVHD的研究中，CD4⁺调节T细胞通过磁珠进行分选，再对纯化的Treg进行体外的培养、扩增后输入受者。虽然体外扩增及回输调节性T细胞显示了对哮喘和GVHD的抑制效应，但是承担很高的污染、损伤、细胞变性的风险，操作复杂，不易应用到临床上。

因此本领域期望寻找一种体内选择性扩增Treg的有效方法。

发明内容

本发明旨在提供一种能够体内选择性扩增Treg的组合物。

进一步地，本发明还要提供该组合物的用途。

在本发明的第一方面，提供了一种用于上调动物体内调节性T细胞的组合物，所述的组合物含有：

20-50×10⁴I.U.的白介素2；和

0.05-10.5mg糖皮质激素。

在另一优选例中，所述的组合物含有：

20-50×10⁴I.U.的白介素2；和

1.5-10.5mg短效糖皮质激素；

更佳地，所述的组合物含有：

20-50×10⁴I.U.的白介素2；和

2.5-4.5mg短效糖皮质激素。

在另一优选例中，所述的组合物含有：

20-50×10⁴I.U.的白介素2；和

0.2-2.5mg中效糖皮质激素。

更佳地，所述的组合物含有：

20-50×10⁴I.U.的白介素2；和

0.2-1.5mg中效糖皮质激素。

在另一优选例中，所述的组合物含有：

20-50×10⁴I.U.的白介素2；和

0.05-0.3mg长效糖皮质激素。

更佳地，所述的组合物含有：

20-50×10⁴I.U.的白介素2；和

0.06-0.2mg长效糖皮质激素。

在本发明的第二方面，提供了一种如上所述的本发明提供的组合物的用途，用于制备治疗过敏性哮喘的药物。

在本发明的第三方面，提供了一种如上所述本发明提供的组合物的用途，用于制备治疗移植物抗宿主病的药物。

据此，本发明寻找到了一种体内选择性扩增Treg的有效方法。

附图说明

图1显示了白介素2(IL-2)同糖皮质激素配伍形成的组合物连续注射小鼠3日后采集小鼠脾细胞，进行流式检测的流式细胞检测图；其中，

A是应用不同剂量的IL-2和不同的糖皮质激素进行组合，所得到的上调调节性T细胞的比例，配伍中白介素2的用量为每只小鼠0、20、30、40和50×10⁴I.U.，糖皮质激素的用量分别为：每只小鼠可的松(Cortisone)是0和3.5mg，每只小鼠甲基强地松龙(Solu-Medrol)是0和0.5mg，每只小鼠强的松(Prednisonum)是0和0.7mg，每只小鼠曲安奈德(Triamcinolone Acetonide)是0和0.5mg，每只小鼠倍他米松(Betamethasone)是0和0.1mg；每组设立单用白介素2(IL-2)40×10⁴I.U.作为对照，以及单用可的松(3.5mg)或单用甲基强地松龙(0.5mg)或单用曲安奈德倍他米松(0.1mg)作为对照。

B是固定IL-2的用量，变换各种激素的用量，所得到的上调调节性T细胞的比例，配伍中白介素2的用量为每只小鼠40I.U.，糖皮质激素的用量分别为：每只小鼠可的松(Cortisone)是1.5、3.5、7、和10.5mg，每只小鼠甲基强地松龙(Solu-Medrol)是0.2、0.5、1.0、和1.5mg，每只小鼠强的松(Prednisonum)是0.3、0.7、1.5、和2.5mg，每只小鼠曲安奈德(Triamcinolone Acetonide)是0.2、0.5、1.0、和1.5mg，每只小鼠倍他米松(Betamethasone)是0.05、0.1、0.2、和0.3mg。

图2、图4、和图6均显示了各组预处理(预防用药)小鼠后进行小鼠过敏性哮喘模型建立，检测一系列相关指标，检测肺泡灌洗液中细胞数，检测肺泡灌洗液中细胞因子量以及小鼠肺部病理切片；不同造模过程中应用IL-240万IU/只小鼠；其中，

