CN102731417B - 内核为炔基、外层为氨基酸的树状分子及其Huisgen 1,3-偶极环加成合成方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了内核为炔基、外层为氨基酸的树状分子及其Huisgen 1，3-偶极环加成合成方法与应用。该树状分子制备过程中合成了的外层为叠氮基的0.5代、1.5代、2.5代或3.5代树状分子；将该树状分子和组成催化体系的抗坏血酸/硫酸铜加入溶于DMF的炔基化的叔丁氧羰基-氨基酸中，使外层为叠氮基的树状分子与炔化氨基酸之间通过Huisgen1，3-偶极环加成反应而键接在一起；于15～35°C下反应4～24小时后，加入二氯甲烷稀释反应液，并用水萃取。本发明反应专一性好，反应效率高，树状分子外层带有多个氨基酸配体，使制备的吸附材料较常见的空间臂为单活性位点的吸附材料蛋白分离或血液净化效果更好。
Description
技术领域
本发明涉及Huisgen1,3‐偶极环加成反应在树状分子合成中的应用，具体而言涉及一种内核为炔基、外层为氨基酸的树状分子及其制备方法。
技术背景
树状分子是由多官能团的单体通过逐步反应得到的、高度支化的一种大分子。其结构主要包括三个部分，分别为引发反应的内核、处于树状分子最外端的外表层以及位于内核和外表层之间的内臂。它的结构具有高度的对称性和规整性，分子的形状及外层所带的官能团的数量都可以精确的控制；与传统的高分子相比，树状分子的分子量分布具有单分散性。
PAMAM是目前非常常见的一种树状大分子，其合成的基元反应主要包括两个，一个是氨基和不饱和双键之间的迈克尔加成反应，另一个是氨基与甲酯或乙酯间的转酯化反应。在PAMAM的合成中，为了减少由于位阻增大而引起树状分子结构中可能存在的缺陷，通常其中一种反应原料须大量过量。这不仅浪费反应原料，而且过量的反应原料不易清除干净，而易产生副反应，为树状分子的提纯带来困难。此外，当在PAMAM外表层连接功能性配体时，则可能会因为空间位阻的存在而使所合成的外层带功能性配体的树状分子存在结构缺陷。
针对PAMAM合成中所存在的这些问题，本发明合成的基元反应为羟基与对硝基苯基氯甲酸酯间的酯化反应及氨基与对硝基苯基活性酯间的转酯化反应。由于两个基元反应活性较高，反应原料基本无需过量，反应中生成的对硝基苯酚等副产物，可通过氢氧化钠、碳酸氢钠等除去，易于提纯。由于所合成的树状分子外层带有叠氮基，可在亚铜离子的催化作用下，通过树状分子外层的叠氮基与配体中的炔基间的Huisgen1,3‐偶极环加成反应，方便快速的连接上配体，反应专一性好、反应效率高，所得到的树状分子结构规整，基本没有结构缺陷。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺点，提供一种结构规整、易于提纯、反应专一性好、 反应效率高的内核为炔基、外层为氨基酸的树状分子及其制备方法。
本发明另一目的在于提供所述内核为炔基、外层为氨基酸的树状分子在制备蛋白分离或者血液净化材料中的应用。
本发明中的树状分子可以通过其内核的炔基与叠氮化琼脂糖等载体间的Huisgen1,3‐偶极环加成反应，制得以氨基酸为配体的亲和吸附材料。通过氨基酸配体与蛋白质分子间的静电力、疏水力、氢键等相互作用，所制备的亲和吸附材料可以与蛋白质产生吸附作用，用于蛋白质的分离提纯或人体血液净化。由于所制备的亲和吸附材料以树枝状大分子为间隔臂，使引入该类间隔臂后的载体比引入线型间隔臂的载体的外表面具有更多的活性位点，增加了配基密度，从而可以提高所制备的免疫吸附材料的吸附性能。
本发明由叠氮钠与环氧氯丙烷的开环反应得到含2个叠氮基的叠氮化合物1,3‐二叠氮基‐2‐丙醇，再通过这一叠氮化合物上的羟基与对硝基苯基氯甲酸酯之间的酯化反应、氨基和对硝基苯基活性酯间的转酯化反应合成外层为叠氮基的树状分子；通过被保护的氨基酸和炔丙醇间的酯化反应或与炔丙溴间的取代反应合成炔基化氨基酸；通过Huisgen1,3‐偶极环加成反应将炔基化氨基酸和外层为叠氮基的树状分子偶联起来；由炔丙醇和偶联后的产物间的转酯化反应及三氟乙酸对氨基的脱保护反应得到目标产物。其合成的具体过程如下：
(1)外层为叠氮基的树状分子的合成
(a)1,3‐二叠氮基‐2‐丙醇的合成
将叠氮钠溶于水中，加入乙腈及环氧氯丙烷；然后升温反应。反应结束后，经萃取、干燥和旋转蒸发，得到含2个叠氮基的叠氮化合物1,3‐二叠氮基‐2‐丙醇。反应方程如下：
(b)外层为叠氮基的树状分子的合成
将1,3‐二叠氮基‐2‐丙醇溶于二氯甲烷中，冰浴下滴加溶于二氯甲烷的对硝基苯基氯甲酸酯；反应一段时间后，加入三乙胺及4‐二甲氨基吡啶(DMAP)，再于室温下反应。反应结束后，经萃取、干燥、蒸馏和柱层析纯化，得到外层为叠氮基的0.5代树状分子(G0.5‐N3)。
将三乙胺、DMAP和溶于二氯甲烷的树状分子G0.5‐N3加入溶于DMF的2‐羟基‐1,3‐丙二胺中，室温反应。反应结束后，经萃取、干燥、蒸馏和柱层析，得到外层为叠氮基的1代树状分子(G1‐N3)。重复这两个步骤，可合成外层为叠氮基的1.5代、2.5代、3.5代树 状分子。反应方程式如下所示：
合成得到的外层为叠氮基的树状分子的代数分别为0.5代、1.5代、2.5代和3.5代，分别与结构通式(1)中n＝0、n＝1、n＝2和n＝3时的代数相对应。
(2)炔基化的叔丁氧羰基‐氨基酸(Alkynyl‐boc‐amino)的合成
(a)叔丁氧羰基‐氨基酸(boc‐amino)的合成
将氨基酸加入水和1,4‐二氧六环的混合溶液中，再加入三乙胺；当氨基酸完全溶解后，在冰浴下滴加溶于1,4‐二氧六环的二碳酸二叔丁酯，反应一段时间后升至室温；在室温下反应一段时间后减压蒸馏，然后往所得到的粗产物中加入水，并调节pH，再经萃取、干燥和减压蒸馏，得到化合物叔丁氧羰基‐氨基酸(boc‐amino)。
(b)炔基化的叔丁氧羰基‐氨基酸(Alkynyl‐boc‐amino)的合成
方法1：酯化法
将上述所合成的叔丁氧羰基‐氨基酸溶于无水二氯甲烷中，冰浴下加入炔丙醇和二环己基碳二亚胺(DCC)；在冰浴下反应一段时间后升至室温；反应一段时间后，经过滤、蒸馏和柱层析纯化，得到炔基化的叔丁氧羰基‐氨基酸(Alkynyl‐boc‐amino)。
方法2：亲核取代法
将上述所合成的叔丁氧羰基‐氨基酸溶于N,N‐二甲基甲酰胺(DMF)中，再加入无水碳酸钾；在氮气氛围下室温反应一段时间后，加入炔丙溴；反应一段时间后，经萃取、干燥 和蒸馏，得到炔基化的叔丁氧羰基‐氨基酸(Alkynyl‐boc‐amino)。
化合物炔基化的叔丁氧羰基‐氨基酸(Alkynyl‐boc‐amino)的反应方程式如下所示：
