用于预防或抑制艰难梭菌感染的疗法
本发明涉及用于治疗或抑制艰难梭菌(Clostridium difficile)感染(CDI)的治疗物和相应的疗法。
艰难梭菌感染(CDI)目前是世界范围的医院中的主要问题。该细菌导致医院的抗生素相关的疾病,该疾病自身表现为从轻度自身限制性腹泻至可能威胁生命的严重结肠炎的几种形式。中老年患者处于这些可能威胁生命的疾病的风险最大,且CDI的发病率在过去10年内急剧增高。在2007年,在英国存在50,000多例CDI,其中有8,000多例相关的死亡。每年CDI花费英国国民卫生服务(NHS)超过5亿英镑。
各种艰难梭菌菌株可以通过大量方法来分类。最常用的方法之一是聚合酶链式反应(PCR)核糖核酸分型(ribotyping),其中使用PCR来扩增艰难梭菌的16S-23S rRNA基因间间隔区域。来自该方法的反应产物提供了鉴定分离株的细菌核糖核酸型的特征带型。毒素分型(toxinotyping)是另一分型方法,其中使用来源于编码艰难梭菌毒素的DNA的限制模式来鉴定菌株毒素型。在不同菌株的毒素基因之间观察到的限制模式的差异还表示艰难梭菌毒素家族内的序列变异。毒素B显示了一些区域中的序列变异。例如,毒素型0毒素B的C末端60kDa区域与毒素型III中的相同区域相比较具有大约13%的序列差异。
艰难梭菌菌株产生多种毒力因子,其中值得注意的是几种蛋白毒素:毒素A、毒素B和某些菌株中的二元毒素,该二元毒素与产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)ι毒素类似。毒素A是大的蛋白细胞毒素/肠毒素,其在感染的病理中起作用并可影响肠道(gut)定殖过程。已报道了毒素A阴性/毒素B阳性菌株的CDI爆发,这表明毒素B也能够在疾病病理中起关键作用。毒素A和毒素B二者都经由多步机制来发挥它们的作用机制,所述多步机制包括:与细胞表面的受体结合,内化,随后易位并将效应器结构域释放到细胞胞质溶胶中以及最终的胞内作用。对于毒素A和毒素B二者,这涉及Rho家族的小GTP酶的失活。对于该失活,每种毒素催化葡萄糖部分(来自UDP-葡萄糖)转移至Rho蛋白的氨基残基。毒素A和毒素B二者还均含有半胱氨酸蛋白酶形式的第二种酶活性,该第二种酶活性似乎在易位之后效应器结构域释放到胞质溶胶中起作用。艰难梭菌二元毒素通过涉及将ADP-核糖部分从NAD转移至其靶蛋白的机制修饰细胞肌动蛋白。
艰难梭菌感染的治疗目前依赖于抗生素,其中特别包括甲硝唑和万古霉素。然而,这些抗生素不是在所有情况下都有效,并且20-30%的患者会遭受疾病复发。最受关注的是在英国出现了毒力更强的菌株,该菌株于2002年首次在加拿大被鉴定。这些菌株,其包括属于PCR核糖核酸型027,毒素型III的那些,导致具有比之前观察到的CDI高3倍的直接归因死亡率的CDI。
因此现在尤其急迫地需要新型治疗物,因为目前的抗生素的效力似乎在降低。
因此,本领域中存在对于能够特别地解决艰难梭菌感染(CDI)的新型疗法/治疗物的需要。该需要由本发明所解决,本发明解决了上述问题的一个或多个。
更详细地,本发明的第一方面提供了用于预防或治疗CDI中的口服施用的羊抗体。所述口服治疗提供了具有非预期的效力和/或降低的副作用的CDI的简单治疗/预防/抑制。在另一方面,本发明提供了包括适用于预防或治疗CDI中的口服施用形式的羊抗体的抗体组合物。在一个实施方案中,所述羊抗体是多克隆抗体。
使用时,本发明的抗体与艰难梭菌毒素或其片段结合,优选地中和毒素或其片段的生物活性。因此,本发明的抗体能够预防或治疗CDI,和/或优选地还预防患者复发。
本发明的抗体疗法提供了超越其他疗法的明显优势,因为其能够抑制艰难梭菌的一种或多种毒素的生物作用,同时对患者具有极小的或低的免疫原作用。并且,本发明的抗体可以非常高的毒素中和效价来产生。因此,羊抗体可容易地获得并且可以保护患者免于艰难梭菌产生的病理作用而具有极小的副作用或无副作用。本发明的抗体还可预防性地防止CDI的发作。
本发明的首要靶标是艰难梭菌毒素或其片段。本发明的抗体可以结合和/或中和的适宜的艰难梭菌毒素包括导致CDI或其症状或与CDI或其症状相关的任何艰难梭菌毒素。在又一实施方案中,本发明的抗体结合和/或中和选自以下的一种或多种类型的艰难梭菌毒素:艰难梭菌毒素A或其片段、艰难梭菌毒素B或其片段、以及艰难梭菌二元毒素或其片段。
因此,在一个实施方案中,本发明的抗体组合物包括结合和/或中和艰难梭菌毒素A(或其片段)的羊抗体。在另一实施方案中,本发明的抗体组合物包括结合和/或中和艰难梭菌毒素B(或其片段)的羊抗体。在又一实施方案中,本发明的抗体组合物包括结合和/或中和艰难梭菌二元毒素(或其片段)的羊抗体。
在另一实施方案中,本发明的抗体组合物包括结合和/或中和艰难梭菌毒素A(或其片段)和艰难梭菌毒素B(或其片段)的羊抗体。在另一实施方案中,本发明的抗体组合物包括结合和/或中和艰难梭菌毒素A(或其片段)和艰难梭菌二元毒素(或其片段)的羊抗体。在又一实施方案中,本发明的抗体组合物包括结合和/或中和艰难梭菌毒素B(或其片段)和艰难梭菌二元毒素(或其片段)的羊抗体。
本发明的抗体组合物还可包括结合和/或中和艰难梭菌毒素A(或其片段)、艰难梭菌毒素B(或其片段)和艰难梭菌二元毒素(或其片段)的羊抗体。
本发明的抗体与毒素的特定表位相互作用。例如,抗体可结合艰难梭菌毒素A的N末端结构域(例如,氨基酸1-957之间)或中间区域结构域(例如,氨基酸958-1831之间)或C末端重复结构域(例如,氨基酸1832-2710之间)中的表位。例如,抗体可与艰难梭菌毒素A的氨基酸1832-2710中的表位结合。类似地,抗体可结合毒素B的N末端结构域(例如,氨基酸1-955之间)或中间区域结构域(例如,氨基酸956-1831之间)或C末端重复结构域(例如,氨基酸1832-2366之间)中的表位。例如,抗体可结合毒素B的氨基酸1832-2366中的表位。在二元毒素的情况下,抗体可结合催化结构域(片段A)或受体结合结构域,受体结合结构域位于片段B的C末端部分(大约残基400-870);和/或结合片段B的N末端半侧(大约残基1-400),其参与片段A的结合和向细胞中的易位。
在一个实施方案中,艰难梭菌毒素选自毒素型0至XV中的一种。优选的毒素型(加上示例核糖核酸型和菌株)列在下面的表中。所列的毒素型纯粹是示例,并不旨在限制本发明。
本发明的不同抗体可结合和/或中和来自相同的或不同的艰难梭菌菌株的艰难梭菌毒素。例如,抗体可结合和/或中和以下中的一种或多种:艰难梭菌毒素A-毒素型0;艰难梭菌毒素B-毒素型0;艰难梭菌毒素A-毒素型III;艰难梭菌毒素B-毒素型III;艰难梭菌毒素A-毒素型V;和/或艰难梭菌毒素B-毒素型V。优选地,应用结合和/或中和来自这些毒素型的全部或大部分的毒素A和B的抗体的混合物。本发明的抗体可与所述菌株的艰难梭菌毒素A和/或艰难梭菌毒素B和/或艰难梭菌二元毒素的N末端结构域、中间区域结构域、和/或C末端重复结构域中的表位结合。
在某些实施方案中,本发明的抗体可结合和/或中和至少一种艰难梭菌毒素,所述艰难梭菌毒素包括与SEQ ID NO:1-6至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或更多相同的氨基酸序列或其片段。
本发明还涵盖用于预防或治疗CDI的相应方法,所述方法包括向患者口服施用本发明的抗体组合物。患者可以是被艰难梭菌感染的,或具有艰难梭菌的症状(例如,轻度自身限制性腹泻、腹痛、发热和食欲丧失乃至威胁生命的病症,诸如假膜性结肠炎和细胞毒性巨结肠)或具有艰难梭菌感染的倾向(例如,经受着抗生素治疗、经历过艰难梭菌并处于复发的风险、或暴露于显示出与艰难梭菌感染相关的临床症状的第二个体)。本发明因此提供了用于预防、抑制或治疗CDI(或其症状)的有效手段。
在一个实施方案中,治疗CDI的所述方法包括向感染艰难梭菌或经受CDI的症状的患者口服施用本发明的抗体组合物。这可利用治疗有效量的抗体来完成。该施用可通过重复施用本发明的抗体组合物持续延长的时间段来实现。所述组合物的抗体组分可以是相同的或不同的(根据其毒素型特异性和/或艰难梭菌毒素上的靶向的结合区域或表位),且施用可以是同时的或顺序的,且可以任何顺序来实现。
在另一个实施方案中,预防CDI的所述方法包括向患者口服施用本发明的抗体组合物以提供针对CDI的被动免疫。这可在CDI的发作之前或在CDI的非常早期中利用预防有效量的抗体来完成。该施用可通过重复施用本发明的抗体组合物持续延长的时间段来实现。所述组合物的抗体组分可以是相同的或不同的(根据其毒素型特异性和/或艰难梭菌毒素上的靶向的结合区域或表位),且施用可以是同时的或顺序的,且可以任何顺序来实现。
在另一个实施方案中,治疗CDI的所述方法包括系统地施用抗体(例如,每天1次或2次,或每3-4天1次或2次或3次或4次;持续通常1-2周的短时间段),随后口服施用抗体更加延长的时间段(例如,每天1次或2次或3次或4次或5次或6次,或每3-4天1次或2次或3次或4次或5次或6次,或每周1次或2次或3次或4次或5次或6次)。在该实施方案中,系统施用的抗体作为适宜于该途径的制剂来提供,而口服施用的抗体以本发明的组合物的形式来提供。所述施用可通过经由系统途径提供抗体的一次或多次施用,随后重复地口服施用本发明的抗体组合物持续更加延长的时间段来实现。所述组合物的抗体组分可以是相同的或不同的(根据其毒素型特异性和/或艰难梭菌毒素上的靶向的结合区域或表位)。
在另一个实施方案中,以上的口服施用可在所述抗体的相应的系统施用之前进行或与其同时进行。当然,当系统施用时,对抗体进行相应地配制(例如,所述制剂通常作为同种毒素的含水制剂来提供,且不需要用于保护其免于胃酸或胃酶诸如胰蛋白酶和/或糜蛋白酶的剂(means))。
在一个实施方案中,待治疗或保护的对象是以下种类的一个或多个中的对象:住院者;超过65或70岁者;接受广谱抗生素者;具有先前CDI病史/感染者;与有症状的CDI患者非常接近者;具有轻到中度疾病严重度者;表现为无症状但认为其处于复发的高风险者(例如,由于一个或多个复发事件);与CDI爆发区域或患者非常接近者。
抗体制备
羊抗体是在绵羊中产生的抗体。因此,本发明包括产生用于本发明的抗体组合物的羊抗体的方法,所述方法一般包括(i)向绵羊施用包括艰难梭菌毒素或其片段的免疫原;(ii)允许有足够的时间在所述绵羊中产生抗体;和(iii)从所述绵羊中获得所述抗体。如本文所用的,绵羊包括属于盘羊属(Ovis)的任何物种(例如,盘羊(Ovis ammon)、Ovis orientalisaries、Ovis orientalis orientalis、维氏盘羊(Ovis orientalis vignei)、加拿大盘羊(Ovis Canadensis)、戴氏盘羊(Ovis dalli)、雪羊(Ovis nivicola))。
本发明还包括产生用于本发明的口服抗体组合物的羊抗体的方法,其中所述羊抗体是由绵羊响应于包括艰难梭菌毒素或其片段(优选地,具有与全长天然毒素的抗原交叉反应性和/或保留全长天然毒素的毒素或毒素样活性的片段)的免疫原而引发的。
抗体可获自绵羊血清。因此,该程序产生包含能够结合和中和艰难梭菌毒素的抗体的绵羊抗血清。在另一实施方案中,抗体是分离的和/或纯化的。因此,本发明的另一方面包括从绵羊抗血清中纯化抗体。
在一个实施方案中,用于生成本发明的抗体的免疫原是已任选地被纯化的艰难梭菌毒素或其片段。适宜的艰难梭菌毒素包括导致CDI或其症状、或与CDI或其症状相关的任何艰难梭菌毒素。在另一实施方案中,毒素选自以下毒素的至少一种:艰难梭菌毒素A或其片段、艰难梭菌毒素B或其片段、和艰难梭菌二元毒素或其片段。艰难梭菌毒素还可以是选自如上文所定义的毒素型0至XV中之一的毒素。
纯化的艰难梭菌毒素的产生在实施例中示出。在某些实施方案中,免疫原是艰难梭菌毒素变体。在另一实施方案中,免疫原包括与SEQ ID NO:1-6至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或更多相同的氨基酸序列或其片段。
用于生成本发明的抗体的免疫原还可以是部分或完全失活的,即,具有降低的毒性。修饰的实例包括:化学处理(例如,用UDP-二醛、甲醛、戊二醛、过氧化物或氧处理)和重组方法(例如,毒素中的缺失或突变)。例如,免疫原可以是来源于通过用甲醛处理的天然毒素的艰难梭菌类毒素或其片段。可选地,重组类毒素可通过用定点诱变选择性地使活性位点基序失活而生成。降低或消除毒素A和毒素B的毒素作用的定点诱变的实例是修饰毒素的N末端结构域中的DXD基序。可以将天冬氨酸和/或其他残基突变为例如丙氨酸以降低毒素A和毒素B中任一种的生物活性。例如,对于毒素A,可以突变下列氨基酸中的一种或多种:Asp269、Asp285、Asp287、Asn383、Trp519、Tyr283、Arg272。对于毒素B,可以突变下列氨基酸中的一种或多种:Asp270、Asp286、Asp288、Asn384、Trp520、Tyr284、Arg273。
抗原可以与佐剂一起配制。适宜的佐剂可包括广泛用于人类的铝(alum)(磷酸铝或氢氧化铝),和其他佐剂诸如皂苷及其纯化的组分QuilA、弗氏完全佐剂和不完全佐剂、RIBBI佐剂以及用于研究和兽医应用的其他佐剂。
艰难梭菌毒素或类毒素可独立地或者同时或顺序组合地用作免疫原,以产生对单个艰难梭菌毒素或组合特异性的抗体。例如,两种或更多种毒素或类毒素可以混合在一起并用作单个免疫原。可选择地,艰难梭菌毒素(例如,艰难梭菌毒素A)可独立地用作第一绵羊的第一免疫原,并且另一艰难梭菌毒素(例如,艰难梭菌毒素B)可独立地用于第二绵羊。可将由独立的免疫产生的抗体组合以产生针对艰难梭菌毒素的抗体组合物。
在本发明的口服递送方面包括独立的或另外的治疗性组分(例如,非口服疗法/治疗物)时,后者通过常规手段来配制——非口服治疗的实例包括经由包括皮下、肌内、腹膜内和静脉内的任何非口服途径施用本发明的抗体。
该方法包括所有的免疫(即,生成本发明的抗体)模式,包括皮下、肌内、腹膜内和静脉内。本发明还考虑了多种免疫方案。在一个实施方案中,在第0天给绵羊或山羊施用毒素且随后绵羊或山羊按间隔接受毒素。应了解所需的间隔范围和剂量范围取决于免疫原的精确性质、施用途径、制剂的性质以及主治人员的判断。利用用于优化的标准经验程序可调节这些剂量水平的变化。类似地,本发明并不旨在限于收集抗体的任何特定方案。优选的收集时间是第56天之后的某天。特异性抗体,即与免疫原结合的抗体,其水平应呈现为每升血清中至少3g。
收集之后可按需要修饰本发明的抗体,以便在某些情况下它们在被施用的患者中具有较低的免疫原性。例如,如果患者是人,则可以通过本领域中熟知的方法使抗体脱种特性(despeciate)。关于可如何制备较低免疫原性的抗体的一个实例是制备F(ab)2片段。本发明的抗体可用于产生这种抗体片段,已针对该抗体片段开发了多种技术。例如,片段可以通过完整抗体的蛋白水解消化衍生。用于它们的产生的其他技术对于熟练的从业者来说是明显的。