A是地塞米松联合白介素2预防用药在先，用卵清蛋白(OVA)诱发哮喘在后的顺序示意图，analysis为分析取样的时间；

B是小鼠首先接受药物干预后进行过敏性哮喘诱发及激发后2天检测肺泡灌洗液中总细胞数，嗜酸性粒细胞数以及细胞因子量；

C是小鼠接受药物干预后进行过敏性哮喘诱发，肺部病理切片变化；

图2是短效激素+白介素2作用组，即联合可的松3.5mg/只(可用于预防疾病)，每实验组设立对照(单用糖皮质激素，单用白介素2和不用药组)；

图4是中效激素(强的松)+白介素2作用组，即强的松0.7mg/只(可用于预防疾病)，每实验组设立对照(单用糖皮质激素，单用白介素2和不用药组)；

图6是长效激素(beta：倍他米松)+白介素2组，即倍他米松0.1mg/只(可用于预防疾病)，每实验组设立对照(单用糖皮质激素，单用白介素2和不用药组)。

图3、图5、和图7均显示了小鼠首先进行支气管过敏性哮喘的建模诱发和激发，然后进行药物干预之后再利用OVA抗原进行激发，检测肺泡灌洗液中细胞数，检测肺泡灌洗液中细胞因子量以及小鼠肺部病理切片，不同造模过程中应用IL-240万IU/只小鼠；其中，

A为地塞米松联合白介素2在过敏性哮喘OVA诱发、激发后及在OVA抗原再次激发前用的顺序示意图，表明对过敏性哮喘的治疗作用；

B为小鼠接受药物治疗后再次OVA抗原激发后2天检测肺泡灌洗液中总细胞数，嗜酸性粒细胞数及细胞因子量；

C是小鼠接受药物治疗后进行OVA抗原激发后2天的肺部病理切片变化；

图3是短效激素+白介素2作用组，即可的松3.5mg/只(可用于治疗疾病)；

图5是中效激素(强的松)+白介素2作用组，即强的松0.7mg/只(可用于治疗疾病)；

图7是长效激素(beta：倍他米松)+白介素2组，即倍他米松0.1mg/只(可用于治疗疾病)。

具体实施方式

发明人的深入研究表明，白介素2(Interleukin-2)和糖皮质激素(glucocorticoid)联用能够在动物体内选择性扩增调节性T细胞，从而减轻过敏性哮喘和GVHD。在此基础上，完成了本发明。

具体地，本发明提供一种组合物，其中含有白介素2和糖皮质激素，所述组合物的单元剂量中含有20-50×10⁴I.U.的白介素2和0.05-10.5mg糖皮质激素。

所述的糖皮质激素包括长效糖皮质激素、中效糖皮质激素、和短效糖皮质激素。所述的长效糖皮质激素选自地塞米松或倍他米松(Betamethasone)；所述的中效糖皮质激素选自强的松(Prednisonum)、强地松龙(Predonin)、甲基强地松龙(Solu-Medrol)、曲安奈德(Triamcinolone Acetonide)、或去炎松(Triamcinolone)；所述的短效糖皮质激素选自氢化可的松(Hydrocortisone)、或可的松(Cortisone)。

当糖皮质激素是长效糖皮质激素时，本发明提供的单元剂量的组合物中含有20-50×10⁴I.U.的白介素2和0.05-0.3mg长效糖皮质激素；当糖皮质激素是中效糖皮质激素时，本发明提供的单元剂量的组合物中含有20-50×10⁴I.U.的白介素2和0.2-2.5mg中效糖皮质激素；当糖皮质激素是短效糖皮质激素时，本发明提供的单元剂量的组合物中含有20-50×10⁴I.U.的白介素2和1.5-10.5mg短效糖皮质激素。

