CN102712683A - 赖氨酰氧化酶和loxl2的催化结构域 - Google Patents
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Abstract
本文公开了人和小鼠的LOX和LOXL2蛋白的分离催化域的氨基酸序列和编码核苷酸序列。还提供了这些分离催化域的制备方法和用途。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年8月21日提交的美国临时专利申请第61/235,776号的权益,该专利申请通过引用全文纳入本文。
有关联邦资助的说明
无。
技术领域
本申请涉及酶学和分子生物学领域。
背景技术
结缔组织提供构架使身体的细胞和器官驻留其中。脊椎动物中结缔组织的主要成分是胞外基质。胞外基质的两种主要结构组分是多糖和纤维状蛋白,多糖形成胶状基质,而纤维状蛋白包埋在所述基质中。这些纤维状蛋白中最常见的两种是胶原蛋白和弹性蛋白。胶原蛋白纤维由胶原纤维的自缔合形成,胶原纤维自身通过三螺旋胶原分子的交联而形成。这种交联由赖氨酰氧化酶(LOX)和相关酶(“赖氨酰氧化酶样”或“LOXL”)催化,所有这些酶都含有催化域使赖氨酸和羟赖氨酸残基的ε-氨基团脱氨导致肽基赖氨酸转化成肽基-α-氨基己二酸-δ-半醛(醛赖氨酸)。醛赖氨酸残基能彼此自发缩合,导致胶原分子的交联。
胞外基质在多种病理(包括,例如纤维化和转移)中的作用已日益突出。参见例如,WO 01/83702(2001年11月8日);WO 2004/047720(2004年6月10日);WO 2007/126457(2007年8月11日);US 2006/0127402(2006年6月15日);US2007/0225242(2007年9月27日);US 2009/0053224(2009年2月26日);US 2009/0104201(2009年4月23日);Csiszar(2001)Prog.Nucleic Acid Res.and Molec.Biol.70:1-32;Kirschmann等(2002)Cancer Research 62:4478-4483。由于赖氨酰氧化酶和赖氨酰氧化酶样酶在胞外基质形成中通过交联胶原起关键作用,它们代表了重要的治疗靶标。因此,需要筛选这些胶原交联酶的抑制剂的方法,鉴定结合这些酶的分子的方法,以及用于不同治疗用途(例如,伤口愈合)的胶原交联活性的来源。
发明内容
本发明提供来自人和小鼠的赖氨酰氧化酶(LOX)和赖氨酰氧化酶样2(LOXL2)酶的分离的催化域,以及编码这些催化域的核酸。因此,提供下列肽以及编码这些肽的核酸:人LOX催化域,人LOXL2催化域,鼠LOX催化域和鼠LOXL2催化域。因此,本发明提供:
1.包含人赖氨酰氧化酶(LOX)催化域的氨基酸序列的多肽。(SEQ ID NO:1)
2.包含编码人赖氨酰氧化酶(LOX)催化域的核苷酸序列的多核苷酸。(SEQ IDNO:2)
3.包含人赖氨酰氧化酶样2(LOXL2)催化域的氨基酸序列的多肽。(SEQ IDNO:3)
4.包含编码人赖氨酰氧化酶样2(LOXL2)催化域的核苷酸序列的多核苷酸。(SEQ ID NO:4)
5.包含鼠赖氨酰氧化酶(LOX)催化域的氨基酸序列的多肽。(SEQ ID NO:5)
6.包含编码鼠赖氨酰氧化酶(LOX)催化域的核苷酸序列的多核苷酸。(SEQ IDNO:6)
7.包含鼠赖氨酰氧化酶样2(LOXL2)催化域的氨基酸序列的多肽。(SEQ IDNO:7)
8.包含编码鼠赖氨酰氧化酶样2(LOXL2)催化域的核苷酸序列的多核苷酸。(SEQ ID NO:8)
还提供:
1a.包含如本文所述(SEQ ID NO:1)人赖氨酰氧化酶(LOX)催化域的全部或部分氨基酸序列,而不含人LOX催化域外序列的多肽。
2a.所含核苷酸序列编码如本文所述(SEQ ID NO:2)人赖氨酰氧化酶(LOX)催化域的全部或部分,而不编码人LOX催化域外序列的多核苷酸。
3a.包含如本文所述(SEQ ID NO:3)人赖氨酰氧化酶样2(LOXL2)催化域的全部或部分氨基酸序列,而不含人LOXL2催化域外序列的多肽。
4a.所含核苷酸序列编码如本文所述(SEQ ID NO:4)人赖氨酰氧化酶样2(LOXL2)催化域的全部或部分,而不编码人LOXL2催化域外序列的多核苷酸。
5a.包含如本文所述(SEQ ID NO:5)鼠赖氨酰氧化酶(LOX)催化域的全部或部分氨基酸序列,而不含鼠LOX催化域外序列的多肽。
6a.所含核苷酸序列编码如本文所述(SEQ ID NO:6)鼠赖氨酰氧化酶(LOX)催化域的全部或部分,而不编码鼠LOX催化域外序列的多核苷酸。
7a.包含如本文所述(SEQ ID NO:7)鼠赖氨酰氧化酶样2(LOXL2)催化域的全部或部分氨基酸序列,而不含鼠LOXL2催化域外序列的多肽。
