CN102712939A - 在存在氨基脲或者碳酰肼的条件下发酵生产（3-羟基）丙醛的方法 - Google Patents

在存在氨基脲或者碳酰肼的条件下发酵生产（3-羟基）丙醛的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于生产醛及其氧化和还原产物的方法。

Description

在存在氨基脲或者碳酰肼的条件下发酵生产（3-羟基）丙醛的方法
技术领域
本发明涉及用于生产醛及其氧化和还原产物的方法。
背景技术
在文献中多次描述了用于生产醛的酶法。
因而，例如，WO 2009001304描述了在13-氢过氧化物-裂合酶协作下从多不饱和脂肪酸生产醛的方法。
Smit等人在Appl. Microbiol. Biotechnol., 2009, 81, 987-999中，描述了用于得到3-甲基丁醛的生化途径。
在US 5783429中，描述了在来自毕赤酵母属（Pichia）、汉逊酵母属（Hansenula）、假丝酵母属（Candida）、或球拟酵母属（Torulopsis）的甲醇氧化酶和过氧化氢酶辅助下从醇类制备醛。
根据WO 2001031047，使用二甲苯单加氧酶或烷烃单加氧酶，可得到芳族醛衍生物。
可以将3-羟基丙醛(3HPA)转化成丙烯酸（一种用于工业生产聚合物和塑料的重要单体），还可转化成同样重要的丙烯酸酯。可以从3-羟基丙醛衍生出的其它重要的产物是1,3-丙二醇(通过还原)、3-羟基丙酸(通过氧化)和丙烯醛(通过脱水)。由于迄今为止没有可利用的3-羟基丙醛的商业来源，所以在深入研究从甘油生产3-羟基丙醛，尤其是以罗伊素（Reuterin）的形式。
因而，二十世纪八十年代末期，Talarico和Dobrogosz在Antimicrob. Agents Chemother., 1989, 33, 674-679描述了使用罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）从甘油发酵生产3-羟基丙醛。
在US 5413960中，描述了使用限氧情况下一种类似的方法。
DK180099 公开了连续供入甘油并使用罗伊氏乳杆菌DSM12246的方法。
Doleyres等人, Appl Microbiol Biotechnol. 2005年9月;68 (4):467-74描述了在不同的生长条件下在罗伊氏乳杆菌ATCC 53608中生产3-羟基丙醛的方法，并指出，生物催化剂由于严重下降的活性，不可能被重复使用。
CN1778935描述了在氨基脲存在下使用肺炎克雷伯菌（Klebsiellapneumoniae）DSM2026的甘油溶液一步发酵。
US 4962027描述了肺炎克雷伯菌NRRL B-4011在好氧的两步发酵中生产3-羟基丙醛的方法，其中，在第一步中，首先产生细胞群和甘油脱水酶，并在第二步中，在氨基脲存在下，将甘油转化成3-羟基丙醛。
EP 1669457描述了如下的3-羟基丙醛的生物技术生产：（尤其）使用肺炎克雷伯菌，在加入辅酶B12情况下，通过增加细胞/底物比以几乎定量的产率进行。
所有上述方法的一个共同特征是，产率和转化率低。此外，在所述的方法中，总是需要高的费用用于提供生物催化剂，所述生物催化剂此后仅具有短的使用期限，即此后仅可以短期使用。
因此，本发明的目的是，提供一种克服现有技术的上述缺点的方法。
发明内容
令人惊奇地发现，下述的方法能够实现本发明的目的。
本发明因此提供了用于生产醛的方法，所述方法包括下述方法步骤：A) 优选地，使邻位二醇的水溶液与氢裂解酶(Hydro-Lyase)接触, B) 分离在方法步骤A)中形成的醛和氢裂解酶, C) 使用从方法步骤B)得到的氢裂解酶，重复步骤A)和B)至少一次，并任选地 D) 分离形成的醛，其特征在于，在存在与醛形成键的化合物情况下，进行所述方法。
本发明另外提供了用于生产通过前述方法得到的醛的氧化产物和还原产物的方法。
根据本发明的方法的优点是：基于使用的醇几乎定量的醛的产率，用作生物催化剂的氢裂解酶的长使用期限和它的可重复使用性。这使得连续操作方式成为可能。
根据本发明的方法的另一个优点是，不需要抑制用作生物催化剂的氢裂解酶对所形成的醛的次级活性，例如醛进一步还原成醇。
本发明还有一个优点是，根据本发明的方法提供了大部分情况下以排除氧气或减少氧气来操作的可能性，其结果是，可以减少例如产物的腐蚀和不希望的氧化，使得简单的设备构造成为可能，且可以节省能量，也防止了与生物技术反应器的气体处理(Begasung)有关的其它已知的问题，例如，泡沫形成。
在本发明中，术语“醛”同样理解为表示醛的水合物和二聚体，以及这些化合物的混合物和例如罗伊素（在3-羟基丙醛的情况下）。
除非另有说明，所有描述的百分比(%)是质量百分比。
可以用于根据本发明的方法中的氢裂解酶是在EC 4.2.1.X类中列出的酶。
这里，特别是这样的氢裂解酶对于根据本发明的方法有益，其不依赖于辅酶B12有活性，即，在没有辅酶B12或该物质的替代物/类似物（例如，类咕啉、钴胺素）存在下也具有氢裂解酶的活性。在WO 200814864中，可以找到这样的氢裂解酶的典型代表。
