CN102742580A

CN102742580A - 醌霉素a制剂及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN102742580A
Application number: CN2012102456359A
Authority: CN
Inventors: 林壁润; 沈会芳; 蒲小明; 张景欣; 潘群英
Original assignee: Plant Protection Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Plant Protection Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-07-16
Filing date: 2012-07-16
Publication date: 2012-10-24
Anticipated expiration: 2032-07-16
Also published as: CN102742580B

Abstract

本发明公开了一种醌霉素A制剂及其制备方法与应用。该醌霉素A制剂包含有1～30%醌霉素A、10～12%乳化剂和60～89%有机溶剂，上述百分比均为质量百分比。本发明以醌霉素A为原料，在反应釜中经乳化剂乳化后，与有机溶剂混合得到均匀稳定的醌霉素A制剂。该制备工艺简单，生产成本低。该制剂喷雾后，以细小颗粒分布于作物表面，更有利于直接抑杀病原菌，提高药效。本发明制备的醌霉素A制剂高效、低毒，是一种无公害的生物农药。醌霉素A制剂主要通过破坏病原菌的细胞膜、抑制其DNA双螺旋的形成而起到防治病害的作用。其对疫病菌引起的病害如黄瓜疫病、辣椒疫病和菠萝心腐病的防治效果好，比常规药剂用量少，可以克服疫病菌对常规农药的抗药性。

Description

醌霉素A制剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于植物保护及生物农药技术领域，特别涉及一种醌霉素A制剂及其制备方法与应用。

背景技术

近年来，我国的经济作物种植面积不断扩大，且常年连作使土传病害呈逐年上升趋势，其中由卵菌引起的植物病害较难控制，尤其疫霉菌潜育期短，再侵染次数多，常暴发流行而导致损失严重。疫霉菌是疫霉属（Pytophthra de Bary）真菌的通称，隶属鞭毛菌亚门、卵菌纲、霜霉目、腐霉科疫霉菌。疫霉菌大多存活于土壤，潜育期短，传播速度快，侵染力强，对植物破坏性大。疫霉菌侵入寄主植物后在很短的时间内产生大量的孢子囊并释放游动孢子，成为再侵染源，病害难以控制，经常给农业生产造成巨大损失。

目前，化学防治仍是控制疫霉菌病害的重要手段之一。80年代以前，多采用非内吸性铜制剂、二硫代氨基甲酸酯类保护性杀菌剂防治疫霉菌病害，常用的有硫酸铜、氢氧化铜、氯化亚铜、代森锌、代森锰、代森锰锌和丙森锌等，它们的共同特点是对病菌多位点抑制不易产生抗药性，但是持效期长，使用后效果不够理想；80年代以来推广应用乙磷铝、瑞毒霉、杀毒矾甲霜灵等内吸性杀菌剂，效果较好。这些药剂价格昂贵，且使用多年，部分地区已产生抗药性，抗药性状大多可在无性的后代繁殖过程中持续稳定遗传。目前这一类药剂药效大幅度下降，田间防效很差，已不能控制病害流行，该病的防治又处于困境。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种醌霉素A制剂。

本发明的另一目的在于提供上述醌霉素A制剂的制备方法。

本发明的再一目的在于提供所述的醌霉素A制剂的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种醌霉素A制剂，包括以下按质量百分比计的成分：

醌霉素A 1～30%

乳化剂 10～12%

有机溶剂 60～89%；

所述的乳化剂优选为农乳2201、农乳0203B或聚山梨酯-80（吐温80）中的至少一种；

所述的有机溶剂优选为异丙醇、丙酮或二甲基甲酰胺中的至少两种；

所述的醌霉素A制剂的制备方法，包括以下步骤：将1～30%醌霉素A和10～12%乳化剂置于反应釜中，在温度25～35℃、转速为300～320转/分钟的条件下反应30～35分钟，然后再加入60～89%有机溶剂，搅拌均匀，得到醌霉素A制剂；

上述百分比（%）均为质量百分比；

所述的反应釜优选为玻璃反应釜；

所述的搅拌时间优选为30～35分钟。

所述的醌霉素A制剂具有很强的杀菌活性，可应用于防治卵菌病害，如黄瓜疫病菌、辣椒疫霉病菌、菠萝心腐病菌等。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