抗体制剂和递送
在使用时,本发明应用药物组合物,所述药物组合物包括呈适宜于口服施用的形式的本发明的抗体组合物。配制纯化的完整抗体或其片段以用于该递送。例如,可以将浓度在5-50或15-50或25-50g/升的抗体或其片段配制于缓冲液中。适宜的缓冲液组分的实例包括生理盐,比如柠檬酸钠和/或柠檬酸。优选的缓冲液包含100-200mM或125-175mM或大约150(例如,153)mM生理盐,比如氯化钠。
本发明的抗体组合物被配制用于口服递送。口服递送的关键问题是确保足够的抗体到达需要其的结肠。关于此,可抑制到达肠道的抗体的最优量的因素包括存在于消化分泌物中的降解抗体分子的蛋白水解酶,和在一些情况下,CDI自身的作用,CDI可导致麻痹性肠梗阻以及阻止流体沿消化管向下运动的其他并发症。因此,在本发明的优选的实施方案中,通过掺入用于对抗/降低消化酶(例如,胃酶)和环境(例如,胃酸)的不期望的作用的剂来配制抗体组合物。下面非限制性地描述了所述剂的多种实施方案。所述实施方案中的每一个可单独应用或互相组合应用。技术人员已知的另外的剂包括在本发明的内容中,且还可单独地使用或与以下实施方案中的任何一种组合地使用。
本发明的口服抗体制剂/组合物可包括一种或多种胰蛋白酶的抑制剂(例如,胰蛋白酶-1和/或胰蛋白酶-2的抑制剂)和/或糜蛋白酶的抑制剂(例如,糜蛋白酶B的抑制剂)。在一个实施方案中,所述抑制剂是大分子抑制剂(例如,具有至少5kDa的分子量的大分子抑制剂),比如基于多肽的抑制剂。通过示例的方式,所述抑制剂可包含多肽环,当被胰蛋白酶或糜蛋白酶裂解时其导致抑制剂与蛋白酶非常强烈地结合,从而抑制胰蛋白酶和/或糜蛋白酶的进一步的作用。为方便,关于此的优选的抑制剂可以以蛋清(白蛋白)形式提供。可选地(或另外地),可应用其活性组分(例如,卵类粘蛋白和卵固蛋白(ovostatin)/卵巨球蛋白(ovomacroglobulin))。另一实例是大豆胰蛋白酶抑制剂。
在一个实施方案中,为方便,可提供初乳形式的(例如,牛的)抑制剂混合物。可选地(或另外地),可应用其活性组分。初乳可与羊抗体容易地组合以提供口服施用的适宜的制剂。
在一个实施方案中,胰蛋白酶抑制剂是胰腺外分泌部分(exocrinepancreas)中天然合成的小蛋白(例如,分子量5-25kDa),其防止胰蛋白酶原转化为胰蛋白酶,从而保护其自身免于胰蛋白酶消化。胰腺胰蛋白酶抑制剂与胰蛋白酶的活性位点竞争性地结合并在非常低的浓度使其失活。适用于本发明的胰蛋白酶抑制剂的实例包括天然产生的和重组产生的分子二者,比如:
天然胰腺胰蛋白酶抑制剂是通过腺泡细胞产生的并针对偶然胰蛋白酶原激活和随后激烈的蛋白水解提供保障。以举例的方式,胞内碱性胰腺胰蛋白酶抑制剂(BPTI)于1936年由Kunitz和Northrop首次结晶。在pH3和10之间,碱性胰腺胰蛋白酶抑制剂(BPTI)与牛胰蛋白酶形成非常稳定的1∶1复合物,且对人类胰蛋白酶也如此。糜蛋白酶也受BPTI的抑制。由Kunitz(1945)首次结晶的大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)是发现于大豆中的几种胰蛋白酶抑制剂之一。最著名的制备物是Kunitz的制备物(分子量21,500±800;等电点:4.5)。Kunitz大豆抑制剂由通过2个二硫桥交联的单一多肽链组成,并摩尔对摩尔地抑制胰蛋白酶和较小程度地抑制糜蛋白酶。卵类粘蛋白(分子量28,500±3,500)是鸟类蛋清的糖蛋白蛋白酶抑制剂,并作用于牛胰蛋白酶和糜蛋白酶。利马豆胰蛋白酶抑制剂(LBI)通过形成等摩尔复合物作用于胰蛋白酶和糜蛋白酶。胰蛋白酶敏感型结合位点是lys-ser肽键,而糜蛋白酶作用的位点是leu-ser键(Krahn和Stevens1970)。利马豆胰蛋白酶抑制剂(分子量8,000-10,000)可经色谱分离为多达6个变体。全部具有相似的但不相同的氨基酸组成,包含6个或7个二硫键且缺少蛋氨酸和色氨酸。
以进一步举例的方式,Bowman Birk蛋白酶抑制剂是由大豆和一系列豆科植物产生的一组糜蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂。它们是7-10kda的小的富二硫键蛋白,其对于人类是非毒性的且是耐受良好的。对极端pH非常稳定的糜蛋白酶肽抑制剂出现于海龟蛋清。这些小的肽抑制剂(约13kDa)与糜蛋白酶形成稳定的复合物(Guha等人(1984)J.Bioscience 6:155-163)。
在一个实施方案中,胰蛋白酶和/或糜蛋白酶抑制剂组分可以是与胰蛋白酶和/或糜蛋白酶结合(例如,特异性地结合)并使其酶活性失活的抗体(包括其片段)。此类基于抗体的抑制剂可用作以上非基于抗体的抑制剂的替代物或除以上非基于抗体的抑制剂之外使用。因而,可应用基于抗体的抑制剂和非基于抗体的抑制剂的抑制剂组合。以举例的方式,非抗体抑制剂(例如,卵类粘蛋白)可与其中抗体抑制糜蛋白酶(和/或胰蛋白酶)的抗体抑制剂组合使用。相似地,非抗体糜蛋白酶抑制剂可与其中抗体抑制胰蛋白酶(和/或糜蛋白酶)的抗体抑制剂组合使用。此类抗体可常规制备(例如,参见实施例10)。
以上所描述的胰蛋白酶和/或糜蛋白酶抑制剂可在抗体组分之前、与抗体组分同时或继抗体组分之后口服施用。在一个实施方案中,抑制剂在抗体组分之前或与抗体组分同时施用。
在一个实施方案中,本发明的口服抗体制剂可包括解酸剂组分。使用时,所述解酸剂组分协助保护抗体组分免于患者中存在的高度酸性胃环境。
解酸剂(antacid)是对抗胃酸度的任何物质,一般为碱或碱性盐。换言之,解酸剂是胃酸中和物,其在有限的时间段提高胃pH,理想地高于pH 4.0。解酸剂进行中和反应,即,其缓冲胃酸,提高pH以降低胃中的酸度。
用于本发明的适宜的解酸剂的例子包括:氢氧化铝(例如,安福杰耳(Amphojel),AlternaGEL);氢氧化镁(例如,氧化镁的菲利普斯乳剂(Phillips’Milk of Magnesia));氢氧化铝和氢氧化镁(例如,马阿洛克斯(Maalox),氢氧化铝镁(Mylanta),Diovol);碳酸铝凝胶(例如,碱式碳酸铝(Basaljel));碳酸钙(例如,Alcalak,TUMS,Quick-Eze,Rennie,Titralac,Rolaids);碳酸氢钠(例如,苏打的碳酸氢盐,Alka-Seltzer);碳酸镁;三硅酸镁;水滑石(例如,Mg6Al2(CO3)(OH)16·4(H2O);达喜(Talcid));碱式水杨酸铋(例如,Pepto-Bismol);藻酸盐(例如,海藻酸钠,藻酸);镁加铝和西甲硅油(magaldrate with simethicone)(例如,Pepsil);以上任何一种与西甲硅油的组合例如复方二甲基硅油(Asilone),其具有3种活性成分,氢氧化铝和氧化镁中和酸,去除疼痛的起因,以及二甲硅油(dimethicone)。
除以上所描述的制剂组分之外(或替代以上所描述的制剂组分地),组合物可包括用于保护抗体免于胃的酸性环境而使活性抗体最终被递送到肠作用位点(例如,结肠)的物理和/或化学剂。
以举例的方式,抗体可以是包囊的(例如,丸(pellet)、粒状基质、珠、微球体、纳米颗粒或脂质体)和/或可以是受化学保护的(例如,通过聚乙二醇化)。
适用于本发明的常规包囊(encapsulation)技术包括:
回肠末端和结肠(升结肠除外)中的pH高于胃肠道的任何其他区域。因此优先在高pH水平崩解的制剂对于位点特异性递送到该区域是最佳的。用于设计pH依赖的多颗粒(multiparticulate)结肠特异性递送系统的最简单的方法之一是肠溶包衣颗粒。肠溶包衣惯用于防止药物在上胃肠道中的释放。肠溶包衣聚合物可用作黏合剂和用作颗粒的包衣材料。将柠檬酸掺入到包衣和/或片剂基质中由于因为该酸的存在核心系统(core system)的崩解时间的延长而协助体外释放和体内吸收的延迟。用于口服递送的最常用的pH依赖的包衣聚合物是甲基丙烯酸共聚物,Eudragit L100和EudragitS100,其分别在pH 6.0和7.0溶解。该两种聚合物不同比率的组合使在6.0-7.0pH范围内操作药物释放成为可能。包括这些聚合物的胶囊可进一步利用聚甲基丙烯酸酯来包衣。
相似地,可添加赋形剂诸如作为包衣材料的含水羟丙基甲基纤维素乙酸琥珀酸酯和作为pH调节剂的柠檬酸。硬脂酸棕榈酸甘油酯可用作阻化剂材料(retardant material)以配制控制释放的基质。
包衣制剂(例如,Eudragit S100)可进一步利用壳聚糖-HCl层来覆盖。水合之后,胶囊外壳溶解且壳聚糖层形成凝胶(内部pH 4.5),其在Eudragit薄膜周围形成酸性环境从而其不会在升结肠中溶解。在升结肠中,壳聚糖HCl凝胶通过结肠微生物群降解,从而将Eudragit薄膜暴露于结肠环境。但由于升结肠是具有小于7.0的pH的弱酸性,薄膜包衣仍保持完整。然而,在到达pH大于7的降结肠中后,Eudragit薄膜包衣溶解且药物以控制的方式从基质中释放。多层包衣可基于,例如,内部包衣(Eudragit RL/RS的组合),和外部包衣(Eudragit FS 30D)来应用。Eudragit FS 30D是丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸的离子共聚物,且是pH敏感的,在pH高于6.5时溶解。
还可应用微生物控制的递送系统,其依赖于结肠微生物群的独特的酶能力。该类型的递送系统能够进行更特异性的靶向,不依赖于沿胃肠道的pH变化。可应用许多天然多糖诸如硫酸软骨素、果胶、葡聚糖、瓜尔胶等。包括水凝胶珠(壳聚糖和三聚磷酸盐(TPP))的多颗粒系统是一个选择——TPP用作针对带正电荷的壳聚糖的平衡离子以形成凝胶珠。该珠装载牛血清白蛋白(BSA),该蛋白倾向于在胃肠道的上部降解,而壳聚糖和TPP的交联导致壳聚糖的降低的溶解度,从而导致在上胃肠道穿越过程中较少的蛋白(抗体)释放。直链淀粉是特别好的成膜聚合物(经由胶凝作用),且还可与Eudragit RS/RL 30D水分散体相混合。相似地,可应用与二价阳离子(例如,钙或锌)形成硬凝胶的酰胺化的低甲氧基果胶以产生用于结肠递送的果胶酸钙凝胶珠。果胶可与钙盐相组合——果胶酸钙(果胶的不溶性盐)不被胃酶或肠酶所降解,但能够被结肠果胶分解酶所降解。作为交联可溶性多糖而形成不溶性盐的替代形式,可用pH敏感的聚合物来包衣基于多糖的系统。以举例的方式,可制备壳聚糖微核并用丙烯酸类聚合物诸如分别用Eudragit L100和Eudragit S100来包衣。Eudragit P-4135F代表适宜的pH敏感型聚合物的另一个例子,其可应用于制备用于结肠递送的微粒。
可应用多颗粒系统,其将pH敏感型递送和在结肠环境中的生物降解相组合。以举例的方式,利用诸如喷雾干燥的技术可制备壳聚糖微核的内部包埋基质,随后通过诸如油包油溶剂蒸发(oil-in oil solvent evaporation)的技术在Eudragit聚合物中应用微囊化的壳聚糖微核。在外部Eudragit包衣于适当的pH下溶解后,暴露的壳聚糖微核膨胀并在碱性pH中形成凝胶屏障,并且,在结肠区域中,壳聚糖经历降解从而增强释放。相似的结肠递送多颗粒系统可基于用Eudragit L100或S100包衣的壳聚糖微球体。适宜的制备技术包括乳化溶剂蒸发。壳聚糖可以是与戊二醛交联的。
聚丙烯酸酯代表用于本发明的适宜的递送运载体的另一个例子。以举例的方式,可应用与双官能偶氮基化合物交联的苯乙烯和甲基丙烯酸羟乙酯的三元共聚物。该系统依赖于通过结肠微生物群对偶氮键的裂解导致聚合物的降解。相似地,pH敏感的聚(甲基丙烯酸-接枝-乙二醇)水凝胶可用作口腔递送运载体。一旦在小肠的碱性和中性环境内,凝胶快速膨胀和分解。
在另一个实施方案中,微胶囊制剂可用于口服的结肠特异性递送。更详细地,可使用例如通过乳液聚合技术合成的丙烯酸乙酯/甲基丙烯酸甲酯(ethylacrylate)/2-甲基丙烯酸羟乙酯(聚(EA/MME/HEMA)的含水胶体三元共聚物。这些聚合物表现延迟的释放谱(release profile),其以长的滞后时间和随后的被包埋部分的快速释放为特征。
在另一个实施方案中,口服施用的纳米颗粒可用作适宜的递送运载体。以举例的方式,可将装载的纳米颗粒包埋在pH敏感的微球体中,其用于将包含的纳米颗粒递送到需要的结肠作用位点。纳米颗粒具有大的比表面(specific surface),这指示与生物表面的高度相互作用的可能。因而,通过用不同的分子结合纳米颗粒可诱导生物粘附。以举例的方式,纳米颗粒可从来自小麦面筋的醇溶蛋白分离物制备并将其与凝集素(提供特异性生物粘附的非免疫来源的糖蛋白)缀合。因此,提供了纳米颗粒,其具有与肠非特异性相互作用的高能力,且与凝集素的结合提供了对于结肠粘膜的更高的特异性。
在一个实施方案中,可应用基于白蛋白-壳聚糖混合基质微球体填充的包衣胶囊制剂的递送运载体。关于此,将本发明的抗体制备物填充到硬明胶胶囊中并对其进行肠溶包衣。
在一个实施方案中,白蛋白微球体可用作口服递送系统。
在一个实施方案中,可应用含角鲨烷油的多重乳液。
在一个实施方案中,聚(丙交酯-共-乙交酯)微球体可用作口服递送运载体。
在一个实施方案中,可应用在单层基质薄膜中包括pH敏感的肠溶聚合物(Eudragit S)和生物可降解多糖(抗性淀粉)的混合物的结肠递送包衣。这些递送运载体的例子是商业上可获得的,比如来自Encap DrugDelivery(Livingston,UK)——特定的实施方案包括PHLORALTM和ENCODETM。
除以上的递送运载体实施方案之外(或替代以上递送运载体实施方案地),可通过用聚乙二醇(PEG)进行聚乙二醇化来保护本发明的抗体片段免于酸腐蚀。可将不同的分子量(500-40000Da)的PEG偶联于IgG,例如,以2-20PEG分子每抗体分子的比率。我们参考Greenwald,R.B等人(2003)“Effective drug delivery by PEGylated drug conjugates”,AdvancedDrug Delivery Reviews 55,第217-250页。该出版物通过对其的引用以其整体并入。
在一个实施方案中,递送胶囊诸如脂质体、微胶囊或纳米胶囊(例如,壳聚糖纳米胶囊)可利用聚乙二醇(PEG)进行化学修饰。典型的聚乙二醇化程度在0.1%至5%的范围中,比如0.5%至2%,例如0.5%或1%。PEG的存在,无论单独地或与壳聚糖接枝,改善了递送胶囊在胃肠液中的稳定性。
在一个实施方案中,可利用由氰尿酰氯、琥珀酰亚胺琥珀酸酯和三氟代乙烷磺酰氯(tresyl chloride)活化的单甲氧基聚乙二醇(monomethoxypoly(ethylene)glycol)处理本发明的抗体。
聚乙二醇化的递送运载体诸如脂质体、微胶囊或纳米胶囊具有在疾病位点聚集的固有能力并有利于对靶细胞的转染。与许多病毒载体不同,一般认为聚乙二醇化的脂质体是非免疫原性的。