优选地用于根据本发明的方法中的氢裂解酶是甘油脱水酶和二醇-脱水酶以及丙二醇脱水酶 (EC 4.2.1.30、EC 4.2.1.28)。
在这种情况下，在根据本发明的方法中尤其使用可分离自选自下述属的微生物的甘油脱水酶：克雷伯菌属（Klebsiella）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、梭菌属（Clostridium）、乳杆菌属（Lactobacillus）、肠杆菌属（Enterobacter）、喜热菌属（Caloramator）、沙门氏菌属（Salmonella）和李斯特菌属（Listeria），特别优选得自选自下述的种的甘油脱水酶：肺炎克雷伯菌、肺炎柠檬酸杆菌（Citrobacter pneumoniae）、巴斯德梭菌（Clostridium pasteurianum）、莱希曼氏乳杆菌（Lactobacillus leichmannii）、中间柠檬酸杆菌（Citrobacter intermedium）、罗伊氏乳杆菌、布赫纳乳杆菌（Lactobacillus buchneri）、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、聚团肠杆菌（Enterobacter agglomerans）、巴斯德梭菌、产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）、克鲁氏梭状芽孢杆菌（Clostridium kluyveri）、Caloramator viterbensis、丘状菌落乳杆菌（Lactobacillus collinoides）、希氏乳杆菌（Lactobacillus hilgardii）、鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium）、单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）和无害李斯特菌（Listeria innocua）。
使用的甘油脱水酶优选地由选自下述的基因编码：来自罗伊氏乳杆菌ATCC55730的pduC 、 pduD 、 pduE 、 pddA 、 pddB 、 pddC 、 dhaB 、 dhaC 、 dhaE和gldABC基因。还有利的是，使用在WO-A-2004/056963中描述的甘油脱水酶变体SHGDH22，其具有在WO 2004056963中公开的SEQ.-ID号 322。这种和其它对甘油脱水酶合适的基因的核苷酸序列可以得自例如：“Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes” (KEGG数据库)，国立医学图书馆(National Library of Medicine, Bethesda, MD, USA)的美国国立生物技术信息中心 (National Center for Biotechnology Information, NCBI)的数据库，或欧洲分子生物学实验室（European Molecular Biologies Laboratories）的核苷酸序列数据库。
关于二醇脱水酶，能有利地在所述方法中特别使用这样的二醇脱水酶，其可分离自选自下述属的微生物：克雷伯菌属、丙酸杆菌属（Propionibacterium）、梭菌属、乳杆菌属、沙门氏菌属、柠檬酸杆菌属、黄杆菌属（Flavobacterium）、醋酸杆菌属（Acetobacterium）、布氏杆菌属（Brucella）和梭杆菌属（Fusobacterium），特别优选地可分离自选自下述种的微生物：肺炎克雷伯菌、费氏丙酸杆菌（Propionibacterium freudenreichii）、乙二醇梭菌（Clostridium glycolicum）、短乳杆菌、鼠伤寒沙门菌、弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）、布赫纳乳杆菌、马尔他布鲁氏杆菌（Brucella melitensis）、具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）、产酸克雷白杆菌（Klebsiella oxytoca）、鼠伤寒沙门菌、单核细胞增生李斯特菌和无害李斯特菌。
关于丙二醇脱水酶，能有利地在所述方法中特别使用这样的丙二醇脱水酶，其可分离自选自下述属的微生物：柠檬酸杆菌属、梭菌属、克雷伯菌属、乳杆菌属、丙酸杆菌属和沙门氏菌属，特别优选地，可分离自选自下述种的微生物：弗氏柠檬酸杆菌、乙二醇梭菌、产酸克雷白杆菌、肺炎克雷伯菌、短乳杆菌、布赫纳乳杆菌、丘状菌落乳杆菌、费氏丙酸杆菌和鼠伤寒沙门菌。
