CN102731573A - 布雷菲德菌素a的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物及其制备方法和应用，涉及一种真菌代谢产物。所述衍生物包括(+)-Brefeldin A-4,7-二羟基磷酸氨基酸酯、(+)-Brefeldin A-4-羟基磷酸氨基酸酯和(+)-Brefeldin A-7-羟基磷酸氨基酸酯。合成了具有高度生物活性、较好溶解性及好的生物利用度的布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物，简单、低成本。结构新颖、结构相对稳定，且对肿瘤细胞的增殖具有显著的抑制活性。相对原药(+)-BrefeldinA具有溶解性好，半衰期长等优点，布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物可在制备抗癌药品中应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种真菌代谢产物，尤其是涉及一种布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
(一)、(+)-Brefeldin A的研究概括
布雷菲徳菌素A(英文名：(+)-Brefeldin A,简称BFA，中文名称为：布雷菲德菌素A，也称作斜卧菌素或蓝菌素或壳二孢素)，是一种大环内酯类真菌代谢产物，最早由Singleton等在1958年从Penicilliumdecumben中分离得到。虽然BFA的平面结构早已被测定，但是其绝对构型直到1971年才由Weber等用X射线晶体衍射法确立，其结构式如下：
(+)-BrefeldinA具有广泛的生物活性，包括抗病毒、抗真菌、抗线虫、抗有丝分裂和抗肿瘤等，其主要功能是能诱导高尔基体的分解，抑制蛋白从内质网(简称：ER)中转移为高尔基体的复合物，从而阻断高尔基体复合物的蛋白质传输，目前被作为一种重要的分子工具广泛用于研究哺乳动物的信号传导途径。国际肿瘤协会发现，(+)-BrefeldinA能够诱导肿瘤细胞分化和凋亡，作为化学治疗试剂用于抗肿瘤有很大的应用前景。
(+)-Brefeldin A在抗肿瘤方面显示了显著的药理活性，其抗肺癌细胞（HOP-62）、结肠癌细胞(HCT-116)、黑色素瘤细胞(UAC-662)、卵巢癌细胞(OVCAR-3)、前列腺癌细胞(DU-145)、乳癌细胞(MDA-MB-435)等的IC50均<0.1μmol/L（[1]Argade,A.B.;Devraj,R.;Vroman,J.A.;Haugwitz,R.D.;Hollingshead,M.;Cushman,M.Design and Synthesis of Brefeldin A SulfideDerivatives as Prodrug Candidates with Enhanced Aqueous Solubilities[J].J.Med.Chem.1998,41:3337）
(二)、(+)-Brefeldin A结构改造概括
(+)-BrefeldinA作为一个新的抗肿瘤候选药物，在国际上受到极为广泛的关注。该化合物具有活性高等特点，同时对多种肿瘤均具有良好的抑制作用。近年来，国外对该化合物的研发速度非常快，前景广阔。但是(+)-BrefeldinA作为一种抗癌候选药物，有许多药代动力学方面的缺点，如(+)-BrefeldinA的溶解性很差；口服后吸收差；若静脉注射给药，则(+)-BrefeldinA在血液中浓度会迅速下降，从而被清空；(+)-BrefeldinA的毒副作用也较大。因此，为克服上述缺点，化学家们对(+)-Brefeldin A的结构进行修饰，主攻方向是通过改善(+)-Brefeldin A的亲水亲油性，使其有利于药物的吸收。
目前，国际上对(+)-Brefeldin A抗肿瘤活性方面的研究非常活跃，对(+)-Brefeldin A全合成和表观合成也报道了30多种；而国内对(+)-BrefeldinA的研究主要集中在(+)-BrefeldinA原料的发酵生产、剂型研究及其合成。2004年上海有机所有一篇关于(+)-Brefeldin A的全合成，但也只是作为一种合成方法上的研究。由于这样合成(+)-BrefeldinA投入的人力、财力太多，已无力进行(+)-BrefeldinA的结构改造。结构改造方面，国内研究较少，国际相对研究较多，主要集中在（1）羟基的改造：(+)-Brefeldin A分子中有2个羟基，因此，在结构改造中占有重要地位。反应类型主要有烷基化、酰化、氧化等。生物测试结果表明，烷基化和酰化的(+)-Brefeldin A都具有一定抗肿瘤活性，但是其活性低；而氧化后的(+)-Brefeldin A则没有活性，说明4位和7位上的羟基在(+)-BrefeldinA的生物活性中起着重要作用。（2）酯基的改造：Hitoshi（[2]Zhu,J.W.;Hori,H.;Nojiri，H.;Tsukuda,T.;Taira,Z.Synthesis and Activity ofBrefeldin A Analogs as Inducers of Cancer Cell Differentiation and Apoptosis[J].Bioorg.Med.Chem.Lett.1997,7:139）以BFA为原料用KOH水溶液水解开环，然后合成其开环化合物的甲酯和苄酯。