在一个实施方案中,采用支链的聚乙二醇化试剂,因为支链的PEG保护基团比直链的PEG分子更有效。
因为本发明的抗体制剂是用于口服递送的,所述制剂可包括增甜剂,比如香草精、糖(例如,葡萄糖、蔗糖等)、糖醇、蜂蜜、水果、糖浆(例如,槭糖浆(maple syrup)、大米糖浆、桦树糖浆、松树糖浆、山核桃糖浆(hickory syrup)、杨树糖浆、棕榈树糖浆、甜菜糖浆、高粱糖浆、玉米糖浆、甘蔗糖浆、金黄糖浆、大麦麦芽糖浆(barley malt syrup)、糖蜜(蜜糖(treacle))、糙米糖浆、龙舌兰糖浆(agave syrup)、雪莲果糖浆(yaconsyrup))、乙酰氨基磺酸钾(也称作Sunett)、阿力甜(alitame)(也称作aclame)、阿司帕坦(也称作Equal或Nutrasweet)、茴香脑、环己烷氨基磺酸盐、甘草皂苷、罗汉果、纽甜(neotame)、紫苏亭(perillartine)、糖精(也称作Sweet′n′Low)、甜菊糖苷(stevioside)、三氯半乳蔗糖(sucralose)(也称作SucraPlus和Splenda)、或菊粉。
适宜于口服递送的组合物可以为溶液、悬浮液或在使用前溶解或悬浮于适宜的运载体中的干粉形式。
在制备药物制剂时,可将抗体和/或其片段溶于运载体中,并在装入适宜的无菌瓶或安瓿中并密封之前利用无菌技术例如通过经过无菌滤器的过滤而灭菌。有利地,可将如下的添加剂溶于运载体中:缓冲剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂或杀菌剂、或悬浮剂和/或局部麻醉剂。
在使用前溶解或悬浮于适宜的运载体中的干粉可通过在无菌区域中利用无菌技术将预灭菌的成分装入无菌容器中而制备。可选地,可以在无菌区域中利用无菌技术将成分溶解在适宜的容器中。然后将产物冷冻干燥并无菌密封容器。
用于施用本发明的抗体的剂量范围是产生需要的治疗作用的那些剂量范围。应理解所需的剂量范围取决于抗体或组合物的精确性质、制剂的性质、患者的年龄、患者病症的性质、程度或严重度、禁忌症(若存在)、以及主治医师的判断。利用用于优化的标准经验程序可调节这些剂量水平的变化。
在一个实施方案中,典型的日剂量在5-20mg(例如,8-15mg或约10mg)/kg体重的范围内。单位剂量可以从低于100mg变化,但通常在每剂250-500mg的区域内,该剂量可以每天施用(例如,每天1次、2次、3次或4次)或更低频率地施用(例如,隔天施用,或者说每周一次)。
还在本发明的范围内的是在预防或治疗CDI的口服治疗方法中如下使用本发明的抗体:将本发明的抗体彼此组合、或作为另一种常用于CDI治疗的其他已确定的治疗的辅助或与其联合。例如,本发明的抗体可以与适宜的抗生素(例如,甲硝唑和/或万古霉素)联合施用。
组合治疗可以按本领域的技术人员认为必要或方便的任何方式实施,并且对于本说明书的目的,不考虑关于组合使用的化合物的顺序、量、重复(repetition)或相对量的限制。
定义部分
艰难梭菌是梭菌属的革兰氏阳性菌物种。
艰难梭菌感染(CDI)意为影响人和动物并导致如下的一系列症状的细菌感染:从轻度自身限制性腹泻至威胁生命的病症,诸如假膜性结肠炎和细胞毒性巨结肠。在该疾病中,艰难梭菌取代了正常的肠道菌群并产生攻击和损坏肠道上皮的细胞毒素。人CDI的主要风险因素包括:接受广谱抗生素、超过65岁以及住院。
艰难梭菌毒素A是大小为约300kDa的蛋白细胞毒素/肠毒素家族。毒素A在N末端区域内具有酶活性,该酶活性起作用破坏哺乳动物细胞的细胞骨架导致细胞死亡。在艰难梭菌菌株中存在大量天然存在的毒素A的变体,它们称为“毒素型”。毒素A的各种毒素型在它们的一级序列中总体具有通常小于10%的变异。适宜的毒素A序列的例子包括SEQ ID No:1和3。
艰难梭菌毒素B是大小约270kDa的蛋白细胞毒素家族,其与毒素A相似但具有显著更高的细胞毒性。像毒素A一样,毒素B在N末端区域内具有酶活性,该酶活性起作用破坏哺乳动物细胞的细胞骨架导致细胞死亡。在艰难梭菌菌株中存在大量天然存在的毒素B变体,它们称为“毒素型”。毒素B的各种毒素型在它们的一级序列中总体具有通常小于15%的变异。适宜的毒素A序列的实例包括SEQ ID No:2和4。
二元毒素是由一些但并非全部的艰难梭菌菌株产生的二组分细胞毒素。二元毒素在作用上与肉毒梭菌(Clostridium botulinum)C2和产气荚膜梭菌ι毒素相似,与艰难梭菌二元毒素类似,这些毒素由大约100kDa的细胞结合片段和大约50kDa的酶活性“效应器”片段组成。适宜的二元毒素序列的例子包括SEQ ID No:5和6。
如本文所用的,术语“毒素”涵盖所述毒素片段。片段可以为在参考毒素的10至2700(例如,至少50、100、150、200、250、300、350、400、500、750、1000、1500、2000或2500)个氨基酸的任何数目的范围内。片段优选地包括所研究的基因产物的至少一个表位。“片段”还可以具有与其所来源的毒素共同的抗原交叉反应性和/或基本上相同的体内生物活性。例如,能够结合片段的抗体还将能够结合该片段所来源的毒素。可选地,片段可以共有诱导T淋巴细胞的“记忆应答”的共同能力,所述T淋巴细胞之前已暴露于艰难梭菌毒素的抗原组分。
提及术语毒素包括其“变体”——例如,与艰难梭菌毒素具有至少80%或85%或90%或95%或96%或97%或98%或99%氨基酸序列同源性的肽或肽片段。在另一实施方案中,“变体”可以是肽或肽片段的模拟物,该模拟物再现该肽或肽片段的至少一个表位。
提及毒素包括毒素“类毒素”,下面对其进行更详细地讨论。
毒素型通常用于分类艰难梭菌菌株。毒素型基于表征对毒素基因所获得的限制模式的方法。如上所述,毒素A和B的毒素型代表这些蛋白毒素的一级氨基酸序列变体。
艰难梭菌类毒素用于描述部分或完全失活的艰难梭菌毒素(毒素A、毒素B或二元毒素)或艰难梭菌毒素的混合物。如果通过体外细胞毒性测定或通过动物毒性测量,毒素具有比未处理的毒素更低的毒性(例如,低100%、99%、95%或90%的毒性),则认为该毒素是失活的。
与感兴趣的毒素结合的抗体是能够以足够的亲和力与该毒素结合而使该抗体可用作治疗剂的抗体。与感兴趣的毒素结合的抗体是以至少104M的亲和力(Ka)与艰难梭菌的毒素结合的抗体。
毒素中和意为阻断艰难梭菌的一种或多种细胞毒素(毒素A和/或毒素B和/或二元毒素)的生物学作用的物质(例如,抗体)的作用。细胞毒素的生物学作用被定义为其杀伤或削弱哺乳动物细胞、尤其是哺乳动物肠道上皮的细胞的功能的能力。物质的毒素中和活性可以通过其阻止培养中生长的哺乳动物细胞死亡的能力来测量。
治疗有效量指在单独地或组合地施用于患者以治疗CDI、或CDI的至少一种临床症状时,足以对疾病或症状的这种治疗起作用的抗体的量。治疗有效量可依据例如抗体、感染、和/或感染症状、感染严重度、和/或感染症状、待治疗患者的年龄、体重和/或健康、以及处方医师的判断而不同。任何既定情况下的合适的治疗有效量可以由本领域的技术人员来确定或能够通过常规实验来确定。治疗有效量还是其中抗体的有益效果超过其任何毒性或有害作用的量。
“预防有效量”是在单独地或组合地施用于患者时,抑制或延迟CDI、或CDI的至少一种临床症状的发作或复发的抗体的任何量。在一些实施方案中,预防有效量完全阻止艰难梭菌感染的发作或复发。“抑制”发作意为降低感染发作的可能或完全阻止发作。
口服抗体制剂是当口服施用时,允许预防有效量的抗体到达肠道并抑制或延迟CDI的发作或复发的量。口服制剂通过包括蛋白酶抑制剂、物理和化学屏障的使用的多种机制防止或降低抗体在肠道环境中的降解。
绵羊意为属于盘羊属的任何物种(例如,盘羊、Ovis orientalis aries、Ovis orientalis orientalis、维氏盘羊、加拿大盘羊、戴氏盘羊、雪羊)。
羊抗体是与在绵羊中产生的抗体具有至少100%、99%、95%、90%、80%、75%、60%、50%、25%或10%氨基酸序列同一性的抗体。
对于序列比较,通常一个序列作为参考序列,检验序列可以与其比较。当使用序列比较算法时,将检验序列和参考序列输入到计算机中,若需要则随后指定坐标,并指定序列算法程序参数。然后,序列比较算法基于指定的程序参数计算检验序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
可以进行用于比较的最佳序列比对,例如通过Smith和Waterman的局部同源性比对算法[Adv.Appl.Math.2:484(1981)];通过Needleman&Wunsch的算法[J.Mol.Biol.48:443(1970)];通过Pearson&Lipman的相似性检索方法[Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)];通过这些算法的计算机实现方式(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA——威斯康辛大学生物技术中心(1710University Avenue,Madison,Wis.53705)的遗传学计算机组(Genetics Computer Group)的序列分析软件包);或通过目视检查[参见Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausbel等人,编,CurrentProtocols,Greene Publishing Associates,In.和John Wiley&Sons,Inc.合资(1995增刊)Ausbubel]。
适于确定序列相似性百分比的算法的例子是BLAST算法和BLAST2.0算法[参见Altschul(1990)J.Mol.Biol.215:第403-410页;和美国国立生物技术信息中心的“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/”]。
在一个同源性比较中,同一性跨越长度至少10个或20个或30个或40个或50个氨基酸残基的序列的区域而存在。在另一个同源性比较中,同一性跨越长度至少60个或70个或80个或90个或100个氨基酸残基的序列的区域而存在。
“抗体”以最广含义使用,且具体地包含多克隆抗体和抗体片段,条件是它们表现出需要的生物活性。特别地,抗体是包括至少一个或两个重链(H)可变区(本文缩写为VHC)和至少一个或两个轻链(L)可变区(本文缩写为VLC)的蛋白。VHC区和VLC区可进一步细分为称为“互补决定区”(“CDR”)的高变区,其散布于更保守的称为“框架区”(FR)的区域中。框架区和CDR的范围已被精确定义(参见,Kabat,E.A.,等人Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第5版,美国卫生和公共服务部(U.S.Department of Health and Human Services),NIH公布第91-3242号,1991,和Chothia,C.等人,J.Mol.Biol.196:901-917,1987,它们通过引用并入本文)。优选地,每个VHC和VLC由从氨基末端到羧基末端以如下次序排列的三个CDR和四个FR组成:FRI、CDRI、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
抗体的VHC或VLC链可进一步包括重链或轻链恒定区的全部或部分。在一个实施方案中,抗体是两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链的四聚体,其中所述免疫球蛋白重链和轻链通过例如二硫键相互连接。重链恒定区包括三个结构域:CHI、CH2和CH3。轻链恒定区由一个结构域CL组成。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区通常介导抗体与宿主组织或因子的结合,所述宿主组织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如,效应器细胞)和经典补体系统的第一成分(C1q)。术语“抗体”包括IgA型、IgG型、IgE型、IgD型、IgM型(以及它们的亚型)的完整免疫球蛋白,其中所述免疫球蛋白的轻链可以是κ型或λ型。
如本文所用的,术语抗体还指与艰难梭菌的毒素(例如,毒素B)结合的抗体的部分,例如,其中一条或更多条免疫球蛋白链不是全长,但结合毒素的分子。包括在术语抗体中的结合部分的例子包括(i)Fab片段,由VLC、VHC、CL和CHI结构域组成的单价片段;(ii)F(ab′)2片段,包括由铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段;(iii)由VHC和CHI结构域组成的Fc片段;(iv)由抗体单臂的VLC和VHC结构域组成的Fv片段;(v)dAb片段(Ward等人,Nature 341:544-546,1989),其由VHC结构域组成;和(vi)分离的互补决定区(CDR),其具有足够的框架以结合例如可变区的抗原结合部分。轻链可变区的抗原结合部分和重链可变区的抗原结合部分,例如,Fv片段的两个结构域VLC和VHC,可利用重组方法通过合成的连接物连接,所述合成的连接物使得它们可以作为单个蛋白链制备,在该单个蛋白链中VLC和VHC区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv);参见,例如,Bird等人(1988)Science IAI-ATi-Alβ;和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.ScL USA 85:5879-5883)。这种单链抗体也包括在术语抗体内。这些是利用本领域中的技术人员已知的常规技术获得的,并且以与完整抗体相同的方式筛选这些部分的效用。
下面是附图的简要说明,其示出了本发明的方面和/或实施方案。
图1通过亲和色谱对血清中毒素A的抗体进行的测量。将结合毒素A的抗体固定于琼脂糖凝胶上,随后将其洗脱。该图显示了血清加载量与洗脱的毒素A特异性抗体之间的线性关系。实验细节在实施例9中提供。
图2通过亲和色谱对血清中毒素A的抗体进行的测量。将结合毒素A的抗体固定于琼脂糖凝胶上,随后将其洗脱。该图显示了用毒素A的类毒素免疫的绵羊中的特异性抗体。毒素A的抗体以大于3mg/ml(3g/升)存在于绵羊血清中。实验细节在实施例9中提供。
图3蛋清初乳和正常绵羊血清对胰蛋白酶活性的抑制。数据显示胰蛋白酶可被多种天然存在的抑制剂诸如发现于鸡和火鸡蛋清、初乳和羊血清中的那些抑制剂所抑制。
图4酪蛋白和初乳琼脂径向蛋白酶扩散平板中的胰蛋白酶活性。利用径向蛋白酶扩散方法显示了初乳对胰蛋白酶的抑制。
