CN110037055A - 一种水分散粒剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种水分散粒剂，所述的制剂包括深绿木霉T2蛋白激发子(TraT2A)、载体煅烧高岭土、湿润剂十二烷基苯磺酸钠、分散剂聚羧酸盐(5040)、崩解剂硫酸铵、粘结剂聚乙烯吡咯烷酮(PVP)以及保护剂抗坏血酸，该制剂无毒、无残留，能够有效诱导植物抗病。

Description

一种水分散粒剂及其应用

技术领域

本申请属于生物农药技术领域，具体涉及一种水分散粒剂及其应用。

背景技术

生物农药高效低毒、对非靶标生物安全、对生态环境友好,现已成为植物病害防治的新趋势。其中生防木霉具有繁殖速度快、生存能力强、对植物病原菌具有拮抗作用等特点，经过大量研究及开发，现已被广泛用于农业植物病害生物防治中。研究表明，生防木霉除了自身具有拮抗病原菌的作用外，其部分代谢产物能够诱导植物产生抗病性，促进植物生长。植物免疫诱抗剂种类繁多，作用机制多样，能够提高农作物抗性，有效防控农作物病害。生物源激发子与环境相容性好,是目前国内外研究的热点。梁巧兰等在对深绿木霉T2菌株抗病机理的研究中发现，其发酵液蛋白提取物TraT2A能够激活百合防御体系，提高百合叶片内GLU、 PAL、POD、PPO等抗病物质的活性，促进胼胝质的积累，诱导百合产生抗病性，同时还可促进植株生长，提高百合产品品质。目前，国内外生物农药诱抗剂剂型种类繁多，其中以可湿性粉剂(WP)和水剂(AS)最为常见，如3％激活蛋白可湿性粉剂、6％寡糖·连蛋白可湿性粉剂、3％氨基寡糖素水剂、0.5％香菇多糖水剂等。CN201810471947.9公开了一种植物免疫诱抗剂，是一种可湿性粉剂，其包括 20％的深绿木霉T2蛋白激发子(TraT2A)，在百合抗裂褶菌、灰霉菌诱导抗病中起到良好的效果，然而可湿性粉剂粉尘大，堆积密度较低，使用不方便，容易造成健康问题。水剂含有着大量的水分，有效成分中多肽类物质容易被细菌污染而腐败变质，且液体农药不易运输和保存。水分散粒剂是一种加水后能迅速崩解并分散成悬浮液的粒状制剂，与其它两种剂型相比，具有无粉尘、有效成分含量高(可达90％)、使用方便、运输和保存方便等优点。