如果根据本发明用于本方法中的氢裂解酶是维生素B12依赖性的酶，在具有甘油脱水酶再激活酶活性或二醇脱水酶再激活酶活性的酶和/或酶复合物存在下能有利地进行方法步骤A)，因为所述氢裂解酶也许能通过维生素的键合而被灭活。这样的再激活酶描述在例如Mori 等人, J. Biol. Chem. 272:32034 (1997)中。优选使用可以从生物体分离出的再激活酶，从所述生物体可以分离出相应的氢裂解酶。合适的二醇脱水酶再激活酶为已知的，来自产酸克雷白杆菌 (GenBank Nos: AAC15871、AF017781; GenBank Nos: AAC15872、AF017781)、鼠伤寒沙门菌 (GenBank Nos: AAB84105、AF026270; GenBank Nos: AAD39008、AF026270)和丘状菌落乳杆菌(GenBank Nos: CAD01092、AJ297723; GenBank Nos: CAD01093、AJ297723)，合适的甘油脱水酶再激活酶来自肺炎克雷伯菌(参见WO 2008137403)。
可以以本领域技术人员已知的所有可利用形式，使用用于根据本发明的方法中的氢裂解酶。因而，使用的氢裂解酶可以作为分离的酶（例如分离自重组表达系统）或作为酶复合物的组分来使用。优选使用全细胞反应器形式的氢裂解酶，即氢裂解酶存在于生物细胞中，优选地存在于表达氢裂解酶的细胞中。
具有氢裂解酶的细胞作为野生型已经可以表达氢裂解酶，或为可以被遗传修饰的种，它们通过遗传修饰才具有氢裂解酶活性。
这样的细胞可在根据本发明的方法中用作野生型含氢裂解酶的细胞，其在上面被描述为可分离出氢裂解酶的微生物。
含有合适的氢裂解酶且可以用于根据本发明的方法中的遗传修饰的细胞被描述在例如WO 2008148640中，其公开内容明确地通过引用并入本文。
此外，它的优点为通过细胞相应的遗传修饰，可以减少细胞从醛还原生成副产物的趋势，尤其是相应的醛还原为相应的醇的趋势。例如，如果根据本发明的方法生产的醛是3-羟基丙醛，能够使用使用这样的细胞，与它们的野生型相比，其减少了具有能够将3-羟基丙醛还原为1,3-丙二醇的酶E1的活性。酶E1 (1,3-丙二醇-脱氢酶、3-羟基丙醛还原酶、1,3-丙二醇:NAD+氧化还原酶或丙-1,3-二醇:NAD+-1-氧化还原酶; EC 1.1.1.202)催化下面反应：3-羟基丙醛 + NAD(P)H → 1,3-丙二醇 + NAD(P)+。这样的酶是例如具有GenBank登录号AP007281.1、EDX43365.1、BAG24545.1、ABQ82306.1、ABO43839.1、EEI08979.1、EEI66346.1、EEI73647.1、EEJ92522.1、EEI09194.1、EEI73500.1、ABQ83973.1或BAG26138.1的蛋白质。
从该数据，可鉴别用于根据本发明的方法中的各含氢裂解酶的细胞对应的氧化还原酶，并与它的野生型相比，减少它的活性。
使用的表述“减少的酶的活性”优选地理解为因子为至少0.5，特别优选至少0.1，更优选至少0.01，此外还更优选至少0.001，最优选至少0.0001的减少的活性。某种酶的活性的减少可以例如通过定向的或非定向的突变，通过加入竞争性的或非竞争性的抑制剂，或通过本领域技术人员已知的减少特定酶合成的其它措施完成。
适合通过定向突变来减少酶E1活性的是，例如，定向敲除，其中，例如，删除靶基因的启动子活性序列、靶基因的活性区域 (酶的催化功能所必需的)或整个靶基因，置换为外源DNA，或被外源DNA中断。
此外，不同的基因沉默技术是本领域技术人员已知的，其通过反义核酸或小干扰RNA (siRNA)，特异性地减少或甚至完全阻止单个基因的转录和/或翻译。根据选择的系统，该抑制可以短暂发生，可以是可诱导的，或组成性地存在。
本领域技术人员同样已知可以将单个点突变定向地放入靶基因中的方法。此外，本领域技术人员已知可以将突变非定向地放入靶基因中的方法，目的是之后选择具有减少的酶E1活性的细胞。因而，可以如下触发这样的突变：例如，通过遗传物质复制过程中的天然差错率，或通过使细胞暴露于物理的或化学的病原，例如紫外光、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍、甲磺酸乙酯、亚硝酸（Nitrose Säure）、羟基胺或4-硝基喹啉-1-氧化物。
根据本发明在此方法中使用的含有氢裂解酶的细胞可以是活细胞或死细胞，优选活细胞。
在所述方法过程中，将用作氢裂解酶的活的含有氢裂解酶的细胞保持在合适的培养基中可以是有利的，所述培养基给它们供应生长所需的物质。但是，已经发现，关于氧的供给，限制地供应可以是有利的。因此，优选在微厌氧或厌氧的条件下，在方法步骤A)中使用活的、含有氢裂解酶的细胞作为氢裂解酶。优选地，微厌氧或厌氧的条件的特征在于，在用作氢裂解酶的活的、含有氢裂解酶的细胞周围的培养基具有小于1 mg/L、优选小于0.5 mg/L、尤其是小于0.1 mg/L（基于总培养基）的溶解氧含量。这些条件可以例如这样实现：在细胞周围的培养基不额外用空气或氧通气，即不使空气或氧通过培养基，且任选的，另外尽可能气密性密封反应批料周围的容器。