(3)内核为对硝基苯基、外层为叔丁氧羰基‐氨基酸的树状分子(G‐boc‐amino)的合成
将抗坏血酸、硫酸铜及外层为叠氮基的0.5代、1.5代、2.5代或3.5代树状分子加入溶于DMF的Alkynyl‐boc‐amino中，室温反应；反应一段时间后，加入二氯甲烷稀释反应体系；再经萃取、干燥和蒸馏，分别得到内核为对硝基苯基、外层为叔丁氧羰基‐氨基酸的1代、2代、3代或4代树状分子。反应方程式如下所示：
合成所得的内核为对硝基苯基、外层为叔丁氧羰基‐氨基酸的树状分子的代数分别为1代、2代、3代和4代，分别与结构通式(1)中n＝0、n＝1、n＝2和n＝3时的代数相对应。
(4)内核为炔基、外层为叔丁氧羰基‐氨基酸的树状分子(Alkynyl‐G‐boc‐amino)的合 成
将三乙胺、溶于二氯甲烷中的1代、2代、3代或4代内核为对硝基苯基、外层为叔丁氧羰基‐氨基酸的树状分子和DMAP加入炔丙醇中，室温反应。反应结束后，经萃取、干燥、抽滤和蒸馏，分别得到内核为炔基、外层为叔丁氧羰基‐氨基酸的1代、2代、3代或4代树状分子。反应方程式如下所示：
合成所得的内核为炔基、外层为叔丁氧羰基‐氨基酸的树状分子的代数分别为1代、2代、3代、4代，分别与结构通式(1)中n＝0、n＝1、n＝2、n＝3时的代数相对应。
(5)内核为炔基、外层为氨基酸的树状分子(Alkynyl‐G‐amino)的合成
将内核为炔基、外层为叔丁氧羰基‐氨基酸的1代、2代、3代或4代树状分子溶于二氯甲烷中，室温下加入三氟乙酸。反应结束后，旋转蒸发除去三氟乙酸与二氯甲烷，分别得到内核为炔基、外层为氨基酸的1代、2代、3代或4代树状分子。该产物为淡黄色油状物。反应方程式如下所示：
其中，步骤(3)、(4)、(5)的反应方程式中的n为0、1、2、3；
R1为叔丁氧羰基‐氨基酸残基，氨基酸种类包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、氨基酸、赖氨酸、精氨酸、L‐组氨酸、天冬氨酸及谷氨酸。
R为氨基酸残基，包括：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、氨基酸、赖氨酸、精氨酸、L‐组氨酸、天冬氨酸及谷氨酸。
合成所得的内核为炔基、外层为氨基酸的树状分子的代数分别为1代、2代、3代、4代，分别与结构通式(1)中n＝0、n＝1、n＝2、n＝3，R为氨基酸残基时的产物一致。
本发明的目的通过如下技术方案实现。
内核为炔基、外层为氨基酸的树状分子，其结构通式(1)为：
其中：n为0、1、2或3；
R为氨基酸残基，包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、氨基酸、赖氨酸、精氨酸、L‐组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸中的一种或多种。
所述的内核为炔基、外层为氨基酸的树状分子的Huisgen1,3‐偶极环加成合成方法，包括如下的步骤及工艺条件：
(1)外层为叠氮基的树状分子的合成
将叠氮钠溶于水中，加入乙腈及环氧氯丙烷；在60～95℃下反应24～48小时后，旋转蒸发除去反应体系中的乙腈，再用乙酸乙酯萃取；萃取后将油相经干燥、抽滤和减压蒸馏， 得到1,3‐二叠氮基‐2‐丙醇；所述叠氮钠与环氧氯丙烷的摩尔比为3∶1.5～2；
将1,3‐二叠氮基‐2‐丙醇溶于二氯甲烷中，在‐5～10℃下滴加溶于二氯甲烷的对硝基苯基氯甲酸酯；在‐5～10℃下反应30～60分钟后，加入三乙胺及4‐二甲氨基吡啶(DMAP)；在15～35℃下反应12～72小时后，分别用盐酸溶液与饱和碳酸氢钠溶液萃取；萃取后将油相经干燥、抽滤、旋转干燥和柱层析纯化，得到外层为叠氮基的0.5代树状分子(G0.5‐N3)；所述1,3‐二叠氮基‐2‐丙醇、对硝基苯基氯甲酸酯、三乙胺和4‐二甲氨基吡啶的摩尔比为1∶1～2∶1～3∶0.001～0.1；
将三乙胺、4‐二甲氨基吡啶和溶于二氯甲烷的外层为叠氮基的0.5代树状分子加入溶于N,N‐二甲基甲酰胺的2‐羟基‐1,3‐丙二胺中；在15～35℃下反应1～24小时后，反应体系分别用盐酸溶液及氢氧化钠溶液萃取；然后，经干燥、抽滤、旋转干燥和柱层析纯化，得到外层为叠氮基的1代树状分子(G1‐N3)；
以外层为叠氮基的1代树状分子(G1‐N3)为起始反应物，重复外层为叠氮基的0.5代树状分子的合成步骤，得到外层为叠氮基的1.5代树状分子(G1.5‐N3)；
以外层为叠氮基的1.5代树状分子(G1.5‐N3)为起始反应物，重复外层为叠氮基的1代树状分子(G1‐N3)的合成步骤，得到外层为叠氮基的2代树状分子(G2‐N3)；
以外层为叠氮基的2代树状分子为起始反应物，重复外层为叠氮基的0.5代树状分子的合成步骤，得到外层为叠氮基的2.5代树状分子(G2.5‐N3)；
以外层为叠氮基的2.5代树状分子为起始反应物，重复外层为叠氮基的1代树状分子的合成步骤，得到外层为叠氮基的3代树状分子(G3‐N3)；
以外层为叠氮基的3代树状分子为起始反应物，外层为叠氮基的0.5代树状分子的合成步骤，得到外层为叠氮基的3.5代树状分子(G3.5‐N3)；
合成得到的外层为叠氮基的树状分子的代数分别为0.5代、1.5代、2.5代及3.5代，分别与结构通式(1)中n＝0、n＝1、n＝2、n＝3时的代数相对应。
(2)炔基化的叔丁氧羰基‐氨基酸(Alkynyl‐boc‐amino)的合成
将氨基酸加入水和1,4‐二氧六环体积比为1:1～1:5的混合溶液中，再加入三乙胺；当氨基酸完全溶解后，在‐5～10℃下滴加溶于1,4‐二氧六环的二碳酸二叔丁酯，滴加完毕后，在‐5～10℃下继续反应30～60分钟；然后，在15～35℃下反应3～48小时。反应结束后，减压蒸馏，调节pH至1～7；然后，经萃取、干燥和减压蒸馏，得到化合物叔丁氧羰基‐氨基酸；所述氨基酸、三乙胺和二碳酸二叔丁酯的摩尔比为1∶1～4∶1～3；
将叔丁氧羰基‐氨基酸溶于无水二氯甲烷中，在‐5～10℃下加入炔丙醇和溶于无水二氯 甲烷的二环己基碳二亚胺(DCC)；反应30～60分钟后，撤去冰浴；升温至15～35℃下反应12～48小时。反应结束后，经过滤、减压蒸馏和柱层析，得到炔基化的叔丁氧羰基‐氨基酸(Alkynyl‐boc‐amino)；所述叔丁氧羰基‐氨基酸、炔丙醇和二环己基碳二亚胺的摩尔比为1∶1～2∶1～2；
或者将叔丁氧羰基‐氨基酸溶于N,N‐二甲基甲酰胺中，加入无水碳酸钾；在氮气氛围中室温反应30～60分钟后，加入炔丙溴；继续于室温下反应12～48小时后，加入二氯甲烷，再用水萃取；萃取后将油相经干燥、抽滤、减压蒸馏和柱层析，得到炔基化的叔丁氧羰基‐氨基酸(Alkynyl‐boc‐amino)；所述叔丁氧羰基‐氨基酸、无水碳酸钾和炔丙溴的摩尔比为1∶1～2∶1～2；