（1）本发明首次成功地将醌霉素A应用于防治卵菌病害药物的制备。

（2）醌霉素A的溶解性不好，单用很难发挥其作用。本发明以醌霉素A为原料，在反应釜中经乳化剂乳化后，与有机溶剂混合得到均匀稳定的醌霉素A制剂。该制备工艺简单、易于操作，生产成本低。该制剂喷雾后，以细小颗粒分布于作物表面，更有利于直接抑杀病原菌，提高药效。

（3）本发明制备的醌霉素A制剂高效、低毒、安全，是一种无公害的生物农药。醌霉素A制剂主要通过破坏病原菌的细胞膜、抑制其DNA双螺旋的形成而起到防治病害的作用。其对疫病菌引起的病害防治效果好，比常规药剂用量少，可以克服疫病菌对常规农药的抗药性。

附图说明

图1是正常黄瓜疫病菌菌丝形态的扫描电子显微镜图，其中图A、B为正常黄瓜疫病菌菌丝的扫描电子显微镜图，a为表面光滑、菌体圆润的菌丝体；图C、D为自然衰老的的黄瓜疫病菌菌丝的扫描电子显微镜图，b为变形、皱缩和凹陷的菌丝体，c为菌丝体的孔洞。

图2是经醌霉素A制剂处理后的黄瓜疫病菌菌丝形态的扫描电子显微镜图，其中图A、B为经0.8μg/ml醌霉素A处理的黄瓜疫病菌菌丝的扫描电子显微镜图，a为表面粗造、菌体膨胀的菌丝体，b为发生变形的新生菌丝体；图C、D 为经2μg/ml醌霉素A处理的黄瓜疫病菌菌丝的扫描电子显微镜图，c为萎焉、疲软和皱缩的菌丝，d为有裂痕的菌丝体。

图3是正常黄瓜疫病菌的菌丝体断面的透视电子显微镜图，其中图B为正常黄瓜疫病菌的菌丝体断面的透视电子显微镜图，图C为自然衰老的的黄瓜疫病菌的菌丝体断面的透视电子显微镜图，a表示菌丝体外围都包围着一连续的外层。

图4是经醌霉素A制剂处理后的黄瓜疫病菌菌丝断面的透视电子显微镜图，其中图A为经2μg/ml醌霉素A处理后黄瓜疫病菌菌丝断面（13000×）的透视电子显微镜图，a表示菌丝外围一连续的外层已没有，b表示细胞内成分固缩成团，c表示空白区；图B为经0.8μg/ml醌霉素A处理后黄瓜疫病菌菌丝断面（9300×）的透视电子显微镜图，a表示菌丝外围一连续的外层已没有，c表示空白区。

图5是醌霉素A制剂对黄瓜疫病菌孢子形成的影响的结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

将醌霉素A（购于上海博升生物科技有限公司）1克、农乳0203B5克、吐温805克置于玻璃反应釜（广州市星烁仪器有限公司生产，型号为S212；下同。）中，在温度35℃、转速为320转／分钟的条件下反应35分钟，然后加入异丙醇40克，再加二甲基甲酰胺至总质量为100克，搅拌35分钟，得到醌霉素A制剂；

所述的醌霉素A制剂为淡黄褐色的透明液体。

实施例2

将醌霉素A（购于上海博升生物科技有限公司）15克、农乳0203B10克置于反应釜中，在温度30℃、转速为300转／分钟的条件下反应30分钟，然后加入异丙醇20克，再加丙酮至总质量为100克，搅拌30分钟，得到醌霉素A制剂；

所述的醌霉素A制剂为淡黄褐色的透明液体。

实施例3

将醌霉素A（购于上海博升生物科技有限公司）30克、农乳0203B 2克和农乳22018克置于反应釜中，在温度28℃、转速为310转／分钟的条件下反应32分钟，然后加入异丙醇10克、二甲基甲酰胺10克，再加丙酮至总质量为100克，搅拌32分钟，得到醌霉素A制剂；