生物测试结果表明，水解和改造后的产物已经没有(+)-BrefeldinA的生物活性，说明稳定的13元环的构型也是与Sec7d-ARF-GDP复合物结合的关键。（3）双键的改造：Zhu等（[3]Zhu,J.W.;Nagasawa,H.;Nagura,F.;Mohamad,S.B.;Uto,Y.;Ohkura,K.Elucidationof Strict Structural Requirements of Brefeldin A as an Inducer of Differentiation and Apoptosis[J].Bioorg.Med.Chem.2000,8:455）从(+)-Brefeldin A出发合成了一些类似物并对这些类似物进行了生物测试，结果发现，10,11位环氧化的(+)-BrefeldinA能够对人类直肠癌细胞和正常细胞进行区分，而四氢化的(+)-Brefeldin A和其它一些类似物则不能进行区分，这说明双键在(+)-BrefeldinA生物活性中同样起着重要的作用。
药物的脂溶性和酸碱度是影响药物生物利用度的主要原因。将含有羟基或羧基的药物制成酯类前药，可以提高药物的脂溶性，增强药物通过生物膜的能力，从而提高生物利用度。磷酸化氨基酸具有很好的生物活性，本申请人（[4]Li,Y.M.;Yin,Y.W.;Zhao,Y.F.Phosphoryl group participation leads to peptide formation from N‐phosphorylamino acidsInt[J].Peptide Protein Res.1992;39:375；[5]Zhou,W.H.;Ju,Y.;Zhao,Y.F.;Wang,Q.G.;Luo,G.A.Simultaneous formation of peptides and nucleotides from N-phosphothreonine[J].Origins LifeEvol.Biosphere.1996;26:547）早期的研究发现，它能够自催化生成多肽及核苷等，并用于抗艾滋病活性分子AZT的前药改造中。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物。
本发明的第二目的在于提供一种布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物的合成方法。
本发明的第三目的在于提供一种布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物的应用。
所述布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物的结构式为：
(+)-BrefeldinA可购自百灵威科技有限公司CA号：20350-15-6。1H-NMR，13C-NMR由Bruker av400超导核磁共振仪上测定，以TMS为内标在氘代有机溶剂中测得；31P-NMR由Bruker av400超导核磁共振仪测得，以85%磷酸(H3PO4)作为外标，测量温度为室温(22℃)。质谱系使用Bruker ESOSUIRE-3000测得，高分辨质谱在Bruker Daltonics APEX II质谱仪上测得。X-Ray单晶衍射在Bruker APEX CCD面碳晶体衍射仪上测得。红外在红外吸收光谱仪Nicolet Avatar360上测得。酶标仪使用Bio-Rad公司。药代动力学研究采用Applied Biosystems3200Q TRAP LC/MS/MS System四极杆质谱仪。
所述布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物包括(+)-Brefeldin A-4,7-二羟基磷酸氨基酸酯、(+)-Brefeldin A-4-羟基磷酸氨基酸酯和(+)-Brefeldin A-7-羟基磷酸氨基酸酯。
所述(+)-Brefeldin A-4,7-二羟基磷酸氨基酸酯的结构式为：
其中，R是氢，甲基，异丙基，或苄基等；
所述(+)-BrefeldinA-4,7-二羟基磷酸氨基酸酯的合成方法包括以下步骤：
a）冰水浴，惰性气体保护下，将(+)-Brefeldin A、磷酰化氨基酸和4-二甲氨基吡啶溶解于第一有机溶剂中，所述(+)-Brefeldin A、磷酰化氨基酸和4-二甲氨基吡啶的摩尔配比1∶4∶0.1；所述第一有机溶剂可选自二氯甲烷、DMF等中的一种；所述磷酰化氨基酸可选自磷酰化甘氨酸、磷酰化丙氨酸、磷酰化缬氨酸、磷酰化苯丙氨酸等中的一种。
b）在冰浴条件下，将二环己基碳二亚胺的有机溶剂加入步骤a）所得的混合物中，反应后，得4,7-二羟基磷酸氨基酸酯-(+)-Brefeldin A；
在步骤b）中，所述二环己基碳二亚胺的有机溶剂可选自二氯甲烷、DMF等中的一种；所述反应可采用薄层层析色谱跟踪监测。
c）步骤b）反应后，过滤掉不溶物，减压，浓缩，除去有机溶剂，产物质量用5%的第二有机溶剂溶解，进行硅胶柱层析分离，得到4,7-二羟基磷酸氨基酸酯-(+)-Brefeldin A。