为了能够简化地进行在方法步骤B)中进行的醛和氢裂解酶的分离，优选地，将氢裂解酶固定在载体上。如果氢裂解酶作为游离的、分离的酶使用，许多酶固定方法可供本领域技术人员使用，例如，环氧化物活化的载体材料的偶联，和描述在文献中的方法，例如: Mateo 等人Advances in the design of new epoxy supports for enzyme immobilization-stabilization, Biochem Soc Trans. 2007年12月;35(Pt 6):1593-601和Balcão 等人, Bioreactors with immobilized lipases: state of the art, Enzyme Microb Technol. 1996年5月1日;18(6):392-416。
如果将具有氢裂解酶活性的细胞用作氢裂解酶，能够使用本领域技术人员已知的方法来固定化细胞，例如，藻酸钙方法。特别是在DE 102007031689中描述的基于硅氧烷的方法，以及使用可商业得到的Lentikat液体固定化细胞，在这方面是特别适合的。
在根据本发明的方法中，在方法步骤A)中可以使用取代的和未取代的邻位二醇；优选地，所述取代基选自：羧基、氨基、酯、异氰酸盐和羟基，其中OH是特别优选的。
在根据本发明的方法中，优选地使用碳链长度为2-20、尤其为2-12和特别优选为2-6个碳原子的邻位二醇。作为在根据本发明的方法中使用的邻位二醇，特别优选具有3-6个碳原子的糖和糖醇，例如，山梨醇；在这方面特别优选1,2-丙二醇、乙二醇和甘油。
特别地，将甘油在根据本发明的方法中用作邻位二醇，使得得到的醛是3-羟基丙醛。除了甘油，特别地也使用1,2-丙二醇，其中作为醛得到丙醛。这种醛可以通过随后的容易的歧化反应转化成正丙醇和丙酸。
在方法步骤A)中，基于总反应混合物，在0.01重量%-50重量%，优选0.2重量%-20重量%的浓度范围，使用邻位二醇。
在方法步骤B)中，分离在方法步骤A)中形成的醛和氢裂解酶。
尤其是固定在载体上的氢裂解酶的分离借助于本领域技术人员已知的分离方法完成，例如，离心分离。如果在方法步骤A)中使用含有氢裂解酶的细胞作为氢裂解酶，细胞与醛的分离可考虑例如借助于合适的过滤器，例如借助于排阻尺寸范围为20-200 kDa的过滤器。也可考虑使用离心分离，使用合适的沉降装置，或使用这些装置的组合，其中特别优选地，首先通过沉降分离出至少一部分细胞，然后将由细胞部分释放出的醛供入超滤或离心分离装置。
任选地纯化以此方式分离的细胞（如果它们得自多个相继进行的分离阶段），且可以直接地再次回到方法步骤A)。但是，可证实，在再次进行方法步骤A)之前再次洗涤含有氢裂解酶的细胞是有利的，其中该洗涤优选地使用与在方法步骤A)中使用的相同培养基进行。
特别优选地，在额外加入葡萄糖的条件下，使用在方法步骤A)中使用的培养基进行洗涤；通过这样做，可以在实际的生物转化过程中，以有利的方式抑制从醛衍生的副产物的形成。
为了洗涤细胞，可以将它们例如重新悬浮在合适体积的在方法步骤A)中使用的培养基中，然后通过上述的分离方法（特别是通过过滤、沉降或离心分离，或者通过这些措施的组合），从培养基中清除。对于固定在载体上的氢裂解酶，同样可以使用类似的洗涤过程。
同样地，通过将与醛形成键的化合物固定在载体上，可以容易地实现在方法步骤B)中进行的醛和氢裂解酶的分离。在这里适用的是，例如，可用载有亚硫酸氢盐的离子交换树脂，诸如Amberlite® CG400或Amberlite® IRA400 (Rohm和Haas)。
本发明必要的是，使用经分离的氢裂解酶重复方法步骤A)和B)至少一次，以便再次利用生物催化剂与新鲜的邻位二醇来生产醛。
在根据本发明的方法的优选的、替代性的实施方案中，方法步骤A)、B)和C)连续进行。
这可以以不同的途径来实现：
氢裂解酶作为固定相经固定地存在，含有邻位多元醇和与醛形成键的化合物的培养基绕着固定的氢裂解酶流动，且根据方法步骤A)，与其相接触。生成的醛作为流动相与固定相分离，这相当于方法步骤B)中醛和氢裂解酶的分离。连续地新供给氢裂解酶的邻位二醇相当于用从方法步骤B)得到的氢裂解酶重复方法步骤A)和B)。
或者，与醛形成键的化合物可以作为固定相固定存在。邻位多元醇和氢裂解酶存在于培养基中，因而，根据方法步骤A)，接触固定的与醛形成键的化合物，并绕其流动，其中，形成的醛保留在固定相上。氢裂解酶离开固定相，这相当于方法步骤B)中醛和氢裂解酶的分离，并例如以环流反应器的形式与新鲜的邻位多元醇一起，再次供给固定相。
根据本发明的方法的另一个连续运转的变体设计成，与醛形成键的化合物以及氢裂解酶以固定化形式作为固定相存在。含有邻位多元醇的培养基绕着固定相流动，并因而根据方法步骤A)与氢裂解酶接触。形成的醛通过与醛形成键的化合物连接到固定相上，因而根据方法步骤B)与氢裂解酶分离。连续地新供给固定相的邻位二醇相当于用从方法步骤B)得到的氢裂解酶重复方法步骤A)和B)。
为了实现所述目的，在根据本发明的方法的过程中，必须存在与醛形成键的化合物。
与醛形成的键可以是所有已知的化学键形式，例如，共价键或离子键，以及所谓的弱键如氢键或通过静电相互作用产生的键。优选地，与醛形成键的化合物会与醛形成共价键。
与醛形成键的化合物可以是多官能的，即每分子化合物可以与醛形成多于一个键。