发明内容

本申请公开了一种水分散粒剂，按重量百分数计，该制剂的有效活性成分包括50％的深绿木霉T2蛋白激发子(TraT2A)。

进一步地，所述的一种水分散粒剂还包括载体、湿润剂、的分散剂、崩解剂、粘结剂。

进一步地，所述的制剂还包括保护剂抗坏血酸。

优选地，所述的载体为煅烧高岭土。

优选地，所述的湿润剂为十二烷基苯磺酸钠。

优选地，所述的分散剂为聚羧酸盐(5040)。

优选地，所述的崩解剂为硫酸铵。

优选地，所述的粘结剂为聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。

进一步地，一种水分散粒剂，按所述的水分散粒剂质量为1g计，各组分配比为：

深绿木霉T2蛋白激发子(TraT2A) 0.5g

湿润剂十二烷基苯磺酸钠 0.02g

分散剂聚羧酸盐 0.08g

崩解剂硫酸铵 0.045g

粘结剂聚乙烯吡咯烷酮 0.005g

载体煅烧高岭土 0.35g。

进一步地，一种水分散粒剂，按所述的水分散粒剂质量为1g计，配方优化后，各组分配比为：

深绿木霉T2蛋白激发子(TraT2A) 0.5g

湿润剂十二烷基苯磺酸钠 0.02g

分散剂聚羧酸盐 0.08g

崩解剂硫酸铵 0.045g

粘结剂聚乙烯吡咯烷酮 0.005g

载体煅烧高岭土 0.34g

保护剂抗坏血酸 0.01g。

本发明还公开了所述的水分散粒剂在百合灰霉菌诱导抗病中的应用。

具体实施方式

本申请结合以下实施例用于进一步描述技术方案，但这些实施例并非限制本申请的范围。

实施例1：一种水分散粒剂的配方筛选及制备

1材料与方法

1.1材料

TraT2A：蛋白质提取物TraT2A由深绿木霉T2菌株发酵液经离心过滤、盐析、透析、凝胶过滤层析(SephadexG-100凝胶)获得。

供试菌株：百合灰霉病菌Botrytis cinerea由甘肃农业大学植物保护学院农药实验室保存。

填料及助剂：

填料：膨润土、硅藻土、煅烧高岭土、凹凸棒土(山东优索化工科技有限公司)；表面活性剂：亚甲基双萘磺酸钠(NNO)、聚乙二醇(PEG)、聚羧酸盐(5040) (山东优索化工科技有限公司)、木质素磺酸钙(木钙)、十二烷基苯磺酸钠(SDBS)、十二烷基硫酸钠(SDS)、丁基萘磺酸钠(拉开粉BX)(天津市凯信化学工业有限公司)、洗衣粉(纳爱斯集团有限公司)；粘结剂及崩解剂：明胶、β-环糊精、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、淀粉、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、尿素、三氯化铝、可溶性淀粉、硫酸铵、氯化钠(天津市光复精细化工研究所)；紫外光保护剂(抗坏血酸)。水：去离子水、蒸馏水(自制)、标准硬水(342mg/L，p H＝6-7，按照GB/T 14825-93制备)。

其它材料：PDA培养基、种植于甘肃农业大学农药实验室的兰州百合幼苗、培养皿、烧杯、250mL具塞量筒、研钵、移液枪、玻璃棒等。

仪器及设备：酸度计、密度计(中国雷磁分析仪器厂)、紫外分光光度计(上海谱元仪器有限公司)、水浴锅(上海跃进医疗器械有限公司)、台式鼓风干燥箱(上海和呈仪器制造有限公司)、YK-90挤压造粒机(湖南省衡阳市一帆制药设备有限公司)、QLS-30气流粉碎机(湖南省衡阳市一帆制药设备有限公司)、恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)

1.2试验方法

1.2.1 50％TraT2A水分散粒剂研制助剂筛选

初步设置总量为100g的50％TraT2A水分散粒剂配方为：TraT2A：50g，SDS 为湿润剂：5g，木质素磺酸钙为分散剂：5g，硅藻土为载体：40g。以预设配方为基础，逐一改变助剂种类及用量，通过质量标准对比，得到制剂配方。

1.2.1.1载体筛选

按预设配方称取各组分，以凹凸棒土、煅烧高岭土、硅藻土、膨润土作为载体，补足100g后挤压造粒，从各组合润湿时间、粘度、造粒难易程度、吸附性大小，崩解速度等方面确定最佳载体。

1.2.1.2湿润剂与分散剂筛选

湿润剂与分散剂种类确定：湿润剂筛选：在上述载体筛选的基础上，分别以洗衣粉、SDBS、SDS作为预设配方中的湿润剂(5g)，在其它助剂不变的条件下，以1.2.1.1中筛选的最佳载体补足总量为100g，将各配方组合经气流粉碎及鼓风干燥后加工为可湿性粉剂粉末，比较润湿时间及悬浮率，确定最佳湿润剂种类；分散剂筛选：在以上助剂及湿润剂筛选的基础上，参照上述方法从NNO、BX、PEG、 5040、木质素磺酸钙中筛选出最佳分散剂种类。

湿润剂和分散剂最佳比例确定：润湿分散剂不同比例对制剂湿润时间及悬浮率有很大的影响，故对所得湿润剂和分散剂按总用量10g，以比例1:4、2:3、1:1、 3:2、4:1分别添加其它组分后，以最佳载体补足100g，对比润湿时间和悬浮率大小，筛选出最佳比例。

湿润剂和分散剂的用量确定：将湿润剂和分散剂以上筛选的最佳比例混合，然后按0％、5％、10％、15％、20％用量，分别添加其它组分后，以1.2.1.1中筛选的最佳载体补足总量为100g，对比润湿时间和悬浮率大小，筛选出最佳比例，表1 为供试助剂。

表1供试助剂

1.2.1.3粘结剂与崩解剂筛选

在以上以TraT2A为有效成分(50g)、所筛选的湿润剂及分散剂基础上，对粘结剂和崩解剂的种类及用量进行筛选，以明胶(5g)为粘结剂，尿素(5g)为崩解剂，用所筛选的载体补足100g为新预设配方。