(3)内核为对硝基苯基、外层为叔丁氧羰基‐氨基酸的树状分子(G‐boc‐amino)的合成
将抗坏血酸、硫酸铜和外层为叠氮基的0.5代、1.5代、2.5代或3.5代树状分子加入溶于DMF的所述炔基化的叔丁氧羰基‐氨基酸中；于15～35℃下反应4～24小时后，加入二氯甲烷稀释反应体系，再用水萃取；萃取后的油相用无水硫酸镁干燥；然后，经抽滤和旋转干燥，分别得到1代、2代、3代或4代内核为对硝基苯基、外层为叔丁氧羰基‐氨基酸的树状分子。
当外层为叠氮基的树状分子为0.5代时，所得产物为内核为对硝基苯基、外层为叔丁氧羰基‐氨基酸的1代树状分子(G1‐boc‐amino)；当外层为叠氮基的树状分子为1.5代时，所得产物为内核为对硝基苯基、外层为叔丁氧羰基‐氨基酸的2代树状分子(G2‐boc‐amino)；当外层为叠氮基的树状分子为2.5代时，所得产物为内核为对硝基苯基、外层为叔丁氧羰基‐氨基酸的3代树状分子(G3‐boc‐amino)；当外层为叠氮基的树状分子为3.5代时，所得产物为内核为对硝基苯基、外层为叔丁氧羰基‐氨基酸的4代树状分子(G4‐boc‐amino)。
合成所得的内核为对硝基苯基、外层为叔丁氧羰基‐氨基酸的树状分子的代数分别为1代、2代、3代、4代，分别与结构通式(1)中n＝0、n＝1、n＝2、n＝3时的代数相对应。
(4)内核为炔基、外层为叔丁氧羰基‐氨基酸的树状分子(Alkynyl‐G‐boc‐amino)的合成
将三乙胺、溶于二氯甲烷中的1代、2代、3代或4代内核为对硝基苯基、外层为叔丁氧羰基‐氨基酸的树状分子和4‐二甲氨基吡啶(DMAP)加入炔丙醇中，于15～35℃下反应1～24小时后，反应体系用HCl溶液和NaOH溶液萃取；然后，经干燥、抽滤和旋转干燥，分别得到内核为炔基、外层为叔丁氧羰基‐氨基酸的1代、2代、3代或4代树状分子 (Alkynyl‐G‐boc‐amino)。
当内核为对硝基苯基、外层为叔丁氧羰基‐氨基酸的树状分子(G‐boc‐amino)为1代时，所得产物为内核为炔基、外层为叔丁氧羰基‐氨基酸的1代树状分子(Alkynyl‐G1‐boc‐amino)；当内核为对硝基苯基、外层为叔丁氧羰基‐氨基酸的树状分子(G‐boc‐amino)为2代时，所得产物为内核为炔基、外层为叔丁氧羰基‐氨基酸的2代树状分子(Alkynyl‐G2‐boc‐amino)；当内核为对硝基苯基、外层为叔丁氧羰基‐氨基酸的树状分子(G‐boc‐amino)为3代时，所得产物为内核为炔基、外层为叔丁氧羰基‐氨基酸的3代树状分子(Alkynyl‐G3‐boc‐amino)；当内核为对硝基苯基、外层为叔丁氧羰基‐氨基酸的树状分子(G‐boc‐amino)为4代时，所得产物为内核为炔基、外层为叔丁氧羰基‐氨基酸的4代树状分子(Alkynyl‐G4‐boc‐amino)。
合成所得的树状分子的代数分别为1代、2代、3代、4代，分别与结构通式(1)中n＝0、n＝1、n＝2、n＝3时的代数相对应。
(5)内核为炔基、外层为氨基酸(Alkynyl‐G‐amino)的树状分子的合成
将内核为炔基、外层为叔丁氧羰基‐氨基酸的1代、2代、3代或4代树状分子(Alkynyl‐G‐boc‐amino)溶于二氯甲烷中，加入三氟乙酸，于15～35℃下反应1～12小时后，蒸馏除去三氟乙酸与二氯甲烷，分别得到内核为炔基、外层为氨基酸的1代、2代、3代或4代树状分子。
当内核为炔基、外层为氨基酸的树状分子(Alkynyl‐G‐boc‐amino)为1代时，所得产物为内核为炔基、外层为氨基的1代树状分(Alkynyl‐G1‐amino)，与权利要求1结构式中n＝0的产物一致；当内核为炔基、外层为氨基酸的树状分子(Alkynyl‐G‐boc‐amino)为2代时，所得产物为内核为炔基、外层为氨基的2代树状分(Alkynyl‐G2‐amino)，与结构通式(1)中n＝1的产物一致；当内核为炔基、外层为氨基酸的树状分子(Alkynyl‐G‐boc‐amino)为3代时，所得产物为内核为炔基、外层为氨基的3代树状分(Alkynyl‐G3‐amino)，与结构通式(1)中n＝2的产物一致；当内核为炔基、外层为氨基酸的树状分子(Alkynyl‐G‐boc‐amino)为4代时，所得产物为内核为炔基、外层为氨基的4代树状分(Alkynyl‐G4‐amino)，与结构通式(1)中n＝3的产物一致。
进一步地，步骤(2)所述氨基酸为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、氨基酸、赖氨酸、精氨酸、L‐组氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。
步骤(1)所述1,3‐二叠氮基‐2‐丙醇、对硝基苯基氯甲酸酯、三乙胺和4‐二甲氨基吡啶的摩尔比优选为1∶1～2∶1～3∶0.001～0.1。
步骤(1)所述三乙胺、4‐二甲氨基吡啶、外层为叠氮基的0.5代树状分子、2‐羟基‐1,3‐丙二胺的摩尔比优选为1～3∶0.001～0.1∶1∶1～1.5。
步骤(3)所述外层为叠氮基的0.5代、1.5代、2.5代或3.5代树状分子、炔基化的叔丁氧羰基‐氨基酸、抗坏血酸和硫酸铜的摩尔比优选为1∶m～2m∶0.12m～0.24m∶0.06m～0.12m；其中，m为树状分子外层叠氮基的个数。
步骤(4)所述1代、2代、3代或4代内核为对硝基苯基、外层为叔丁氧羰基‐氨基酸的树状分子、三乙胺、4‐二甲氨基吡啶和炔丙醇的摩尔比优选为1∶1～3∶0.001～0.1∶1～1.5。
步骤(5)所述内核为炔基、外层为叔丁氧羰基‐氨基酸的1代、2代、3代或4代树状分子与三氟乙酸的摩尔比优选为1∶1～1.5m；其中，m为树状分子外层叔丁氧羰基‐氨基酸的数量。
所述内核为炔基、外层为氨基酸的树状分子在制备蛋白质分离或者血液净化用的亲和吸附材料中的应用。
相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明反应活性较高，反应原料基本无需过量，反应中生成的对硝基苯酚等副产物，可通过氢氧化钠、碳酸氢钠等除去，易于提纯。
(2)Huisgen1,3‐偶极环加成反应专一性好，反应效率非常高，所合成的外层为氨基酸、内核为炔基的树状分子的外层基本上不存在任何的缺陷，外层氨基酸配体的数量可精确确定。
(3)所合成的树状分子的内核为炔基，是“可点击”的反应模块，可通过Huisgen1,3‐偶极环加成反应与叠氮化的琼脂糖等固相载体实现高效、高选择性的偶合，制备一种用于蛋白质分离或者血液净化的亲和吸附材料。
