CN1493194A - 真菌生物蛋白可湿性粉剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物真菌提取的生物蛋白制品剂型。本发明的真菌蛋白可湿性粉剂的组分与含量为：真菌蛋白1～3％，硅藻土50～60％，表面活性剂20～24％，乙二胺四乙酸二钠1～2％，硫代硫酸钠0.5～1％，磷酸缓冲液由磷酸二氢钠1～2％和磷酸氢二钠12～20％组成，pH6.8～8.0。用本发明研制的1～3％的可湿性粉剂经大量田间与室内试验证明，可增强多种作物对多种病虫害的抗性，防治效率达40～80％，并能促进作物生长，增产率达10～30％，降低果品的烂果率，粉剂在室温存放两年真菌蛋白仍保持其活性。本产品无色，无味，无毒害，无残留，解决了化学制品引起的生态破坏和环境污染的问题，又克服了转基因植物存在的安全性问题，本品使用方便，用量小，持效期长。
Description
技术领域：
本发明涉及微生物真菌提取的生物蛋白，具体涉及真菌生物蛋白制品的剂型。
背景技术：
随着全球经济一体化的进程，以提高我国农产品质量和国际竞争力，保障农业生产安全为目标，以解决制约我国农业健康生产的关键问题为重点，研究开发保障农产品质量安全、环境友好的关键技术及其系列产品，建立农业健康生产技术创新体系，建设农产品绿色清洁生产示范基地，培育环保型农业高科技企业，全面提高我国农业绿色清洁生产技术的整体水平，已成为人们关注的热点。
我国是一个农业大国，每年由于农作物病虫害造成的经济损失达15-25％。由于化学农药的滥用，人类赖以生存的生态环境遭到了严重的破坏，环境污染日趋严重，人畜中毒事件频频发生。环境保护已成为我国基本国策，生物农药已列入21世纪优先发展领域。特别是随着我国加入WTO和人民生活水平的不断提高，对绿色农产品的生产提出了更高的要求。生物农药成为现代农产品安全生产、环境友好的关键技术措施之一。
近年来，国际上已开展了大量的科学研究与有益的探索。1999年诺华公司开发登记了世界上第一个利用真菌产生的植物活化剂(Bion)，其有效成分为水杨酸类似物，它能够激发和诱导植物产生免疫、抗病、促进生长的作用。2001年美国EDEN公司又开发登记了更为先进的Messenger(Harpin)，农作物使用后一般可以增产10％，并可用于蔬菜、水果的贮藏保鲜。这类产品获得了美国2001年度总统绿色化学挑战奖。我国也开展了水稻黄单胞菌两个致病变种(Xoo和Xooc)中Harpin蛋白的比较遗传学研究，发掘出编码HarpinX的功能基因，并通过转基因手段发现这类基因可在植物中高效表达。山西省农科院也已从细菌Harpin的研究材料中获得了具有生物活性的细菌蛋白质材料。证实了细菌蛋白质具有提高植物抗病虫性和促进植物增产的功能。
美国EDEN生物科学公司利用在原核细菌Harpin的研究中于2001年开发并推出了具有生物活性功能的产品Messenger。CN1344727A提出了不同于细菌蛋白质的真核微生物活性蛋白质，它的分子量、氨基酸及基因序列均有别于Messenger。真菌蛋白质比细菌蛋白质分子量大，氨基酸种类多，在某些方面具有更强的活性功能。CN1344727A研制成功了真菌蛋白制品，但是如何研制一种剂型，既适合工业化生产，又保持真菌活性蛋白的稳定性是目前尚未解决的问题。
发明内容：
本发明旨在提出一种真菌蛋白的可湿性粉剂，使真菌活性蛋白制品实现工业化生产，而且解决了真菌蛋白制品的稳定性问题。
本发明是通过以下技术方案实现上述发明目的的。
真菌生物蛋白可湿性粉剂的组分与重量百分比为：真菌蛋白1～3％，硅藻土50～60％，表面活性剂20～24％，乙二胺四乙酸二钠1～2％，硫代硫酸钠0.5～1％，磷酸缓冲液由磷酸二氢钠1～2％和磷酸氢二钠12～20％组成，PH6.8～8.0。
下面进一步详述本发明：