粘结剂与崩解剂种类筛选：以明胶、β-环糊精、PVP、淀粉、CMC-Na作为粘结剂，以尿素、三氯化铝、可溶性淀粉、硫酸铵、氯化钠作为崩解剂(各5g)，制作成可湿性粉末，并将所得各组可湿性粉末通过挤压法造粒，测定颗粒硬度、崩解时间及充分溶解反复颠倒并静置24h后的沉降情况，分析比较筛选最适粘结剂与崩解剂种类。

粘结剂与崩解剂比例及用量筛选：经检验，当粘结剂用量增大时颗粒硬度增大，崩解时间延长，崩解剂用量增大时颗粒变酥易碎，但崩解时间缩短。由于母粉本身具有一定的粘结性，故设置粘结剂与崩解剂比例为1:9、1:7、1:5、1:3、 1:1，最佳比例下总含量为0％、5％、10％、15％、20％，并参照上述方法进行筛选。 1.2.1.4 50％TraT2A水分散颗粒剂制备

按试验所得50％TraT2A水分散颗粒剂配方分别称取、润湿剂、分散剂、粘结剂、崩解剂、载体，将预先称取的TraT2A用载体吸附并干燥，加入润湿剂、分散剂、崩解剂后经气流粉碎机充分混合粉碎，取合格细度(通过44μm标准筛) 备用。粘结剂溶于适量去离子水后均匀喷施于混合粉末中并搅拌均匀，待粉末完全浸湿后加入至挤压造粒机中挤压造粒。将造好的颗粒经鼓风干燥并筛取合格粒度(大于100μm标准筛目)颗粒备用。测定所得水分散粒剂质量标准，并根据测定结果及实际使用条件对制剂配方进行进一步补充。

1.2.2 50％TraT2A水分散粒剂质量标准测定

研制过程中的可湿性粉末质量标准分别参照GB/T1600、GB/T1601、GB/T5451、 GB/T14825、GB/T16150方法进行水分含量，定pH值、润湿性，悬浮率、细度测定。50％TraT2A水分散粒剂各项质量标准参考华人民共和国国家标准 GB/T28139-2011要求进行测定。

1.2.3配方优化

根据1.2.2质量标准测定结果以及TraT2A稳定性分析，对50％TraT2A水分散粒剂配方进行调整，优化制剂配方，进一步提高制剂质量及稳定性。

1.2.4 50％TraT2A水分散粒剂药效评价

1.2.4.1离体抑菌活性测定

离体抑菌活性测定：采用菌丝生长速率法(朱丽梅等，2011)，预先活化培养灰霉病病菌(25℃，3d)，制作1000mLPDA培养基，连同玻璃培养皿一齐放入高温蒸汽灭菌锅中灭菌。称取50％TraT2A水分散粒剂2.00g、1.00g、0.50g、0.25g，研成粉末后分别加入预先制备好的PDA培养基中(灭菌后冷却至45℃左右)，定容至50.00mL并充分溶解后平均倒至灭过菌的4个培养皿中，制成浓度为 40.00mg/mL、20.00mg/mL、10.00mg/mL、5.00mg/mL的含药培养基。将直径5.00mm 的灰霉病菌饼放置于含药培养基平板中央，每皿1块，用制剂中除有效成分TraT2A以外的其它组分制作对应浓度含药培养基，并以此为助剂对照，以加灭菌水为空白对照，每处理4次重复，25℃培养3d，十字交叉法测量菌落直径，抑菌率计算公式为：

抑菌率％＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-5mm)×100。

1.2.4.2室内诱导抗病活性测定：

50％TraT2A水分散粒剂诱导兰州百合抗灰霉病效果采用盆栽试验法(韩亮等，2016)，制剂以40.00mg/mL、20.00mg/mL、10.00mg/mL、5.00mg/mL稀释液分别喷雾处理兰州百合幼苗，以喷施灭菌水为空白对照组。为减少农药助剂对诱导抗病效果的影响，百合幼苗处理3d后用灭菌脱脂棉蘸取无菌水擦洗百合叶面至无药残留渍，待叶面水分挥发完，将直径为5mm的灰霉菌菌饼倒扣接种在对照和处理百合叶片上，每个叶片接种1个菌饼，每株共接5片叶子，每组处理5 株幼苗。将试验幼苗置于适宜的温度、湿度条件下培养6d后，按以下分级标准调查发病情况，根据以下公式计算病情指数及诱导抗病效果。