图5体内实验1——通过在解酸剂存在时口服递送抗体而保护仓鼠免于CDI。这些数据显示在解酸剂存在时口服递送的艰难梭菌毒素A和B的抗体提供了使仓鼠免于CDI的保护。
图6体内实验2——通过在解酸剂存在时口服递送抗体而保护仓鼠免于CDI。这些数据显示在解酸剂存在时口服递送的艰难梭菌毒素A和B的抗体提供了使仓鼠免于CDI的保护。
图7体内实验3——通过口服递送包囊形式的抗体保护仓鼠免于CDI。这些数据显示了口服递送的肠溶包衣胶囊中艰难梭菌毒素A和B的抗体提供了使仓鼠免于CDI的一些保护。
实施例概述
实施例1毒素型0的艰难梭菌毒素A和B的纯化
实施例2其他毒素型的艰难梭菌毒素A和B的纯化
实施例3重组艰难梭菌毒素A和B的纯化
实施例4艰难梭菌二元毒素的纯化
实施例5艰难梭菌毒素A和B的类毒素的制备
实施例6抗血清的制备
实施例7毒素型0的毒素A和B的抗血清的制备
实施例8利用体外细胞测定评估抗血清对毒素的中和效力
实施例9利用免疫亲和柱定量血清中针对艰难梭菌毒素的特异性抗体的量
实施例10针对胰蛋白酶和/或糜蛋白酶的抗体抑制剂的制备
实施例11从蛋清(白蛋白)制备胰蛋白酶和/或糜蛋白酶抑制剂
实施例12胰蛋白酶的蛋白水解活性的抑制的证明
实施例13糜蛋白酶的蛋白水解活性的抑制的证明
实施例14包含胰蛋白酶和/或糜蛋白酶的基于抗体的抑制剂的制剂的制备
实施例15包含胰蛋白酶和/或糜蛋白酶的基于药品的抑制剂的制剂的制备
实施例16牛初乳-羊抗体制剂的制备
实施例17用聚乙二醇(PEG)修饰的抗体的制备
实施例18用丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸(Eudragit)的共聚物包衣抗体
实施例19用藻酸盐/壳聚糖的共聚物包衣抗体
实施例20用果胶包衣抗体
实施例21利用模拟的胃条件和肠条件评估抗体制剂对消化酶的稳定性
实施例22羊抗体预防CDI的体内效力的评估
实施例23羊抗血清治疗CDI的体内效力的评估
实施例24抗体制剂(药品)的临床应用
实施例25口服递送的抗体和抗生素的组合的临床应用
实施例26系统递送的和口服递送的抗体制剂的组合的临床应用SEQ ID NO概述
在下列SEQ ID NO的任一个中指示了起始Met氨基酸残基或相应的起始密码子时,所述残基/密码子是任选的。
1.艰难梭菌毒素A-毒素型0的蛋白序列
2.艰难梭菌毒素B-毒素型0的蛋白序列
3.艰难梭菌毒素A-毒素型III的蛋白序列
4.艰难梭菌毒素B-毒素型III的蛋白序列
5.艰难梭菌二元毒素片段A的蛋白序列
6.艰难梭菌二元毒素片段B的蛋白序列
7.人类胰蛋白酶-1的蛋白序列(Swiss Prot登录号P07477)
8.人类胰蛋白酶-2的蛋白序列(Swiss Prot登录号P07478)
9.人类胰蛋白酶-3的蛋白序列(Swiss Prot登录号P17538)
实施例
实施例1毒素型0的艰难梭菌毒素A和B的纯化
如所描述的(Roberts和Shone(2001)Toxicon 39:325-333),在透析囊(dialysis sac)培养中使产生毒素型0毒素A和B的艰难梭菌菌株(例如,VPI 10463)生长。生长后,从透析囊收集细胞浆液,且然后以10000×g离心30分钟,并将所得上清液的pH调节为pH 7.5,并使其关于硫酸铵为70%饱和。通过离心收集含有毒素的沉淀物,然后重悬于50mM bistris pH6.5缓冲液中并在4℃针对同一缓冲液进行透析。透析后,通过Q琼脂糖色谱、阴离子交换色谱和用NaCl梯度洗脱含有毒素的蛋白峰来纯化粗制毒素A和B的溶液。将含有毒素A的峰针对含有0.5M NaCl的50mM HepespH 7.4缓冲液进行透析并在Zn螯合柱(Zn琼脂糖)上纯化。加载毒素并从柱上洗去污染蛋白后,用含有50mM Hepes pH 7.4、20mM EDTA和0.1M NaCl的缓冲液洗脱纯化的毒素A。将纯化的毒素A针对含有0.15MNaCl的50mM Hepes pH 7.4缓冲液进行透析,并储存在4℃或冷冻直至使用。通过在高分辨的Mono Q阴离子交换树脂柱上的色谱来进一步纯化来自最初的Q琼脂糖柱的含有毒素B的峰。在将毒素加载到在50mM bistrispH 6.5缓冲液中的柱之后,用NaCl梯度洗脱纯化的毒素B并合并含有毒素的级分。将纯化的毒素B针对含有0.15M NaCl的50mM Hepes pH 7.4缓冲液进行透析,并储存在4℃或冷冻直至使用。
实施例2其他毒素型的艰难梭菌毒素A和B的纯化
代表任何已知毒素型的毒素A和B按照实施例1中所描述的进行纯化。产生各种毒素型的毒素A和B的已知艰难梭菌菌株在表1中给出,并通过选择纯化所需的菌株,纯化所需毒素型的毒素A和B。可选择地,可按先前所描述的(Rupnik等人(1998)J.Clinical Microbiol.36:2240-2247;Rupnik等人(2001)Microbiology 147:439-447)对艰难梭菌进行毒素分型直到获得产生需要的毒素型的毒素的艰难梭菌菌株。这些参考文献中的每一个以其整体通过引用并入。
为产生毒素型III毒素A和B,使艰难梭菌菌株R20291(也称为NCTC13366)按所描述的(Roberts和Shone(2001)Toxicon 39:325-333,其以其整体通过引用并入)生长于透析囊培养中,并按实施例1中所描述的纯化毒素。
实施例3重组艰难梭菌毒素A和B的纯化
艰难梭菌毒素A和B的例子的氨基酸序列显示于Seq ID 1至4中。具有对于任何期望表达宿主(例如,大肠杆菌(E.coli)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))的密码子偏倚的编码这些肽的基因是商业上可得到的。利用标准的分子生物学方法(例如Sambrook等人1989,Molecular Cloninga Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,New York)从这些基因表达肽并通过疏水相互作用色谱、离子交换色谱和陶瓷羟基磷灰石色谱的组合纯化所得的可溶性的表达多肽。可使用对于蛋白纯化领域来说熟知的替代的色谱技术,例如尺寸排阻色谱和/或亲和色谱。对于后者来说,可以与亲和纯化标签(例如,组氨酸-6、strep标签)一起表达重组片段,诸如在pET vector Expression System Manual,第11版,Merck KGaA出版,Darmstadt,Germany中所描述的。
为了从序列未知的艰难梭菌毒素型产生重组毒素,提取DNA并通过标准分子生物学方法得到毒素序列。然后如上从合成的基因表达重组毒素。
实施例4重组艰难梭菌二元毒素的纯化
艰难梭菌二元毒素片段A和B的氨基酸序列分别显示在Seq ID 5和6中。具有对于任何需要的表达宿主(例如,大肠杆菌、巴斯德毕赤酵母)的密码子偏倚的编码这些肽的基因是商业上可获得的。使用标准的分子生物学方法(例如Sambrook等人1989,Molecular Cloning a LaboratoryManual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)从这些基因表达肽并通过疏水相互作用色谱、离子交换色谱和陶瓷羟基磷灰石色谱的组合纯化所得的可溶性的表达肽。可以使用对蛋白纯化领域来说熟知的替代的色谱技术,例如尺寸排阻色谱和/或亲和色谱。
将重组片段与亲和纯化标签(例如,组氨酸-6、strep标签)一起表达,诸如在pET vector Expression System Manual,第11版,Merck KGaA出版,Darmstadt,Germany中所描述的(以其整体并入本文)。纯化二元毒素组分的细节描述于Sundriyal等人.2010(Protein Expression&Purification 74:42-48),其以其整体并入本文。
利用商业上可获得的表达载体诸如pET52b可将肽与组氨酸-6纯化标签一起表达以提高溶解度,并通过柱上再折叠技术再折叠,如Lia等人的综述和其中所含的参考文献(Lia M等人(2004)Protein Expression&Purification 33,1-10)中所描述的,其通过引用并入本文。
实施例5艰难梭菌毒素A和B的类毒素的制备
将浓度为0.2-2mg/ml的纯化的艰难梭菌毒素针对适宜的缓冲液(例如,含有150mM NaCl的10mM Hepes缓冲液pH 7.4)透析,然后添加终浓度为0.05%至0.5%的甲醛并在35℃下孵育1至25天。孵育后,通过透析移除甲醛。不同的肽之间用甲醛处理的条件可以稍微变化,并且最终的条件基于保护功效评估结果来细调。
实施例6抗血清的制备
在制备抗血清期间要考虑大量常规因素以达成最佳的体液抗体应答。这些因素包括:动物的品种;佐剂的选择;免疫位点的数目和位置;免疫原的数量;给药的次数和给药之间的间隔。
这些参数的常规优化,通常获得超过6g/L血清的特异性抗体水平。
对于绵羊,将含有10至500μg艰难梭菌抗原的2ml缓冲液与2.6ml弗氏佐剂混合。完全形式的佐剂用于初次免疫,不完全弗氏佐剂用于所有的后续加强。佐剂混合持续进行几分钟以确保稳定的乳液。使用约4.2ml的抗原/佐剂混合物来通过肌内注射免疫每只绵羊并覆盖了包括颈部和所有上肢的6个位点。每28天进行重复。在每次免疫后的14天取血液样品。一旦达到了足够的抗体水平,将更大体积(10ml/kg体重)采入无菌袋中。缓慢旋转袋子以加速凝血,以4500×g离心30分钟并在无菌条件下移出血清并合并。从群体中移出对需要的艰难梭菌抗原显示低效价的任何动物。
实施例7毒素型0的毒素A和B的抗血清的制备
按照实施例1中所描述的制备来自毒素型0菌株(例如,VPI 10463)的毒素A和B。可选地,毒素A或B可按照Yang等人所描述的重组方法(Yang G,Zhou B,Wang J,He X,Sun X,Nie W,Tzipori S,Feng H(2008)Expression of recombinant Clostridium difficile toxin A and B in Bacillusmegaterium.BMC Microbiol.8:192)制备。可如实施例5中所描述地对纯化的毒素制备类毒素。
对于用类毒素A或B免疫绵羊,将含有10至500μg的艰难梭菌类毒素A或B的2ml缓冲液与2.6ml弗氏佐剂混合。完全形式的佐剂用于初次免疫,不完全弗氏佐剂用于所有的后续加强。佐剂混合持续进行几分钟以确保稳定的乳液。混合后,使用大约4.2ml的抗原/佐剂混合物来通过肌内注射免疫每只绵羊并覆盖了包括颈部和所有上肢的6个位点。每28天进行重复并且在每次免疫后14天收集血清样品。一旦达到了足够的抗体水平,将更大的生产样品(10ml/kg体重)采入无菌袋中。缓慢旋转袋子以加速凝血,以4500×g离心30分钟并在无菌条件下移出血清并合并。将对毒素A或B显示低效价的任何动物从群体中略去。
实施例8利用体外细胞测定评估抗血清对毒素的中和效力
通过利用Vero细胞进行细胞毒性测定来测量抗艰难梭菌毒素抗血清的毒素中和活性。将固定量的纯化的艰难梭菌毒素A或毒素B与多种稀释度的抗体混合,在37℃下孵育1小时,然后应用于生长在24孔组织培养板上的Vero细胞。毒素A和B均具有导致Vero细胞在24-72小时的期间内特征性变圆的细胞毒活性。在存在中和抗体时,这种活性被抑制并且抗体制剂的中和强度通过中和指定量的毒素A或B的作用所需的稀释度来评估。
显示羊抗体对艰难梭菌毒素A的中和活性的数据示于表2中。在该实验中,将多种稀释度的羊抗体与终浓度为50ng/ml的毒素A混合并在37℃下孵育1小时,然后应用于上述Vero细胞并在37℃下孵育,在24-72小时期间监测。计算保护细胞抵抗毒素A的细胞毒作用的抗体稀释度。表2显示免疫14周的绵羊具有16000的中和效价(即,1/16000稀释度的血清保护细胞免于毒素A的细胞毒作用)。
表2针对甲醛处理的毒素A产生的羊抗体的中和效价:
在细胞中和测定中中和50ng/ml毒素A所需的血清的稀释度
对于由毒素B(类毒素)产生的抗血清,每四周向每个动物施用250μg/剂量的一次免疫的14周方案导致了具有>1/10000的抗血清效价的抗血清(使用0.5ng/ml的固定浓度的毒素B)。
表3针对甲醛处理的毒素B产生的羊抗体的中和效价:
这些数据显示如通过Vero细胞的细胞毒性测定所测量的,类毒素B抗原的较高的免疫剂量导致更好的羊毒素-中和免疫应答。这些测定描述于实施例8中。
艰难梭菌类毒素B的免疫剂量(μg) |
在细胞测定中针对毒素B的中和效价* |
绵羊抗类毒素B(10μg) |
1/1280 |
绵羊抗类毒素B(50μg) |
1/2560 |
绵羊抗类毒素B(250μg) |
1/10240 |
所有动物被给予2剂量的甲醛处理的毒素B
*在细胞中和测定中完全中和0.5ng/ml毒素B所需的血清的稀释度
表4、5和6显示了通过用来源于毒素A和B的类毒素进行免疫可在绵羊中获得每毫升血清非常高的毒素中和效价(>20,000)单位。这些效价显著高于先前在其他物种中报道的效价。
表4利用不同剂量甲醛处理的毒素A产生的羊抗体的中和效价
数据显示了在延长的免疫时间段之后,利用不同的类毒素剂量可在绵羊中获得非常高的效价。这些测定描述于实施例8中。
在细胞中和测定中中和50ng/ml的毒素A所需的血清的稀释度
表5针对甲醛处理的毒素B产生的羊抗体的中和效价
数据显示了在延长的免疫时间段250μg类毒素B抗原的免疫剂量导致非常高的毒素中和效价。这些测定描述于实施例8中。
*在细胞中和测定中完全中和0.5ng/ml毒素B所需的血清的稀释度
表6通过针对甲醛处理的毒素A和B免疫获得的纯化的IgG的中和效价
数据显示了通过利用辛酸对其他蛋白进行沉淀从羊抗血清得到的纯化的IgG的高毒素中和效价
实施例9利用免疫亲和柱定量血清中针对艰难梭菌毒素的特异性抗体的量
柱制备
称重CNBr-激活的琼脂糖凝胶4FF(Sepharose 4Fast Flow)(0.5g干重)放入适宜的清洁容器(玻璃或塑料的)中。添加约10ml稀盐酸(1mM)以使凝胶膨胀,并且在20-30分钟后,将凝胶转移到10-mL玻璃柱中并再用20mL的HCl(1mM)洗涤,随后用20mL的偶联缓冲液(碳酸氢钠,100mM,pH 8.3,含有500mM氯化钠)洗涤。用偶联缓冲液将浓度为1mg/mL的毒素(毒素A、毒素B或二元毒素片段)溶液(1mL)稀释至5mL并添加至含有激活的凝胶的柱中,并轻轻混合内容物直到凝胶重悬,在室温下旋转过夜(16-18小时)。然后排空柱并添加5ml阻断试剂(乙醇胺溶液,1M),轻轻混合并在室温下旋转2小时。接着,先后用20mL偶联缓冲液和20mL洗脱缓冲液(甘氨酸溶液100mM,pH 2.5)洗涤柱。重复该步骤两次。最后用20mL的测定缓冲液(含有500mM氯化钠和终浓度为1g/L的叠氮化钠的磷酸钠缓冲液,10mM,pH 7.4)洗涤柱并在2-8℃下储存在3-5mL的测定缓冲液中直到使用。