(4)由于Huisgen1,3‐偶极环加成反应专一性好，反应活性高，使树状分子反应模块与载体偶合时较普通的环氧开环、活性酯转酯化等偶合法的副反应少。此外，由于树状分子外层带有多个氨基酸配体，使所制备的吸附材料与常见的以仅具有单一活性位点的线型分子为空间臂的吸附材料相比，具有更高的配体密度，从而表现出更优异的蛋白质分离或血液净化效果。
附图说明
图1为实施例1内核为炔基、外层为叔丁氧羰基‐苯丙氨酸的1代树状分子的1H NMR谱图；
图2为实施例1内核为炔基、外层为叔丁氧羰基‐苯丙氨酸的1代树状分子的13C NMR 谱图；
图3为实施例1内核为炔基、外层为叔丁氧羰基‐苯丙氨酸的1代树状分子的MS谱图；
图4为实施例1内核为炔基、外层为叔丁氧羰基‐苯丙氨酸的2代树状分子的1H NMR谱图；
图5为实施例1内核为炔基、外层为叔丁氧羰基‐苯丙氨酸的2代树状分子的13C NMR谱图；
图6为实施例1内核为炔基、外层为叔丁氧羰基‐苯丙氨酸的2代树状分子的MS谱图。
具体实施方式
以下详述本发明的实施例子。应理解的是，本发明的实施例用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质而进行的改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1：内核为炔基、外层为苯丙氨酸的树状分子的合成方法
(1)外层为叠氮基的树状分子的合成
(a)1,3‐二叠氮基‐2‐丙醇(C‐1)的合成
将2.356g(36.2mmol)叠氮钠溶于15.0ml H2O，1.340g(14.5mmol)环氧氯丙烷溶于15.0ml乙腈；将两者混合，在85±3℃下反应36小时后，旋转蒸发除去反应体系中的乙腈；用50ml乙酸乙酯萃取一次，再用25ml水萃取三次；萃取后的油相用无水MgSO4干燥后，经抽滤和蒸馏，得到化合物1,3‐二叠氮基‐2‐丙醇(C‐1)1.466g。
(b)外层为叠氮基的0.5代树状分子(G0.5‐N3)的合成
将1.552g(7.7mmol)对硝基苯基氯甲酸酯和0.998g(7.0mmol)1,3‐二叠氮基‐2‐丙醇分别溶于5.0ml二氯甲烷和7.0ml二氯甲烷中；在0～5℃的冰浴下慢慢滴加对硝基苯基氯甲酸酯溶液至1,3‐二叠氮基‐2‐丙醇溶液中，反应30分钟后，撤去冰浴；加入1.423g(14.1mmol)三乙胺和0.087g(0.710mmol)的DMAP；室温反应48小时后，反应体系分别用25ml1.0mol/L的HCl溶液和25ml饱和NaHCO3溶液各萃取三次；萃取后的油相用无水MgSO4干燥，再经抽滤和减压蒸馏得到粗产物；所得粗产物经柱层析纯化后，得外层为叠氮基的0.5代树状分子(G0.5‐N3)1.366g。
(c)外层为叠氮基的1代树状分子(G1‐N3)的合成
将3.369g(11.0mmol)外层为叠氮基的树状分子(G0.5‐N3)和0.520g(5.8mmol)2‐羟基‐1,3‐丙二胺分别溶于17.0ml二氯甲烷与2.0ml DMF中；室温下将化合物2‐羟基‐1，3‐丙二胺溶液、2.222g(22.0mmol)三乙胺和135g(1.110mmol)的DMAP加入化合物G0.5‐N3的溶液中；反应3小时后，反应体系分别用25ml0.5mol/L的HCl溶液和25ml1mol/L的 NaOH溶液各萃取三次；萃取后的油相用无水MgSO4干燥，再经抽滤、减压蒸馏和柱层析纯化，即得外层为叠氮基的1代树状分子(G1‐N3)1.834g。
(d)外层为叠氮基的1.5代树状分子(G1.5‐N3)的合成
将1.023g(3.3mmol)外层为叠氮基的树状分子(G1‐N3)溶于7ml二氯甲烷；在0℃冰浴下慢慢滴加溶于5ml二氯甲烷的对硝基苯基氯甲酸酯(0.998g，5.0mmol)；在冰浴下反应30分钟后，撤去冰浴，加入0.667g(6.6mmol)三乙胺和0.040g(0.330mmol)的DMAP；于室温下反应48小时后，反应体系用50ml1.0mol/L的HCl溶液和50ml饱和NaHCO3溶液各萃取三次；萃取后的油相用无水硫酸镁干燥，再经抽滤、旋转干燥和柱层析纯化，最后得到外层为叠氮基的1.5代树状分子(G1.5‐N3)0.979g。
(2)炔基化的叔丁氧羰基‐苯丙氨酸(Alkynyl‐boc‐Phe)的合成
(a)叔丁氧羰基‐苯丙氨酸的合成
将1.002g(6.1mmol)苯丙氨酸(Phe)和1.232g(12.2mmol)三乙胺加入20.0ml体积比为1:1的H2O和1,4‐二氧六环混合溶剂中；待苯丙氨酸完全溶解后，在0～5℃的冰浴下慢慢滴加1.995g(9.2mmol)溶于3.0ml1,4‐二氧六环的二碳酸二叔丁酯；滴加完毕后，在冰浴下继续反应30分钟，再撤去冰浴，室温搅拌；待苯丙氨酸中的氨基反应完全后，旋转蒸发除去反应体系中的1,4‐二氧六环；然后，用0.5mol/L的HCl溶液调节pH至2左右，再用20ml乙酸乙酯萃取三次；所得油相用无水MgSO4干燥后，经抽滤和减压蒸馏，得叔丁氧羰基‐苯丙氨酸粗产物。
(b)炔基化的叔丁氧羰基‐苯丙氨酸(Alkynyl‐boc‐Phe)的合成
炔基化的叔丁氧羰基‐苯丙氨酸(Alkynyl‐boc‐Phe)的合成可通过如下两种方法中任意一种方法合成炔基化的叔丁氧羰基‐苯丙氨酸。
方法1：酯化法
将上述所合成的叔丁氧羰基‐苯丙氨酸粗产物和1.570g(7.6mmol)二环己基碳二亚胺(DCC)分别溶于7ml无水二氯甲烷和3ml无水二氯甲烷中；将叔丁氧羰基‐苯丙氨酸粗产物的溶液置于‐5℃的冰浴下，再加入0.429g(7.6mmol)炔丙醇和二环己基碳二亚胺(DCC)溶液；反应60分钟后，撤去冰浴；再于25℃下反应24小时；过滤除去反应中所生成的二环己基脲(DCU)，将滤液进行旋转蒸发，所得油状物用4ml乙酸乙酯溶解，滤去不溶物；将滤液经旋转干燥和柱层析纯化，得到炔基化的叔丁氧羰基‐苯丙氨酸(Alkynyl‐boc‐Phe)1.262g。
方法2：亲核取代法
将上述所合成的叔丁氧羰基‐苯丙氨酸粗产物溶于6ml DMF，并加入1.051g(7.6mmol)无水碳酸钾；在氮气氛围中室温反应30分钟；加入炔丙溴(0.906g，7.6mmol)，继续于室温下反应24小时；然后，加入30ml二氯甲烷，再用25ml水萃取三次；萃取后的油相用无水硫酸镁干燥，再经抽滤、旋转蒸发和柱层析纯化，得到炔基化的叔丁氧羰基‐苯丙氨酸(Alkynyl‐boc‐Phe)0.946g。
(3)内核为炔基、外层为苯丙氨酸的1代树状分子(Alkynyl‐G1‐Phe)的合成
(a)内核为对硝基苯基活性酯、外层为叔丁氧羰基‐苯丙氨酸的1代树状分子(G1‐boc‐Phe)的合成