在步骤c）中，所述第二有机溶剂可选自二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、氯仿等中的一种。
所合成得到(+)-Brefeldin A-4,7-二羟基磷酸氨基酸酯的产率可达85%～97%。
所述(+)-Brefeldin A-4-羟基磷酸氨基酸酯的结构式为：
其中，R是氢，甲基，异丙基，或苄基等。
所述(+)-Brefeldin A-4-羟基磷酸氨基酸酯的合成方法包括以下步骤：
a）将(+)-Brefeldin A、咪唑和叔丁基二甲基氯硅烷在第一有机溶剂中反应后，再加入第二有机溶剂后，洗涤，有机相减压浓缩，剩余物柱层析分离得到7-O-叔丁基二甲基硅(+)-Brefeldin A；
在步骤a)中，所述(+)-Brefeldin A、咪唑和叔丁基二甲基氯硅烷的质量配比为280∶126-204∶165；所述的第一有机溶剂可选自DMF、DMSO等中的一种；所述反应可采用薄层层析板跟踪监测反应，所述的第二有机溶剂加入量按(+)-Brefeldin A质量10mg/mL，所述第二有机溶剂为乙酸乙酯，二氯甲烷，所述洗涤可采用加入水按(+)-Brefeldin A质量10mg/mL，洗3次。
b)在惰性气体保护下，将步骤a）得到的7-O-叔丁基二甲基硅(+)-Brefeldin A、磷酰化氨基酸和4-二甲氨基吡啶在第二有机溶剂中形成混合物，冰浴下，加入二环己基碳二亚胺的第三有机溶剂，反应后，过滤除掉不溶物，减压浓缩，柱层析分离得到纯的7号位叔丁基二甲基硅保护的(+)-Brefeldin A-4-羟基磷酸氨基酸酯；
在步骤b）中，所述在惰性气体可采用氩气等，所述(+)-Brefeldin A、磷酰化氨基酸和4-二甲氨基吡啶的摩尔配比可为1∶2∶0.1；所述第二有机溶剂可选自乙酸乙酯、二氯甲烷等中的一种；所述的第二有机溶剂加入量按(+)-Brefeldin A质量20mg/mL所述第三有机溶剂的加入量按(+)-Brefeldin A质量10mg/mL，所述第三有机溶剂可选自二氯甲烷、氯仿、DMF等中的一种；所述反应可采用薄层层析板跟踪监测反应；所述磷酰化氨基酸可选自磷酰化甘氨酸、磷酰化丙氨酸、磷酰化缬氨酸、磷酰化苯丙氨酸等中的一种。
c）将7-O-叔丁基二甲基硅-(+)-Brefeldin A-4-O-磷酸氨基酸酯溶解在第四有机溶剂中，再加入碘单质，反应后，再加入硫代硫酸钠，直到溶液变为澄清，然后加入第五有机溶剂，再洗涤，有机相减压浓缩，剩余物柱层析分离得到(+)-Brefeldin A-4-羟基磷酸氨基酸酯。
在步骤c）中，所述7-O-叔丁基二甲基硅-(+)-Brefeldin A-4-羟基磷酸氨基酸酯、碘单质、硫代硫酸钠、第四有机溶剂、第五有机溶剂的配比可为100～300mg：30～100mg：10～60mg：3～5mL：10～30mL；所述第四有机溶剂可选自甲醇等；所述第五有机溶剂可选自乙酸乙酯、二氯甲烷等中的一种；所述洗涤可采用的水洗涤加入水按(+)-Brefeldin A质量10mg/mL，洗3次。
所述(+)-BrefeldinA-7-羟基磷酸氨基酸酯的结构式为：
其中，R是氢，甲基，异丙基，或苄基等。
所述(+)-Brefeldin A-7-羟基磷酸氨基酸酯的合成方法包括以下步骤：
a）将(+)-Brefeldin A、咪唑和叔丁基二甲基氯硅烷在第一有机溶剂中反应后，再加入第二有机溶剂后，洗涤，有机相减压浓缩，剩余物柱层析分离得到形成4,7-O-叔丁基二甲基硅(+)-Brefeldin A。
在步骤a)中，所述(+)-Brefeldin A、咪唑和叔丁基二甲基氯硅烷的摩尔配比为1∶3∶6；所述第一有机溶剂可选自DMF、DMSO等中的一种；所述第二有机溶剂可选自乙酸乙酯、二氯甲烷等中的一种；所述反应可采用薄层层析板跟踪监测反应，所述的第二有机溶剂加入量按(+)-Brefeldin A质量10mg/mL，所述第二有机溶剂为乙酸乙酯，二氯甲烷，所述洗涤可采用加入水按(+)-Brefeldin A质量10mg/mL，洗3次。
b）将4,7-双叔丁基二甲基硅-(+)-Brefeldin A溶于THF中，加入醋酸及水，反应后将反应液减压浓缩，加入第三有机溶剂后，洗涤，有机相减压浓缩，剩余物柱层析分离得到4-O-叔丁基二甲基硅(+)-Brefeldin A。
在步骤b）中，所述4,7号位TBS双保护的(+)-Brefeldin A、四氢呋喃、醋酸、水、第三有机溶剂的配比1mL:1mL:2mL；所述反应的条件可为在50~60℃搅拌反应24h；所述第三有机溶剂可选自乙酸乙酯、二氯甲烷等中的一种；所述洗涤可依次用水、碳酸氢钠,和水洗涤。
c)在惰性气体保护下，将4号位TBS保护的(+)-Brefeldin A、磷酰化氨基酸和4-二甲氨基吡啶在第四有机溶剂中形成混合物，冰浴下，再加入二环己基碳二亚胺的第四有机溶剂，反应后，过滤除掉不溶物，减压浓缩，柱层析分离得到4号位叔丁基二甲基硅保护的(+)-Brefeldin A-7-羟基磷酸氨基酸酯；
在步骤c)中，所述惰性气体可采用氩气、氮气等；所述4号位叔丁基二甲基硅保护的(+)-Brefeldin A、磷酰化氨基酸和4-二甲氨基吡啶的摩尔配比可为1∶2∶0.1；所述第四有机溶剂可选自二氯甲烷、氯仿、DMF等中的一种；所述反应可采用薄层层析板跟踪监测反应；所述磷酰化氨基酸可选自磷酰化甘氨酸、磷酰化丙氨酸、磷酰化缬氨酸、磷酰化苯丙氨酸等中的一种。
