CN102759582A - 川麦冬药材中黄酮类成分的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种川麦冬药材中黄酮类成分的测定方法，该方法包括以下步骤：步骤1、对照品溶液的制备，分别精密称取对照品甲基麦冬黄烷酮A、B、6-醛基异麦冬黄烷酮A适量，加甲醇溶解，分别制成甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B，6-醛基异麦冬黄烷酮A三种对照品溶液；步骤2、供试品溶液的制备，取川麦冬药材粉末用甲醇溶解，过C18柱，甲醇洗脱得供试品溶液；步骤3、将步骤1和步骤2注入HPLC仪器中，得到色谱图；步骤4、对图谱的相似性进行比较相似为含量合格。

Description

川麦冬药材中黄酮类成分的测定方法

技术领域：

本发明涉及一种中药测定方法，特别涉及一种川麦冬药材中黄酮类成分的含量测定方法。

背景技术：

川麦冬：主产于四川绵阳地区，以涪江冲积平原所产麦冬为佳品，又称涪江麦冬，含多种甾体皂甙：麦冬皂甙A、B、C、D，甙元均为假叶树皂甙元，另含麦冬皂甙B’、C’、D’，甙元均为薯蓣皂甙元；尚含多种黄酮类化合物：如麦冬甲基黄烷酮A、B，麦冬黄烷酮A、麦冬黄酮A、B，甲基麦冬黄酮A，B；另分得5个高异黄酮类化合物.

麦冬具有养阴生津，润肺清心的功能。用于肺燥干咳，虚痨咳嗽，津伤口渴，心烦失眠，内热消渴，肠燥便秘；咽白喉。目前已有一些文献报道麦冬的指纹图谱分析方法，但尚缺少对麦冬药材中黄酮类成分指纹图谱的研究，因此本实验对麦冬药材中黄酮类成分进行了指纹图谱的研究，以期为全面控制麦冬药材的质量提供参考依据。

川麦冬药材中黄酮类成分的含量测定目前主要使用滴定法，该法操作复杂，精密度差，目前尚无更精确的测定方法，本发明采用HPLC法，获得了川麦冬药材中黄酮类成分指纹图谱，同时使用该法测定川麦冬药材中黄酮类成分的含量，取得了良好的效果。

发明内容：

本发明提供一种川麦冬药材中黄酮类成分的含量测定，该方法包括以下步骤：

步骤1、对照品溶液的制备，分别精密称取对照品甲基麦冬黄烷酮A、B、6-醛基异麦冬黄烷酮A适量，加甲醇溶解，分别制成甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B，6-醛基异麦冬黄烷酮A三种对照品溶液；

步骤2、供试品溶液的制备，取川麦冬药材粉末用甲醇溶解，过C18柱，甲醇洗脱得供试品溶液；

步骤3、将步骤1和步骤2注入HPLC仪器中，得到色谱图；

步骤4、对图谱的相似性进行比较相似为含量合格。

本发明中所述指纹图谱是HPLC的色谱图。

另一种方法为：

(A)取合格的川麦冬药材粉末，按照上述方法建立川麦冬药材粉末标准指纹图谱；

(B)取待检川麦冬药材粉末，按照上述方法得到指纹图谱；

(C)将步骤(B)得到的指纹图谱和步骤(A)得到的标准指纹图谱进行比对，符合即为合格产品，不符合即为不合格产品。

优选的本发明的测定方法，步骤如下：

步骤1、对照品溶液的制备，分别精密称取对照品甲基麦冬黄烷酮A、B、6-醛基异麦冬黄烷酮A适量，加甲醇溶解，分别制成甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B，6-醛基异麦冬黄烷酮A三种对照品溶液。

步骤2、供试品溶液的制备，取川麦冬药材粉末约6.0g，精密称定，用甲醇超声提取3次，每次30min，每次加甲醇50mL，合并提取液，过滤，蒸干，加水50mL使溶解，上自制C18小柱富集(80～100目，内径1cm，柱高为2cm，单个柱体积约为6ml，上样前用0.5mol·L^-1NaOH溶液处理，再加水平衡)，首先上样(流速0.5ml·min^-1)，用4倍柱体积50％甲醇除去杂质(流速0.5ml·min^-1)，再用5倍柱体积甲醇洗脱目标物质(流速0.3ml·min^-1)，将所得甲醇液蒸干，加甲醇溶解至5mL容量瓶，即得供试品溶液。

步骤3、将步骤1和步骤2的溶液分别注入HPLC仪器中，得到色谱图，对图谱的相似性进行比较。

步骤4、相似为含量合格。

本发明的色谱条件如下：

色谱柱：Waters symeteryC18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)；流动相：A(0.05％磷酸)-B(乙腈)，梯度洗脱(见表1)，柱温30℃，流速1.0mL·min^-1，检测波长296nm，进样量10μL。