8a.所含核苷酸序列编码如本文所述(SEQ ID NO:8)鼠赖氨酰氧化酶样2(LOXL2)催化域的全部或部分,而不编码鼠LOXL2催化域外序列的多核苷酸。
还提供包含前述核酸和/或多核苷酸的表达载体。这些表达载体可选含有启动子(例如,T7启动子、T3启动子、SP6启动子、大肠杆菌(E.coli)RNA聚合酶启动子、CMV启动子、SV40启动子、PGK启动子、EF-1α启动子),转录终止信号(例如,SV40终止信号),剪接位点(例如,SV40剪接位点、β-珠蛋白剪接位点),核糖体结合位点,信号序列(例如,免疫球蛋白κ信号序列),表位标签(例如,myc),纯化标签(例如,His6),复制起点和药物选择标记。本文公开的表达载体中也可有编码接头氨基酸和/或包含限制性酶识别位点的接头序列,或任何其它类型的接头序列。
因此,本发明还提供:
9.一种多肽,其包含人LOX催化域的全部或部分氨基酸序列,不含人LOX催化域外氨基酸序列,还含有信号序列、表位和His6纯化标签中的一种或多种;例如,包含信号肽、人LOX催化域、myc表位标签和His6纯化标签的多肽(如SEQ ID NO:9)。
10.编码实施方式9所述多肽的多核苷酸;例如,包含编码信号肽、人LOX催化域、myc表位标签和His6纯化标签的序列的多核苷酸(如SEQ IDNO:10)。
11.包含实施方式10所述多核苷酸的表达载体。
12.如实施方式11所述的表达载体,还包含启动子、药物筛选标记和复制起点中任一种、任意组合或其全部。
13.一种多肽,其包含人LOXL2催化域的全部或部分氨基酸序列,不含人LOXL2催化域外氨基酸序列,还含有信号序列、表位标签和His6纯化标签中的一种或多种;例如,包含信号序列、人LOXL2催化域、myc表位标签和His6纯化标签的多肽(如SEQ ID NO:11)。
14.编码实施方式13所述多肽的多核苷酸;例如,包含编码信号序列、人LOXL2催化域、myc表位标签和His6纯化标签的序列的多核苷酸(如SEQ IDNO:12)。
15.包含实施方式14所述多核苷酸的表达载体。
16.如实施方式15所述的表达载体,还包含启动子、药物筛选标记和复制起点中任一种、任意组合或其全部。
17.一种多肽,其包含鼠LOX催化域的全部或部分氨基酸序列,不含鼠LOX催化域外氨基酸序列,还含有信号序列、表位和His6纯化标签中的一种或多种;例如,包含信号序列、鼠LOX催化域、myc表位标签和His6纯化标签的多肽(如SEQ ID NO:13)。
18.编码实施方式17所述多肽的多核苷酸;例如,包含编码信号序列、鼠LOX催化域、myc表位标签和His6纯化标签的序列的多核苷酸(如SEQ IDNO:14)。
19.包含实施方式18所述多核苷酸的表达载体。
20.如实施方式19所述的表达载体,还包含启动子、药物筛选标记和复制起点中任一种、任意组合或其全部。
21.一种多肽,其包含鼠LOXL2催化域的全部或部分氨基酸序列,不含鼠LOXL2催化域外氨基酸序列,还含有信号序列、表位标签和His6纯化标签中的一种或多种;例如,包含信号序列、鼠LOXL2催化域、myc表位标签和His6纯化标签的多肽(如SEQ ID NO:15)。
22.编码实施方式21所述多肽的多核苷酸;例如,包含编码信号序列、鼠LOXL2催化域、myc表位标签和His6纯化标签的序列的多核苷酸(如SEQ IDNO:16)。
23.包含实施方式22所述多核苷酸的表达载体。
24.如实施方式23所述的表达载体,还包含启动子、药物筛选标记和复制起点中任一种、任意组合或其全部。
附图简要说明
图1显示由转染了phLOXMCD表达载体的HEK293细胞表达人赖氨酰氧化酶(hLOX)蛋白的催化域。显示通过免疫印迹分析6株稳定转染的细胞系(编号23至28)。左图显示含各获自所述6株细胞系的未稀释生长培养基(净CM)样品(15ul)的聚丙烯酰胺凝胶的免疫印迹。中图显示可溶性胞内物质的分析,而右图显示不溶性胞内物质的分析。对于这些图,各泳道含有来自约105个细胞的物质。所有印迹用小鼠抗-His5一抗探测,然后与HRP偶联驴抗小鼠二抗反应。HRP活性用Chemi-Glow试剂(阿尔法新技术公司(Alpha Innotech),加利福尼亚州圣莱安德罗)显示。加工后催化域的预测分子量为26.9kD。
各图中标为“+”的泳道包括含His6序列的蛋白,用作抗-His5抗体的阳性对照。
图2显示转染了phLOXL2MCD表达载体的HEK293细胞表达人赖氨酰氧化酶样2(hLOXL2)蛋白的催化域。左图显示一些稳定转染细胞系(由各泳道顶部数字标示)的全细胞裂解液的免疫印迹,各泳道含有来自约1x105个细胞的物质。右图显示含各获自六个细胞系(由数字标示)的未稀释生长培养基(15μl净CM)样品的聚丙烯酰胺凝胶免疫印迹。所有印迹用小鼠抗-His5一抗探测,然后与HRP偶联驴抗小鼠二抗反应。HRP活性用Chemi-Glow试剂(阿尔法新技术公司,加利福尼亚州圣莱安德罗)显示。加工后催化域的预测分子量为31kD。