病叶率％＝(调查病叶数/调查总叶数)×100

病情指数＝[∑(各级病叶数×相对级数值)/(调查病叶数×最高级数值)]× 100

诱导抗病效果％＝(对照区病情指数-处理区病情指数)/对照区病指数×100

病情分级标准为：0级：无病斑；1级：病斑面积占整个叶面积5％以下；3 级：病斑面积占整个叶面积6.00％-10.00％；5级：病斑面积占整个叶面积 11.00％-20.00％；7级：病斑面积占整个叶面积21.00％-50.00％；9级：病斑面积占整个叶面积50.00％以上。

2.结果与分析

2.1配方筛选

2.1.1载体筛选

从表2可以看出，硅藻土粘度小，不易造粒。膨润土粉末润湿性小，颗粒崩解速度慢。凹凸棒土颗粒粘度过大，在水中几乎不崩解。通过颗粒性状观察结果及0.05水平显著性分析表明，高岭土煅烧后含水量少，有利于制剂干燥，增加吸附性，相比于其它载体悬浮率高、崩解速度快且粘度较高易于造粒，粉末润湿时间为38.09S，悬浮率为68.57％，与其它载体悬浮率之间存在显著差异。此外，煅烧高岭土还具有良好的稳定性及耐盐碱性，与TraT2A相容性及吸附可逆性好，由此选择煅烧高岭土作为载体。

表2载体筛选结果

注：同列数据后不同小写字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P＝0.05水平差异显著，下同。

2.1.2湿润剂与分散剂选筛选

湿润剂筛选：由数据显著性分析结果(P＝0.05水平)可以看出，三种润湿剂湿润时间无显著性差异，其中洗衣粉成本较高，且分散性能中等。十二烷硫酸钠对硬水适应性差，易产生不溶沉淀，影响稳定性。十二烷基苯磺酸钠对酸碱不敏感，不易产生变质，对硬水适应性强，具有软化水质的特性，润湿时间为38.39S，悬浮率最高，达到75.56％，且与其它两个湿润剂悬浮率之间存在显著差异，故选择十二烷基苯磺酸钠为湿润剂(表3)。

分散剂筛选：5040属于聚羧酸盐类分散剂，对大部分载体具有优良的分散性，在本试验中润湿性良好，湿润时间介于PEG和NNO之间，为27.07s，差异显著，悬浮率明显高于其它分散剂，达到77.55％，差异显著，故选择5040为分散剂。

从表4可以看出当润湿剂与分散剂比例为1:4时润湿分散效果综合达到最高水平，悬浮率达80.16％，与其它配比悬浮率之间存在显著差异，该比例下总用量在10％及以上时，悬浮率之间差异不显著，20％时润湿时间为24.53S，与其它组分之间差异显著，但由于润湿时间均在合格范围内，且综合环保及成本问题，选择总用量为10％最为合适。

表3湿润剂筛选结果

表4润湿分散剂配比及用量筛选结果

2.1.3粘结崩解剂筛选

比较表5各组合崩解时间、颗粒硬度以及溶解后静置24h时的沉降情况，通过显著性分析可知，选择硫酸铵(5％)为崩解剂时，颗粒硬度较大，沉降速度较慢，且崩解时间最短，为128.69S，相比于其它崩解剂差异显著。以PVP为粘结剂时，颗粒硬度大，沉降速度慢，且崩解性良好，崩解时间为139.79S，相比于其粘结剂差异显著。通过崩解剂及粘结剂数据横向分析发现，虽然加入粘结剂PVP 后颗粒崩解时间略有延长，但其沉降速度以及颗粒硬度有了明显改善；由表6结果可以看出，当崩解剂用量增大时颗粒硬度变化较小，但崩解时间变化较为明显，当崩解剂与粘结剂比例为1:9时，颗粒硬度较大，沉降速度慢，且崩解时间最短，为63.75S，与其它组分之间差异显著。随着该比例下两种助剂总用量的增大，崩解时间呈先减小，后逐渐增大的趋势，总用量为5％时颗粒硬度大，沉降速度慢，崩解时间最短，为57.11S，相比于其它组分差异显著。

表5粘结剂及崩解剂筛选

表6粘结剂崩解剂比例及用量筛选结果

2.1.4 50％TraT2A水分散粒剂配方

50％TraT2A水分散粒剂配方：TraT2A(50％)、十二烷基苯磺酸钠(2％)、5040(8％)、PVP(0.5％)、硫酸铵(4.5％)、煅烧高岭土(35％)。