表1液相梯度洗脱条件

本发明的方法是经过筛选获得的，研究过程如下：

1.仪器与试药

Waters Alliance2695高效液相色谱仪，Waters2998检测器，Empower色谱工作站(美国Waters公司)，AL204电子天平，XS105梅特勒精密电子分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，KQ-500DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。甲基麦冬黄烷酮A、B、6-醛基异麦冬黄烷酮A对照品(自制，经光谱与色谱鉴定，纯度均达到98％以上)。10批川麦冬药材为市售药材，均来自四川雅安，经天津天士力之骄药业有限公司叶正良研究员鉴定为川麦冬。

2.方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：Waters symeteryC18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)；流动相：A(0.05％磷酸)-B(乙腈)，梯度洗脱(见表1)，柱温30℃，流速1.0mL·min^-1，检测波长296nm，进样量10μL。色谱图见图1。

表1液相梯度洗脱条件

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取对照品甲基麦冬黄烷酮A、B、6-醛基异麦冬黄烷酮A适量，加甲醇溶解，分别制成甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B，6-醛基异麦冬黄烷酮A三种对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取川麦冬药材粉末约6.0g，精密称定，用甲醇超声提取3次，每次30min，每次加甲醇50mL，合并提取液，过滤，蒸干，加水50mL使溶解，上自制C18小柱富集(80～100目，内径1cm，柱高为2cm，单个柱体积约为6ml，上样前用0.5mol·L^-1NaOH溶液处理，再加水平衡)，首先上样(流速0.5ml·min^-1)，用4倍柱体积50％甲醇除去杂质(流速0.5ml·min^-1)，再用5倍柱体积甲醇洗脱目标物质(流速0.3ml·min^-1)，将所得甲醇液蒸干，加甲醇溶解至5mL容量瓶，即得供试品溶液。

2.4 精密度试验

取同一供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，结果各共有峰相对峰面积比值的RSD小于2.82％，相对保留时间的RSD小于0.20％，说明仪器的精密度较好。

2.5 重复性试验

取同一批样品，按“2.2”项下制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别进样，记录色谱图，结果见表2和表3。结果各共有峰相对峰面积比值的RSD小于3.01％，相对保留时间的RSD小于0.31％，说明实验方法的重现性较好。

表2重复性试验相对峰面积(n＝6)

表3重复性试验相对保留时间

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别放置0、2、4、8、12、24小时，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，结果各共有峰相对峰面积比值的RSD小于3.09％，相对保留时间的RSD小于0.33％，表明供试品溶液在24小时内稳定。

2.7 结果

10批具有代表性的川麦冬药材黄酮类成分的指纹图谱见图2，3。由表4可见，10批药材与对照指纹图谱的相似性较好，在0.960～0.995，说明得到的共有模式图具有代表性，可反映川麦冬药材中黄酮类成分的指纹特征。

表4 10批川麦冬药材比较的相似度测定结果

3 讨论

3.1 共有指纹峰相对保留时间及相对峰面积比值  本实验根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》^[3]，采用HPLC法对川麦冬药材黄酮类成分的指纹图谱进行了研究。结果表明，所建立的方法操作简单、重复性好，为川麦冬药材的质量评价提供了参考。川麦冬中甲基麦冬黄烷酮A的含量高于甲基麦冬黄烷酮B^[4]，本实验选定甲基麦冬黄烷酮A为参照峰(S)的相对保留时间和峰面积为1，进行了方法学验证，经分析，符合技术要求的有关规定。

3.2 从川麦冬中黄酮类物质的指纹图谱相似度计算结果可以看出：各样品生成谱图的对照指纹图谱比较，相似度都大于0.96，说明在该产区中的样品质量基本一致，由10批川麦冬药材生成的对照指纹图谱有13个共有峰，在指纹图谱中可以指认出甲基麦冬黄烷酮A，甲基麦冬黄烷酮B，6-醛基异麦冬黄烷酮A等三种已知物质。

3.3 作者对供试品溶液制备方法，检测波长，色谱柱选择，流动相选择都进行了相关考察，最终确定本实验中所选择的甲醇超声，C18小柱富集为最适宜提取方法；通过3D数据分析确定样品在296nm处有最大吸收；经过与Phenomenex LunaC18(4.6mm×250mm，5μm)和Diamonsil C18(4.6mm×250mm，5μm)进行对比，确定Waters Symmetry C18色谱柱最为适；通过与乙腈-水^[5]流动相洗脱效果对比，确定以乙腈-0.05％磷酸水溶液梯度洗脱溶剂系统所得图谱的峰形较好、分离度大，确定为为本试验的流动相系统。