以植物病原微生物真菌葡萄孢属(Botrytis)、交链孢属(Alternaria)、稻瘟菌(Pyrcularia)、青霉菌(Penicillium)、黄曲霉菌(Asporgillus)、纹枯病菌(Rhizoctonia solani)，镰刀菌(Fusarium)，木霉菌属(Trichoderma)和疫霉属(Phytophthora)等真菌中的任一种为材料，在PDA等常规培养液中培养发酵至微生物真菌最大生长量时，经真空抽滤，将抽滤收集的真菌菌丝和孢子按培养液体积1/10加入PH6.8-8.0的5mM磷酸缓冲液或柠檬酸缓冲液，真菌菌丝和孢子悬浮液采用超声波20-30分钟或1000-1800bar高压破碎菌丝和孢子细胞，再以5000rpm离心30分钟，去除沉淀的破碎细胞组织，上清液用100度沸水水浴15-20分钟，即获得具有诱导，激活生物活性的分子量为42-60KD之间特种生物蛋白，以及分子量为30KD和20KD的辅助活性蛋白。经过对诱导，激活生物特种蛋白的理化特性分析，选用和添加蛋白保护及稳定剂，并根据生物农药登记要求，生产出符合要求的生物制品。将其获得的微生物特种蛋白1-3克与50-60克硅藻上(细度99％，过75μm标准筛)，20-24克表面活性剂(烷基酚类非离子型表面活性剂，北京市齐民生物环境公司制)，1-2克蛋白质保护剂EDTA(乙二胺四乙酸二钠)和0.5-1克蛋白质稳定剂STS(硫代硫酸钠)以及1-2克磷酸二氢钠和12-20克磷酸氢二钠混合的PH6.8-8.0的磷酸缓冲系统等组合配制而成真菌生物蛋白1％到3％可湿性粉剂。配制而成真菌生物蛋白1％到3％可湿性粉剂在烘箱75度中烘干一小时或将上述各组分在流化床干燥喷雾造粒机(实研型流化床，型号STREA-1)上干燥喷雾造粒后，最后在真空包装机上对样品进行真空包装。经过这样的制备工艺过程而得到的真菌生物蛋白1％到3％可湿性粉剂可在室温下保存2年以上，其制剂仍具有防病虫，增产和保鲜的生物活性。
真菌生物蛋白1％到3％可湿性粉剂中所含有的微生物真菌特种生物蛋白它能通过与植物表面蛋白受体的互作，可诱导植物的信息传导，启动植物体内一系列代谢反应，引起基因表达，诱导和激活植物自身防卫系统和生长系统，从而产生对病虫害的抗性，促进植物生长，提高作物产量。本发明的真菌生物蛋白1％到3％可湿性粉剂可通过溶于500倍或1000倍水中配制而成水液体和直接用粉剂剂型，它可用于植物的拌种、浸种、浇根和叶面喷施，生物特种蛋白的使用浓度为10-60μg/ml，经40多种植物的室内盆栽和田间实验，表明真菌生物蛋白1％到3％可湿性粉剂对病虫害的防治效率达40-80％。提高作物产量10-20％(详见表1～表7)。
表1真菌生物蛋白3％可湿性粉剂对提高柑桔座果率的效果
| 处理树 | 对照树 | |||
| 花量 | 346 | 210 | 486 | 273 |
| 座果数 | 17 | 15 | 20 | 11 |
| 座果率 | 4.91％ | 7.14％ | 4.11％ | 4.03％ |
| 平均座果率 | 5.75％ | 4.08％ | ||
表1可以看出，喷施真菌生物蛋白3％可湿性粉剂1000倍液能使柑桔座果率比对照提高1.67％个百分点，即处理可提高柑桔座果率30％以上。
表2真菌生物蛋白3％可湿性粉剂处理10天后促进植物生长的效果(cm)
| 对照1 | 对照1 | 对照1 | 平均 | 处理1 | 处理1 | 处理1 | 平均 | 增加％ | |
| 油菜 | 3.30 | 4.02 | 3.78 | 3.70 | 4.46 | 4.20 | 4.15 | 4.27 | 15.4％ |
| 黄瓜 | 4.34 | 4.75 | 4.50 | 4.53 | 5.75 | 5.82 | 5.90 | 5.82 | 28.5％ |
| 番茄 | 2.51 | 2.40 | 2.63 | 2.51 | 3.30 | 3.25 | 3.15 | 3.23 | 28.7％ |
| 水稻 | 9.61 | 9.84 | 9.71 | 9.72 | 12.80 | 12.62 | 12.70 | 12.71 | 30.7％ |