所述的醌霉素A制剂为淡黄褐色的透明液体。

实施例4

将醌霉素A（购于上海博升生物科技有限公司）10克、农乳0203B 2克、吐温808克置于反应釜中，在温度35℃、转速为320转／分钟的条件下反应35分钟，然后加入异丙醇10克，再加二甲基甲酰胺至总质量为100克，搅拌35分钟，得到醌霉素A制剂；

所述的醌霉素A制剂为淡黄褐色的透明液体。

实施例5

将醌霉素A（购于上海博升生物科技有限公司）20克、农乳0203B 10克、置于反应釜中，在温度30℃、转速为300转／分钟的条件下反应30分钟，然后加入异丙醇20克，再加丙酮至总质量为100克，搅拌30分钟，得到醌霉素A制剂；

所述的醌霉素A制剂为淡黄褐色的透明液体。

实施例6

将醌霉素A（购于上海博升生物科技有限公司）8克、农乳0203B 10克、农乳22012克置于反应釜中，在温度25℃、转速为310转／分钟的条件下反应32分钟，然后加入异丙醇15克，再加丙酮至总质量为100克，搅拌32分钟，得到醌霉素A制剂；

所述的醌霉素A制剂为淡黄褐色的透明液体。

实施例7

将醌霉素A（购于上海博升生物科技有限公司）25克、农乳0203B 8克、吐温802克置于反应釜中，在温度35℃、转速为320转／分钟的条件下反应35分钟，然后加入异丙醇21克，再加二甲基甲酰胺至总质量为100克，搅拌35分钟，得到醌霉素A制剂；

所述的醌霉素A制剂为淡黄褐色的透明液体。

效果实施例：醌霉素A制剂用于防治黄瓜疫病菌的防治效果试验

黄瓜疫病菌（Phytophthora melonis）（吴永官,胡春锦,黄思良,陆少峰,车江旅,付岗.华南瓜类疫霉种群的致病力及其寄主嗜好性[J].植物保护学报，2012,39(2)：103-107。）菌株由广东省农科院植保所提供；

V8液体培养基的配制：分别取V-8液（美国进口V8蔬菜汁）200mL、碳酸钙2g和蒸馏水800mL，混合均匀，在121℃灭菌15min，用盐酸（量取10ml37wt%盐酸加无菌水稀释至120ml。）和氢氧化钠溶液（称取氢氧化钠40克，加无菌水溶解并定容至1000ml。）调节pH至6.4～6.7，制得V8液体培养基；

V8固体培养基的配制：取上述制得的V8液体培养基，每升V8液体培养基加琼脂20g，搅拌均匀，制得V8固体培养基；

1、醌霉素A制剂对黄瓜疫病菌菌丝生长的影响：

取实施例4制备的醌霉素A制剂1ml，用无菌水配制成每毫升含醌霉素A2μg的溶液A；取实施例4制备的醌霉素A制剂1ml，用无菌水配制成每毫升含醌霉素A0.8μg的溶液B；取滤纸A（滤纸A的面积为V8固体培养基平皿A（直径9cm）面积的1/4）浸取溶液A，置于V8固体培养基平皿A上；取滤纸B（滤纸B的面积为V8固体培养基平皿B（直径9cm）面积的1/4）浸取溶液B，置于V8固体培养基平皿B上；取滤纸C（滤纸C的面积为V8固体培养基平皿C（直径9cm）面积的1/4）浸取无菌水，置于V8固体培养基平皿C上；然后分别将在V8固体培养基平皿（直径9cm）上28℃培养5d的黄瓜疫病菌块（圆形、直径5mm）置于平皿A、平皿B和平皿C的中央，28℃培养36h，分别取滤纸A、滤纸B和滤纸C上的菌丝制样，进行电镜观察。

扫描电镜观察结果如图1、2所示：正常黄瓜疫病菌的菌丝体圆润、表面光滑；未经醌霉A处理的自然衰老、坏死黄瓜疫病菌，其菌丝体明显皱缩、凹陷和变形，有的整个菌丝体皱缩干瘪变形，菌丝体外层结构不完整，有大量内容物溢出。经0.8μg/mL醌霉素A处理后，黄瓜疫病菌的菌丝体表面变得粗造，菌丝体膨胀，但未观察到有孔洞，新生菌丝体发生变形，菌丝畸形。经2μg/mL醌霉素A的处理后，黄瓜疫病菌的菌丝体表面更为粗造，菌丝呈现肿胀后萎焉、疲软、皱缩、变形的状态，但菌丝形态基本完整，并未观察到象自然坏死菌丝体干瘪，外层结构不完整有孔洞的现象，在菌丝体的某些部位出现了大的裂痕。