将0.998g(3.3mmol)1,3‐二叠氮基‐2‐丙醇(C‐1)和1.974g(6.5mmol)炔基化的叔丁氧羰基‐苯丙氨酸(Alkynyl‐boc‐Phe)分别溶于4ml DMF和6ml DMF中，将二者混合均匀；再加入0.138g(0.8mmol)抗坏血酸钠和0.098g(0.4mmol)硫酸铜；于室温下反应4小时；加入30ml二氯甲烷结束反应，再用30ml水萃取六次；所得油相用无水硫酸镁干燥，再经抽滤和旋转蒸发，最终得到内核为对硝基苯基活性酯、外层为叔丁氧羰基‐苯丙氨酸的1代树状分子(G1‐boc‐Phe)1.781g。
(b)内核为炔基、外层为叔丁氧羰基‐苯丙氨酸的1代树状分子(Alkynyl‐G1‐boc‐Phe)的合成
将2.0g(2.2mmol)内核为对硝基苯基活性酯、外层为叔丁氧羰基‐苯丙氨酸的1代树状分子(G1‐boc‐Phe)溶于5ml二氯甲烷，再加入0.245g(4.4mmol)炔丙醇、0.442g(4.4mmol)三乙胺和0.027g(0.220mmol)的DMAP；在25℃下反应7小时。反应结束后，用30ml0.5mol/L的HCl溶液和30ml1.0mol/L的NaOH溶液各萃取三次，除去反应体系中的三乙胺和对硝基苯酚；所得油相经干燥、抽滤、旋转蒸发和柱层析纯化，最终得到内核为炔基、外层为叔丁氧羰基‐苯丙氨酸的1代树状分子(Alkynyl‐G1‐boc‐Phe)1.402g。
图1为内核为炔基、外层为叔丁氧羰基‐苯丙氨酸的1代树状分子(Alkynyl‐G1‐boc‐Phe)的1H NMR谱图，图2为该树状分子的13C NMR谱图，图3为该树状分子的MS谱图。对1HNMR、13C NMR及MS谱图的分析如下所示。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ：7.62(s,2H,2CH),δ：7.28～7.24(m,6H,2C6H5),δ：7.10(s,4H,C6H5),δ：5.49(s,1H,CH),δ：5.29(s,4H,2CH2),δ：5.00(s,2H,2NH),δ：4.73～4.69(m,4H,2CH,CH2),δ：4.59(s,4H,2CH2),δ：3.13～3.02(m,4H,2CH2),δ：2.63(m,1H,CH),δ：1.41(s,18H,6CH3)。
13C NMR(400MHz,CDCl3):δ：171.19,155.13,153.07,142.79,135.93,129.34,128.53,127.01,125.64,80.03,73.94,58.19,56.25,54.50,53.49,49.79,38.12,28.27。
MS(MALDI‐TOF):854[M+Na]+，867[M+K]+。
通过该树状分子的1H NMR、13C NMR及MS谱图的分析可知，所得产物为目标产物。
(c)内核为炔基、外层为苯丙氨酸的1代树状分子Alkynyl‐G1‐Phe的合成
将1.035g(1.3mmol)内核为炔基、外层为叔丁氧羰基‐苯丙氨酸的1代树状分子(Alkynyl‐G1‐boc‐Phe)溶于5ml无水二氯甲烷中，再加入0.228g(2.0mmol)三氟乙酸；在25℃下反应6小时后，通过旋转蒸发除去三氟乙酸和二氯甲烷，得到内核为炔基、外层为苯丙氨酸的1代树状分子(Alkynyl‐G1‐Phe)0.503g。该产物与权利要求1中n＝0、R为苯丙氨酸残基时的产物一致。
(4)内核为炔基、外层为苯丙氨酸的2代树状分子(Alkynyl‐G2‐Phe)的合成
(a)内核为对硝基苯基活性酯、外层为叔丁氧羰基‐苯丙氨酸的2代树状分子(G2‐boc‐Phe)的合成
将1.567g(2.7mmol)外层为叠氮基的1.5代树状分子(G1.5‐N3)和3.272g(10.8mmol)炔基化的叔丁氧羰基‐苯丙氨酸(Alkynyl‐boc‐Phe)分别溶于5.0ml DMF和8.0ml DMF中，再加入0.228g(1.3mmol)抗坏血酸和0.162g(0.6mmol)硫酸铜；在室温下反应4小时后，加入30.0ml二氯甲烷稀释反应体系，再用25ml水萃取六次；萃取后的二氯甲烷溶液用无水MgSO4干燥，再经抽滤和减压蒸馏，得内核为对硝基苯基活性酯、外层为叔丁氧羰基‐苯丙氨酸的2代树状分子(G2‐boc‐Phe)4.362g。
(b)内核为炔基、外层为叔丁氧羰基‐苯丙氨酸的2代树状分子(Alkynyl‐G2‐boc‐Phe)的合成
将2.151g(1.2mmol)内核为对硝基苯基活性酯、外层为叔丁氧羰基‐苯丙氨酸的2代树状分子(G2‐boc‐Phe)溶于10.0ml二氯甲烷中，再加入0.134g(2.4mmol)炔丙醇、0.242g(2.4mmol)三乙胺和0.017g(0.012mmol)的DMAP；于室温下反应7小时后，反应体系用20ml0.5mol/L的HCl溶液和20ml1.0mol/L的NaOH溶液各萃取三次；萃取后的二氯甲烷溶液用无水MgSO4干燥，再经抽滤、减压蒸馏，得到内核为炔基、外层为叔丁氧羰基‐苯丙氨酸的2代树状分子(Alkynyl‐G2‐boc‐Phe)1.267g。
图4为内核为炔基、外层为叔丁氧羰基‐苯丙氨酸的2代树状分子(Alkynyl‐G2‐boc‐Phe)的1H NMR谱图，图5为该树状分子的13C NMR谱图，图6为该树状分子的MS谱图。对1HNMR、13C NMR及MS谱图的分析如下所示。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ：7.78～7.72(m,4H,4CH),δ：7.23～7.21(m,12H,4C6H5),δ：7.11～7.08(m,8H,C6H5),δ：6.19(s,2H,2NH),δ：5.45(s,2H,2CH),δ：5.25(s,8H,4CH2),δ： 5.09～5.04(m,4H,4NH),δ：4.78(s,1H,CH),δ：4.65,4.53～4.47(s,m,14H,5CH2,4CH),δ：3.38(m,4H,2CH2),δ：3.08～3.00(m,8H,4CH2),δ：2.52(s,1H,CH),δ：1.36～1.34(d,36H,12CH3).
13C NMR:(400MHz,CDCl3):δ：171.83,155.20,153.71,142.65,135.94,129.34,128.64,127.05,125.86,80.125,76.29,75.58,70.45,58.42,55.73,54.57,53.47,50.23,40.81,38.09,28.32。
MS(MALDI‐TOF):1744[M+Na]+，1760[M+Na]+。.