合适的与醛形成键的化合物是，例如，酰肼、胺、肼、脲化合物、羟基胺、醇、硫醇、亚硫酸氢盐、亚硫酸盐、偏亚硫酸氢盐和焦亚硫酸盐，其中，在根据本发明的方法中，优选地使用氨基脲[CAS 57-56-7]、碳酰肼[CAS 497-18-7]和亚硫酸钠[CAS 7757-83-7]。
它们可以游离在溶液中或者固定在载体上来使用，在这方面优选未固定化的、溶解的化合物，因为它们可以更有效地且更迅速地与醛形成键，因而能够防止不希望的副反应。
如果使用细胞进行根据本发明的方法，根据本发明优选地，将与醛形成键的化合物加入在细胞周围的培养基中。
也可以使用与醛形成键的化合物的混合物。
在根据本发明的方法中，优选地，以至少1:1、优选至少1:1.2、尤其是至少1:1.5的摩尔比，使用邻位二醇和与醛形成键的化合物的官能团。
在根据本发明的方法的方法步骤D)中，可以分离形成的醛，其中，为了分离，本领域技术人员已知用于从复杂组合物中分离出低分子量物质的所有方法都是合适的。作为实例，在这点上，可以提及：借助于合适溶剂的沉淀，借助于合适溶剂的萃取，络合（例如借助于环糊精或环糊精衍生物），结晶，借助于色谱法的纯化和/或分离，或将醛转化成可以容易地分离的衍生物。
方法步骤D)中的分离部分也可以是将与醛形成键的化合物又与醛分离。
取决于存在的键，这可以通过其本身是本领域技术人员已知的方法来实现。因而，例如，醛和氨基脲或碳酰肼之间的键可以用酸来断开；醛和与醛形成键的化合物以及Amberlite® CG400或Amberlite® IRA400的复合物之间的键，可以例如通过增加盐浓度（约1M NaCl或NaHCO3/Na2CO3系统 (0.15 M/0.075 M)）来分离。此外，通过热处理，可以断开醛和与醛形成键的化合物之间的键。
对于实现在开始时指出的目的的另一个贡献还在于用于生产醛的氧化或还原产物的方法，所述方法包括下述方法步骤：
I) 借助于上述的从邻位二醇生产醛的方法，提供醛，
II) 通过还原、氧化、歧化或脱水，进行醛的化学或生物催化反应，得到任选不饱和的还原或氧化中间产物，和任选地
III) 通过还原、氧化或加成，进行在方法步骤II)中得到的还原或氧化中间产物的其它化学或生物催化反应。
醛的氧化或还原产物包括化合物，例如，任选不饱和的羧酸、羧酸衍生物、胺、异氰酸盐/酯、缩醛、腈和肟。
方法步骤II)的还原或氧化中间产物因此可以已经是醛的希望的还原或氧化产物。
首先，在方法步骤I)中，借助于上述的生产醛的方法，提供醛，其中所述醛可以任选地如上面关于该方法所述地纯化。
然后在方法步骤II)中，醛可以通过还原、氧化、歧化或脱水，化学地或生物催化地转化，得到还原或氧化中间产物，特别如果在方法步骤I)中得到的醛是3-羟基丙醛，得到1,3-丙二醇(1,3-PDO)(还原)、丙烯醛(脱水)或3-羟基丙酸(氧化)。在这方面，关于3-羟基丙醛向丙烯醛的转化的细节，尤其由Hall和Stern描述在Journal of the Chemical Society, 1950, 第490-498页中，而关于从3-羟基丙醛生产1,3-丙二醇的细节，尤其可以参见US 5,334,778。从3-羟基丙醛生产3-羟基丙酸，尤其又描述在US 6,852,517中。如果在方法步骤I)中得到的醛是来自1,2-丙二醇的丙醛，则通过生物转化培养基中丙醛容易的歧化反应，可以形成1-丙醇和丙酸 (Sriramulu, D. D.; Liang, M.; Hernandez-Romero, D.; Raux-Deery, E.; Lunsdorf, H.; Parsons, J. B.; Warren, M. J. & Prentice, M. B. J. Bacteriol., 2008, 190, 4559-4567)。
任选地，在方法步骤II)中得到的还原或氧化中间产物可在另外的方法步骤III)中化学或微生物地通过还原、氧化或加成，进一步转化。在这里特别适用的反应是，在方法步骤II)中得到的丙烯醛通过氧化得到丙烯酸，其随后可以任选地，在又一方法步骤IV)中，进行自由基反应，形成基于丙烯酸的聚合物。在这里特别适用的是，在合适的交联剂存在下，任选地经部分中和的丙烯酸的自由基聚合反应，形成吸水的聚丙烯酸酯，其也被称作“超级吸收剂”。丙烯醛生成丙烯酸的化学氧化反应和以此得到的丙烯酸的随后的自由基聚合反应尤其描述在WO-A-2006/136336中。
此外，同样适合的是，通过氧化性酯化将在方法步骤II)中得到的丙烯醛转化成丙烯酸酯的反应，后者然后任选地可以在又一方法步骤IV)中进行自由基反应，形成基于丙烯酸酯的聚合物。
通过上述步骤可以从根据本发明的方法得到的醛的还原或氧化产物因而优选是物质，如1,3-丙二醇、1-丙醇、丙烯醛、3-羟基丙酸、丙酸、丙烯酸、丙烯酸酯和基于丙烯酸或丙烯酸酯的聚合物，其中在方法步骤I)中得到的醛是3-羟基丙醛。
在下面列出的实施例中，示例性描述了本发明，所述实施例不意在将本发明（其应用范围由整个说明书和权利要求书给出）限制为在实施例中指出的实施方案。
下面的附图是实施例的一部分：
图1：在一个生物转化周期过程中，在用固定化的罗伊乳杆菌细胞转化甘油的过程中，甘油、3HPA和1,3-PDO的浓度曲线。