d)将4号位TBS保护的(+)-Brefeldin A-7-羟基磷酸氨基酸酯溶解在第五有机溶剂中，再加入碘，反应后，冷却至室温，再加入硫代硫酸钠，直到溶液变为澄清，然后加入水洗涤，有机相减压浓缩，剩余物柱层析分离得到(+)-Brefeldin A-7-羟基磷酸氨基酸酯。
在步骤d）中，所述4号位叔丁基二甲基硅保护的(+)-Brefeldin A-7-羟基磷酸氨基酸酯、碘、硫代硫酸钠、第五有机溶剂、水的配比可为100～300mg：30～100mg：10～60mg：3～5mL：10～30mL；所述反应的条件可为50～80℃下反应10～30h；所述洗涤可采用与原料10%配比水洗涤3次；所述第五有机溶剂可选自乙酸乙酯、二氯甲烷等中的一种。
以下给出(+)-Brefeldin A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物的抗肿瘤活性：
本发明所述布雷菲德菌素A具有抗真菌、抗病毒、抗肿瘤等方面的药理作用与用途，本发明对布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物在抗肿瘤活性方面进行了多次试验，发现其具有显著的抗肿瘤活性，所述肿瘤包括肺癌细胞、胃癌细胞、肠癌细胞或白血病细胞中的至少一种所导致的肿瘤。
本发明合成了具有高度生物活性、较好溶解性及好的生物利用度的布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物，提供了一种设计布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物前药的新思路，其合成方法简单、低成本。另外，本发明对布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物的抗肿瘤细胞毒活性进行评价，并对布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物的动物体内药代动力学进行测试分析。
用本发明的方法制备的布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物，是一类结构新颖的、结构相对稳定(pH=5.5)且对胃癌、肠癌、肝癌、白血病、乳腺癌、肺癌等肿瘤细胞的增殖具有显著的抑制活性。通过这个制备方法合成的布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物，在酯酶的催化下，能酶催化水解，并释放出原药(+)-BrefeldinA。同时，通过对布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物的大鼠体内代谢动力学研究表明，这类前药的半衰期比原药(+)-Brefeldin A延长了。因此布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物是一种具备抑制肿瘤细胞功能性制品，相对原药(+)-BrefeldinA具有溶解性好，半衰期长等优点，由此可见，布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物可在制备抗癌药品中应用。
附图说明
图1为(+)-Brefeldin A-4-羟基磷酸氨基酸酯在不同pH值缓冲盐溶液中的降解图。在图1中，横坐标为时间（h），纵坐标为相对浓度百分比；a为pH=1.2，b为pH=5.5，c为pH=7.4，d为pH=10.4。
图2为(+)-BrefeldinA-7-羟基磷酸氨基酸酯的广谱酯酶水解图。在图2中，横坐标为时间（h），纵坐标为O.D.215nm；S7-01为(+)-Brefeldin A-7-羟基磷酸氨基酸酯；a为BFA，b为S7-01。
图3为(+)-Brefeldin A-羟基磷酸氨基酸酯对肺癌A549细胞的抑制作用图。在图3中，横坐标为样品编号；纵坐标为半数抑制率IC50(μmol·L-1)。
图4为静脉注射(+)-BrefeldinA和S7-01(5mg/kg)后大鼠体内(+)-BrefeldinA的血药浓度-时间曲线(n=4)。在图4中，横坐标为时间（min），纵坐标为浓度（ng/mL）；a为(+)BrefldinA，b为S7-01。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
实施例1