通过内核为炔基、外层为叔丁氧羰基‐苯丙氨酸的2代树状分子(Alkynyl‐G2‐boc‐Phe) 1H NMR、13C NMR及MS谱图的分析可知，该产物为目标产物。
(c)内核为炔基、外层为苯丙氨酸的2代树状分子(Alkynyl‐G2‐Phe)的合成
将1.721g(1.0mmol)内核为炔基、外层为叔丁氧羰基‐苯丙氨酸的2代树状分子(Alkynyl‐G2‐boc‐Phe)溶于5ml二氯甲烷中，再加入0.456g(4.0mmol)三氟乙酸；在25℃下反应6小时后，旋转蒸发除去三氟乙酸和二氯甲烷，得到内核为炔基、外层为苯丙氨酸的2代树状分子(Alkynyl‐G2‐Phe)1.174g。该产物与权利要求1中n＝1、R为苯丙氨酸残基时的产物一致。
实施例2：内核为炔基、外层为L‐组氨酸的树状分子的合成
(1)外层为叠氮基的树状分子的合成
(a)1,3‐二叠氮基‐2‐丙醇(C‐1)的合成
将1.177g(18.1mmol)叠氮钠溶于15.0ml H2O中，0.837g(9.0mmol)环氧氯丙烷溶于15.0ml乙腈中；将二者混合，在95℃下反应48小时；旋转蒸发除去反应体系中的乙腈；然后，用60ml乙酸乙酯萃取一次，再用25ml水萃取三次；萃取后的油相用无水MgSO4干燥，再经抽滤、旋转蒸发，得到1,3‐二叠氮基‐2‐丙醇0.611g。
(b)外层为叠氮基的0.5代树状分子(G0.5‐N3)的合成
将2.821g(14.0mmol)对硝基苯基氯甲酸酯和0.994g(7.0mmol)1,3‐二叠氮基‐2‐丙醇分别溶于5.0ml二氯甲烷和7.0ml二氯甲烷中；将1,3‐二叠氮基‐2‐丙醇的二氯甲烷溶液置于‐5℃的冰浴中，再慢慢滴加对硝基苯基氯甲酸酯溶液；反应30分钟后，撤去冰浴，加入2.121g(21.0mmol)三乙胺和0.009g(0.074mmol)DMAP；升温至35℃下反应72小时后，反应体系分别用25ml1.0mol/L的HCl溶液和25ml饱和NaHCO3溶液各萃取三次。萃取后的油相用无水MgSO4干燥，再经抽滤和减压蒸馏得到粗产物；所得粗产物经柱层析纯化后，得到外层为叠氮基的0.5代树状分子(G0.5‐N3)1.039g。
(c)外层为叠氮基的1代树状分子(G1‐N3)的合成
将5.066g(16.5mmol)外层为叠氮基的树状分子(G0.5‐N3)和0.975g(10.8mmol)2‐羟基‐1,3‐丙二胺分别溶于17.0ml二氯甲烷和2.0ml DMF中；将2‐羟基‐1，3‐丙二胺溶液、5.002g(49.5mmol)三乙胺和0.020g(0.16mmol)DMAP加入外层为叠氮基的树状分子(G0.5‐N3)的溶液中；在室温下反应3小时；反应体系分别用25ml0.5mol/L的HCl溶液和25ml1.0mol/L的NaOH溶液各萃取三次。萃取后的油相用无水MgSO4干燥，再经抽滤、减压蒸馏，得到外层为叠氮基的1代树状分子(G1‐N3)1.994g。
(d)外层为叠氮基的1.5代树状分子(G1.5‐N3)的合成
将1.662g(8.2mmol)对硝基苯基氯甲酸酯和1.801g(4.1mmol)外层为叠氮基的1代树状分子(G1‐N3)分别溶于18.8ml二氯甲烷和15.0ml二氯甲烷中；将外层为叠氮基的1代树状分子(G1‐N3)的二氯甲烷溶液置于‐5℃的冰浴中，再慢慢滴加对硝基苯基氯甲酸酯溶液，反应30分钟后撤去冰浴，加入1.252g(12.4mmol)三乙胺和0.005g(0.04mmol)DMAP；在室温下反应72小时；反应体系用50ml1.0mol/L的HCl溶液和50ml饱和NaHCO3溶液各萃取三次。萃取后的油相用无水硫酸镁干燥，再经抽滤、旋转蒸发和柱层析纯化，最后得外层为叠氮基的1.5代树状分子(G1.5‐N3)0.979g。
(2)炔基化的叔丁氧羰基‐L‐组氨酸(Alkynyl‐boc‐His)的合成
(a)叔丁氧羰基‐L‐组氨酸的合成
将1.891g(12.2mmol)L‐组氨酸(His)和4.903g(48.8mmol)三乙胺加入20.0ml体积比为1:1的H2O和1,4‐二氧六环的混合溶剂中；待L‐组氨酸完全溶解后，置于‐5℃的冰浴中，再慢慢滴加7.975g(36.6mmol)溶于20ml1,4‐二氧六环的二碳酸二叔丁酯；滴加完毕后，在冰浴中继续反应30分钟，撤去冰浴，室温搅拌；待L‐组氨酸中氨基反应完全后，旋转蒸发除去反应体系中的1,4‐二氧六环；然后，用0.5mol/L的HCl溶液调节pH至7左右，用20ml乙酸乙酯萃取三次。所得油相用无水MgSO4干燥，再经抽滤和减压蒸馏，得到叔丁氧羰基‐L‐组氨酸粗产物。
(b)炔基化的叔丁氧羰基‐L‐组氨酸(Alkynyl‐boc‐His)的合成
炔基化的叔丁氧羰基‐L‐组氨酸(Alkynyl‐boc‐His)的合成可通过以下两种方法中任意一种方法实现。
方法1：酯化法
将上述所合成的叔丁氧羰基‐L‐组氨酸粗产物和5.025g(24.4mmol)二环己基碳二亚胺(DCC)分别溶于20.0ml二氯甲烷和3.0ml二氯甲烷中；将叔丁氧羰基‐L‐组氨酸粗产物的溶液置于‐5℃的冰浴下，再加入1.366g(24.4mmol)炔丙醇和二环己基碳二亚胺(DCC) 溶液；反应60分钟后，撤去冰浴；于35℃下反应48小时；过滤除去反应中所生成的DCU；再将滤液旋转蒸发除去二氯甲烷；所得油状物用4ml乙酸乙酯溶解，滤去不溶物；然后，通过旋转蒸发和柱层析纯化，得到炔基化的叔丁氧羰基‐L‐组氨酸(Alkynyl‐boc‐His)1.874g。
方法2：亲核取代法
将上述所合成的叔丁氧羰基‐L‐组氨酸粗产物溶于9.0ml DMF，再加入3.367g(24.4mmol)无水碳酸钾；在氮气氛围中室温反应60分钟；加入2.905g(24.4mmol)炔丙溴，继续于室温下反应48小时；然后，加入30ml二氯甲烷，再用25ml水萃取三次；萃取后的油相用无水硫酸镁干燥，再经抽滤、旋转蒸发和柱层析纯化，得到炔基化的叔丁氧羰基‐L‐组氨酸(Alkynyl‐boc‐His)1.688g。
(3)内核为对硝基苯基活性酯、外层为叔丁氧羰基‐L‐组氨酸的2代树状分子(G2‐boc‐His)的合成
将2.556g(4.32mmol)外层为叠氮基的1.5树状分子(G1.5‐N3)和13.583g(34.6mmol)化合物Alkynyl‐boc‐His分别溶于5.0ml DMF和8.0ml DMF中，再加入0.732g(4.16mmol)抗坏血酸和0.480g(1.9mmol)硫酸铜；在室温下反应4小时后，加入30.0ml二氯甲烷，再用25ml水萃取三次。萃取后得到的油相用无水MgSO4干燥，再经抽滤和减压蒸馏，得到内核为对硝基苯基活性酯、外层为叔丁氧羰基‐L‐组氨酸的2代树状分子(G2‐boc‐His)6.746g。
(4)内核为炔基、外层为叔丁氧羰基‐L‐组氨酸的2代树状分子(Alkynyl‐G2‐boc‐His)的合成
将2.596g(1.2mmol)内核为对硝基苯基活性酯、外层为叔丁氧羰基‐L‐组氨酸的2代树状分子(G2‐boc‐His)溶于10.0ml二氯甲烷，再加入0.102g(1.8mmol)炔丙醇、0.363g(3.6mmol)三乙胺和0.002g(0.016mmol)DMAP；于室温下反应24小时；反应体系用20ml0.5mol/L的HCl溶液和20ml1.0mol/L的NaOH溶液各萃取三次。萃取后得到的油相用无水MgSO4干燥，再经抽滤和减压蒸馏，得到内核为炔基、外层为叔丁氧羰基‐L‐组氨酸的2代树状分子(Alkynyl‐G2‐boc‐His)1.267g。