如本文所用，“上调”是指比施与组合物前高。

如本文所用，“动物体内应用”是指通过口服经肠道吸收或经肌肉注射或其他注射的方法进入动物体内。

如本文所用，“调节性T细胞”是指对机体免疫反应具有调节作用的细胞，通常对免疫效应细胞的免疫过程具有抑制作用，其免疫表型为CD4+Foxp3+，由T regulatory cells(Treg)翻译而来。如本文所用，术语“单元剂量”或“单元剂型”都是指为了计量方便或服用方便，将本发明的组合物制备成单次服用所需的剂量或剂型。所述的单元剂量或单元剂型中含有对于治疗哮喘和/或GVHD有效的本发明的组合物。

当将组合物制备成单元剂量或单元剂型时，可以根据治疗对象的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、组合物中化合物活性强度、服用、代谢速率、病症的严重程度以及诊治医师的主观判断，对服用量或注射量进行调整，例如但不限于，每天服用所述单元剂量的组合物0.5-5倍，或每天服用所述单元剂型的组合物1-3剂；更优选的，每天服用所述单元剂量的组合物1-3倍，或每天服用所述单元剂型的组合物1-2剂。

如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由......构成”、和“由......构成”。

如本文所用，术语“基本上由......构成”指在组合物中，除了含有必要成分或必要组份之外，还可含有少量的且不影响有效成分的次要成分和/或杂质。例如，可以含有甜味剂以改善口味、抗氧化剂以防止氧化，以及其他本领域常用的添加剂。

术语“治疗对象”或“治疗对象”是指鼠、人及其他哺乳动物。

术语“治疗有效量”或“有效量”都是指可对治疗对象产生功能或活性的且可被治疗对象所接受的量。本发明能够在治疗对象体内达到治疗目的是本发明提供的组合物的单元剂量或单元剂量的倍数量，所述的倍数包括20-100倍，较佳地为20-80倍，更佳地为25-50倍。本领域的普通技术人员应理解，所述“治疗有效量”可随本发明提供的组合物的给药途径、所用药物辅料以及与其他药物联合用药情况的不同而有所不同。

在本文中，“组合物”一词是指其所含的各成份可分别独立存在(例如包含各成份分开包装的套组(kit))、部份成份混合在一起(例如两成份混合在一起，另一成份则单独存在)、或者全部成份混合在一起以形成一混合物的各种形式。

本发明还提供一种药物组合物，其中含有本发明提供的组合物和药学上可接受的载体。

所述药物组合物可以根据不同给药途径而制备成各种剂型。这些剂型以下面方式之一施用：口服、喷雾吸入、直肠用药、鼻腔用药、颊部用药、局部用药、非肠道用药，如皮下、静脉、肌肉、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内和颅内注射或输入，或借助一种外植储器用药。

如本文所用，术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、pH缓冲物质等。

本发明所引用参考资料的技术内容就其整体一并引入本文作为参考。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本发明的主要优点在于：

1、本发明首次将白介素2和糖皮质激素相互配伍，通过体内注射3日来上调体内T调节细胞的比例，从而减轻过敏性哮喘和GVHD。

2、本发明提供的组合物通过药物的巧妙配伍来达到适度上调T调节细胞的比例从而治疗疾病，是从疾病的根源上进行治疗，具有有效、副作用小，经济、安全、技术难度低、疗效较持久等特点。

3、在动物实验中观察到，注射本发明提供的组合物的小鼠移植，GVHD显著减轻，生存时间延长。

下面将结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。

本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例

材料：

6-8周BALB/C雌鼠购自中国科学院九亭实验动物饲养基地

白介素2 购自上海华新生物技术有限公司

可的松购自上海通用药业股份有限公司

强的松购自上海信谊药厂有限公司

甲强龙购自辉瑞投资有限公司

曲安奈德购自浙江仙琚制药股份有限公司

倍他米松购自上海先灵葆雅制药有限公司

Varian Clinic 600C直线加速器华山医院伽玛刀分院所购，借用仪器

方法：

一、通过给小鼠注射不同剂量的药物来摸索不同组合上调Treg细胞的能力，分成若干组，应用IL-2联合可的松组，IL-2联合强的松组，IL-2联合甲强龙组，IL-2联合曲安奈德组，IL-2联合倍他米松组。连续3日，3日后采集小鼠脾细胞，进行流式检测。