2.1.5 50％TraT2A水分散粒剂质量控制标准测定

50％TraT2A水分散粒剂主要质量控制标准测定结果见表7。50％TraT2A水分散粒剂有效成分质量分数为48.6，崩解时间为57.00S，加入粘结剂后悬浮率有所提升，为83.04％。经热贮及冷贮稳定性测定，制剂有效成分分解率均小于5％，制剂外观及各项质量标准经检测均无明显变化，且冷贮稳定性略高于热贮稳定性。其它各项指标均显示合格。

表7质量标准测定结果

2.1.6 50％TraT2A水分散粒剂配方优化

由表7测定结果可以看出，50％TraT2A水分散粒剂各项质量标准均达到国家规定质量控制标准，且热、冷贮藏稳定性良好；持久起泡性合格(1min后泡沫量小于20mL)，无需添加消泡剂；研究表明，TraT2A对pH(5-10)及紫外光不稳定，由表7可知，50％TraT2A水分散粒剂pH介于6-9之间，对TraT2A稳定性无明显影响；经试验研究发现50％TraT2A水分散粒剂在紫外光下照射10min以后其有效成分分解率大于50％，当加入少量紫外保护剂(1％抗坏血酸)后其稳定性大大提高，经紫外照射60min后，有效成分分解率小于5％。由此得到50％TraT2A水分散粒剂最终配方(质量分数)：50％TraT2A、2％十二烷基硫酸钠、8％5040、0.5％PV、 4.5％硫酸铵、1％抗坏血酸、34％煅烧高岭土。

2.2 TraT2A水分散粒剂活性测定

50％TraT2A水分散粒剂活性测定，结果表明该制剂浓度为40.00mg/mL、 20.00mg/mL、10.00mg/mL、5.00mg/mL时对百合灰霉菌的抑制率分别为61.79％、 42.95％、33.02％、19.69％，以50％TraT2A水分散粒剂中除TraT2A以外的助剂成分作为对照发现，在对应浓度下有效成分TraT2A的实际抑菌率分别为28.60％、 19.56％、14.12％、11.06％，当制剂稀释浓度为40.00mg/mL时，制剂、有效成分 TraT2A的抑菌率均最大，分别为61.79％、28.60％(表8)。当制剂浓度为20.00mg/mL 时对百合幼苗抗灰霉病的诱导抗病效果最好，达到65.77％(表9)；方差分析表明制剂不同浓度对灰霉菌的抑菌率和诱导抗病效果之间均存在差异。

表8 50％TraT2A水分散粒剂抑菌活性测定

表9 50％TraT2A水分散粒剂诱导抗病活性测定

Claims (10)

1.一种水分散粒剂，其特征在于，按重量百分数计，该制剂的有效活性成分包括50％的深绿木霉T2菌株发酵液蛋白质提取物(TraT2A)。

2.如权利要求1所述的一种水分散粒剂，其特征在于，该制剂还包括载体、湿润剂、分散剂、崩解剂、粘结剂。

3.如权利要求1所述的一种水分散粒剂，其特征在于，该制剂还包括保护剂抗坏血酸。

4.如权利要求2所述的一种水分散粒剂，其特征在于，所述的载体为煅烧高岭土。

5.如权利要求2所述的一种水分散粒剂，其特征在于，所述的湿润剂为十二烷基苯磺酸钠。

6.如权利要求2所述的一种水分散粒剂，其特征在于，所述的分散剂为聚羧酸盐(5040)。

7.如权利要求2所述的一种水分散粒剂，其特征在于，所述的崩解剂为硫酸铵。

8.如权利要求2所述的一种水分散粒剂，其特征在于，所述的粘结剂为聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。

9.如权利要求1所述的一种水分散粒剂，其特征在于，按所述的水分散粒剂质量为1g计，各组分配比为：

深绿木霉T2蛋白激发子(TraT2A)0.5g

湿润剂十二烷基苯磺酸钠0.02g

分散剂聚羧酸盐0.08g

崩解剂硫酸铵0.045g

粘结剂聚乙烯吡咯烷酮0.005g

载体煅烧高岭土0.35g。

10.如权利要求1所述的一种水分散粒剂，其特征在于，按所述的水分散粒剂质量为1g计，配方优化后各组分配比为：

深绿木霉T2蛋白激发子(TraT2A)0.5g

湿润剂十二烷基苯磺酸钠0.02g

分散剂聚羧酸盐0.08g

崩解剂硫酸铵0.045g

粘结剂聚乙烯吡咯烷酮0.005g

载体煅烧高岭土0.34g

保护剂抗坏血酸0.01g。