柱评估
在使用前通常评估柱的特异性结合和非特异性能力。从冰箱中取出柱并使其在室温下平衡,然后用25mL测定缓冲液洗涤。将递增体积的产物(全抗血清、纯化的IgG、Fab或F(ab′)2)分别加载到柱上并在室温下轻轻翻转混合1小时。用25mL测定缓冲液洗去未结合级分并且然后用20ml洗脱缓冲液(甘氨酸缓冲液100mM,pH 2.5)将结合级分从柱洗脱。洗脱的级分的蛋白含量以分光光度法在280nm利用关于产物的消光系数来确定,关于产物的消光系数即对于绵羊IgG为1.5(Curd等人,1971)或对于绵羊Fab和F(ab′)2为1.4(Allen,1996)。通过将洗脱蛋白的量针对加载体积绘图来获得饱和曲线。
使用免疫前正常绵羊血清(NSS)评估非特异性结合(NSB)。因此,必须区分这种结合与由于正常血清中某些特异性抗体引起的结合(因为所有动物都将暴露于艰难梭菌)。图1展示典型的结合能力曲线,该曲线显示了由于增加抗血清加载体积所引起的特异性结合增高。随着加载体积的增加,非特异性结合(NSB)有少量改变。0.5g(1.5-2.0mL膨胀的凝胶)含有1mg毒素(偶联率为2mg/g)对于加载的特异性抗血清的体积(0.5-4mL)是足够的。关于此,为了容易和方便计算,1ml是推荐的加载体积。
10个重复的变异系数(在测定之间的CV)为约6%。随着时间推移柱容量没有降低(在使用80-100次时所估计的)。这表明没有毒素从柱中浸出。
用于产物评估的亲和柱
该柱用于过程中的产物和终产物即全抗血清、纯化的IgG、Fab和F(ab′)2的GMP/GLP评估。其还用于评估和监测被免疫动物的免疫应答以及检测人类样品中的抗毒素抗体。
从冰箱中取出柱并使其在室温下平衡,然后用25mL测定缓冲液洗涤。将产物(1mL)添加到柱中并在室温下轻轻翻转混合1小时,然后用25mL测定缓冲液(含有500mM氯化钠和终浓度为1g/L的叠氮化钠的磷酸钠缓冲液,10mM,pH 7.4)洗掉未结合级分。然后用20ml洗脱缓冲液(甘氨酸缓冲液100mM,pH 2.5)洗脱结合级分并且使用关于产物的消光系数以分光光度法在280nm确定其蛋白含量。图2显示来自用毒素A的类毒素免疫的绵羊的血清的分析。
实施例10针对胰蛋白酶/糜蛋白酶的抗体抑制剂的制备
适宜的抗原可通过例如以下的方案(a)或(b)来制备。
(a)用天然的和/或类毒素化的胰蛋白酶和糜蛋白酶进行的免疫
人类胰蛋白酶-1、胰蛋白酶-2和糜蛋白酶是商业获得的。这些酶被透析到适宜的缓冲液诸如含有150mm NaCl的MES(50mM,pH 6.0)中,并通过添加0.2%的甲醛然后在4至37℃之间孵育1至14天而进行类毒素化。
(b)用重组的胰蛋白酶和糜蛋白酶进行的免疫
主要的人类胰蛋白酶和糜蛋白酶的氨基酸序列分别显示于SEQ ID 7、8和9中。例如,通过将标下划线的残基的一个或多个(例如,组氨酸、天冬酰胺、丝氨酸)替换为诸如丙氨酸(或其保守性置换)的氨基酸残基来提供催化上失活的抗原。具有对于任何需要的表达宿主(例如,大肠杆菌、巴斯德毕赤酵母)的密码子偏倚的编码这些修饰的胰蛋白酶肽和糜蛋白酶肽的基因是商业上可获得的。利用标准的分子生物学方法(例如Sambrook等人1989,Molecular Cloning a Laboratory Manual,第二版,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)从这些基因表达肽并通过疏水相互作用色谱、离子交换色谱和陶瓷羟基磷灰石色谱的组合纯化所得的可溶性的表达肽。可使用对于蛋白纯化领域来说熟知的替代的色谱技术,例如尺寸排阻色谱和/或亲和色谱。
还可将重组片段与亲和纯化标签(例如,组氨酸-6、strep标签)一起表达,诸如在pET vector Expression System Manual,第11版,Merck KGaA出版,Darmstadt,Germany中所描述的。
利用商业上可获得的表达载体诸如pET52b可将肽与组氨酸-6纯化标签一起表达以提高溶解度,并通过柱上再折叠技术再折叠,如Lia等人的综述和其中所含的参考文献(Lia M等人(2004)Protein Expression&Purification 33,1-10)中所描述的,其通过引用并入本文。
单独地或以不同组合使用以上的抗原通过以下的方法来生成抗体。关于在绵羊中制备抗体,将包含10到500μg胰蛋白酶抗原和/或糜蛋白酶抗原的2ml缓冲溶液与2.6ml的弗氏佐剂混合。完全形式的佐剂用于初次免疫,不完全弗氏佐剂用于所有的后续加强。佐剂混合持续进行几分钟以确保稳定的乳液。使用约4.2ml的抗原/佐剂混合物来通过肌内或皮内注射免疫每只绵羊并覆盖了包括颈部和所有上肢的6个位点。每28天进行重复。在每次免疫后的14天取血液样品。一旦达到了足够的抗体水平,将更大体积(10ml/kg体重)采入无菌袋中。缓慢旋转袋子以加速凝血,以4500×g离心30分钟并在无菌条件下移出血清并合并。从群体中移出对需要的艰难梭菌抗原显示低效价的任何动物。
实施例11从蛋清制备胰蛋白酶和/或糜蛋白酶抑制剂
蛋清仅含有痕量的脂质和碳水化合物,并主要由蛋白组成。含有主要的蛋白酶抑制剂卵类粘蛋白和卵固蛋白的蛋白级分可容易地通过沉淀或通过标准蛋白纯化方法诸如离子交换色谱和尺寸排阻色谱获得。在一个这样的方法中,将蛋的蛋清与蛋黄分离并悬浮于2体积的包含1mM EDTA的含1%NaCl的50mM Tris-HCl(pH 7.5)中并利用超声破碎仪使其均质化,然后在15,000×g下离心20分钟。然后将上清液针对10mM Tris-HCl缓冲液,pH 7.5进行透析,并应用于Q琼脂糖柱。用含有具有从0M至0.5M的线性梯度的NaCl的10mM Tris-HCl缓冲液洗脱柱以获得蛋白酶抑制剂的不同的峰。可任选地将含有针对胰蛋白酶和糜蛋白酶的蛋白酶抑制剂活性(如在实施例12和13中所评估的)的粗制的或纯化的蛋白级分组合以产生富集的蛋白酶抑制剂蛋白混合物。
在其他方法中,通过利用诸如丙酮的多种剂对蛋清蛋白质进行沉淀(Lineweaver&Murray(1947)J.Biol.Chem.171,565-581)或通过利用高达70%的硫酸铵进行沉淀容易地获得蛋清蛋白酶抑制剂的浓缩的混合物。可选地,蛋清蛋白酶是商业上可获得的。
实施例12胰蛋白酶的蛋白水解活性的抑制的证明
利用L-BAPNA测定测量胰蛋白酶活性:该方法基于在存在和不存在抑制剂时,苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯胺(DL-BAPNA)被给定浓度的胰蛋白酶分解的分解产物的分光光度确定(Kakade等人,1974),其以其整体通过引用并入。
材料
测定缓冲液:含有0.02M CaCl2的Tris-缓冲液(0.05M,pH 8.2)。
底物溶液:将盐酸苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯胺(DL-BAPNA)(10mg)溶于0.2mL的二甲基亚砜(DMS)中并利用测定缓冲液稀释到20mL。每天制备该溶液并贮存在37℃下直至使用。
胰蛋白酶溶液(0.2mg/mL:将胰蛋白酶40mg溶于200mL的稀HCl(0.001M)中。溶液可在2-8℃下贮存2周。
终止溶液:通过将冰乙酸(30mL)与蒸馏水(70mL)混合来制备乙酸溶液(30%v/v)。
程序
将不同体积的胰蛋白酶抑制剂(例如,抗体,或蛋清,或蛋清衍生物或初乳)移吸到重复的检验管组中并用测定缓冲液调节至1mL。对照样品含有相等的蛋白浓度的非特异性蛋白或抗体。将胰蛋白酶溶液添加到每个管,然后加入1mL的DL-BAPNA溶液。在室温下孵育5分钟之后,通过添加0.5mL的终止溶液来终止反应,并用分光光度法测量每个管在410nm处的吸光度。通过在底物溶液之前添加终止溶液来制备空白样品。
发现含有有效的胰蛋白酶抑制剂的检验样品抑制DL-BAPNA的分解且因此与对照样品相比较在410nm处吸光度增高。
不同的抑制剂制备物(例如,蛋清和初乳)中胰蛋白酶中和活性的证明
试剂
将鸡蛋清与蛋黄人工分离并将鸡蛋清与测定缓冲液(Tris-缓冲液,0.05M,pH8.2,含有0.02M CaCl2)以1∶1的比率进行稀释。从火鸡蛋清(Sigma UK)和牛初乳(Colostrum UK ltd)试剂中分别制备在测定缓冲液中浓度为0.4g/L和100g/L的高度纯化的II型胰蛋白酶抑制剂。
程序
将不同体积的胰蛋白酶抑制剂(鸡蛋清,火鸡蛋清II型胰蛋白酶抑制剂,正常羊血清;牛初乳)移吸到重复的检验管组中并用含有0.02M CaCl2的Tris-缓冲液(0.05M,pH 8.2)调节至1mL。在1mM盐酸中制备胰蛋白酶溶液(0.2mg/ml)并将1ml添加到每个管中,然后添加1ml DL-BAPNA溶液(0.5mg/ml)。在室温下孵育5分钟后,通过添加0.5ml的乙酸溶液(30%v/v)终止反应并用分光光度法测量每个管在410nm处的吸光度。通过在底物溶液之前添加终止溶液来制备空白样品。
对于含有初乳的管,以等体积添加硫酸钠溶液(360g/l)并在3500rpm下离心45分钟以沉淀出酪蛋白。收集每个管的上清液并如上测量吸光度。
结果
在包括羊血清、牛初乳和鸡蛋清和火鸡蛋清的全部所检验的制备物中证明了对胰蛋白酶活性的抑制(图3)。胰蛋白酶抑制是由于这些制备物中存在的内在抑制剂。
通过径向蛋白酶扩散证明初乳对胰蛋白酶的抑制
该技术用来测量初乳的胰蛋白酶抑制活性。通过以下来制备扩散平板:在沸水浴中将0.5g琼脂(Bio-Rad)溶于50ml的测定溶液(Tris-缓冲液,0.05M,pH 8.2;含0.02M CaCl2)中,冷却至60℃并添加含酪蛋白或初乳悬浮液(20g/l)的50ml的测定缓冲液以得到10g/L的终浓度。将温暖的悬浮液倾倒在90cm塑料平板中以产生2.5mm厚的层,允许其在室温下在潮湿的室中凝固2小时。打出直径5mm的孔并将20μL不同的猪胰蛋白酶浓度(6.25、12.5、25和50mg/L)加载到每个孔。将平板在室温下(22℃)在潮湿的室中孵育24小时。测量由胰蛋白酶扩散和酪蛋白的消化导致的透明环的直径(d2mm2)并针对胰蛋白酶浓度绘图(图4)。
结果显示浓度10g/L的初乳抑制了所检验的浓度的胰蛋白酶的蛋白水解活性。
在鸡蛋清存在时保护羊免疫球蛋白免于被胰蛋白酶消化
通过辛酸纯化羊IgG,并将其以25g/L配制到柠檬酸钠盐溶液缓冲液pH 6.0中。将猪胰蛋白酶溶于1mM盐酸中至2g/L的浓度,并将其以总蛋白的5%w/w的浓度添加到羊IgG中。添加利用0.05M,pH 8.2;含0.02MCaCl2的Tris-缓冲液以1∶1的比率稀释的等体积的鸡蛋清,并将混合物在37℃下孵育2小时。通过尺寸排阻凝胶过滤(FPLC)监测消化。
结果显示了鸡蛋清完全保护IgG免于被胰蛋白酶的消化。对照实验已证明了在这些实验条件下和在鸡蛋清不存在时,胰蛋白酶完全消化IgG为Fab和小片段。
实施例13糜蛋白酶的蛋白水解活性的抑制的证明
通过测量由苯甲酰-L-酪氨酸乙酯的水解产生的256nm处的吸光度的增高确定蛋白酶反应速度。在指定的条件下在pH 7.8和25℃下,1单位每分钟水解1微摩尔苯甲酰-L-酪氨酸乙酯(BTEE)。
试剂
含0.1M氯化钙的0.08M Tris·HCl缓冲液,pH 7.8
含0.00107M苯甲酰-L-酪氨酸乙酯(BTEE)的50%w/w甲醇(将63ml无水甲醇添加到50ml试剂级水中)
将酶以1mg/ml溶解到0.001N HCl中。在0.001N HCl中稀释至10-30μg/ml以用于测定。
程序
调节分光光度计至256nm和25℃。
将不同体积的胰蛋白酶抑制剂(例如,抗体,蛋清衍生物或初乳)移吸到重复的检验管组中并用测定缓冲液(0.08M Tris·HCl缓冲液,pH 7.8,含0.1M CaCl2)调节至1.5mL。对照样品含有相等的蛋白浓度的非特异性蛋白或抗体。
向以上中添加1.4ml的0.00107M BTEE。
在25℃下在分光光度计中孵育4-5分钟以获得温度平衡并记录空白比率(若存在)。添加0.1ml的适当稀释的酶并持续4-5分钟记录256nm处吸光度的增高。从曲线的起始线性部分计算ΔA256/分钟。
发现含有效的糜蛋白酶抑制剂的检验样品抑制DL-BAPNA的裂解并因此与对照样品相比较在256nm处吸光度的增高。
实施例14含针对胰蛋白酶和糜蛋白酶的抗体抑制剂的制剂的制备
当口服递送时有效预防和治疗CDI的抗体的制剂可含有以下组分:
-针对艰难梭菌毒素A和/或B的羊抗体
-任选地,针对艰难梭菌二元毒素的羊抗体
-具有针对人类胰蛋白酶的抑制活性的羊抗体和/或具有针对人类糜蛋白酶的抑制活性的羊抗体
-任选地,协助中和胃酸的解酸剂组分
-任选地,使混合物更适口的调味剂诸如增甜剂
详细地,典型制剂含有:
-5-50mg/ml针对毒素A和/或B的羊抗体
-任选地,5-50mg/ml针对二元毒素的羊抗体
-5-50mg/ml胰蛋白酶和/或糜蛋白酶的抗体抑制剂
-任选地,例如浓度0.05至0.5M的解酸剂组分(例如,氢氧化镁或碳酸氢钠)
-任选地,调味剂(例如,增甜剂)诸如香草精
实施例15基于胰蛋白酶和/或糜蛋白酶的药品(例如,蛋来源的)抑制剂的制剂的制备
当口服递送时有效预防和治疗CDI的抗体的制剂含有以下组分:
-针对艰难梭菌毒素A和/或B的羊抗体
-任选地,针对艰难梭菌二元毒素的羊抗体
-如实施例11中所描述的来自鸡蛋的含有针对胰蛋白酶和糜蛋白酶的蛋白酶抑制剂的粗制的或纯化的蛋白级分
-任选地,协助中和胃酸的解酸剂组分
-任选地,使混合物更适口的调味剂诸如增甜剂
详细地,典型的制剂含有:
-5-50mg/ml针对毒素A和/或B的羊抗体
-任选地,5-50mg/ml针对二元毒素的羊抗体
-5-50mg/ml浓度的鸡蛋清来源的蛋白酶抑制剂(如实施例11中所描述纯化的)
-任选地,例如0.05至0.5M浓度的解酸剂组分(例如,氢氧化镁或碳酸氢钠)
-任选地,调味剂(例如,增甜剂)诸如香草精
实施例16牛初乳-羊抗体制剂的制备
可以以下几种方式制备含牛初乳的羊抗体制剂:
通过将液体牛初乳与羊IgG的溶液混合。
通过将冻干的或干燥的牛初乳与液体IgG混合。
通过将液体牛初乳与冻干的羊IgG混合。
通过将冻干的或干燥的牛初乳与冻干的羊IgG混合并用水或缓冲盐溶液重构至需要的浓度。
在以上的制剂中,初乳组分具有在其起始浓度的10%和90%之间的终浓度。理想地,IgG的终浓度在10-50mg/ml之间。
当口服递送时有效预防和治疗CDI的抗体的制剂含有以下组分:
-针对艰难梭菌毒素A和/或B的羊抗体
-任选地,针对艰难梭菌二元毒素的羊抗体
-具有在其起始浓度的10%和90%之间的终浓度的初乳组分
-任选地,协助中和胃酸的解酸剂组分
-任选地,使混合物更适口的调味剂诸如增甜剂
详细地,典型的制剂含有:
-5-50mg/ml针对毒素A和/或B的羊抗体
-5-50mg/ml针对二元毒素的羊抗体