左图中标为“+”的泳道包括含His6序列的蛋白,用作抗-His5抗体的阳性对照。
图3显示由转染了pmLOXMCD表达载体的HEK293细胞表达鼠赖氨酰氧化酶(mLOX)蛋白的催化域。显示通过免疫印迹对5株稳定转染细胞系(编号为4、9、12、18和19)的分析。左图显示含各获自6株细胞系的未稀释生长培养基(净CM)样品(15ul)的聚丙烯酰胺凝胶的免疫印迹。右图显示对这6株中5株的可溶性和不溶性胞内部分的分析,各泳道含有来自约105个细胞的物质。所有印迹用小鼠抗-His5一抗探测,然后与HRP偶联驴抗小鼠二抗反应。HRP活性用Chemi-Glow试剂(阿尔法新技术公司,加利福尼亚州圣莱安德罗)显示。加工后催化域的预测分子量为27kD。
图4显示人和鼠LOX催化域在分泌和氨基酸序列上的差异。详见实施例10。
图6显示本发明中各种多肽的氨基酸序列的比对,包括衍生自人(hLOX、hLOXL1、hLOXL2等)和小鼠(mLOX和mLOXL2)的多肽。氨基酸残基的编号在所示的最N-末端残基处始于“1”,且不必与本领域常规一致。星号“*”表示所有显示的多肽在该位置的氨基酸均相同,冒号“:”表示保守性氨基酸取代,而单点“.”表示半保守性氨基酸取代,均按照欧洲生物信息研究所(EuropeanBioinformatics Institute,EMBL-EBI)提供的ClustalW2程序。
图7显示本发明中各种多肽的氨基酸序列的比对,仅包括衍生自人的那些多肽。编号和图例与图6所用相同。
发明详述
除非另有说明,本文的实施采用细胞生物学、毒理学、分子生物学、生物化学、细胞培养、免疫学、肿瘤学、重组DNA领域和相关领域中的标准方法和常规技术,所述方法和技术在本领域技术范围内。这些技术描述于文献中并因而本领域技术人员可用。参见例如Alberts,B.等“Molecular Biology of the Cell(《细胞分子生物学》)”,第5版,纽约州纽约市的加兰德科学出版社(GarlandScience),2008;Voet,D.等“Fundamentals of Biochemistry:Life at the MolecularLevel(《基础生物化学:分子水平的生命》)”第3版,新泽西州霍博肯的约翰威利出版社(John Wiley&Sons),2008;Sambrook,J.等,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual(《分子克隆:实验室手册》)”第3版,冷泉港实验出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),2001;Ausubel,F.等,“Current Protocolsin Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)”纽约的约翰威利出版社,1987,定期更新;Freshney,R.I.,“Culture of Animal Cells:A Manual of BasicTechnique(《动物细胞培养:基本技术手册》)”第4版,新泽西州萨默塞特的约翰威利出版社,2000;“Methods in Enzymology(《酶学方法》)”丛书,加利福尼亚州圣地亚哥的学术出版社(Academic Press)。
赖氨酰氧化酶型酶
本文所用术语“赖氨酰氧化酶型酶”或“赖氨酰氧化酶”指含催化域催化赖氨酸和羟赖氨酸残基的ε-氨基氧化脱氨的蛋白家族成员,该氧化脱氨导致肽基赖氨酸转变成肽基-α-氨基己二酸-δ-半醛(醛赖氨酸)并释放化学计量量的氨和过氧化氢:
此反应最常胞外发生于胶原和弹性蛋白中的赖氨酸残基上。醛赖氨酸的醛基具有反应性且能与其它醛赖氨酸和赖氨酸残基自发缩合,导致胶原分子交联以形成胶原纤维。
已从鸡、大鼠、小鼠、牛和人中纯化赖氨酰氧化酶。所有赖氨酰氧化酶都包含长约205个氨基酸的共有催化域,其位于所述蛋白羧基末端部分且含有该酶的活性位点。所述活性位点包括含保守氨基酸序列的铜结合位点,所述序列含配位Cu(II)原子的4个组氨酸残基。所述活性位点还包含赖氨酰酪氨酰醌(LTQ)辅因子,由赖氨酸和酪氨酸残基(对应于大鼠赖氨酰氧化酶的lys314和tyr349,以及人赖氨酰氧化酶的lys320和tyr355)之间的分子内共价连接形成。形成LTQ辅因子的酪氨酸残基周边序列也在赖氨酰氧化酶中保守。所述催化域还包含10个保守性半胱氨酸残基,其参与5个二硫键的形成。所述催化域还包括纤连蛋白结合域。最后,所述催化域中存在含有4个半胱氨酸残基的类似生长因子和细胞因子受体结构域的氨基酸序列。