透射电镜观察结果如图3、4所示：正常黄瓜疫病菌的菌丝体断面结构清晰，特别明显的是在所有菌丝外围都包围着一连续的外层。经2μg/mL醌霉素A处理后，黄瓜疫病菌的菌丝体断面结构模糊不清，细胞内成分固缩成团块状并形成大量空白区；与正常菌丝相比较，原菌丝外围包围着一连续的外层已不明显，似有一紧贴于菌体的表面层。

2、醌霉素A制剂对黄瓜疫病菌孢子形成的影响

取在V8固体培养基平皿（直径9cm）上28℃培养5d的黄瓜疫病菌，将自菌落外缘切成1.5mm×1.5mm菌丝块，把菌丝块分别放入V8液体培养基摇瓶中培养48h，把成熟菌丝球用无菌水冲洗浸泡，每30min换水一次，换水5次后分别放入装有下列溶液的平皿中，在黑暗、28℃温箱中进行无菌培养2d后观察游动孢子囊、游动孢子的产生情况。溶液种类：（1）无菌水；（2）取实施例4制备的醌霉素A制剂用无菌水分别配制成每毫升含醌霉素A2μg、1μg、0.5μg、0.25μg、0.125μg、0.0625μg、0.03125μg的溶液。

可以观察到，无菌水处理的菌丝产生大量菌丝膨大体，并有一定数量的游动孢子囊，游动孢子囊的形状多为桃子形，底部较为平坦。经醌霉素A制剂处理的菌丝体膨大、游动孢子囊产生的数量均相对较少，游动孢子囊多数破裂，形状不规则。挤压菌丝体球，分别用2层纱布过滤，把滤液分别滴在血球计数板上，计算出游动孢子的含量，计算出醌霉素A对孢子形成量影响的毒力回归方程为：y=1.302x+6.281（R²=0.895，y为孢子形成抑制率几率值，x为醌霉素A浓度的对数。），结果见图5。无菌水处理的菌丝产生大量活性很强的圆形游动孢子，而经醌霉素A制剂处理的菌丝，随浓度的升高孢子的产生量减少、游动孢子减少，有大量的静止不动的休止孢子，该结果表明醌霉素A制剂对黄瓜疫病菌孢子的形成有强的抑制作用。

3、醌霉素A制剂对疫病菌孢子萌发的影响

取在V8固体培养基平皿（直径9cm）上28℃培养5d的黄瓜疫病菌，将自菌落外缘切成1.5mm×1.5mm菌丝块，把菌丝块分别放入V8液体培养基摇瓶中培养48h，把成熟菌丝球用无菌水冲洗浸泡，每30min换水一次，换水5次后分别放入装有无菌水的平皿中，在黑暗、28℃温箱中进行无菌培养2d后，制备成每毫升含6×10⁶个孢子的孢子悬浮液，待用。

取实施例4制备的醌霉素A制剂分别用无菌水配制成每毫升含醌霉素A2μg、1μg、0.5μg、0.25μg、0.125μg、0.0625μg、0.03125μg的系列溶液，待用；

分别取100μL上述孢子悬浮液置于平皿中，加入50μL V8液体培养基，再加50μL下列溶液，将平皿置于28℃的光照培养箱内进行无菌培养。溶液种类：（1）无菌水；（2）上述配制的系列溶液。用普通光学显微镜（蔡司生物显微镜）对经无菌水处理的平皿进行镜检，在100倍显微镜下观察游动孢子萌发情况，计算萌发率；当有75.7%孢子萌发时，分别考查经系列溶液处理后的孢子萌发率，每处理在显微镜下计算的孢子数必须大于200个。统计孢子萌发抑制率。用最小二乘法计得醌霉素A制剂抑制萌发毒力回归方程为y=0.727x+5.657（R²=0.851，y为孢子萌发抑制率几率值，x为醌霉素A浓度的对数。），醌霉素A制剂对黄瓜疫病菌孢子萌发的影响如表1所示。从表1可以看出，随着醌霉素A浓度的提高，对黄瓜疫病菌孢子的抑制萌发效应增强。