在25mL的圆底烧瓶中加入0.5mmol的(+)-Brefeldin A、2mmol的磷酰化丙氨酸、0.05mmol的4-二甲氨基吡啶在氩气保护下加入10mL的无水二氯甲烷，冰水浴下向反应体系中滴加2mmol二环己基碳二亚胺的CH2Cl2溶液，滴加完后，室温下搅拌过夜，薄层层析板监测反应完全后，过滤掉不溶物（DCU），滤液减压浓缩。用V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)＝1∶3过柱得到纯产品(D-02)，产率90﹪。(波谱数据，31P-NMR(CDCl3):δ=5.08,4.93ppm;1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ7.21(dd,J=15.9,3.5Hz,1H),5.66-5.78(m,2H),5.13-5.31(m,3H),4.82-4.93(m,1H),4.53-4.66(m,4H),3.94-4.03(m,1H),3.82-3.92(m,1H),3.20(q,J=8.7Hz,2H),2.41-2.53(m,1H),2.30-2.40(m,1H),1.99-2.21(m,4H),1.80-1.86(m,1H),1.68-1.78(m,2H),1.60-1.65(m,1H),1.49-1.57(m,1H),1.46(d,J=7.2Hz,3H),1.39(d,J=7.1Hz,3H),1.24-1.33(m,27H),0.87-0.96(m,1H);13C NMR(100MHz,CDCl3):δ173.4,173.3,172.8,172.9(CCO),165.2(C1),146.2(C3),135.2(C11),131.5(C10),118.7(C2),76.7(C4),76.0(C7),71.8(C15),71.1,71.1,71.0,70.9(OCH(CH3)2),50.0(C5),49.6(NHCHCH3),44.1(C8),39.9(C9),38.1(C14),34.0(C6),31.7(C12),26.4(C13),23.8,23.7(OCH(CH3)2),21.5,21.4,21.2,21.1(NHCHCH3)，20.7(C16);ESI-MS:m/z calcd for[M+H]+751.4;[M+Na]+773.4)。
实施例2
将280mg(1mmol)的(+)-Brefeldin A，82mg(1.2mmol)的咪唑溶于10mL干燥的DMF中，冰水浴冷却。将165mg(1.1mmol)的TBSCl溶解于5mL干燥的DMF中，将此溶液用注射器缓慢的滴加到上述体系中，室温搅拌24h，薄层层析板监测反应完全后，加入20mL的有机溶剂(II)稀释后，用3×10mL水洗涤。有机相减压浓缩。用V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)＝8∶1过柱得到纯产品7号位TBS保护的(+)-BrefeldinA(编号：BFA-7TBS)，产率86％。在25mL的圆底烧瓶中加入0.5mmol的BFA-7TBS，1mmol的磷酰化丙氨酸，0.05mmol的4-二甲氨基吡啶在氩气保护下加入10mL的无水二氯甲烷，冰水浴下向反应体系中滴加1mmol二环己基碳二亚胺的二氯甲烷溶液，滴加完后，室温下搅拌过夜，薄层层析板监测反应完全后，过滤掉不溶物（DCU），滤液减压浓缩。用V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)＝1∶2过柱得到纯产品7号位TBS保护的(+)-Brefeldin A-4-羟基磷酸氨基酸酯,产率92％。在10mL的圆底烧瓶中加入0.5mmol的7号位TBS保护的(+)-Brefeldin A-4-羟基磷酸氨基酸酯和5mL的甲醇，产品溶解后，向反应体系加入0.2mmol的I2，室温反应16h，反应完全后，向反应体系中滴加1mol/L Na2S2O3，直到溶液变为澄清。加入30mL的乙酸乙酯稀释后，用3×10mL水洗涤。有机相减压浓缩,用V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)＝1∶2过柱得到目标产物(+)-Brefeldin A-4-羟基磷酸丙氨酸酯(S4-02)的纯产品，产率98％。(波谱数据，31P-NMR(CDCl3):δ=4.91ppm；1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ7.24(dd,J=15.7,3.2Hz,1H)，5.65-5.74(m,2H)，5.26-5.34(m,2H)，4.81-4.91(m,1H)，4.54-4.65(m,2H)，4.29(dq,J=4.3,4.9Hz,1H)，3.91-4.03(m,1H)，3.24(t,J=9.5Hz,1H),2.34-2.46(m,1H)，2.11-2.31(m,3H)，1.90-2.06(m,2H)，1.79-1.89(m,2H)，1.69-1.78(m,1H)，1.48-1.64(m,3H)，1.46(d,J=7.0Hz,3H)，1.28-1.35(m,12H)，1.24(d,J=6.4Hz,3H)，0.87-0.97(m,1H);13C NMR(100MHz,CDCl3):δ172.9，171.9(CCO)，165.4(C1)，146.7(C3)，136.3(C11)，130.5(C10)，118.2(C2)，76.7(C4)，71.9(C7)，71.8(C15)，71.2，71.1(OCH(CH3)2)，50.1(C5)，49.5(NHCHCH3)，44.3(C8)，43.0(C9)，40.9(C14)，31.9(C6)，31.7(C12)，26.5(C13)，23.7，23.7，23.6(OCH(CH3)2)，21.4，21.3(NHCHCH3)，20.7(C16);ESI-MS:m/z calcd for[M+H]+516.3;[M+Na]+538.3.)