表3生物蛋白3％可湿性粉剂对黄瓜(中农12号)发芽影响
将黄瓜种子放在处理液中浸泡4.5小时后，取出后用滤纸将处理液滤干，再将种子放在垫有滤纸(用蒸馏水润湿)的培养皿中培养，每处理10个种子，三次重复。T值分析法检测表明：3％的可湿性粉剂处理黄瓜种子具有促进种子发芽根系生长的活性。
| 处理 | 18小时(发芽数) | 24小时(发芽数) | 24小时后平均芽长(mm) | 总平均芽长增加(mm)及增长率％ | 40小时后平均芽长(mm) | 总平均芽长增加(mm)及增长率％ | T值分析P＜0.05 |
| 蒸馏水 | 0 | 9 | 3.28 | 3.410 | 18.81 | 19.240 | |
| 蒸馏水 | 1 | 9 | 3.44 | 19.66 | |||
| 蒸馏水 | 0 | 10 | 3.50 | 19.24 | 不显著 | ||
| 500倍 | 9 | 10 | 5.65 | 5.4258.9％ | 21.91 | 22.2215.6％ | |
| 500倍 | 10 | 10 | 5.42 | 22.56 | |||
| 500倍 | 10 | 10 | 5.20 | 22.20 | 显著 | ||
| 1000倍 | 10 | 10 | 5.39 | 5.3256.0％ | 21.87 | 22.0414.6％ | |
| 1000倍 | 10 | 10 | 5.43 | 22.06 | |||
| 1000倍 | 9 | 10 | 5.15 | 22.18 | 显著 |
表4生物蛋白3％可湿性粉剂诱导烟草对蚜虫的抗性作用
| 处理方式 | 处理 | 处理液配制 | 一周后(蚜虫数量：只) | 两周后(蚜虫数量：只) |
| 叶背注射 | CK | 10ml蒸馏水 | 43 | 109 |
| 20mlPBS | 40 | 112 | ||
| 生物蛋白 | 500倍液 | 22 | 64 | |
| 1000倍液 | 26 | 72 | ||
| 叶面喷雾 | CK | 10ml蒸馏水 | 41 | 117 |
| 20ml PBS | 45 | 103 | ||
| 生物蛋白 | 500倍液 | 24 | 58 | |
| 1000倍液 | 28 | 63 |
待药液干后2小时各处理接种30只大小比较一致的蚜虫，接种于烟草(珊西烟叶)最上部2～3片新叶。
表5.真菌生物蛋白3％可湿性粉剂处理番茄第十四天诱导抗灰霉病害的效果
注：T-测验表明：在95％和99％的水平上，真菌生物蛋白可湿性粉剂和清水对照在统计学上具有显著差异。
| 不同病指的灰霉病发病果数 | T值分析 | |||||||||
| 处理 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 病情指数 | ％防效 | P＜0.05 | P＜0.01 |
| 500倍 | 4 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0.10 | 72.73％ | 显著 | 显著 |
| 1000倍 | 3 | 2 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0.13 | 63.64％ | 显著 | 显著 |
| 水 | 2 | 0 | 2 | 1 | 1 | 0 | 0.37 | 0 | 不显著 | 不显著 |
表6.真菌生物蛋白3％可湿性粉剂处理番茄第二十天诱导抗灰霉病害的效果
注：T-测验表明：在95％和99％的水平上，真菌生物蛋白可湿性粉剂和清水对照在统计学上具有显著差异。
| 不同病指的灰霉病发病果数 | T值分析 | |||||||||
| 处理 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 病情指数 | ％防效 | P＜0.05 | P＜0.01 |