表1醌霉素A制剂对黄瓜疫病菌孢子萌发的抑制作用的结果

4、醌霉素A制剂对菠萝心腐病的盆栽防治效果试验

盆栽试验在26～28℃的温室中进行。每个塑料盆钵装自然风干菜园土0.8kg和基质（泥炭、珍珠岩、园艺蛭石按体积比1：1：1混合均匀。）0.2kg，每钵移栽健壮菠萝苗1棵（苗高25～30cm），移栽7天后其生长正常进行试验。

烟草疫霉（Phytophthora nicotianae）是引起菠萝心腐病的主要病原菌。烟草疫霉（P.nicotianae）（成家壮,韦小燕.菠萝心腐病原疫霉种的鉴定[J].云南农业大学学报，2003，18（2）：134-135。）在V8固体培养基（美国进口V8蔬菜汁150mL，CaCO₃ 0.2g，琼脂18g，水850mL）平皿（直径9cm）上26℃培养7～9d，显微镜观察有游动孢子囊形成时，平皿中加入无菌水，放入4℃冰箱中处理30分钟后，置于室温下10分钟，用涂布棒轻轻刮菌丝表面，使游动孢子充分释放，血球计数板计算游动孢子数量，并稀释至游动孢子浓度10³～10⁴cfu/mL左右。

设：①对照处理（CK）；②对照药剂为50%烯酰吗啉可湿性粉剂按质量体积比稀释1000倍和2000倍；取实施例4制备的醌霉素A制剂按体积比稀释1000倍和2000倍；试验时，伤根处理菠萝苗，然后各处理药剂喷雾菠萝的叶片和基部，喷药量以滴水为准，晾干，每盆加入20mL浓度为10³～10⁴cfu/mL菠萝心腐病病原菌游动孢子。每浓度处理30盆。处理后保湿处理24小时，处理后12、18天调查发病数，计算发病率和防治效果。

表2醌霉素A制剂对菠萝心腐病的盆栽试验防治效果

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Figure 2012102456359100002DEST_PATH_IMAGE002

注：防治效果（%）=（对照发病率-处理区发病率）/对照区发病率×100%。

由表2可知，醌霉素A制剂对菠萝心腐病具有较好的防治效果，与目前最好的对照药剂50%烯酰吗啉可湿性粉剂对菠萝心腐病的盆栽防治效果相当。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种醌霉素A制剂，其特征在于包括以下按质量百分比计的成分：

醌霉素A 1～30%

乳化剂 10～12%

有机溶剂 60～89%。

2.根据权利要求1所述的醌霉素A制剂，其特征在于：所述的乳化剂为农乳2201、农乳0203B或聚山梨酯-80中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的醌霉素A制剂，其特征在于：所述的有机溶剂为异丙醇、丙酮或二甲基甲酰胺中的至少两种。

4.权利要求1所述的醌霉素A制剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

将1～30%醌霉素A和10～12%乳化剂置于反应釜中，在温度25～35℃、转速为300～320转/分钟的条件下反应30～35分钟，然后再加入60～89%有机溶剂，搅拌均匀，得到醌霉素A制剂；

上述百分比均为质量百分比。

5.根据权利要求4所述的醌霉素A制剂的制备方法，其特征在于：所述的反应釜为玻璃反应釜。

6.根据权利要求4所述的醌霉素A制剂的制备方法，其特征在于：所述的搅拌时间为30～35分钟。

7.权利要求1～3任一项所述的醌霉素A制剂的应用，其特征在于：所述的醌霉素A制剂在防治卵菌病害中得到应用。

8.根据权利要求7所述的醌霉素A制剂的应用，其特征在于：所述的醌霉素A制剂在防治黄瓜疫病菌、辣椒疫霉病菌和菠萝心腐病菌中得到应用。