-具有在其起始浓度的10%和90%之间的终浓度的初乳组分
-任选地,例如0.05至0.5M浓度的解酸剂组分(例如,氢氧化镁或碳酸氢钠)
-任选地,调味剂(例如,增甜剂)诸如香草精
实施例17用聚乙二醇或葡聚糖修饰的抗体的制备
以多种方式将聚乙二醇(PEG)或葡聚糖分子连接至抗体,所述方式可单独地使用或组合使用。
N-羟基琥珀酰亚胺PEG衍生物允许经由氨基连接至羊IgG。为进行这些反应,将新鲜制备的含N-羟基琥珀酰亚胺PEG的水成缓冲液(HEPES50mM,pH6.5和8.0之间)与IgG溶液混合(5-100mg/ml),在37℃下持续多达3小时,或在4℃下持续多达24小时。
羧基聚乙二醇化:在温和酸性pH下通过EDEC(N-(3-二甲基氨丙基)-N′-乙基碳二亚胺,盐酸盐)激活之后,抗体的羧基基团易于与PEG-酰肼反应,而存在于所有试剂中的氨基在这些特定条件下保持无活性。
经由碳水化合物(PEG酰肼与由寡糖残基的高碘酸盐氧化形成的醛基反应而形成腙。
利用以上的偶联方法,将不同的分子量(500-40000Da)的PEG以每抗体分子2-20PEG分子的比率偶联于IgG。
葡聚糖提供了作为衍生剂的PEG的替代,且其可以一系列的分子大小(500-40000Da)来提供,利用高碘酸钠产生葡聚糖的聚醛衍生物可将其以每抗体分子2-20葡聚糖分子的比率与IgG共价连接。与PEG化学不同地,每个葡聚糖部分可在抗体上的一个以上的位点连接。关于葡聚糖的修饰,可使用与以上关于聚乙二醇化所描述的非常相似的策略,并且这些策略由Hermanson所描述(Hernamson,GT(1996)Bioconjugate Techniques,Academic Press)。
如实施例8中所描述的在细胞测定中通过其中和毒素A、B或二元毒素的能力来测量聚乙二醇化的或葡聚糖衍生的IgG制备物的生物活性。利如实施例21中所描述的利用模拟的胃条件和肠条件评估聚乙二醇化的或葡聚糖衍生的IgG的稳定性。这些评估,与体内效力研究相组合,用于优化以上的聚乙二醇化条件而提供具有针对消化环境的需要的稳定性的IgG制剂。
抗体的生物活性(毒素中和活性)的保留将要针对其免于消化环境的保护折中。聚乙二醇化或葡聚糖衍生条件优先地导致活性的IgG到肠道的最高的总递送。
实施例18用丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸(Eudragit)的共聚物包衣抗体
在配制用于口服递送的羊抗体的一个方法中,首先通过与玉米淀粉粉末混合将抗体制成小颗粒。在该方法中,以约1份IgG比4份淀粉的比率将纯化的羊抗体IgG与玉米淀粉混合。然后在颗粒机中(例如,YokomizoGranular model FR160x60)在20-37℃的温度下,在60-90%的湿度下持续2至15分钟使该混合物成颗粒状以提供直径为1-4mm之间的颗粒。在该程序的第二步步骤中,通过浸入到PEG(选自分子量范围3000-10000)的PEG水溶液(3-10%)中且然后在37℃下空气干燥来密封IgG颗粒。在该程序的最终步骤中,用Eudragit(例如,Eudragit L100-55;Rohm GmbH,Germany)的溶液包衣密封的IgG颗粒。为此,通过将聚合物缓慢地添加到水中并添加NaOH以部分地中和5-15%的羧基来制备Eudragit L100-55(10-20%之间)的水溶液。然后通过重复浸入并在37℃下空气干燥在聚合物溶液中包衣PEG包衣的IgG颗粒以得到5-40%(w/w)之间的最终聚合物包衣。
如实施例21中所描述的利用模拟的胃条件和肠条件评估包衣的IgG的稳定性。这些评估,与体内效力研究相组合,可用于优化以上的包衣条件而提供具有针对消化环境的需要的稳定性的IgG制剂。
实施例19用藻酸盐/壳聚糖的共聚物包衣抗体
通过与由Esquisabel等人(J.Microencapsul,14:627-638;1997)所描述的相似的方法来制备藻酸盐/壳聚糖微胶囊,其以其整体通过引用并入。在该方法中,将水中的含0.2%(w/v)氯化钙的2%(w/v)藻酸盐添加到纯化的羊IgG中(终浓度0.1-20mg/ml)。混合后,将该水相与油相(例如,含0.2%吐温80的大豆油)以1份水比10份油相的比率混合并乳化5-10分钟。在将pH调节到约pH 5之后,搅拌混合物15分钟直至胶凝反应完全进行。向该悬浮液中添加水/正己烷(80∶20)混合物并使抗体微胶囊分配至水相。分离该水相并将其以不同的比例添加到含0.1-10%(w/v)壳聚糖溶液的1%的catic acid溶液中并使之反应30分钟,然后过滤并干燥。
然后如实施例21中所描述的利用模拟的胃条件和肠条件评估包衣的IgG的稳定性。这些评估,与体内效力研究相组合,用于优化以上的包衣条件而提供具有针对消化环境的需要的稳定性的IgG制剂。
实施例20用果胶包衣抗体
如由Munjeri等人(Drug Delivery 5:239-241;1998)所描述的形成果胶珠。通过高速混合制备含酰胺化的低甲氧基果胶的溶液(4%w/v)。通过将果胶与抗体以从200∶1到10∶1(果胶比抗体)的不同的比率相组合并将溶液滴加到氯化钙的溶液(约2%w/v)中来制备酰胺化的果胶-抗体珠。通过直径范围从1-5mm的管抽吸溶液并空气干燥所得的珠和将其在4℃贮存。
实施例21利用模拟的胃条件和肠条件评估抗体制剂对消化酶的稳定性
通过暴露于模拟的胃条件来评估制剂的胃稳定性。如美国药典(UnitedStated Pharmacopeial Convention Council of Experts(2004)27,第22卷第2728页)中所描述的制备这些条件,其以其整体并入,且这些条件由pH 1.2的含3.2mg/ml胃蛋白酶的30mM NaCl构成。将抗体制剂与该溶液以1份胃蛋白酶溶液比250份抗体溶液的比率混合,并在37℃下孵育不同的时间(例如,0-360分钟)。在该时间结束后,如实施例8中所描述的关于毒素A/B中和效力评估抗体的完整性。还在SDS PAGE凝胶上评估了150kDa抗体分子的降解,在所述SDS PAGE凝胶上可相对于未处理的对照样品定量完整的150kDa的量。
通过暴露于模拟的肠条件来评估制剂的肠稳定性。如美国药典(UnitedStated Pharmacopeial Convention Council of Experts(2004)27,第22卷第2728页)中所描述的制备这些条件,其以其整体并入,且所述这些条件由pH 6.8的含10mg/ml胰酶的50mM磷酸钾缓冲液构成。将抗体制剂与该溶液以1份胰酶溶液比50份抗体溶液的比率混合,并在37℃下孵育不同的时间(例如,0-360分钟)。在该时间结束后,如实施例8中所描述的关于毒素A/B中和效力评估抗体的完整性。还在SDS PAGE凝胶上评估了150kDa抗体分子的降解,在所述SDS PAGE凝胶上可相对于未处理的对照样品定量完整的150kDa的量。
还使用以上模拟的胃条件和肠条件的组合来评估抗体制剂的稳定性。在该情况中,在用胃蛋白酶溶液处理之后,在如上所述添加胰酶溶液之前通过添加例如0.1M碳酸氢钠溶液或0.1M Tris-HCl将混合物的pH提高到6.8。
实施例22羊抗体预防CDI的体内效力的评估
为证明抗体在体内预防CDI的效力,向叙利亚仓鼠口服施用抗体制剂。为评估预防性制剂的效力,从用艰难梭菌攻击前96小时到攻击后240小时在不同的时间向仓鼠口服施用(高达0.5ml)抗体。
在施用制剂过程中,通过给予广谱抗生素(例如,克林霉素)且然后12-72小时后通过经口用艰难梭菌孢子进行攻击在仓鼠中诱导CDI。然后对于艰难梭菌相关疾病的症状观测动物长达15天。对照,即未处理的动物发生疾病的征兆(例如,腹泻、腹胀、嗜睡、皮毛起皱),而用羊抗体制剂处理的那些动物表现正常或仅发生轻微的疾病症状。
实施例23羊抗血清治疗CDI的体内效力的评估
为证明抗体在体内治疗CDI的效力,向叙利亚仓鼠口服施用抗体制剂(如实施例15和16中所描述的)。为评估治疗制剂的效力,从用艰难梭菌攻击后6小时到攻击后240小时在不同的时间向仓鼠口服施用(高达0.5ml)抗体。
在施用制剂之前,通过给予广谱抗生素(例如,克林霉素)且然后12-72小时后通过经口用艰难梭菌孢子进行攻击在仓鼠中诱导CDI。然后对于艰难梭菌相关疾病的症状观测动物长达15天。对照,即未处理的动物发生疾病的征兆(例如,腹泻、腹胀、嗜睡、皮毛起皱),而用羊抗体制剂处理的那些动物表现正常或仅发生轻微的疾病症状。
体内实验1——在解酸剂存在下口服递送抗体
目的:
为评估口服施用的针对毒素A和B的羊抗体的混合物保护免于通过艰难梭菌孢子(菌株VPI 10463)的攻击诱导的CDI的效力。评估了两个不同的剂量水平,所述两个不同的剂量水平在第0天施用一次,且然后在4天中每天施用2次。
方法
使用了3组动物:
组1和2——其被分为10只动物的“检验亚组”和4只动物的“对照亚组”(其未接受孢子攻击)。
组3——10只动物的“检验亚组”
组1——检验组和对照组接受含0.1M碳酸氢钠(在临给药之前添加碳酸氢钠至0.1M)的PBS
组2——检验组和对照组接受含0.1M碳酸氢钠的1∶1比率的羊抗体A+B混合物(在临给药之前添加碳酸氢钠至0.1M)。以1∶1比率使用羊抗-毒素A-批号CDA000185和羊抗-毒素B-批号CDB000229。最终抗体浓度为45mg混合物每毫升。仓鼠每天接受45mg抗体。
组3——检验组和对照组接受含0.1M碳酸氢钠的1∶1比率的羊抗体A+B混合物(在临给药之前添加碳酸氢钠至0.1M)。以1∶1比率使用羊抗-毒素A-批号CDA000185和羊抗-毒素B-批号CDB000229并用PBS将其稀释5倍。最终抗体浓度为9mg混合物每毫升。仓鼠每天接受9mg抗体。
口胃施用克林霉素(0.2ml的10mg/ml溶液)和艰难梭菌VPI 10463孢子(0.2ml剂量中250cfu)。
体内实验1的给药时间表(所有剂量均口胃施用)
结果和结论
存活数据显示于图5中。对照组显示了严重CDI的快速发作,且所有动物在攻击后3天内死于严重疾病。
口服施用的抗体混合物提供了对疾病的发作速率的保护。在攻击后第4天,在PBS对照组(组1)中的100%的动物已死于疾病时,在低抗体剂量组(组3)和高抗体剂量组(组2)中分别存活了30%和60%。
在实验终止时,与PBS对照组中的0%相比较,在两个抗体组中存活了20%的动物。在解酸剂剂量施用存在下口服施用的抗体提供了针对CDI的发作的一些保护。
体内实验2——在解酸剂存在下口服递送高抗体剂量
目的:
为评估口服施用的针对毒素A和B的羊抗体的混合物保护免于由艰难梭菌孢子(菌株VPI 10463)的攻击诱导的CDI的效力。在第0天施用该抗体一次且然后在4天中每天施用3次。
方法
使用了两组动物:
组1——被分为10只动物的“检验亚组”和4只动物的“对照亚组”(其未接受孢子攻击)。
组2——10只动物的“检验组”
组1——检验亚组和对照亚组不接受治疗
组2——检验组接受含0.1M碳酸氢钠的1.1比率的羊抗体A+B混合物的(在临给药之前添加碳酸氢钠至0.1M)。以1∶1比率使用羊抗-毒素A-批号CDA000264和羊抗-毒素B-批号CDB000229。最终抗体浓度为45mg混合物每毫升。仓鼠每天接受68mg抗体。
口胃施用克林霉素(0.2ml的10mg/ml溶液)和艰难梭菌VPI 10463孢子(0.2ml剂量中500cfu)。
结果和结论
存活数据显示于图6中。对照动物(组1)显示了严重CDI的相对缓慢的发作,且60%的动物在攻击后9天内死于严重疾病。用缓冲的液体抗体处理的组2动物(每天共68mg)在16天的实验时期未显示CDI的症状,且完全受到保护。在第17天一个动物死于疾病。总之,与对照组(组1)相比较组2中的动物存在对CDI的显著保护。
数据显示口服施用的羊抗体可预防和治疗CDI。
体内实验2的给药时间表(所有剂量均口胃施用)
体内实验3——口服递送肠溶包衣胶囊形式的抗体
目的:
为评估口服施用包囊形式的针对毒素A和B的羊抗体的混合物保护免于由艰难梭菌孢子(菌株VPI 10463)的攻击诱导的CDI的效力。
方法
使用了两组动物:
组1——被分为10只动物的“检验亚组”和4只动物的“对照亚组”(其未接受孢子攻击)。组2——10只动物的“检验组”
组1——检验组和对照组不接受治疗
组2——检验组接受肠溶包衣胶囊(Encap:批号244/15/1)。胶囊容纳有2种肠溶包衣(Eudragit+PEG400)以维持其通过胃和小肠的完整性。这些胶囊含有约10μl的1∶1比率的羊抗-毒素A-批号CDA000264和羊抗-毒素B-批号CDB000229的混合物。仓鼠每天接受约1.5mg的抗体混合物。
结果和结论
存活数据显示于图7中。向组2动物施用胶囊形式的小剂量的抗体(约1.5mg每天)。从该抗体剂量观察到一些保护。在攻击后第5天,当组1对照动物的40%死于严重疾病时,组2中90%是存活的。在实验结束后,与组1对照中的40%相比较组2胶囊处理的动物的60%存活。
体内实验3的给药时间表(所有剂量均口胃施用)
实施例24抗体制剂(药品)的临床应用
“风险中”患者组的预防性治疗
作为对CDI的预防,将对鉴定为“风险中”的患者用药品进行治疗。定义这种患者组的参数包括:
-住院
-超过65岁
-接受广谱抗生素
-CDI的既往史或与症状性病例非常接近
特别适合于口服抗体疗法的患者组包括:
-具有轻到中度疾病严重度者
-表现为无症状但认为其处于复发(可能由于一个或多个复发事件)的高风险者
-与爆发病例非常接近者
归入该类的患者将在长达2周的时期中被每天高达6次口服施用10-50ml药品的制剂。当治疗时无患者将发生CDI的症状。
实施例25口服递送的抗体和抗生素的组合的临床应用
如以下实施例中所详述的与标准抗生素疗法联合进行抗体的口服施用以治疗CDI。
一位患有复发性艰难梭菌感染的患者,CL女士,在安老院中时在治疗尿道感染的处方抗生素的疗程后发生腹泻。一些天之后她发生水性腹泻并被转移到医院中,在医院中在粪便样品中检测到毒素A和毒素B。该84岁老人被给予甲硝唑疗程并表现出完全康复。然而一些天之后她再次发生腹泻并且通过适当的程序再次诊断了CDI。万古霉素疗程导致了其腹泻的暂时停止,但在几天中,其第三次复发CDI。最后,通过逐渐减少的剂量的万古霉素之后口服施用羊多克隆抗体(500mg bd)4周疗程的组合而获得彻底痊愈。
实施例26系统递送的和口服递送的抗体制剂的组合的临床应用
当患者患有可导致肠阻塞的严重CDI时,应用系统递送的抗体和口服递送的抗体的组合。以下给出了这种使用的实例。
一位患有难治性艰难梭菌感染的患者,MN女士,是72岁的领养老金者,在轻度中风后被收住院。当其发生胸部感染需要抗生素时进行了顺利康复。10天之后她经历了严重腹泻伴轻度腹痛。在粪便样品中检测到了毒素A和毒素B二者,从其中培养了艰难梭菌,随后艰难梭菌显示为核糖核酸型027。随即诊断了其艰难梭菌感染(CDI),对MN女士给予了甲硝唑疗程。然而,虽然其症状改善了,其仍便水样粪便。万古霉素疗程也未彻底消退其CDI。艰难梭菌毒素仍存在于其粪便中,因而其接受了3次羊抗艰难梭菌毒素抗体的静脉内注射(隔天250mg)。组合地,其作为门诊患者(经由3周疗程)接受了口服羊抗体(500mg bd),并完全康复。