(5)内核为炔基、外层为L‐组氨酸的2代树状分子(Alkynyl‐G2‐His)的合成
将2.085g(1.0mmol)内核为炔基、外层为叔丁氧羰基‐L‐组氨酸的2代树状分子(Alkynyl‐G2‐boc‐His)溶于5ml二氯甲烷中，再加入1.143g(10.0mmol)三氟乙酸；在35℃下反应12小时；旋转蒸发除去三氟乙酸和二氯甲烷，得到内核为炔基、外层为L‐组氨酸的2代树状分子(Alkynyl‐G2‐His)0.936g。该产物与权力要求1中n＝1，R为组氨酸残基 时的产物一致。
实施例3：内核为炔基、外层为色氨酸的树状分子的合成
(1)外层为叠氮基的树状分子的合成
(a)1,3‐二叠氮基‐2‐丙醇(C‐1)的合成
将3.059g(47.1mmol)叠氮钠溶于15.0ml H2O中，1.455g(15.7mmol)环氧氯丙烷溶于15.0ml乙腈中；将二者混合，并在95℃下反应24小时；旋转蒸发除去反应液中的乙腈；然后，用60ml乙酸乙酯萃取一次，再用25ml水萃取三次。萃取后的油相用无水MgSO4干燥，再经抽滤、减压蒸馏，得到化合物1,3‐二叠氮基‐2‐丙醇1.576g。
(b)外层为叠氮基的0.5代树状分子(G0.5‐N3)的合成
将1.919g(9.5mmol)对硝基苯基氯甲酸酯和1.352g(9.5mmol)1,3‐二叠氮基‐2‐丙醇(C‐1)分别溶于5.0ml二氯甲烷和7.0ml二氯甲烷中；在10℃下，缓慢地将对硝基苯基氯甲酸酯溶液滴加至化合物C‐1的溶液中，反应30分钟；再加入0.962g(9.5mmol)三乙胺和0.001g(0.01mmol)DMAP，并升温至35℃下反应72小时；反应体系分别用25ml1.0mol/L的HCl溶液和25ml饱和NaHCO3溶液各萃取三次。萃取后的油相用无水MgSO4干燥，再经抽滤和减压蒸馏得到粗产物；将所得粗产物用柱层析纯化，得到外层为叠氮基的0.5代树状分子(G0.5‐N3)1.712g。
(c)外层为叠氮基的1代树状分子(G1‐N3)的合成
将5.919g(13.9mmol)外层为叠氮基的0.5代树状分子(G0.5‐N3)和0.591g(6.6mmol)2‐羟基‐1,3‐丙二胺分别溶于17.0ml二氯甲烷和2.0ml DMF中；将2‐羟基‐1,3‐丙二胺溶液、1.403g(13.9mmol)三乙胺和0.002g(0.016mmol)DMAP加到外层为叠氮基的0.5代树状分子(G0.5‐N3)的溶液中；于室温下反应3小时；反应体系分别用25ml0.5mol/L的HCl溶液和25ml1.0mol/L的NaOH溶液各萃取三次。萃取后的油相用无水MgSO4干燥，再经抽滤和减压蒸馏，得到外层为叠氮基的1代树状分子(G1‐N3)1.712g。
(d)外层为叠氮基的1.5代树状分子(G1.5‐N3)的合成
将1.184g(5.9mmol)对硝基苯基氯甲酸酯和3.471g(5.9mmol)外层为叠氮基的1代树状分子(G1‐N3)分别溶于18.8ml二氯甲烷和15.0ml二氯甲烷中；将外层为叠氮基的1代树状分子(G1‐N3)的二氯甲烷溶液置于10℃的冷水浴中，再慢慢滴加对硝基苯基氯甲酸酯溶液，反应30分钟后撤去冰浴，加入1.403g(13.9mmol)三乙胺和0.001g(0.008mmol)DMAP；在室温下反应12小时；反应体系用50ml1.0mol/L的HCl溶液和50ml饱和NaHCO3溶液各萃取三次。萃取后的油相用无水硫酸镁干燥，再经抽滤、旋转蒸发和柱层析纯化， 得外层为叠氮基的1.5代树状分子(G1.5‐N3)1.005g。
(2)炔基化的叔丁氧羰基‐色氨酸(Alkynyl‐boc‐Trp)的合成
(a)叔丁氧羰基‐色氨酸的合成
将1.991g(9.8mmol)色氨酸(Trp)和3.943g(39.0mmol)三乙胺加入80.0ml体积比为1:1的H2O和1,4‐二氧六环的混合溶剂中；待色氨酸完全溶解后，在10℃下慢慢滴加4.255g(19.5mmol)溶于20ml1,4‐二氧六环的二碳酸二叔丁酯；滴加完毕后，继续反应45分钟，室温搅拌；待色氨酸中的氨基反应完全后，旋转蒸发除去反应体系中的1,4‐二氧六环；然后，用0.5mol/L的HCl溶液调节pH至1左右，再用20ml乙酸乙酯萃取三次。所得油相用无水MgSO4干燥，再经抽滤和减压蒸馏，得到叔丁氧羰基‐色氨酸的粗产物。
(b)化合物炔基化的叔丁氧羰基‐色氨酸(Alkynyl‐boc‐Trp)的合成
化合物炔基化的叔丁氧羰基‐色氨酸(Alkynyl‐boc‐Trp)的合成可通过如下两种方法中任意一种方法实现。
方法1：酯化法
将上述所合成的叔丁氧羰基‐色氨酸的粗产物和2.011g(9.8mmol)二环己基碳二亚胺(DCC)分别溶于20.0ml二氯甲烷和3.0ml二氯甲烷中；将叔丁氧羰基‐色氨酸的粗产物的溶液置于10℃的冷水浴中，再加入0.547g(9.8mmol)炔丙醇和二环己基碳二亚胺(DCC)溶液；反应45分钟后，撤去冷水浴；于15℃下反应12小时；过滤除去反应中所生成的DCU；再将滤液旋转蒸发除去二氯甲烷；所得油状物用4ml乙酸乙酯溶解，滤去不溶物；然后，通过旋转蒸发和柱层析纯化，得到炔基化的叔丁氧羰基‐色氨酸(Alkynyl‐boc‐Trp)1.465g。
方法2：亲核取代法
将上述所合成的叔丁氧羰基‐色氨酸的粗产物溶于9.0ml DMF，再加入0.842g(6.1mmol)无水碳酸钾；在氮气氛围中室温反应45分钟；加入0.725g(6.1mmol)炔丙溴，继续于室温下反应12小时；然后，加入30ml二氯甲烷，再用25ml水萃取三次；萃取后的油相用无水硫酸镁干燥，再经抽滤、旋转蒸发和柱层析纯化，得到炔基化的叔丁氧羰基‐色氨酸(Alkynyl‐boc‐Trp)1.327g。
(3)内核为对硝基苯基活性酯、外层为叔丁氧羰基‐色氨酸的2代树状分子(G2‐boc‐Trp)的合成
将1.792g(3.0mmol)外层为叠氮基的1.5树状分子(G1.5‐N3)和8.060g(18.2mmol)化合物Alkynyl‐boc‐Trp分别溶于5.0ml和8.0ml的DMF中，再加入0.385g(2.2mmol)抗 坏血酸和0.252g(1.0mmol)硫酸铜；在室温下反应4小时后，加入30ml二氯甲烷，再用25ml水萃取三次。萃取后得到的油相用无水MgSO4干燥，再经抽滤和减压蒸馏，得到内核为对硝基苯基活性酯、外层为叔丁氧羰基‐色氨酸的2代树状分子(G2‐boc‐Trp)4.704g。
(4)内核为炔基、外层为叔丁氧羰基‐色氨酸的2代树状分子(Alkynyl‐G2‐boc‐Trp)的合成
将7.259g(3.1mmol)内核为对硝基苯基活性酯、外层为叔丁氧羰基‐色氨酸的2代树状分子(G2‐boc‐Trp)溶于10.0ml二氯甲烷，再加入0.172g(3.1mmol)炔丙醇、0.310g(3.1mmol)三乙胺和1.0mg(0.008mmol)DMAP；于室温下反应24小时；反应体系用20ml0.5mol/L的HCl溶液和20ml1.0mol/L的NaOH溶液各萃取三次。萃取后得到的油相用无水MgSO4干燥，再经抽滤和减压蒸馏，得到内核为炔基、外层为叔丁氧羰基‐色氨酸的2代树状分子(Alkynyl‐G2‐boc‐Trp)2.875g。