二、选取6-8周BALB/C雌鼠，分为五组，实验组腹腔注射白介素2：40万IU/只小鼠，联合可的松3.5mg/只小鼠或强的松0.7mg/只小鼠或倍他米松0.1mg/只小鼠(三个实验组)，连续3日，每日一次，其他组注射生理盐水。

不同激素组均有上调T调节细胞的作用，然后短效，中效和长效各选用上调T调节细胞最好的一组组合用于动物实验。结果见图6、图7(培他米松组)，图2、图3(可的松组)和图4、图5(强的松组)。

一周后，分别进行过敏性哮喘模型与GVHD模型的建立，具体实验方法为：

过敏性哮喘模型：取BalB/C小鼠，分为两组，实验组于第0，14天腹腔注射100μg OVA(卵清蛋白，albumin)与10mg AL(OH)₃佐剂组成的混合溶液，对照组仅给10mg AL(OH)₃佐剂。再第28，29，30与第34，35，36天给予小鼠100μg OVA溶液进行滴鼻诱发，在诱发后两天进行气管插管，肺泡灌洗等检测，具体造模顺序见图2A、3A、4A、5A、6A、7A。

移植模型：

移植前预处理：Varian Clinic 600C直线加速器对受鼠进行500cGy全身放疗，剂量率80cGy/min，SSD 100cm。

制备移植细胞：超净台取出供鼠脾脏，碾磨后150-200目滤网过滤，将脾细胞悬液1500r，7min离心，加入红细胞裂解液洗涤后，无菌PBS液悬浮。

淋巴细胞植入：放疗后24小时，腹腔注射移植入新鲜取出的供鼠脾单个核细胞3-4×10⁷。

上述实验方法在检测时过敏性哮喘检测肺泡灌洗液中IL-4，IL-5，IFN-gamma因子水平，嗜酸性粒细胞计数，肺脏病理。

GVHD检测实验小鼠的生存时间、死亡率和症状。

结果：

1、应用不同药物组合3天后采集小鼠脾细胞进行流式细胞检测，由于目前认为CD4+FoxP3+细胞即T调节细胞，故使用相应的标记抗体标记细胞(以下图1示)，直方图代表CD4+FoxP3+细胞，即T调节细胞(Treg)的比例越高，免疫抑制的程度越强，理论上对治疗疾病越有效，见图1。

图IA的结果表明，白介素2(IL-2)40×10⁴I.U.是最佳使用剂量。

结果表明，IL-2联合倍他米松上调T调节细胞作用最强。IL-2与其它糖皮质激素联合也有不同程度的上调T调节细胞的作用，而单用糖皮质激素或单用IL-2与不用药组无明显差异，表明单用糖皮质激素或IL-2不能明显上调T调节细胞。

2、通过给小鼠注射不同剂量的药物来摸索白介素2，糖皮质激素最佳配伍，能够最好地上调T调节细胞的比例。结果发现，在不同的糖皮质激素IL-2的组合中，无论是短效激素(比如可的松)，还是中效激素(比如强的松，甲强龙)，或是长效激素(比如倍他米松)，与IL-2联用均可以上调调节性T细胞的比例，但是长效激素与IL-2联用上调的效果最好。

3、各组药物处理(地塞米松联合白介素2预防用药或治疗用药)小鼠后及小鼠哮喘模型建立后，检测一系列相关指标。检测肺泡灌洗液中细胞数，检测肺泡灌洗液中细胞因子量以及小鼠肺部病理切片。见图2、图3、图4、图5、图6和图7，不同造模过程中应用IL-240万IU/只小鼠，联合可的松3.5mg/只小鼠或强的松0.7mg/只小鼠或倍他米松0.1mg/只小鼠预处理。