3.4 川麦冬药材是天津天士力之骄药业有限公司产品注射用益气复脉(冻干)的重要原料药，企业要求原料药产地固定，质量稳定，本实验经过对10批原料药的指纹图谱研究表明，原料药材质量稳定可控，为产品的质量标准建立提供了有力保障。

本发明效果好，操作简单，易于推广。

附图说明

图1对照品的色谱图(1.甲基麦冬黄烷酮A，2.甲基麦冬黄烷酮B，3.6-醛基异麦冬黄烷酮A)

图2 10批川麦冬药材黄酮类指纹图谱

图3 10批川麦冬药材黄酮类指纹图谱共有模式

具体实施方式：

以下通过实施例，进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1

步骤1、对照品溶液的制备，分别精密称取对照品甲基麦冬黄烷酮A、B、6-醛基异麦冬黄烷酮A适量，加甲醇溶解，分别制成甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B，6-醛基异麦冬黄烷酮A三种对照品溶液。

步骤2、供试品溶液的制备，取川麦冬药材粉末约6.0g，精密称定，用甲醇超声提取3次，每次30min，每次加甲醇50mL，合并提取液，过滤，蒸干，加水50mL使溶解，上自制C18小柱富集(80～100目，内径1cm，柱高为2cm，单个柱体积约为6ml，上样前用0.5mol·L^-1NaOH溶液处理，再加水平衡)，首先上样(流速0.5ml·min^-1)，用4倍柱体积50％甲醇除去杂质(流速0.5ml·min^-1)，再用5倍柱体积甲醇洗脱目标物质(流速0.3ml·min^-1)，将所得甲醇液蒸干，加甲醇溶解至5mL容量瓶，即得供试品溶液。

步骤3、将步骤1和步骤2的溶液分别注入HPLC仪器中，得到色谱图，对图谱的相似性进行比较。

步骤4、相似为含量合格。

Claims (7)

1.一种川麦冬药材中黄酮类成分的测定方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤1、对照品溶液的制备，分别精密称取对照品甲基麦冬黄烷酮A、B、6-醛基异麦冬黄烷酮A适量，加甲醇溶解，分别制成甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B，6-醛基异麦冬黄烷酮A三种对照品溶液；

步骤2、供试品溶液的制备，取川麦冬药材粉末用甲醇溶解，过C18柱，甲醇洗脱得供试品溶液；

步骤3、将步骤1和步骤2注入HPLC仪器中，得到色谱图；

步骤4、对图谱的相似性进行比较相似为含量合格。

本发明中所述指纹图谱是HPLC的色谱图。

2.根据权利要求1的测定方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤1、对照品溶液的制备，分别精密称取对照品甲基麦冬黄烷酮A、B、6-醛基异麦冬黄烷酮A适量，加甲醇溶解，分别制成甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B，6-醛基异麦冬黄烷酮A三种对照品溶液。

步骤2、供试品溶液的制备，取川麦冬药材粉末约6.0g，精密称定，用甲醇超声提取3次，每次30min，每次加甲醇50mL，合并提取液，过滤，蒸干，加水50mL使溶解，上自制C18小柱富集(80～100目，内径1cm，柱高为2cm，单个柱体积约为6ml，上样前用0.5mol·L^-1NaOH溶液处理，再加水平衡)，首先上样(流速0.5ml·min^-1)，用4倍柱体积50％甲醇除去杂质(流速0.5ml·min^-1)，再用5倍柱体积甲醇洗脱目标物质(流速0.3ml·min^-1)，将所得甲醇液蒸干，加甲醇溶解至5mL容量瓶，即得供试品溶液。

步骤3、将步骤1和步骤2的溶液分别注入HPLC仪器中，得到色谱图，对图谱的相似性进行比较。

步骤4、相似为含量合格。

3.一种川麦冬药材中黄酮类成分的测定方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(A)取合格的川麦冬药材粉末，按照上述方法建立川麦冬药材粉末标准指纹图谱；

(B)取待检川麦冬药材粉末，按照上述方法得到指纹图谱；

(C)将步骤(B)得到的指纹图谱和步骤(A)得到的标准指纹图谱进行比对，符合即为合格产品，不符合即为不合格产品。

4.根据权利要求1的测定方法，其特征在于，色谱条件如下：

色谱柱：Waters symeteryC18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)；流动相：A(0.05％磷酸)-B(乙腈)，梯度洗脱(见表1)，柱温30℃，流速1.0mL·min^-1，检测波长296nm，进样量10μL。

液相梯度洗脱条件

5.根据权利要求1的测定方法，其特征在于，该方法精密度较好。

6.根据权利要求1的测定方法，其特征在于，该方法重现性较好。

7.根据权利要求1的测定方法，其特征在于，该方法在24小时内稳定。

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