| 500倍 | 3 | 1 | 1 | 0 | 1 | 0 | 0.23 | 56.25％ | 显著 | 显著 |
| 1000倍 | 2 | 2 | 1 | 0 | 1 | 0 | 0.27 | 50.00％ | 显著 | 显著 |
| 水 | 1 | 0 | 2 | 1 | 1 | 1 | 0.53 | 0 | 不显著 | 不显著 |
表7喷施生物蛋白3％可湿性粉剂后第7天接种所诱导对烟草花叶病毒病的抗性效果
经果品的贮存实验，真菌生物蛋白的保鲜效果显著(见表8～表11)。用3％的可湿性粉剂处理桃子的保鲜实验结果如下：
| 样本 | 喷雾叶1TMV病斑数 | 喷雾叶2TMV病斑数 | 喷雾叶3TMV病斑数 | 喷雾叶平均病斑数 | 喷雾％效果 | 喷雾P＜0.05 | 喷雾P＜0.01 |
| 500倍液1000倍液清水对照 | 4544 | 5649 | 4452 | 4.335.0048.33 | 91.0489.650 | 显著显著不显著 | 显著显著不显著 |
实验用桃子(品种为：大久保)：用3％的可湿性粉剂500倍和1000倍稀释后，将桃子放在稀释液中浸沾20-30秒后，让桃子自然分干后，在室温下(24-28℃)保存，每处理桃子30个，分别于第4天和第7天调查其桃子的发病率和烂果率。
表8处理4天后的桃子灰霉病和烂果率
| 不同病指的灰霉病发病果数 | T值分析 | |||||||||
| 处理 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 病情指数 | ％防效 | P＜0.05 | P＜0.01 |
| 500倍 | 25 | 2 | 2 | 1 | 0 | 0 | 0.06 | 68.97％ | 显著 | 显著 |
| 1000倍 | 24 | 2 | 3 | 1 | 0 | 0 | 0.07 | 62.07％ | 显著 | 显著 |
| 水 | 18 | 3 | 3 | 4 | 2 | 0 | 0.19 | 0 | 不显著 | 不显著 |
表9处理7天后的桃子灰霉病和烂果率
| 不同病指的灰霉病发病果数 | T值分析 | |||||||||
| 处理 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 病情指数 | ％防效 | P＜0.05 | P＜0.01 |
| 500倍 | 14 | 4 | 5 | 3 | 2 | 2 | 0.27 | 56.38％ | 显著 | 显著 |
| 1000倍 | 13 | 4 | 4 | 3 | 4 | 2 | 0.31 | 50.00％ | 显著 | 显著 |
| 水 | 3 | 1 | 5 | 7 | 8 | 6 | 0.63 | 0 | 不显著 | 不显著 |
统计分析：T值分析法检测表明：微生物蛋白3％的可湿性粉剂500倍和1000倍稀释可减轻桃子灰霉病的发病率和烂果率，可见微生物蛋白3％的可湿性粉剂处理对桃子具有保鲜作用。用3％的可湿性粉剂处理西红柿的保鲜实验结果如下：
实验用西红柿(品种为：粉冠)：用3％的可湿性粉剂500倍和1000倍稀释后，将西红柿放在稀释液中浸沾20-30秒后，让西红柿自然分干后，在室温下(24-28℃)保存，每处理西红柿20个，分别于第7天和第10天调查其西红柿的发病率和烂果率。
表10处理7天后的西红柿灰霉病和烂果率
| 不同病指的灰霉病发病果数 | T值分析 | |||||||||
| 处理 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 病情指数 | ％防效 | P＜0.05 | P＜0.01 |
| 500倍 | 18 | 1 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0.04 | 69.23％ | 显著 | 显著 |