尽管存在这些保守区,不同赖氨酰氧化酶型酶可在催化域内和之外通过核苷酸和氨基酸序列不同的区域来彼此区分。
此酶家族中分离和表征的第一个成员是赖氨酰氧化酶(EC 1.4.3.13);也称为蛋白-赖氨酸6-氧化酶、蛋白-L-赖氨酸:氧6-氧化还原酶(脱氨基)或LOX。参见例如Harris等,Biochim.Biophys.Acta(1974)341:332-344;Rayton等,(1979)J.Biol.Chem.254:621-626;Stassen,(1976)Biophys.Acta 438:49-60。
随后发现了其它赖氨酰氧化酶型酶。这些蛋白称为“LOX样”或“LOXL”。它们都包含上述共有催化结构域并具有类似酶活性。目前,已知人和小鼠中都存在5种不同赖氨酰氧化酶:LOX和4种LOX相关或LOX样蛋白LOXL1(也标注为“赖氨酰氧化酶样”、“LOXL”或“LOL”)、LOXL2(也标注为“LOR-1”)、LOXL3和LOXL4。编码所述5种不同赖氨酰氧化酶型酶的基因各位于不同染色体。参见例如Molnar等(2003)Biochim Biophys Acta.1647:220-24;Csiszar(2001)Prog.Nucl.Acid Res.70:1-32;2001年11月8日公开的WO 01/83702和美国专利第6,300,092号,其都通过引用纳入本文。已从鼠EC细胞系中分离出名为LOXC的LOX样蛋白,其与LOXL4具有一些相似性但表达模式不同。Ito等(2001)J.Biol.Chem.276:24023-24029。已从果蝇(Drosophila)中分离了2种赖氨酰氧化酶DmLOXL-1和DmLOXL-2。
尽管所有赖氨酰氧化酶型酶共有共同的催化域,但它们也彼此不同,特别是在其氨基末端区。所述4种LOXL蛋白与LOX相比具有氨基末端延伸。因此,人前LOX原(preproLOX)(例如,信号序列切割前的初级翻译产物,见下)包含417个氨基酸残基;LOXL1包含574个,LOXL2包含638个,LOXL3包含753个而LOXL4包含756个。本领域对全长赖氨酰氧化酶型酶的常规编号起始于信号序列的最N-末端残基处从“1”开始。
LOXL2、LOXL3和LOXL4在其氨基末端区含有4个重复的富含半胱氨酸的清除受体(SRCR)结构域。这些结构域在LOX或LOXL1中不存在。在分泌、跨膜或胞外基质蛋白中发现SRCR结构域,已知该结构域在许多分泌和受体蛋白中介导配体结合。Hoheneste等(1999)Nat.Struct.Biol.6:228-232;Sasaki等(1998)EMBO J.17:1606-1613。LOXL3在SRCR结构域外还包含氨基末端区的核定位信号。富含脯氨酸的结构域看来是LOXL1特有的。Molnar等(2003)Biochim.Biophys.Acta 1647:220-224。各种赖氨酰氧化酶型酶的糖基化模式也不同。
所述赖氨酰氧化酶型酶的组织分布也不同。人LOX mRNA在心脏、胎盘、睾丸、肺、肾和子宫中高表达,但在脑和肝中微弱表达。人LOX1mRNA在胎盘、肾、肌肉、心脏、肺和胰腺中表达,且与LOX类似,在脑和肝中表达水平低许多。Kim等(1995)J.Biol.Chem.270:7176-7182。高水平的LOXL2mRNA在子宫、胎盘和其它器官中表达,但如LOX和LOXL,其在脑和肝中低水平表达。Jourdan Le-Saux等(1999)J.Biol.Chem.274:12939:12944。LOXL3mRNA在睾丸、脾和前列腺中高表达,在胎盘中中等表达,在肝中不表达,而在肝中观察到高水平的LOXL4mRNA。Huang等(2001)Matrix Biol.20:153-157;Maki和Kivirikko(2001)Biochem.J.355:381-387;Jourdan Le-Saux等(2001)Genomics74:211-218;Asuncion等(2001)Matrix Biol.20:487-491。
不同赖氨酰氧化酶在疾病中的表达和/或参与也可改变。参见例如Kagen(1994)Pathol.Res.Pract.190:910-919;Murawaki等(1991)Hepatology14:1167-1173;Siegel等(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:2945-2949;JourdanLe-Saux等(1994)Biochem.Biophys.Res.Comm.199:587-592;Kim等(1999)J.Cell Biochem.72:181-188。赖氨酰氧化酶型酶还与许多癌症有关,包括头颈癌、膀胱癌、结肠癌、食管癌和乳腺癌。参见例如Wu等(2007)Cancer Res.67:4123-4129;Gorough等(2007)J.Pathol.212:74-82;Csiszar(2001)Prog.Nucl.Acid Res.70:1-32和Kirschmann等(2002)Cancer Res.62:4478-4483。