图2: 在7个生物转化周期过程中，且在有作为清除剂的氨基脲存在下，在用固定化的罗伊氏乳杆菌细胞转化甘油的过程中，甘油、3HPA和1,3-PDO的浓度曲线。
图3: 在7个生物转化周期过程中，且在有作为清除剂的氨基脲存在下，在用固定化的罗伊氏乳杆菌细胞转化甘油的过程中，3HPA的累积产量。
图4: 在10个生物转化周期过程中，且在有作为清除剂的碳酰肼存在下，在用固定化的罗伊氏乳杆菌细胞转化甘油的过程中，甘油、3HPA和1,3-PDO的浓度曲线。
图5: 在10个生物转化周期过程中，且在有作为清除剂的碳酰肼存在下，在用固定化的罗伊氏乳杆菌细胞转化甘油的过程中，3HPA的累积产量。
图6: 在用罗伊氏乳杆菌细胞生物转化甘油和1,2-丙二醇的过程中，甘油和1,2-丙二醇的浓度相对于时间的曲线。
图7: 在没有加入亚硫酸盐的情况下(对比实施例)，在用固定化的罗伊氏乳杆菌细胞连续7次生物转化甘油的过程中，3HPA、甘油和1,3-PDO的浓度曲线。
图8: 在加入亚硫酸氢钠的情况下(根据本发明)，在用固定化的罗伊氏乳杆菌细胞连续7次生物转化甘油的过程中，3HPA、甘油和1,3-PDO的浓度曲线。
图9: 在用野生型罗伊氏乳杆菌细胞生物转化甘油的过程中，3HPA、甘油和1,3-PDO的浓度相对于时间的曲线。
图10: 在用遗传修饰的罗伊氏乳杆菌细胞生物转化甘油的过程中，3HPA、甘油和1,3-PDO的浓度相对于时间的曲线。
实施例:
实施例1: 罗伊氏乳杆菌的培养
在封闭的合适容器中，在厌氧化的（anaerobisiert）加入了20 mM甘油(MRSG20)的MRS 培养基(根据DeMan、Rogosa和Sharpe，乳杆菌属用培养基)中，在80 转每分钟（rpm），培养罗伊氏乳杆菌。培养基MRSG20 (组成[每升的数据]: 10 g
Figure DEST_PATH_DEST_PATH_IMAGE002
蛋白胨3号(Roth)、8 g 牛肉膏 (Roth)、4 g 酵母浸出物 (VWR)、1.5 mL 甘油(Roth)、1 mL吐温80 (Roth)、40 mL盐溶液 [10 g/L的磷酸氢二钾 {Roth}、250 g/L的三水合醋酸钠 {Roth}、100 g/L的柠檬酸氢二铵 {Roth}、10 g/L的七水合硫酸镁 {Roth}、2.5 g/L的四水合硫酸锰 {Roth}]，在厌氧化和高压灭菌 (121℃ 20 min)以后，加入25 mL葡萄糖溶液 (4 mol/L)。
对于预培养物1 (50 mL)，使用冷冻培养物。为此，在-80℃在MRS 培养基中储存罗伊氏乳杆菌SD2112，所述MRS 培养基另外包含6% (w/v)的脱脂奶粉和10% (v/v)的甘油。为了生产储用培养物，将过夜培养物 (10 ml MRS 培养基)与储备溶液进行1:1混合。预培养物用作1%的接种物，并在33℃温育。15小时后，从该批中，接种第二批预培养物(50 mL)至1%，并在37℃温育9小时。这又作为1%的接种物，用于主培养物(2 x 1L)。在33℃15小时后，收获细胞。
为此，离心(4000 g; 20℃; 10 min)2升，抛弃上清液，将两份得到的沉淀物(Pellet)重新悬浮于1升在pH 7的0.1 M磷酸钾缓冲液(KPP; K2HPO4 + KH2PO4 [Roth])中。在相同条件下再次离心。再次抛弃上清液，以1 g /1 mL的比例，将细胞沉淀物重新悬浮于在pH 7的0.1 M KPP中，并在N2下储存。该悬浮液用于随后的固定化。
实施例2: 罗伊氏乳杆菌的固定化
为了固定化，将20 mL在实施例1中描述的细胞悬浮液与加热至~35℃的Lentikat-Liquid® (GeniaLab)相混合，以LentiKat®-Printer (GeniaLab)制备Lentikats，并干燥至28%的残余水分。在LentiKat-Stabilizer® (GeniaLab)中回溶胀（Rückquellung）以后，在厌氧气氛中以300 转每分搅拌固定化物（Immobilizate）至少2小时，以使Lentikat在LentiKat-Stabilizer®中稳定。分离的，并用pH 7的0.1 M KPP洗涤2次的固定化物，在33℃于1 L 的装满的瓶子中在MRSG20中静置15小时，再生至3%，其中可以进行气体交换。从培养基(好氧条件)分离出固定化物以后，用0.1 M KPP (pH 7)洗涤它们2次。
实施例3: 基于HPLC的甘油和1,3-丙二醇的定量分析
为了定量分析甘油和1,3-丙二醇(1,3-PDO)，在每份1 ml细胞悬浮液中，通过离心 (10 min, 16.100 g, 4℃)，分离出生物质，使用Shimadzu HPLC 系统 (自动采样器 SIL-10AT, 泵 LC-10AT, 脱气器DGU-3A, 折射率检测器RID-10A, 紫外检测器 SPD-10A, 烘箱CTO-10A, 控制器SCA-10A-VP)，使用具有9 µm粒度的Aminex HPX-87H 300 x 7.8 mm分离柱 (Bio-Rad Laboratories GmbH, 慕尼黑)，并使用前置柱 (HPX-87H, 30 x 4.6 mm)，分析40 µl培养上清液。待分析的物质用5 mM硫酸的流动相，以0.6 ml/min的流速，在40℃等度洗脱20 分钟。通过比较参比物(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim)的停留时间，进行鉴别。通过与预先用外标标准品产生的校正线进行峰面积对比，计算培养上清液中化合物的浓度。