| 1000倍 | 17 | 2 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0.04 | 69.23％ | 显著 | 显著 |
| 水 | 12 | 4 | 3 | 1 | 0 | 0 | 0.13 | 0 | 不显著 | 不显著 |
表11处理10天后的西红柿灰霉病和烂果率
| 不同病指的灰霉病发病果数 | T值分析 | |||||||||
| 处理 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 病情指数 | ％防效 | P＜0.05 | P＜0.01 |
| 500倍 | 10 | 1 | 3 | 3 | 2 | 1 | 0.29 | 47.27％ | 显著 | 显著 |
| 1000倍 | 9 | 2 | 3 | 4 | 1 | 1 | 0.29 | 47.27％ | 显著 | 显著 |
| 水 | 5 | 1 | 1 | 4 | 5 | 4 | 0.55 | 0 | 不显著 | 不显著 |
统计分析：T值分析法检测表明：微生物蛋白3％的可湿性粉剂500倍和1000倍稀释可减轻西红柿灰霉病的发病率和烂果率，可见微生物蛋白3％的可湿性粉剂处理对西红柿水果具有保鲜作用。
真空包装的真菌蛋白可湿性粉剂在室温(24～28℃)存放二年后，用紫外分光光度计测试3％的可湿性粉剂的蛋白浓度仍为3％。用SDS-PAGE凝胶电泳测试保存二年后3％的可湿性粉剂的蛋白在42KD等处仍有明显可见的蛋白条带，表明保存二年后3％的可湿性粉剂的蛋白是稳定的。
用保存二年后的真菌生物蛋白可湿性粉剂处理黄瓜种子，仍具有促进黄瓜种子发芽、根系生长的活性(表12)。
真菌蛋白可湿性粉剂保存二年后的效果试验结果如下：
样品经干燥后真空包装在室温下(24-28℃)存放二年后，样品经用黄瓜种子发芽生长法，测试蛋白的稳定性。
表12保存二年后3％的可湿性粉剂对黄瓜(中农12号)种子发芽根系生长的检测结果。
| 处理 | 18小时(发芽数) | 24小时(发芽数) | 24小时后平均芽长(mm) | 总平均芽长增加％ | 48小时后平均芽长(mm) | 总平均芽长增加％ | T值分析P＜0.05 |
| 500倍 | 9 | 10 | 5.32 | 24.86 | |||
| 500倍 | 10 | 10 | 5.28 | (5.25) | 23.64 | (24.27) | |
| 500倍 | 9 | 10 | 5.16 | 52.2％ | 24.30 | 19.97％ | 显著 |
| 1000倍 | 10 | 10 | 5.24 | 24.58 | |||
| 1000倍 | 9 | 10 | 5.30 | (5.19) | 23.44 | (24.05) | |
| 1000倍 | 9 | 10 | 5.02 | 54.4％ | 24.12 | 18.88％ | 显著 |
| 蒸馏水 | 1 | 10 | 3.38 | 20.46 | |||
| 蒸馏水 | 1 | 10 | 3.52 | (3.45) | 19.88 | (20.23) | |
| 蒸馏水 | 1 | 10 | 3.44 | 0 | 20.36 | 0 | 不显著 |
将黄瓜种子放在保存二年后的3％可湿性粉剂处理液中浸泡6小时后，取出后用滤纸将处理液滤干，再将种子放在垫有滤纸(用蒸馏水润湿)的培养皿中(28℃)培养，每处理10个种子，三次重复。
统计分析：T值分析法检测表明：保存二年后3％的可湿性粉剂处理黄瓜(中农12号)种子仍具有促进种子发芽根系生长的活性。
真菌生物蛋白1％到3％可湿性粉剂，可与常用的酸性，中性农药混合使用，但不能与碱性物质混用。药液配制时要充分搅匀，即配即用，喷雾要匀。喷药时间于早上露水干后，或傍晚用药。喷药后6小时遇雨需补喷。药品宜存放在阴凉通风处。有效期2年。
本发明生产工艺简单，成本较低，持效期长，可广泛用于作物的高效、优质、无公害生产和果品保鲜。