因此,尽管所述赖氨酰氧化酶型酶在结构和功能上呈现某些重叠,它们看来还各具有独特的功能。例如,就结构而言,针对人LOX蛋白催化域产生的某些抗体不结合人LOXL2。就功能而言,据报道小鼠中靶向缺失LOX看来对分娩致命,而LOXL1缺陷不引起严重的发育表型。Hornstra等(2003)J.Biol.Chem.278:14387-14393;Bronson等(2005)Neurosci.Lett.390:118-122。
尽管最广泛记载的赖氨酰氧化酶型酶活性是氧化细胞外胶原和弹性蛋白中的特定赖氨酸残基,但有证据显示赖氨酰氧化酶型酶还参与许多胞内过程。例如,据报道某些赖氨酰氧化酶型酶调节基因表达。Li等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:12817-12822;Giampuzzi等(2000)J.Biol.Chem.275:36341-36349。此外,据报道LOX氧化组蛋白H1中的赖氨酸残基。LOX的其它胞外活性包括诱导单核细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞趋化性。Lazarus等(1995)MatrixBiol.14:727-731;Nelson等(1988)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.188:346-352。LOX自身表达受许多生长因子和类固醇如TGF-β、TNF-α和干扰素诱导。Csiszar(2001)Prog.Nucl.Acid Res.70:1-32。近期研究显示LOX在多种生物学功能如发育调节、肿瘤抑制、细胞迁移和细胞衰老中具有其它作用。
来自各种来源的赖氨酰氧化酶(LOX)蛋白的示例包括具有的氨基酸序列与以下序列之一所表达或翻译的多肽基本相同的酶:EMBL/GenBank登录号:M94054;AAA59525.1-mRNA;S45875;AAB23549.1-mRNA;S78694;AAB21243.1-mRNA;AF039291;AAD02130.1-mRNA;BC074820;AAH74820.1-mRNA;BC074872;AAH74872.1-mRNA;M84150;AAA59541.1-基因组DNA。LOX的一个实施方式是人赖氨酰氧化酶(hLOX)前原蛋白。
赖氨酰氧化酶样酶编码序列的示例性公开如下:LOXL1由以GenBank/EMBL BC015090保藏的mRNA编码;AAH15090.1;LOXL2由以GenBank/EMBL U89942保藏的mRNA编码;LOXL3由以GenBank/EMBLAF282619保藏的mRNA编码;AAK51671.1;LOXL4由以GenBank/EMBLAF338441保藏的mRNA编码;AAK71934.1。
称为前原肽的LOX蛋白初级翻译产物包含从氨基酸1-21延伸的信号序列。此信号序列在小鼠和人LOX中都通过Cys21与Ala22间的切割来胞内释放,从而产生LOX的46-48kDa前肽形式,在本文中也称为全长形式。所述前肽在通过高尔基体时进行N-糖基化以产生50kDa蛋白,然后分泌到胞外环境中。在此阶段,所述蛋白没有催化活性。在小鼠LOX的Gly168和Asp169之间、人LOX的Gly174和Asp175之间的进一步切割产生成熟、具催化活性的30-32kDA酶,释放18kDa前肽。此最终切割事件由金属内切蛋白酶前胶原C蛋白酶催化,该酶也称为骨形态发生蛋白-1(BMP-1)。有趣的是,该酶还在LOX底物—胶原的加工中发挥作用。然后去除N-糖基单元。
预测可能的信号肽切割位点在LOXL1、LOXL2、LOXL3和LOXL4的氨基末端。所预测信号切割位点为:LOXL1在Gly25和Gln26之间,LOXL2在Ala25和Gln26之间,LOXL3在Gly25和Ser26之间,LOXL4在Arg23和Pro24之间。
已鉴定LOXL1蛋白的BMP-1切割位点在Ser354和Asp355之间。Borel等(2001)J.Biol.Chem.276:48944-48949。已预测其它赖氨酰氧化酶型酶的潜在BMP-1切割位点,预测是根据前胶原和前LOX中BMP-1切割的共有序列位于Ala/Gly-Asp序列,之后通常是酸性或带电残基。LOXL3中预测的BMP-1切割位点位于Gly447和Asp448之间;加工此位点可产生与成熟LOX大小类似的成熟肽。也在LOXL4内鉴定了潜在的BMP-1切割位点,位于残基Ala569和Asp570之间。Kim等(2003)J.Biol.Chem.278:52071-52074。LOXL2也可与其它LOXL家族成员类似地进行蛋白水解切割并分泌。Akiri等(2003)Cancer Res.63:1657-1666。