实施例3
在25mL的圆底烧瓶中加入0.5mmol的4号位TBS保护的(+)-Brefeldin A、1mmol的DIPP-Ala、0.05mmol的4-二甲氨基吡啶在氩气保护下加入10mL的无水二氯甲烷，冰水浴下向反应体系中滴加1mmol二环己基碳二亚胺的CH2Cl2溶液，滴加完后，室温下搅拌过夜，薄层层析板监测反应完全后，过滤掉不溶物（DCU），滤液减压浓缩。用石油醚∶乙酸乙酯为1∶3过柱得到纯产品产率92﹪。在10mL的圆底烧瓶中加入0.3mmol的4号位TBS保护的(+)-Brefeldin A-7-羟基磷酸氨基酸酯，加入5mL的CH3OH,产品溶解后，向反应体系加入0.02mg的I2，60℃反应16h，反应完全后，向反应体系中滴加1mol/L Na2S2O3,直到溶液变为澄清。加入30mL的乙酸乙酯稀释后，用3×10mL水洗涤。有机相减压浓缩。用V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)＝1∶2过柱得到目标产物(+)-Brefeldin A-7-羟基磷酸丙氨酸酯(S7-02)的纯产品，产率60﹪。(波谱数据，31P-NMR(CDCl3):δ=5.04ppm；1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ7.24(dd,J=15.7,3.2Hz,1H)，5.92(dd,J=15.7,2.0Hz,1H)，5.7(ddd,J=15.2,9.9,2.0Hz,1H)，5.15-5.2(m,2H)，4.81-4.91(m,1H)，4.51-4.65(m,2H)，4.08-4.15(m,1H)，3.79-3.90(m,1H),3.20(t,J=9.7Hz,1H),2.50-2.58(m,1H),2.34-2.46(m,1H)，2.26-2.35(m,1H),2.17-2.21(m,1H)，1.96-2.06(m,1H)，1.79-1.92(m,4H)，1.69-1.78(m,1H)，1.48-1.64(m,2H)，1.37(d,J=7.0Hz,3H)，1.28-1.35(m,15H)，0.91-0.97(m,1H);13C NMR(100MHz,CDCl3):δ173.6，173.5(CCO)，166.4(C1)，151.5(C3)，135.7(C11)，131.1(C10)，117.8(C2)，76.7(C4)，75.7(C7)，71.7(C15)，71.1，71.1(OCH(CH3)2)，52.1(NHCHCH3)，50.2(C5)，44.0(C8)，43.0(C9)，38.5(C14)，34.1(C6)，31.8(C12)，26.6(C13)，23.8，23.7，23.7(OCH(CH3)2)，21.1，21.1(NHCHCH3)，20.8(C16);ESI-MS:m/z[M+H]+516.3;[M+Na]+538.3)。
实施例4
(+)-Brefeldin A磷酸氨基酸酯类化合物在不同pH值缓冲液中的化学稳定性：
为考察(+)-Brefeldin A磷酸氨基酸酯类化合物在室温下不同pH值缓冲液中的化学稳定性，采用HPLC同步跟踪检测在不同pH值水溶液中，不同时间点前药的百分比。旨在考察和对比前药在不同pH值下的水解速率，为血浆中代谢研究及药物设计、改进提供参考，进而为新药开发奠定基础。具体操作方法如下：精密吸取2.5mL各前药S7-01的DMSO溶液（浓度为1.00mg/mL），置于25mL量瓶中，分别加入不同pH值的缓冲液，稀释至刻度，摇匀。再精密吸取10mL该液，置于离心管中，平行操作3份，放入37±0.5℃恒温水浴锅中，于不同时间取样1mL，进样20μL，HPLC测定前药的浓度变化,平行做三份样品。以残余药物的含量百分量对时间（t）作图。选择部分(+)-Brefeldin A磷酸氨基酸酯在不同pH值缓冲液中的实验进行举例(图1)。
实施例5
(+)-Brefeldin A磷酸氨基酸酯类化合物的酯酶代谢：
精密吸取各前药S7-01贮备液（浓度为10.00mg/mL）10μL，加至990μL在37±0.5℃水浴预热的含有30Unints酯酶的Tris缓冲液中（pH7.4），涡旋10s，于不同时间取样100μL，经甲醇沉淀，1000转离心，取上清，HPLC测定前药的浓度变化，平行做三份样品。以残余前药量以及原药(+)-Brefeldin A生成量的O.D.值对时间（t）作图。选择部分(+)-Brefeldin A磷酸氨基酸酯在酯酶缓冲液中的实验进行举例(图2)。
实施例6
选择部分抗肿瘤的实验研究结果进行举例。选择肺癌细胞A549作为检测细胞株，用MTT法测定(+)-Brefeldin A及其羟基磷酸氨基酸酯类衍生物的抗肿瘤活性。MTT法实验结果显示：(+)-Brefeldin A及其羟基磷酸氨基酸酯类衍生物对人肺癌A549细胞的增殖有显著抑制作用，且呈明显的浓度依赖性。布雷菲德菌素A对人肺癌A549细胞72h的半数抑制浓度约为0.04μM/L，而布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物对人肺癌A549细胞72h的半数抑制浓度0.05μM/L～100M/L。布雷菲德菌素A的羟基酯类衍生物部分化合物因为羟基侧链的引入增强的活性，而部分布雷菲德菌素A羟基酯类衍生物作为布雷菲德菌素A的前药发挥抗肿瘤活性，因为酯的种类不同，释放(+)-BrefeldinA的快慢不一样，所以抗肿瘤活性不同程度地弱于布雷菲德菌素A。(+)-Brefeldin A羟基磷酸氨基酸酯类衍生物的对肿瘤细胞A549的半数抑制率见图3。