(5)内核为炔基、外层为色氨酸的2代树状分子(Alkynyl‐G2‐Trp)的合成
将2.280g(1.0mmol)内核为炔基、外层为叔丁氧羰基‐色氨酸的2代树状分子(Alkynyl‐G2‐boc‐Trp)溶于5ml二氯甲烷中，再加入0.684g(6.0mmol)三氟乙酸；在15℃下反应1小时；旋转蒸发除去三氟乙酸与二氯甲烷，得到内核为炔基、外层为色氨酸的2代树状分子(Alkynyl‐G2‐Trp)1.277g。该产物与权力要求(1)中n＝1，R为色氨酸残基时的产物一致。
本发明中的树状分子可以通过其内核的炔基与叠氮化琼脂糖等载体间的Huisgen1,3‐偶极环加成反应，制得以氨基酸为配体的亲和吸附材料。通过氨基酸配体与蛋白质分子间的静电力、疏水力、氢键等相互作用，所制备的亲和吸附材料可以与蛋白质产生吸附作用，用于蛋白质的分离提纯或人体血液净化。
由于所制备的亲和吸附材料以树枝状大分子为间隔臂，使引入该类间隔臂后的载体比引入线形间隔臂的载体的外表面具有更多的活性位点，增加了配基密度，从而可以提高所制备的免疫吸附材料的吸附性能。
Claims (8)
1.内核为炔基、外层为氨基酸的树状分子，其特征在于其结构通式(1)为：
其中：n为0、1或2；
R为氨基酸残基，所述氨基酸为苯丙氨酸、色氨酸和L‐组氨酸中的一种或多种。
2.权利要求1所述的内核为炔基、外层为氨基酸的树状分子的Huisgen1,3‐偶极环加成合成方法，其特征在于包括如下的步骤及工艺条件：
(1)外层为叠氮基的树状分子的合成
将叠氮钠溶于水中，加入乙腈及环氧氯丙烷；在60～95℃下反应24～48小时后，旋转蒸发除去反应体系中的乙腈，并用乙酸乙酯萃取；将萃取后的油相干燥，再经抽滤和减压蒸馏，得到1,3‐二叠氮基‐2‐丙醇；所述叠氮钠与环氧氯丙烷的摩尔比为3∶1.5～2；
将1,3‐二叠氮基‐2‐丙醇溶于二氯甲烷中，在‐5～10℃下滴加溶于二氯甲烷的对硝基苯基氯甲酸酯；在‐5～10℃下反应30～60分钟后加入三乙胺及4‐二甲氨基吡啶；在15～35℃下反应12～72小时后，分别用盐酸溶液与饱和碳酸氢钠溶液萃取；将萃取后的油相干燥，再经抽滤、旋转蒸发和柱层析纯化，得到外层为叠氮基的0.5代树状分子；
将三乙胺、4‐二甲氨基吡啶和溶于二氯甲烷的外层为叠氮基的0.5代树状分子加入溶于N,N‐二甲基甲酰胺的2‐羟基‐1,3‐丙二胺中；在15～35℃下反应1小时～24小时后，反应液分别用盐酸溶液及氢氧化钠溶液萃取；将萃取后的油相干燥，再经抽滤、旋转蒸发和柱层析纯化，得到外层为叠氮基的1代树状分子；
以外层为叠氮基的1代树状分子为起始反应物，重复外层为叠氮基的0.5代树状分子的合成步骤，得到外层为叠氮基的1.5代树状分子；
以外层为叠氮基的1.5代树状分子为起始反应物，重复外层为叠氮基的1代树状分子的合成步骤，得到外层为叠氮基的2代树状分子；
(2)炔基化的叔丁氧羰基‐氨基酸的合成
将氨基酸加入体积比为1:1～1:5的水和1,4‐二氧六环混合溶液中，并加入三乙胺，当氨基酸完全溶解后，在‐5～10℃下滴加溶于1,4‐二氧六环的二碳酸二叔丁酯，滴加完毕后，在‐5～10℃下继续反应30～60分钟；然后，在15～35℃下反应3～48小时；反应结束后，减压蒸馏，调节pH至1～7；再经萃取、干燥和减压蒸馏，得到化合物叔丁氧羰基‐氨基酸；所述氨基酸、三乙胺和二碳酸二叔丁酯的摩尔比为1∶1～4∶1～3；
将叔丁氧羰基‐氨基酸溶于无水二氯甲烷中，在‐5～10℃下加入炔丙醇和溶于无水二氯甲烷的二环己基碳二亚胺；反应30～60分钟后，撤去冰浴；升温至15～35℃下反应12～48小时；反应结束后，经过滤、减压蒸馏和柱层析纯化，得到炔基化的叔丁氧羰基‐氨基酸；所述叔丁氧羰基‐氨基酸、炔丙醇和二环己基碳二亚胺的摩尔比为1∶1～2∶1～2；
或者将叔丁氧羰基‐氨基酸溶于N,N‐二甲基甲酰胺中，加入无水碳酸钾；在氮气氛围下室温反应30～60分钟后，加入炔丙溴；于室温下反应12～48小时，加入二氯甲烷，再用水萃取；萃取后将油相干燥、抽滤、减压蒸馏和柱层析纯化，得到炔基化的叔丁氧羰基‐氨基酸；所述叔丁氧羰基‐氨基酸、无水碳酸钾和炔丙溴的摩尔比为1∶1～2∶1～2；
(3)内核为对硝基苯基、外层为叔丁氧羰基‐氨基酸的树状分子的合成
将抗坏血酸、硫酸铜及外层为叠氮基的0.5代或1.5代树状分子加入溶于DMF的所述炔基化的叔丁氧羰基‐氨基酸中；于15～35℃下反应4～24小时后，加入二氯甲烷稀释反应体系，再用水萃取；萃取后的油相用无水硫酸镁干燥；然后，经抽滤、旋转干燥，得到1代或2代内核为对硝基苯基、外层为叔丁氧羰基‐氨基酸的树状分子；
(4)内核为炔基、外层为叔丁氧羰基‐氨基酸的树状分子的合成
将三乙胺，溶于二氯甲烷中的1代或2代内核为对硝基苯基、外层为叔丁氧羰基‐氨基酸的树状分子、4‐二甲氨基吡啶加入炔丙醇中，在15～35℃下反应1～24小时后，反应体系用盐酸溶液及氢氧化钠溶液萃取；然后，经干燥、抽滤和旋转干燥，得到内核为炔基、外层为叔丁氧羰基‐氨基酸的1代或2代树状分子；
(5)内核为炔基、外层为氨基酸的树状分子的合成
将内核为炔基、外层为叔丁氧羰基‐氨基酸的1代或2代树状分子溶于二氯甲烷中，加入三氟乙酸，在15～35℃下反应1～12小时后，蒸馏除去三氟乙酸与二氯甲烷，分别得内核为炔基、外层为氨基酸的1代或2代树状分子。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述1,3‐二叠氮基‐2‐丙醇、对硝基苯基氯甲酸酯、三乙胺和4‐二甲氨基吡啶的摩尔比为1∶1～2∶1～3∶0.001～0.1。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述三乙胺、4‐二甲氨基吡啶、外层为叠氮基的0.5代或1.5代树状分子、2‐羟基‐1,3‐丙二胺的摩尔比为1～3∶0.001～0.1∶1∶0.5。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(3)所述外层为叠氮基的0.5代或1.5代树状分子、炔基化的叔丁氧羰基‐氨基酸、抗坏血酸和硫酸铜的摩尔比为1∶m～2m∶0.12m～0.24m∶0.06m～0.12m；其中，m为树状分子外层叠氮基的个数。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(4)所述1代或2代内核为对硝基苯基、外层为叔丁氧羰基‐氨基酸的树状分子、三乙胺、4‐二甲氨基吡啶和炔丙醇的摩尔比为1∶1～3∶0.001～0.1∶1～1.5。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(5)所述内核为炔基、外层为叔丁氧羰基‐氨基酸的1代或2代树状分子与三氟乙酸的摩尔比为1∶1～1.5m；其中，m为树状分子外层叔丁氧羰基‐氨基酸的数量。
8.权利要求1所述内核为炔基、外层为氨基酸的树状分子在制备蛋白质分离或者血液净化用的亲和吸附材料中的应用。
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