基于赖氨酰氧化酶型酶中存在共同催化域,活性位点所在的酶原C-末端30kDa区的某些氨基酸残基高度保守。在所述前肽结构域中观察到较为适度的保守性(约60-70%)。
就本公开的目的而言,术语“赖氨酰氧化酶型酶”包括所有上述5种赖氨酸氧化酶,即LOX、LOXL1(也鉴定为LOXL)、LOXL2、LOXL3和LOXL4),还包括基本保留酶活性如能催化赖氨酰残基脱氨的LOX、LOXL1、LOXL2、LOXL3和LOXL4的功能片段和/或衍生物。在关于氨基酸序列或多核苷酸序列(例如,“衍生自”LOXL2的氨基酸序列)的语境中,“片段和/或衍生物”意在表示所述多肽或核酸含有某天然产生赖氨酰氧化酶型酶蛋白或其编码核酸的全部或部分的连续序列,而不用来对所述蛋白质或核酸制备的来源或方法构成限制。
通常,功能片段或衍生物保留其至少50%的赖氨酸氧化活性。在一些实施方式中,功能片段或衍生物保留其至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%的赖氨酸氧化活性。
赖氨酰氧化酶型酶的功能片段还旨在包括不显著改变催化活性的保守性氨基酸取代(就天然多肽序列而言)。术语“保守性氨基酸取代”指基于某些共有结构和/或性质的氨基酸分组。就共有结构而言,氨基酸可分成含非极性侧链(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸),含极性不带电侧链(丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸和半胱氨酸)和含极性带电侧链(赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸)。含芳族侧链的氨基酸组包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。脯氨酸、色氨酸和组氨酸中存在杂环侧链。在含非极性侧链的氨基酸组中,具有短烃侧链的氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)可与具有较长、非烃侧链的氨基酸(甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)相区分。在具有极性带电侧链的氨基酸组中,酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)可与带碱性侧链的氨基酸(赖氨酸、精氨酸和组氨酸)相区分。
一种确定个体氨基酸共有性质的功能性方法是分析同源生物体对应蛋白之间氨基酸改变的归一化频率(Schulz,G.E.和R.H.Schirmer,Principles ofProtein Structure(《蛋白结构原理》),施普林格出版公司(Springer-Verlag),1979)。根据此类分析,可限定氨基酸组,同源蛋白中优选用组内的氨基酸相互取代,从而对总体的蛋白结构具有相似的影响(Schulz,G.E.和R.H.Schirmer,《蛋白结构原理》,施普林格出版公司,1979)。根据此类分析,“保守性氨基酸取代”指用某一氨基酸残基取代与其共有氨基酸侧链的化学和物理性质(例如,电荷、大小、疏水性/亲水性)的另一氨基酸残基。以下为共有某些化学和/或物理性质的氨基酸残基的示例:
(i)含带电基团的氨基酸,由Glu、Asp、Lys、Arg和His组成,
(ii)含带正电基团的氨基酸,由Lys、Arg和His组成,
(iii)含带负电基团的氨基酸,由Glu和Asp组成,
(iv)含芳族基团的氨基酸,由Phe、Tyr和Trp组成,
(v)含氮环基团的氨基酸,由His和Trp组成,
(vi)含大的脂肪族非极性基团的氨基酸,由Val、Leu和Ile组成,
(vii)含微极性基团的氨基酸,由Met和Cys组成,
(viii)含小残基的氨基酸,由Ser、Thr、Asp、Asn、Gly、Ala、Glu、Gln和Pro组成,
(ix)含脂肪族基团的氨基酸,由Val、Leu、Ile、Met和Cys组成,以及
(x)含羟基的氨基酸,由Ser和Thr组成。
某些“保守性取代”可包括在以下各组氨基酸残基内的取代:Gly、ala;val、ile、leu;asp、glu;asn、gln;ser、thr;lys、arg;和phe、tyr。