实施例7
布雷菲德菌素A的羟基酯类衍生物的药动性质测定：
①.将样品S7-01用5%(v:v)DMSO溶解完全，然后加入45%(v:v)的聚乙二醇400，混匀，最后用50%(v:v)生理盐水稀释。
②.选取250-280g的SD大鼠4只，雌雄并用。在代谢笼中饲养12h后，称重，用乙醚麻醉，切开颈部皮肤，对大鼠实施颈动脉和静脉插管手术。待大鼠苏醒后，由动脉导管给药，静脉取血。在给药后不同时间点取血300μL，立即转入含有肝素钠溶液的1mL离心管，并以6000rps离心2min，定量取上清血浆100μL，保存在-20℃，直到检测。
③.测定前将血浆解冻，取100μL，加入含有内标紫杉醇（50ng/mL）的甲基叔丁基醚1mL，于漩涡振荡器上混合均匀10min，15000r/min条件下离心10min沉淀蛋白，取出上清液，室温下氮气吹干，置-20℃冰箱保存，直至检测。检测时，用100μL流动相溶解样品，上样20μL进行HPLC/MS/MS检测,得到质谱响应峰面积的数据，对照标准工作曲线，计算血液中(+)-Brefeldin A的浓度。
④.根据以上数据，绘制血药浓度-时间曲线图(图4)。分别由WinNonlin Professional EditionVersion2.1(Pharsight Corporation,Mountain View,CA,USA)动力学软件（为公知的软件）计算相关动力学参数。
表1药代动力学数据
表1给出药代动力学数据。
Claims (9)
1.布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物，其特征在于，
所述布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物的结构式为：
2.如权利要求1所述的布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物，其特征在于，
所述布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物包括(+)-Brefeldin A-4,7-二羟基磷酸氨基酸酯、(+)-Brefeldin A-4-羟基磷酸氨基酸酯和(+)-Brefeldin A-7-羟基磷酸氨基酸酯；
所述(+)-BrefeldinA-4,7-二羟基磷酸氨基酸酯的结构式为：
其中，R是氢，甲基，异丙基，或苄基；
所述(+)-Brefeldin A-4-羟基磷酸氨基酸酯的结构式为：
其中，R是氢，甲基，异丙基，或苄基；
所述(+)-Brefeldin A-7-羟基磷酸氨基酸酯的结构式为：
其中，R是氢，甲基，异丙基，或苄基。
3.如权利要求2所述的(+)-Brefeldin A-4,7-二羟基磷酸氨基酸酯的合成方法，其特征在于包括以下步骤：
a）冰水浴，惰性气体保护下，将(+)-Brefeldin A、磷酰化氨基酸和4-二甲氨基吡啶溶解于第一有机溶剂中，所述(+)-Brefeldin A、磷酰化氨基酸和4-二甲氨基吡啶的摩尔配比1∶4∶0.1；
b）在冰浴条件下，将二环己基碳二亚胺的有机溶剂加入步骤a）所得的混合物中，反应后，得4,7-二羟基磷酸氨基酸酯-(+)-Brefeldin A；
c）步骤b）反应后，过滤掉不溶物，减压，浓缩，除去有机溶剂，产物质量用5%的第二有机溶剂溶解，进行硅胶柱层析分离，得到4,7-二羟基磷酸氨基酸酯-(+)-Brefeldin A。
4.如权利要求3所述的(+)-Brefeldin A-4,7-二羟基磷酸氨基酸酯的合成方法，其特征在于在步骤a）中，所述第一有机溶剂选自二氯甲烷、DMF中的一种；所述磷酰化氨基酸选自磷酰化甘氨酸、磷酰化丙氨酸、磷酰化缬氨酸、磷酰化苯丙氨酸中的一种；
在步骤b）中，所述二环己基碳二亚胺的有机溶剂可选自二氯甲烷、DMF中的一种；
在步骤c）中，所述第二有机溶剂可选自二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、氯仿中的一种。
5.如权利要求2所述的(+)-Brefeldin A-4-羟基磷酸氨基酸酯的合成方法，其特征在于包括以下步骤：
a）将(+)-Brefeldin A、咪唑和叔丁基二甲基氯硅烷在第一有机溶剂中反应后，再加入第二有机溶剂后，洗涤，有机相减压浓缩，剩余物柱层析分离得到7-O-叔丁基二甲基硅(+)-Brefeldin A；
b)在惰性气体保护下，将步骤a）得到的7-O-叔丁基二甲基硅(+)-Brefeldin A、磷酰化氨基酸和4-二甲氨基吡啶在第二有机溶剂中形成混合物，冰浴下，加入二环己基碳二亚胺的第三有机溶剂，反应后，过滤除掉不溶物，减压浓缩，柱层析分离得到纯的7号位叔丁基二甲基硅保护的(+)-Brefeldin A-4-羟基磷酸氨基酸酯；
c）将7-O-叔丁基二甲基硅-(+)-Brefeldin A-4-O-磷酸氨基酸酯溶解在第四有机溶剂中，再加入碘单质，反应后，再加入硫代硫酸钠，直到溶液变为澄清，然后加入第五有机溶剂，再洗涤，有机相减压浓缩，剩余物柱层析分离得到(+)-Brefeldin A-4-羟基磷酸氨基酸酯。