实施例4: 用固定化的罗伊氏乳杆菌将甘油转化成3HPA (对比实施例)
按照实施例2制备的带有罗伊氏乳杆菌的固定化物，以10%浓度(20 g，相当于2 g干细胞/升的浓度)，在装有200 mL反应缓冲液的玻璃发酵罐 (总容积500 mL)中，用于生物转化。所述反应缓冲液由厌氧化的且预热至35℃的， 0.1 M KPP (pH 7)构成。在调节恒定pH-值为 7和恒定温度35℃以后，通过加入8 mL 98%的甘油(Roth，相当于在反应混合物中500 mM 的浓度)，开始反应。
每10分钟进行取样，持续1小时，然后每30分钟进行取样，持续2小时。甘油和副产物的浓度依照实施例3借助于HPLC测定。
3-羟基丙醛的定量分析根据Doleyres 等人 (“Production of 3-hydroxypropionaldehyde using a two-step process with Lactobacillus reuteri ”, Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 68, 2005, 第467-474页)，借助于比色试验完成。
在约100分钟反应时间以后，在游离细胞的情况下，以及在固定化细胞的情况下，不再能观察到甘油的转化。
甘油、3HPA和1,3-PDO的浓度曲线如图1所示；在生物转化过程中，生成1.29 g 3HPA。将反应介质与细胞或固定物分离，并在4℃单独储存。
根据上述的分析，甘油向3HPA和副产物的转化达到~25%。
重复使用细胞或固定化物，没能发现甘油向3HPA的转化。
实施例5: 根据本发明，在有氨基脲存在下用固定化的罗伊氏乳杆菌将甘油转化成3HPA
按照实施例2制备的带有罗伊氏乳杆菌的固定化物，以10%浓度(20 g，相当于2 g干细胞/升的浓度)，在装有200 mL反应缓冲液的玻璃发酵罐 (总容积500 mL)中，用于生物转化。所述反应缓冲液由0.1 M KPP (pH 7)以及500 mM 氨基脲构成，且已经厌氧化，并预热至35℃的反应温度。在调节恒定pH值为 7和恒定温度35℃以后，通过加入8 mL 98%的甘油(Roth，相当于在反应混合物中500 mM 的浓度)，开始反应。
如在实施例4中所述，对反应混合物进行取样和分析。
在150分钟的反应时间以后，将反应介质与固定化物分离，并加入新的厌氧化的、预热的反应介质(0.1 M KPP pH 7，含有500 mM氨基脲)。如上所述，进行另一个生物转化周期。共进行7个相继的，没有固定化物中间储存的周期。甘油、3HPA和1,3-PDO的浓度曲线如图2所示；图3显示了3HPA的累积产量。
使用氨基脲作为清除剂，进行甘油向3HPA的转化，根据上述分析，在前5个周期中，仅达到~55%；在以后的2个周期中，产量连续降低。
实施例6: 根据本发明，在碳酰肼存在下，用固定化的罗伊氏乳杆菌，将甘油转化为3HPA
按照实施例2制备的带有罗伊氏乳杆菌的固定物，以10%浓度(20 g，相当于2 g干细胞/升的浓度)，在装有200 mL反应缓冲液的玻璃发酵罐 (总容积500 mL)中，用于生物转化。所述反应缓冲液由0.1 M KPP (pH 7)以及520 mM碳酰肼构成，且已经厌氧化，并预热至35℃的反应温度。在调节恒定pH值为 7和恒定温度35℃以后，通过加入8 mL 98%甘油(Roth，相当于在反应混合物中的500 mM 浓度)，开始反应。
如在实施例4中所述，对反应混合物进行取样并分析。
在180分钟的反应时间以后，将反应介质与固定化物分离，并加入新的厌氧化的、预热的反应介质(0.1 M KPP pH 7，含有520 mM 碳酰肼)。如上所述，进行另一个生物转化周期。共进行10个相继的，没有固定化物中间储存的周期；甘油、3HPA和1,3-PDO的浓度曲线如图4所示；图5显示了3HPA的累积产量。
使用碳酰肼作为清除剂，进行甘油向3HPA和副产物的转化，根据上述分析，在所有10个周期中，达到~95%。
实施例7: 根据本发明，在含硫化合物存在下，用游离的罗伊氏乳杆菌，将甘油转化为3HPA
将按照实施例1制备的细胞悬浮于1000毫摩尔浓度甘油溶液中，达到总细胞浓度2.2x1010 CFU/ml。在加入含硫化合物(亚硫酸钠、亚硫酸氢钠或焦亚硫酸钠；在反应液中的终浓度分别为100 mmol/L)以后，将悬浮液温育120 min，其中通过导入连续的氮气流，保持混合物无氧。在表1中，列出了在120 min以后得到的3HPA和1,3-PDO浓度以及细胞活性，表明通过加入含硫化合物，可得到的3HPA 浓度增加以及细胞活性减少的降低。
表1。
含硫化合物 c (3-HPA) [mmol/L] c (1,3-PDO) [mmol/L] 细胞活性 [CFU/mL]