因此,如上所示范,氨基酸的保守性取代为本领域技术人员已知且可常规进行而不改变所得分子的生物学活性。本领域技术人员还认识到,多肽非必需区域的单一氨基酸取代通常不显著改变生物学活性。参见例如Watson等“Molecular Biology of the Gene(《基因分子生物学》)”第4版,1987,加利福尼亚州门洛帕克的本杰明/卡明斯出版公司(The Benjamin/Cummings Pub.Co.),224页。
其它关于赖氨酰氧化酶的信息,参见例如Rucker等(1998)Am.J.Clin.Nutr.67:996S-1002S和Kagan等(2003)J.Cell.Biochem 88:660-672。还可参见共有的美国专利申请US 2009/0053224(2009年2月26日)和US 2009/0104201(2009年4月23日);其内容通过引用纳入本文用于描述赖氨酰氧化酶和赖氨酰氧化酶样酶、这些酶的调节剂和鉴定这些酶的调节剂的方法。还可参见WO2004/47720(2004年6月10日);WO 2007/126457(2007年8月11日);WO2009/010974(2009年1月22日);US 2006/0127402(2006年6月15日);US2007/0021365(2007年1月25日)和US 2007/0225242(2007年9月27日);所有这些都通过引用纳入本文用于描述赖氨酰氧化酶和赖氨酰氧化酶样酶、这些酶的调节剂以及鉴定这些酶的调节剂的方法。
具有赖氨酰氧化酶或赖氨酰氧化酶型酶的催化域的多肽
本发明提供具有赖氨酰氧化酶型酶的活性的多肽,例如如上所述根据国际生物化学与分子生物学联盟(International Union of Biochemistry and MolecularBiology)命名法属于EC 1.4.3.13的那些酶。含有信号序列和/或前肽的全长蛋白都可在蛋白获得全部体内催化活性前被切割。全长赖氨酰氧化酶或赖氨酰氧化酶样酶的长度可以超过100、200、300、400、500、700个,至多754个或更多个氨基酸残基。不含信号序列和/或前肽的成熟全长蛋白的长度可以超过100、200、240、480、720、730个,至多740个或更多个氨基酸残基。
本发明的多肽可衍生自成熟的全长LOX或LOXL蛋白(例如,不含信号肽和/或前肽)。示例性多肽可以具有图6和图7所示的任意氨基酸序列。
图6显示由人LOX、人LOXL1、人LOXL2、人LOXL3、人LOXL4、鼠LOX和鼠LOXL2所衍生多肽的氨基酸序列的比对。图7显示仅由人LOX/LOXL蛋白所衍生多肽的序列比对。为方便起见,对氨基酸残基的编号在图6和7所示最N-末端残基处从“1”开始。因此,本发明的多肽可参照图6和图7中所示序列使用的编号系统或如前文所述本领域所用编号系统描述。或者,所述多肽可参照本文给出的序列标识号描述。图6和图7中的星号“*”表示所有显示的多肽在该位置的氨基酸均相同,冒号“:”表示保守性氨基酸取代,而单点“.”表示半保守性氨基酸取代,均按照欧洲生物信息研究所(EuropeanBioinformatics Institute,EMBL-EBI)提供的ClustalW2程序所用图例。
本发明的多肽可以涵盖具有赖氨酰氧化酶型酶C-末端部分的至少约50个、至少约75个、至少约100个、至少约120个、至少约140个、至少约150个、至少约170个、至少约180个、至少约200个、至少约220个、多到至少约240个或更多个氨基酸的多肽。例如,本发明的多肽可含有图6中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:17所示的C-末端207个氨基酸残基。本发明的多肽还涵盖那些所含氨基酸序列少于天然产生的全长赖氨酰氧化酶型酶的多肽。多肽可含有LOX或LOXL-蛋白的C-末端部分的多达约25个、多达约50个、多达约75个、多达约100个、多达约120个、多达约140个、多达约160个、多达约180个、多达约200个、多达约220个、多达约230个或更多的氨基酸残基,如图6和图7中的序列所示例。所述多肽可排除信号序列,前肽,和/或LOX或LOXL-蛋白在图6和图7所示序列N-末端方向的任意部分。
本发明的多肽还可参照上述本领域所用编号系统来描述,该编号系统中氨基酸编号“1”表示含有信号序列的全长LOX或全长LOXL-蛋白的最N-末端的氨基酸残基。根据该编号,所述多肽可描述为具有的氨基酸序列从LOX(例如,SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5)中残基号约190-240,约200-230,或约210-220起始的多肽。所述多肽可含有从LOXL1中残基号约350-360,约340-370,或约330-380起始的氨基酸序列。或者,所述多肽可含有从LOXL2(例如,SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:7)中残基号约540-550,约530-560,或约520-570起始的氨基酸序列。所述多肽还可含有从LOXL3中残基号约520-530,约510-540,或约500-550起始的氨基酸序列。所述多肽还可含有从LOXL4中残基号约530-540,约540-550,或约530-560起始的氨基酸序列。