6.如权利要求5所述的(+)-Brefeldin A-4-羟基磷酸氨基酸酯的合成方法，其特征在于在步骤a)中，所述(+)-Brefeldin A、咪唑和叔丁基二甲基氯硅烷的质量配比为280∶126～204∶165；所述的第一有机溶剂可选自DMF、DMSO中的一种；所述反应可采用薄层层析板跟踪监测反应，所述的第二有机溶剂加入量按(+)-Brefeldin A质量10mg/mL，所述第二有机溶剂为乙酸乙酯，二氯甲烷，所述洗涤可采用加入水按(+)-Brefeldin A质量10mg/mL，洗3次；
在步骤b）中，所述在惰性气体可采用氩气，所述(+)-Brefeldin A、磷酰化氨基酸和4-二甲氨基吡啶的摩尔配比可为1∶2∶0.1；所述第二有机溶剂可选自乙酸乙酯、二氯甲烷中的一种；所述的第二有机溶剂加入量按(+)-Brefeldin A质量20mg/mL所述第三有机溶剂的加入量按(+)-Brefeldin A质量10mg/mL，所述第三有机溶剂可选自二氯甲烷、氯仿、DMF中的一种；所述反应可采用薄层层析板跟踪监测反应；所述磷酰化氨基酸可选自磷酰化甘氨酸、磷酰化丙氨酸、磷酰化缬氨酸、磷酰化苯丙氨酸中的一种；
在步骤c）中，所述7-O-叔丁基二甲基硅-(+)-Brefeldin A-4-羟基磷酸氨基酸酯、碘单质、硫代硫酸钠、第四有机溶剂、第五有机溶剂的配比可为（100～300）mg∶（30～100）mg∶（10～60）mg∶（3～5）mL∶（10～30）mL；所述第四有机溶剂可选自甲醇；所述第五有机溶剂可选自乙酸乙酯、二氯甲烷中的一种；所述洗涤可采用的水洗涤加入水按(+)-BrefeldinA质量10mg/mL，洗3次。
7.如权利要求2所述的(+)-Brefeldin A-7-羟基磷酸氨基酸酯的合成方法，其特征在于包括以下步骤：
a）将(+)-Brefeldin A、咪唑和叔丁基二甲基氯硅烷在第一有机溶剂中反应后，再加入第二有机溶剂后，洗涤，有机相减压浓缩，剩余物柱层析分离得到形成4,7-O-叔丁基二甲基硅(+)-Brefeldin A；
b）将4,7-双叔丁基二甲基硅-(+)-Brefeldin A溶于THF中，加入醋酸及水，反应后将反应液减压浓缩，加入第三有机溶剂后，洗涤，有机相减压浓缩，剩余物柱层析分离得到4-O-叔丁基二甲基硅(+)-Brefeldin A；
c)在惰性气体保护下，将4号位TBS保护的(+)-Brefeldin A、磷酰化氨基酸和4-二甲氨基吡啶在第四有机溶剂中形成混合物，冰浴下，再加入二环己基碳二亚胺的第四有机溶剂，反应后，过滤除掉不溶物，减压浓缩，柱层析分离得到4号位叔丁基二甲基硅保护的(+)-Brefeldin A-7-羟基磷酸氨基酸酯；
d)将4号位TBS保护的(+)-Brefeldin A-7-羟基磷酸氨基酸酯溶解在第五有机溶剂中，再加入碘，反应后，冷却至室温，再加入硫代硫酸钠，直到溶液变为澄清，然后加入水洗涤，有机相减压浓缩，剩余物柱层析分离得到(+)-Brefeldin A-7-羟基磷酸氨基酸酯。
8.如权利要求7所述的(+)-Brefeldin A-7-羟基磷酸氨基酸酯的合成方法，其特征在于在步骤a)中，所述(+)-Brefeldin A、咪唑和叔丁基二甲基氯硅烷的摩尔配比为1∶3∶6；所述第一有机溶剂可选自DMF、DMSO中的一种；所述第二有机溶剂可选自乙酸乙酯、二氯甲烷中的一种；所述反应可采用薄层层析板跟踪监测反应，所述的第二有机溶剂加入量按(+)-Brefeldin A质量10mg/mL，所述第二有机溶剂为乙酸乙酯，二氯甲烷，所述洗涤可采用加入水按(+)-Brefeldin A质量10mg/mL，洗3次；
在步骤b）中，所述4,7号位TBS双保护的(+)-Brefeldin A、四氢呋喃、醋酸、水、第三有机溶剂的配比1mL:1mL:2mL；所述反应的条件可为在50~60℃搅拌反应24h；所述第三有机溶剂可选自乙酸乙酯、二氯甲烷中的一种；所述洗涤可依次用水、碳酸氢钠,和水洗涤；
在步骤c)中，所述惰性气体可采用氩气、氮气；所述4号位叔丁基二甲基硅保护的(+)-Brefeldin A、磷酰化氨基酸和4-二甲氨基吡啶的摩尔配比可为1∶2∶0.1；所述第四有机溶剂可选自二氯甲烷、氯仿、DMF中的一种；所述反应可采用薄层层析板跟踪监测反应；所述磷酰化氨基酸可选自磷酰化甘氨酸、磷酰化丙氨酸、磷酰化缬氨酸、磷酰化苯丙氨酸中的一种；
在步骤d）中，所述4号位叔丁基二甲基硅保护的(+)-Brefeldin A-7-羟基磷酸氨基酸酯、碘、硫代硫酸钠、第五有机溶剂、水的配比可为（100～300）mg∶（30～100）mg∶（10～60）mg∶（3～5）mL∶（10～30）mL；所述反应的条件可为50～80℃下反应10～30h；所述洗涤可采用与原料10%配比水洗涤3次；所述第五有机溶剂可选自乙酸乙酯、二氯甲烷中的一种。
9.如权利要求1所述的布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物在制备抗癌药品中的应用。
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Legal Events
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20150603 Termination date: 20160628 |