无 504 32 5.1*104
Na2S2O5 524 31 > 6.0*109
NaHSO3 546 30 3.2*109
Na2SO3 607 31 2.6*109
实施例8: 根据本发明，在碳酰肼存在下，用固定化的罗伊氏乳杆菌，将1,2-丙二醇或甘油分别转化为丙醛或3-羟基丙醛
将按照实施例1制备的细胞分别悬浮于500毫摩尔浓度甘油溶液或500毫摩尔1,2-丙二醇溶液中，达到总细胞浓度2.2x1010 CFU/ml。在反应液中加入终浓度100 mmol/L的碳酰肼以后，将悬浮液温育120 min，其中通过导入连续的氮气流，保持混合物无氧。显示在图6中的甘油和1,2-丙二醇的浓度曲线说明了两种底物的等效转化。
实施例9: 根据本发明，在含硫化合物存在下，并加入葡萄糖到洗涤溶液中，用固定化的罗伊氏乳杆菌细胞，将甘油转化为3HPA
按照实施例2制备的带有罗伊氏乳杆菌的固定物，以20%浓度(4 mL)，在装有20 mL反应缓冲液的玻璃发酵罐中，用于生物转化。所述反应液包含80 mmol/L的甘油，且温度至30℃以后，调节pH值至恒定为5(根据本发明的对比实施例和实施例)。在根据本发明的批料中，另外将亚硫酸氢钠加入反应溶液中(按照50 mmol/L的终浓度)。完成一个生物转化周期 (30 分钟)以后，过滤出固定化物，在MRSG20 (参见实施例1)中再生，持续30 分钟，并如所述再次用于反应液中。以所述方式，进行共7次甘油转化。未加入亚硫酸氢盐，在每个转化步骤中形成了10 mmol/L的1,3-PDO(图7)，而加入亚硫酸氢钠，可以观察到1,3-PDO 浓度的减少(图8)。
实施例10: 根据本发明，用游离的、遗传上未修饰的或修饰的罗伊氏乳杆菌，将甘油转化为3HPA
将野生型细胞或通过去除氧化还原酶基因生成的细胞悬浮于250毫摩尔浓度甘油溶液中，分别得到总细胞浓度1.2x1010 CFU/ml。如在120分钟生物转化过程中的浓度曲线显示，当使用罗伊乳杆菌野生型时，在20分钟生物转化后形成的3HPA 被降解，这有利于1,3-PDO的形成 (图9)，而当使用通过去除氧化还原酶基因生成的细胞时，会阻止3HPA向1,3-PDO的转化(图10)。
实施例11: 根据本发明，从含有3HPA的发酵产物生产丙烯醛
通过在升高温度的酸性水解，能够由按照实施例4 – 6得到的发酵产物得到丙烯醛。为此，以1:100的比例用水稀释一份发酵产物，与3份37%的盐酸混合，并在37℃温育0.5 h。在该过程中形成的丙烯酸在加入DL-色氨酸溶液 (Fluka, 0.01 mol/L的色氨酸，在0.05 mol/L的盐酸中)并在37℃重新温育 (0.5 h)以后，形成有色的加合物，通过它在560 nm的吸收，可以通过比色法定量分析。

Claims (11)

1. 用于生产醛的方法，所述方法包括下述方法步骤：
A) 使邻位二醇与氢裂解酶接触，
B) 分离在方法步骤A)中形成的醛和所述氢裂解酶，
C) 使用从方法步骤B)得到的氢裂解酶，重复方法步骤A)和B)至少一次，并任选地
D) 分离形成的醛，
其特征在于，
在存在与醛形成键的化合物情况下，进行所述方法。
2. 根据权利要求1的方法，
其特征在于，
在方法步骤A)中的所述氢裂解酶是甘油脱水酶。
3. 根据权利要求1或2的方法，
其特征在于，
在方法步骤A)中使用的氢裂解酶在载体上被固定化。
4. 根据权利要求1-3中至少一项的方法，
其特征在于，
在方法步骤A)中，使用具有氢裂解酶活性的细胞作为氢裂解酶。
5. 根据权利要求4的方法，
其特征在于，
与所述细胞的野生型相比，该细胞具有降低的能够还原所述醛的氧化还原酶的活性。
6. 根据权利要求1-5中的至少一项的方法，其特征在于，
在方法步骤A)中的所述邻位二醇是甘油或1,2-丙二醇。
7. 根据权利要求1-6中的至少一项的方法，其特征在于，
在方法步骤A) 中，基于总反应混合物，以0.01重量%-50重量%，优选0.2重量%-20重量%的浓度范围，使用邻位二醇。
8. 根据权利要求1-7中的至少一项的方法，其特征在于，
连续地进行方法步骤A)、B)和C)。
9. 根据权利要求1-8中的至少一项的方法，其特征在于，
使用氨基脲 [CAS 57-56-7]、碳酰肼 [CAS 497-18-7]或亚硫酸钠 [CAS 7757-83-7]作为与醛形成键的化合物。
10. 根据权利要求1-9中的至少一项的方法，其特征在于，
在根据本发明的方法中，以至少1:1、优选至少1:1.2、尤其是至少1:1.5的摩尔比，使用所述邻位二醇和所述与醛形成键的化合物的官能团。
11. 用于生产醛的氧化或还原产物的方法，所述方法包括下述方法步骤：
I) 通过根据权利要求1-10中任一项的方法，提供醛，
II) 通过还原、氧化、歧化或脱水，进行醛的化学或生物催化反应，得到任选为不饱和的还原或氧化中间产物，和任选地
III) 通过还原、氧化或加成，进行在方法步骤II)中得到的还原或氧化中间产物的其它化学或生物催化反应。
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