本发明创制开发的真菌生物蛋白1％到3％可湿性粉剂中有效成分生物特种蛋白质的作用方式在性质上类似动物免疫的一种抗病机制，属于一种新型、广谱、高效、多功能生物农药，防治黄瓜花叶病毒病、烟草花叶病毒病、蔬菜蚜虫的效果在75％以上，促生增产效果达10％以上。产品本身无毒，不改变植物的DNA，不引起病虫害的抗药性，在植物体内和土壤中易分解，无残留，可大幅度提高农产品质量和国际竞争力，是农业健康生产技术体系中一种新型环保产品，同时大大节省资源，减轻污染，保护生态环境和人类健康。我国病虫害每年发生面积约50万亩次，年需使用防治药剂110万吨制剂，在该项研究完成后按病虫害应防面积和药剂的5％计，可产生直接经济效益在10亿元人民币以上，间接经济效益可达80亿元。
具体实施方式：
实施例一：以筛选获得的高效西红柿灰霉病菌菌株(即真菌葡萄孢属Botrytis)在PDA培养液中(24-26℃)培养发酵3-4天，经真空抽滤，将抽滤收集的真菌菌丝和孢子按培养液体积1/10加入PH6.8-8.0的5mM磷酸缓冲液或柠檬酸缓冲液，真菌菌丝和孢子悬浮液采用超声波20-30分钟或1000-1800bar高压破碎菌丝和孢子细胞，再以5000rpm离心30分钟，去除沉淀的破碎细胞组织，上清液用100℃沸水水浴15-20分钟，即获得具有诱导，激活生物活性的分子量为42-60KD之间特种生物蛋白，以及分子量为30KD和20KD的辅助活性蛋白。将其获得的微生物特种蛋白1克与60克硅藻土，24克表面活性剂(烷基酚类非离子型表面活性剂)，1克蛋白质保护剂EDTA(乙二胺四乙酸二钠)和0.5克蛋白质稳定剂STS(硫代硫酸钠)以及1克磷酸二氢钠和12克磷酸氢二钠的PH6.8-8.0的磷酸缓冲系统等组合配制而成防病虫保鲜生物蛋白1％可湿性粉剂。配制而成防病虫保鲜生物蛋白为1％可湿性粉剂在烘箱75度中烘干一小时或将上述各组分在流化床干燥喷雾造粒机(实研型流化床，型号STREA-1)上干燥喷雾造粒后，最后在真空包装机上对样品进行真空包装。经过这样的制备工艺过程而得到的防病虫保鲜生物蛋白1％可湿性粉剂可在室温下保存2年以上，其制剂仍具有防病虫，增产和保鲜的生物活性。
实施例二：以筛选获得的高效蔬菜黑斑病菌菌株(即交链孢属Alternaria)，在PDA培养液中(25-28℃)培养发酵2-3天，经真空抽滤，将抽滤收集的真菌菌丝和孢子按培养液体积1/10加入PH6.8-8.0的5mM磷酸缓冲液或柠檬酸缓冲液，真菌菌丝和孢子悬浮液采用超声波20-30分钟或1000-1800bar高压破碎菌丝和孢子细胞，再以5000rpm离心30分钟，去除沉淀的破碎细胞组织，上清液用100度沸水水浴15-20分钟，即获得具有诱导，激活生物活性的分子量为42KD之间特种生物蛋白，以及分子量为30KD和20KD的辅助活性蛋白。将其获得的微生物特种蛋白3克与55克硅藻土，22克表面活性剂(烷基酚类非离子型表面活性剂)，2克蛋白质保护剂EDTA(乙二胺四乙酸二钠)和1克蛋白质稳定剂STS(硫代硫酸钠)以及2克磷酸二氢钠和15克磷酸氢二钠的PH6.8-8.0的磷酸缓冲系统等组合配制而成防病虫保鲜生物蛋白3％可湿性粉剂。配制而成防病虫保鲜生物蛋白3％可湿性粉剂在烘箱75度中烘干一小时或将上述各组分在流化床干燥喷雾造粒机(实研型流化床，型号STREA-1)上干燥喷雾造粒后，最后在真空包装机上对样品进行真空包装。经过这样的制备工艺过程而得到的防病虫保鲜生物蛋白3％可湿性粉剂可在室温下保存2年以上，其制剂仍具有防病虫，增产和保鲜的生物活性。
Claims (1)
1、一种真菌生物蛋白可湿性粉剂，其特征在于其组分与重量百分比如下：
真菌蛋白 1～3％
硅藻上 50～60％
表面活性剂 20～24％
乙二胺四乙酸二钠 1～2％
硫代硫酸钠 0.5～1％
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