SEQ ID NO
SEQ ID NO:1艰难梭菌毒素A-毒素型0
MSLISKEELIKLAYSIRPRENEYKTILTNLDEYNKLTTNNNENKYLQLKKLNESIDVFMNKYKTSSRNRALSNLKKDILKEVILIKNSNTSPVEKNLHFVWIGGEVSDIALEYIKQWADINAEYNIKLWYDSEAFLVNTLKKAIVESSTTEALQLLEEEIQNPQFDNMKFYKKRMEFIYDRQKRFINYYKSQINKPTVPTIDDIIKSHLVSEYNRDETVLESYRTNSLRKINSNHGIDIRANSLFTEQELLNIYSQELLNRGNLAAASDIVRLLALKNFGGVYLDVDMLPGIHSDLFKTISRPSSIGLDRWEMIKLEAIMKYKKYINNYTSENFDKLDQQLKDNFKLIIESKSEKSEIFSKLENLNVSDLEIKIAFALGSVINQALISKQGSYLTNLVIEQVKNRYQFLNQHLNPAIESDNNFTDTTKIFHDSLFNSATAENSMFLTKIAPYLQVGFMPEARSTISLSGPGAYASAYYDFINLQENTIEKTLKASDLIEFKFPENNLSQLTEQEINSLWSFDQASAKYQFEKYVRDYTGGSLSEDNGVDFNKNTALDKNYLLNNKIPSNNVEEAGSKNYVHYIIQLQGDDISYEATCNLFSKNPKNSIIIQRNMNESAKSYFLSDDGESILELNKYRIPERLKNKEKVKVTFIGHGKDEFNTSEFARLSVDSLSNEISSFLDTIKLDISPKNVEVNLLGCNMFSYDFNVEETYPGKLLLSIMDKITSTLPDVNKNSITIGANQYEVRINSEGRKELLAHSGKWINKEEAIMSDLSSKEYIFFDSIDNKLKAKSKNIPGLASISEDIKTLLLDASVSPDTKFILNNLKLNIESSIGDYIYYEKLEPVKNIIHNSIDDLIDEFNLLENVSDELYELKKLNNLDEKYLISFEDISKNNSTYSVRFINKSNGESVYVETEKEIFSKYSEHITKEISTIKNSIITDVNGNLLDNIQLDHTSQVNTLNAAFFIQSLIDYSSNKDVLNDLSTSVKVQLYAQLFSTGLNTIYDSIQLVNLISNAVNDTINVLPTITEGIPIVSTILDGINLGAAIKELLDEHDPLLKKELEAKVGVLAINMSLSIAATVASIVGIGAEVTIFLLPIAGISAGIPSLVNNELILHDKATSVVNYFNHLSESKKYGPLKTEDDKILVPIDDLVISEIDFNNNSIKLGTCNILAMEGGSGHTVTGNIDHFFSSPSISSHIPSLSIYSAIGIETENLDFSKKIMMLPNAPSRVFWWETGAVPGLRSLENDGTRLLDSIRDLYPGKFYWRFYAFFDYAITTLKPVYEDTNIKIKLDKDTRNFIMPTITTNEIRNKLSYSFDGAGGTYSLLLSSYPISTNINLSKDDLWIFNIDNEVREISIENGTIKKGKLIKDVLSKIDINKNKLIIGNQTIDFSGDIDNKDRYIFLTCELDDKISLIIEINLVAKSYSLLLSGDKNYLISNLSNTIEKINTLGLDSKNIAYNYTDESNNKYFGAISKTSQKSIIHYKKDSKNILEFYNDSTLEFNSKDFIAEDINVFMKDDINTITGKYYVDNNTDKSIDFSISLVSKNQVKVNGLYLNESVYSSYLDFVKNSDGHHNTSNFMNLFLDNISFWKLFGFENINFVIDKYFTLVGKTNLGYVEFICDNNKNIDIYFGEWKTSSSKSTIFSGNGRNVVVEPIYNPDTGEDISTSLDFSYEPLYGIDRYINKVLIAPDLYTSLININTNYYSNEYYPEIIVLNPNTFHKKVNINLDSSSFEYKWSTEGSDFILVRYLEESNKKILQKIRIKGILSNTQSFNKMSIDFKDIKKLSLGYIMSNFKSFNSENELDRDHLGFKIIDNKTYYYDEDSKLVKGLININNSLFYFDPIEFNLVTGWQTINGKKYYFDINTGAALTSYKIINGKHFYFNNDGVMQLGVFKGPDGFEYFAPANTQNNNIEGQAIVYQSKFLTLNGKKYYFDNNSKAVTGWRIINNEKYYFNPNNAIAAVGLQVIDNNKYYFNPDTAIISKGWQTVNGSRYYFDTDTAIAFNGYKTIDGKHFYFDSDCVVKIGVFSTSNGFEYFAPANTYNNNIEGQAIVYQSKFLTLNGKKYYFDNNSKAVTGLQTIDSKKYYFNTNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTAIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQNEFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGWRIINNKKYYFNPNNAIAAIHLCTINNDKYYFSYDGILQNGYITIERNNFYFDANNESKMVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYYFNTNTSIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLYLHDNIYYFGNNSKAATGWVTIDGNRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGVFKGSNGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINGKVYYFMPDTAMAAAGGLFEIDGVIYFFGVDGVKAPGIYG
SEQ ID NO:2艰难梭菌毒素B-毒素型0的蛋白序列
MSLVNRKQLEKMANVRFRTQEDEYVAILDALEEYHNMSENTVVEKYLKLKDINSLTDIYIDTYKKSGRNKALKKFKEYLVTEVLELKNNNLTPVEKNLHFVWIGGQINDTAINYINQWKDVNSDYNVNVFYDSNAFLINTLKKTVVESAINDTLESFRENLNDPRFDYNKFFRKRMEIIYDKQKNFINYYKAQREENPELIIDDIVKTYLSNEYSKEIDELNTYIEESLNKITQNSGNDVRNFEEFKNGESFNLYEQELVERWNLAAASDILRISALKEIGGMYLDVDMLPGIQPDLFESIEKPSSVTVDFWEMTKLEAIMKYKEYIPEYTSEHFDMLDEEVQSSFESVLASKSDKSEIFSSLGDMEASPLEVKIAFNSKGIINQGLISVKDSYCSNLIVKQIENRYKILNNSLNPAISEDNDFNTTTNTFIDSIMAEANADNGRFMMELGKYLRVGFFPDVKTTINLSGPEAYAAAYQDLLMFKEGSMNIHLIEADLRNFEISKTNISQSTEQEMASLWSFDDARAKAQFEEYKRNYFEGSLGEDDNLDFSQNIVVDKEYLLEKISSLARSSERGYIHYIVQLQGDKISYEAACNLFAKTPYDSVLFQKNIEDSEIAYYYNPGDGEIQEIDKYKIPSIISDRPKIKLTFIGHGKDEFNTDIFAGFDVDSLSTEIEAAIDLAKEDISPKSIEINLLGCNMFSYSINVEETYPGKLLLKVKDKISELMPSISQDSIIVSANQYEVRINSEGRRELLDHSGEWINKEESIIKDISSKEYISFNPKENKITVKSKNLPELSTLLQEIRNNSNSSDIELEEKVMLTECEINVISNIDTQIVEERIEEAKNLTSDSINYIKDEFKLIESISDALCDLKQQNELEDSHFISFEDISETDEGFSIRFINKETGESIFVETEKTIFSEYANHITEEISKIKGTIFDTVNGKLVKKVNLDTTHEVNTLNAAFFIQSLIEYNSSKESLSNLSVAMKVQVYAQLFSTGLNTITDAAKVVELVSTALDETIDLLPTLSEGLPIIATIIDGVSLGAAIKELSETSDPLLRQEIEAKIGIMAVNLTTATTAIITSSLGIASGFSILLVPLAGISAGIPSLVNNELVLRDKATKVVDYFKHVSLVETEGVFTLLDDKIMMPQDDLVISEIDFNNNSIVLGKCEIWRMEGGSGHTVTDDIDHFFSAPSITYREPHLSIYDVLEVQKEELDLSKDLMVLPNAPNRVFAWETGWTPGLRSLENDGTKLLDRIRDNYEGEFYWRYFAFIADALITTLKPRYEDTNIRINLDSNTRSFIVPIITTEYIREKLSYSFYGSGGTYALSLSQYNMGINIELSESDVWIIDVDNVVRDVTIESDKIKKGDLIEGILSTLSIEENKIILNSHEINFSGEVNGSNGFVSLTFSILEGINAIIEVDLLSKSYKLLISGELKILMLNSNHIQQKIDYIGFNSELQKNIPYSFVDSEGKENGFINGSTKEGLFVSELPDVVLISKVYMDDSKPSFGYYSNNLKDVKVITKDNVNILTGYYLKDDIKISLSLTLQDEKTIKLNSVHLDESGVAEILKFMNRKGNTNTSDSLMSFLESMNIKSIFVNFLQSNIKFILDANFIISGTTSIGQFEFICDENDNIQPYFIKFNTLETNYTLYVGNRQNMIVEPNYDLDDSGDISSTVINFSQKYLYGIDSCVNKVVISPNIYTDEINITPVYETNNTYPEVIVLDANYINEKINVNINDLSIRYVWSNDGNDFILMSTSEENKVSQVKIRFVNVFKDKTLANKLSFNFSDKQDVPVSEIILSFTPSYYEDGLIGYDLGLVSLYNEKFYINNFGMMVSGLIYINDSLYYFKPPVNNLITGFVTVGDDKYYFNPINGGAASIGETIIDDKNYYFNQSGVLQTGVFSTEDGFKYFAPANTLDENLEGEAIDFTGKLIIDENIYYFDDNYRGAVEWKELDGEMHYFSPETGKAFKGLNQIGDYKYYFNSDGVMQKGFVSINDNKHYFDDSGVMKVGYTEIDGKHFYFAENGEMQIGVFNTEDGFKYFAHHNEDLGNEEGEEISYSGILNFNNKIYYFDDSFTAVVGWKDLEDGSKYYFDEDTAEAYIGLSLINDGQYYFNDDGIMQVGFVTINDKVFYFSDSGIIESGVQNIDDNYFYIDDNGIVQIGVFDTSDGYKYFAPANTVNDNIYGQAVEYSGLVRVGEDVYYFGETYTIETGWIYDMENESDKYYFNPETKKACKGINLIDDIKYYFDEKGIMRTGLISFENNNYYFNENGEMQFGYINIEDKMFYFGEDGVMQIGVFNTPDGFKYFAHQNTLDENFEGESINYTGWLDLDEKRYYFTDEYIAATGSVIIDGEEYYFDPDTAQLVISE
SEQ ID NO:3艰难梭菌毒素A-毒素型III的蛋白序列
MSLISKEELIKLAYSIRPRENEYKTILTNLDEYNKLTTNNNENKYLQLKKLNESIDVFMNKYKNSSRNRALSNLKKDILKEVILIKNSNTSPVEKNLHFVWIGGEVSDIALEYIKQWADINAEYNIKLWYDSEAFLVNTLKKAIVESSTTEALQLLEEEIQNPQFDNMKFYKKRMEFIYDRQKRFINYYKSQINKPTVPTIDDIIKSHLVSEYNRDETLLESYRTNSLRKINSNHGIDIRANSLFTEQELLNIYSQELLNRGNLAAASDIVRLLALKNFGGVYLDVDMLPGIHSDLFKTIPRPSSIGLDRWEMIKLEAIMKYKKYINNYTSENFDKLDQQLKDNFKLIIESKSEKSEIFSKLENLNVSDLEIKIAFALGSVINQALISKQGSYLTNLVIEQVKNRYQFLNQHLNPAIESDNNFTDTTKIFHDSLFNSATAENSMFLTKIAPYLQVGFMPEARSTISLSGPGAYASAYYDFINLQENTIEKTLKASDLIEFKFPENNLSQLTEQEINSLWSFDQASAKYQFEKYVRDYTGGSLSEDNGVDFNKNTALDKNYLLNNKIPSNNVEEAGSKNYVHYIIQLQGDDISYEATCNLFSKNPKNSIIIQRNMNESAKSYFLSDDGESILELNKYRIPERLKNKEKVKVTFIGHGKDEFNTSEFARLSVDSLSNEISSFLDTIKLDISPKNVEVNLLGCNMFSYDFNVEETYPGKLLLSIMDKITSTLPDVNKDSITIGANQYEVRINSEGRKELLAHSGKWINKEEAIMSDLSSKEYIFFDSIDNKLKAKSKNIPGLASISEDIKTLLLDASVSPDTKFILNNLKLNIESSIGDYIYYEKLEPVKNIIHNSIDDLIDEFNLLENVSDELYELKKLNNLDEKYLISFEDISKNNSTYSVRFINKSNGESVYVETEKEIFSKYSEHITKEISTIKNSIITDVNGNLLDNIQLDHTSQVNTLNAAFFIQSLIDYSSNKDVLNDLSTSVKVQLYAQLFSTGLNTIYDSIQLVNLISNAVNDTINVLPTITEGIPIVSTILDGINLGAAIKELLDEHDPLLKKELEAKVGVLAINMSLSIAATVASIVGIGAEVTIFLLPIAGISAGIPSLVNNELILHDKATSVVNYFNHLSESKEYGPLKTEDDKILVPIDDLVISEIDFNNNSIKLGTCNILAMEGGSGHTVTGNIDHFFSSPYISSHIPSLSVYSAIGIKTENLDFSKKIMMLPNAPSRVFWWETGAVPGLRSLENNGTKLLDSIRDLYPGKFYWRFYAFFDYAITTLKPVYEDTNTKIKLDKDTRNFIMPTITTDEIRNKLSYSFDGAGGTYSLLLSSYPISMNINLSKDDLWIFNIDNEVREISIENGTIKKGNLIEDVLSKIDINKNKLIIGNQTIDFSGDIDNKDRYIFLTCELDDKISLIIEINLVAKSYSLLLSGDKNYLISNLSNTIEKINTLGLDSKNIAYNYTDESNNKYFGAISKTSQKSIIHYKKDSKNILEFYNGSTLEFNSKDFIAEDINVFMKDDINTITGKYYVDNNTDKSIDFSISLVSKNQVKVNGLYLNESVYSSYLDFVKNSDGHHNTSNFMNLFLNNISFWKLFGFENINFVIDKYFTLVGKTNLGYVEFICDNNKNIDIYFGEWKTSSSKSTIFSGNGRNVVVEPIYNPDTGEDISTSLDFSYEPLYGIDRYINKVLIAPDLYTSLININTNYYSNEYYPEIIVLNPNTFHKKVNINLDSSSFEYKWSTEGSDFILVRYLEESNKKILQKIRIKGILSNTQSFNKMSIDFKDIKKLSLGYIMSNFKSFNSENELDRDHLGFKIIDNKTYYYDEDSKLVKGLININNSLFYFDPIESNLVTGWQTINGKKYYFDINTGAASTSYKIINGKHFYFNNNGVMQLGVFKGPDGFEYFAPANTQNNNIEGQAIVYQSKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWRIINNEKYYFNPNNAIAAVGLQVIDNNKYYFNPDTAIISKGWQTVNGSRYYFDTDTAIAFNGYKTIDGKHFYFDSDCVVKIGVFSGSNGFEYFAPANTYNNNIEGQAIVYQSKFLTLNGKKYYFDNNSKAVTGWQTIDSKKYYFNTNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTSIASTGYTIINGKYFYFNTDGIMQIGVFKVPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAITGWQTIDGKKYYFNPNNAIAATHLCTINNDKYYFSYDGILQNGYITIERNNFYFDANNESKMVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDSKKYYFNLNTAVAVTGWQTIDGEKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKRYYFNTNTYIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTHNNNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYYFNTNTYIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLYLHDNIYYFGND SKAATGWATIDGNRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIDGQAIRYQNRFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINSKVYYFMPDTAMAAAGGLFEIDGVIYFFGVDGVKAPGIYG
SEQ ID NO:4艰难梭菌毒素B-毒素型III的蛋白序列
MSLVNRKQLEKMANVRFRVQEDEYVAILDALEEYHNMSENTVVEKYLKLKDINSLTDIYIDTYKKSGRNKALKKFKEYLVTEVLELKNNNLTPVEKNLHFVWIGGQINDTAINYINQWKDVNSDYNVNVFYDSNAFLINTLKKTIVESATNDTLESFRENLNDPRFDYNKFYRKRMEIIYDKQKNFINYYKTQREENPDLIIDDIVKIYLSNEYSKDIDELNSYIEESLNKVTENSGNDVRNFEEFKGGESFKLYEQELVERWNLAAASDILRISALKEVGGVYLDVDMLPGIQPDLFESIEKPSSVTVDFWEMVKLEAIMKYKEYIPGYTSEHFDMLDEEVQSSFESVLASKSDKSEIFSSLGDMEASPLEVKIAFNSKGIINQGLISVKDSYCSNLIVKQIENRYKILNNSLNPAISEDNDFNTTTNAFIDSIMAEANADNGRFMMELGKYLRVGFFPDVKTTINLSGPEAYAAAYQDLLMFKEGSMNIHLIEADLRNFEISKTNISQSTEQEMASLWSFDDARAKAQFEEYKKNYFEGSLGEDDNLDFSQNTVVDKEYLLEKISSLARSSERGYIHYIVQLQGDKISYEAACNLFAKTPYDSVLFQKNIEDSEIAYYYNPGDGEIQEIDKYKIPSIISDRPKIKLTFIGHGKDEFNTDIFAGLDVDSLSTEIETAIDLAKEDISPKSIEINLLGCNMFSYSVNVEETYPGKLLLRVKDKVSELMPSISQDSIIVSANQYEVRINSEGRRELLDHSGEWINKEESIIKDISSKEYISFNPKENKIIVKSKNLPELSTLLQEIRNNSNSSDIELEEKVMLAECEINVISNIDTQVVEGRIEEAKSLTSDSINYIKNEFKLIESISDALYDLKQQNELEESHFISFEDILETDEGFSIRFIDKETGESIFVETEKAIFSEYANHITEEISKIKGTIFDTVNGKLVKKVNLDATHEVNTLNAAFFIQSLIEYNSSKESLSNLSVAMKVQVYAQLFSTGLNTITDAAKVVELVSTALDETIDLLPTLSEGLPVIATIIDGVSLGAAIKELSETSDPLLRQEIEAKIGIMAVNLTAATTAIITSSLGIASGFSILLVPLAGISAGIPSLVNNELILRDKATKVVDYFSHISLAESEGAFTSLDDKIMMPQDDLVISEIDFNNNSITLGKCEIWRMEGGSGHTVTDDIDHFFSAPSITYREPHLSIYDVLEVQKEELDLSKDLMVLPNAPNRVFAWETGWTPGLRSLENDGTKLLDRIRDNYEGEFYWRYFAFIADALITTLKPRYEDTNIRINLDSNTRSFIVPVITTEYIREKLSYSFYGSGGTYALSLSQYNMNINIELNENDTWVIDVDNVVRDVTIESDKIKKGDLIENILSKLSIEDNKIILDNHEINFSGTLNGGNGFVSLTFSILEGINAVIEVDLLSKSYKVLISGELKTLMANSNSVQQKIDYIGLNSELQKNIPYSFMDDKGKENGFINCSTKEGLFVSELSDVVLISKVYMDNSKPLFGYCSNDLKDVKVITKDDVIILTGYYLKDDIKISLSFTIQDENTIKLNGVYLDENGVAEILKFMNKKGSTNTSDSLMSFLESMNIKSIFINSLQSNTKLILDTNFIISGTTSIGQFEFICDKDNNIQPYFIKFNTLETKYTLYVGNRQNMIVEPNYDLDDSGDISSTVINFSQKYLYGIDSCVNKVIISPNIYTDEINITPIYEANNTYPEVIVLDTNYISEKINININDLSIRYVWSNDGSDFILMSTDEENKVSQVKIRFTNVFKGNTISDKISFNFSDKQDVSINKVISTFTPSYYVEGLLNYDLGLISLYNEKFYINNFGMMVSGLVYINDSLYYFKPPIKNLITGFTTIGDDKYYFNPDNGGAASVGETIIDGKNYYFSQNGVLQTGVFSTEDGFKYFAPADTLDENLEGEAIDFTGKLTIDENVYYFGDNYRAAIEWQTLDDEVYYFSTDTGRAFKGLNQIGDDKFYFNSDGIMQKGFVNINDKTFYFDDSGVMKSGYTEIDGKYFYFAENGEMQIGVFNTADGFKYFAHHDEDLGNEEGEALSYSGILNFNNKIYYFDDSFTAVVGWKDLEDGSKYYFDEDTAEAYIGISIINDGKYYFNDSGIMQIGFVTINNEVFYFSDSGIVESGMQNIDDNYFYIDENGLVQIGVFDTSDGYKYFAPANTVNDNIYGQAVEYSGLVRVGEDVYYFGETYTIETGWIYDMENESDKYYFDPETKKAYKGINVIDDIKYYFDENGIMIRTGLITFEDNHYYFNEDGIMQYGYLNIEDKTFYFSEDGIMQIGVFNTPDGFKYFAHQNTLDENFEGESINYTGWLDLDEKRYYFTDEYIAATGSVIIDGEEYYFDPDTAQLVISE
SEQ ID NO:5艰难梭菌二元毒素片段A的蛋白序列
MKKFRKHKRISNCISILLILYLTLGGLLPNNIYAQDLQSYSEKVCNTTYKAPIESFLKDKEKAKEWERKEAERIEQKLERSEKEALESYKKDSVEISKYSQTRNYFYDYQIEANSREKEYKELRNAISKNKIDKPMYVYYFESPEKFAFNKVIRTENQNEISLEKFNEFKETIQNKLFKQDGFKDISLYEPGKGDEKPTPLLMHLKLPRNTGMLPYTNTNNVSTLIEQGYSIKIDKIVRIVIDGKHYIKAEASVVNSLDFKDDVSKGDSWGKANYNDWSNKLTPNELADVNDYMRGGYTAINNYLISNGPVNNPNPELDSKITNIENALKREPIPTNLTVYRRSGPQEFGLTLTSPEYDFNKLENIDAFKSKWEGQALSYPNFISTSIGSVNMSAFAKRKIVLRITIPKGSPGAYLSAIPGYAGEYEVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIP
SEQ ID NO:6艰难梭菌二元毒素片段B的蛋白序列
MKIQMRNKKVLSFLTLTAIVSQALVYPVYAQTSTSNHSNKKKEIVNEDILPNNGLMGYYFSDEHFKDLKLMAPIKDGNLKFEEKKVDKLLDKDKSDVKSIRWTGRIIPSKDGEYTLSTDRDDVLMQVNTESTISNTLKVNMKKGKEYKVRIELQDKNLGSIDNLSSPNLYWELDGMKKIIPEENLFLRDYSNIEKDDPFIPNNNFFDPKLMSDWEDEDLDTDNDNIPDSYERNGYTIKDLIAVKWEDSFAEQGYKKYVSNYLESNTAGDPYTDYEKASGSFDKAIKTEARDPLVAAYPIVGVGMEKLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNGFTANVTTNYSHTTDNSTAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLVLDGDTLSTIKAQENQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQFSSRLIPINYDQLKKLDAGKQIKLETTQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKNLQDPEDKTPELTIGEAIEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLSDKKIYNVKLERGMNILIKTPTYFTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGYSKDPLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNLSITELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEALDYIQKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVD
SEQ ID NO:7人类胰蛋白酶-1(Swiss Prot登录号P07477)
IVGGYNCEENSVPYQVSLNSGYHFCGGSLINEQWVVSAGHCYKSRIQVRLGEHNIEVLEGNEQFINAAKIIRHPQYDRKTLNNDIMLIKLSSRAVINARVSTISLPTAPPATGTKCLISGWGNTASSGADYPDELQCLDAPVLSQAKCEASYPGKITSNMFCVGFLEGGKDSCQGDSGGPVVCNGQLQGVVSWGDGCAQKNKPGVYTKVYNYVKWIKNTIAANS
SEQ ID NO:8人类胰蛋白酶-2(Swiss Prot登录号P07478)
IVGGYICEENSVPYQVSLNSGYHFCGGSLISEQWVVSAGHCYKSRIQVRLGEHNIEVLEGNEQFINAAKIIRHPKYNSRTLDNDILLIKLSSPAVINSRVSAISLPTAPPAAGTESLISGWGNTLSSGADYPDELQCLDAPVLSQAECEASYPGKITNNMFCVGFLEGGKDSCQGDSGGPVVSNGELQGIVSWGYGCAQKNRPGVYTKVYNYVDWIKDTIAANS
SEQ ID NO:9糜蛋白酶-B(Swiss Prot登录号P17538)
GCGVPAIHPVLSGLSRIVNGEDAVPGSWPWQVSLQDKTGFHFCGGSLISEDWVVTAAHCGVRTSDVVVAGEFDQGSDEENIQVLKIAKVFKNPKFSILTVNNDITLLKLATPARFSQTVSAVCLPSADDDFPAGTLCATTGWGKTKYNANKTPDKLQQAALPLLSNAECKKSWGRRITDVMICAGASGVSSCMGDSGGPLVCQKDGAWTLVGIVSWGSDTCSTSSPGVYARVTKLIPWVQKILAAN