结果表明，无论是在抗原提呈前进行药物处理还是在抗原激发后进行联合药物处理，IL-2联合倍他米松组或可的松或强的松的肺部炎症反应均可以减轻，表现为肺部病理切片支气管周围炎症细胞浸润减轻(每组病理图的左图)和支气管粘液分泌量减少(每组病理图右图)及肺泡灌洗液的细胞数和嗜酸粒细胞数明显减少。肺泡灌洗液IL-4和IL-5明显下降和INF-gamma增高，表明过敏性哮喘病态Th2极化明显减轻，见图2、图3、图4，图5、图6、图7中的B和C。

4、各组预处理供鼠进行异基因淋巴细胞移植后，受鼠生存时间分析。此时实验组利用IL-240万IU/只小鼠，联合可的松3.5mg/只小鼠或强的松0.7mg/只小鼠或倍他米松0.1mg/只小鼠预处理，对照组(单用白介素2和不用药组生理盐水组)进行预处理。结果见表1和表2，表1和表2中可见各组小鼠中小鼠的生存时间以及GVHD的发生情况。

表1和表2：首先建立MHC完全不符同种异基因造血干细胞移植模型，移植前对供鼠用IL-240万IU/只小鼠联合可的松3.5mg/只或强的松0.7mg/只或倍他米松0.1mg/只小鼠预处理；每实验组设立对照(单用糖皮质激素，单用白介素2和不用药组)，预处理后的供鼠移植物移植给受鼠，观察急性移植物抗宿主病(aGVHD)发生和小鼠生存时间，表1为各组小鼠的生存时间和急性GVHD症状评分，表2为糖皮质激素+IL-2组和对照组小鼠出现临床症状的平均发生时间和数量。

表1各组小鼠的生存时间和急性GVHD症状评分

^*轻度：GVHD评分＜3，中度：GVHD评分3-5，重度：GVHD评分＞5

^*，**与对照组相比，P＜0.05

表2糖皮质激素+IL-2组和对照组小鼠出现临床症状的平均发生时间和数量

表1和表2的结果表明，移植物抗宿主病(GVHD)组合物组比对照组明显减轻。应用复合制剂组急性GVHD的临床症状减轻，生存时间延长。

GVHD严重程度根据以下文献进行分级：

Kenneth RC，Lester K，Thomas RM，et al.An experimental model ofidiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation ：I.the roles ofminor H antigens and endotoxin.Blood，1996，8：3230-3239。

0级计0分，1级计1分，2级计2分，进行GVHD临床评分统计。死亡小鼠根据GVHD临床评价评分为10分。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims

1.一种用于上调动物体内调节性T细胞的组合物，其特征在于，所述的组合物含有：

20-50×10⁴I.U.的白介素2；和

0.05-10.5mg糖皮质激素。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的组合物含有：

20-50×10⁴I.U.的白介素2；和

1.5-10.5mg短效糖皮质激素。

3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述的组合物含有：

20-50×10⁴I.U.的白介素2；和

2.5-4.5mg短效糖皮质激素。

4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的组合物含有：

20-50×10⁴I.U.的白介素2；和

0.2-2.5mg中效糖皮质激素。

5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述的组合物含有：

20-50×10⁴I.U.的白介素2；和

0.2-1.5mg中效糖皮质激素。

6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的组合物含有：

20-50×10⁴I.U.的白介素2；和

0.05-0.3mg长效糖皮质激素。

7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述的组合物含有：

20-50×10⁴I.U.的白介素2；和

0.06-0.2mg长效糖皮质激素。

8.一种如权利要求1-7任一所述组合物的用途，用于制备治疗过敏性哮喘的药物。

9.一种如权利要求1-7任一所述组合物的用途，用于制备治疗移植物抗宿主病的药物。