本发明的多肽涵盖那些与图6和图7所示氨基酸序列相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多个氨基酸取代,例如保守性氨基酸取代的多肽。对于氨基酸取代的指导可从图6和图7所提供的比对中获得。可被取代的氨基酸残基可以位于并非高度保守的残基位置,例如那些未用星号、冒号或点符标注的残基位置。本领域普通技术人员应当了解,基于所示比对,与其他残基位置相比,某些残基位置的氨基酸残基可容许取代、缺失和/或插入而不改变多肽整体的物理和化学性质。
本发明的多肽涵盖所含氨基酸序列与图6所示任意多肽至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%相同的那些多肽。例如,图6所示鼠LOX催化域多肽的氨基酸序列与人LOX催化域多肽的氨基酸序列有98%的氨基酸序列相同性。
根据上述说明,可从中衍生本发明多肽的蛋白包括LOX(GenBank登录号NP_002308),LOXL1(NP_005567),LOXL2(NP_002309),LOXL3(NP_115882)和LOXL4(NP_115587),其中上述GenBank登录号表示人序列。除了在人中所发现的以外,这些LOX或LOXL蛋白还可包括在小鼠或其它哺乳动物中发现的那些。例如,LOX、LOXL1或LOXL2蛋白可以源自鼠(GenBank登录号分别为NP_034858、NP_034859、NP_201582)。
主题多肽可包括衍生白赖氨酰氧化酶型酶(例如,LOX或LOXL2)的氨基酸序列,还包含异源氨基酸序列,例如LOX或LOXL2序列连接有并非LOX或LOXL2蛋白部分的多肽。这类多肽可以是融合蛋白,如含有表位标签、纯化标签和/或可检测标记的融合蛋白。融合蛋白可在异源序列和衍生自赖氨酰氧化酶型酶的氨基酸序列之间任选地包括接头序列。本领域熟知在提供有核酸序列时产生感兴趣融合蛋白的方法。下文详述其它异源元件和示例性融合蛋白。
含有异源元件的示例性多肽可包括myc和/或His6标签,并可任选地包括侧接的接头序列,例如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ IDNO:15中所示。
本发明的多肽还涵盖那些连接有报道多肽如荧光蛋白和/或偶联有某分子的多肽。与所述多肽偶联的分子可以是载体分子或当存在于动物中时会引起免疫应答的已知免疫原(例如,佐剂)。其它偶联物可包括那些有助于主题多肽的递送和/或提高其半衰期的偶联物。
本发明所述多肽还可含有一个或多个聚乙二醇(PEG)部分。这些多肽被称为“PEG化多肽”。本领域熟知适用于多肽PEG化的方法和试剂。通常,适于偶联多肽的PEG往往在室温下可溶于水,且具有通式R(O-CH2-CH2)nO-R,其中R为氢或保护基团如烷基或链烷醇基团,且其中n是1-1000的整数。R为保护基团时,其通常含有1-8个碳原子。
PEG可有至少一个经修饰羟基以产生官能团与所述多肽中的氨基(例如,赖氨酸残基中的ε-氨基或多肽N-末端的游离氨基)或羧基反应。
其它PEG的衍生物包含末端硫代羧酸基团-COSH,其与氨基选择性反应产生酰胺衍生物。在其它实施方式中,PEG含有活性酯,例如在PEG链末端的N-羟基丁二酰亚胺。这种含N-羟基丁二酰亚胺的PEG分子在特定pH条件如6.5-7.5左右的中性pH下与选定氨基反应。
PEG可直接与所述多肽的氨基酸残基偶联,或可通过接头连接。在一些实施方式中,所述多肽添加接头,形成接头修饰的多肽。这些接头提供各种功能,例如,将PEG试剂与接头修饰的多肽偶联的反应基团如巯基、氨基或羧基。
与所述多肽偶联的PEG可以是直链或支链的。支链PEG衍生物包括但不限于:美国专利第5,643,575号中所述,“星形PEG(star-PEG)”和多分支PEG如谢氏聚合物有限公司(Shearwater Polymers)产品目录“聚乙二醇衍生物1997-1998”中所述的那些。本领域对星形PEG有描述,例如在美国专利第6,046,305号中。
编码含赖氨酰氧化酶型酶催化域多肽的多核苷酸
本发明考虑的多核苷酸含有编码前述具赖氨酰氧化酶型酶活性多肽的核酸序列。本文所考虑的核酸具有的核苷酸序列与编码上述任意多肽的核酸的连续序列的相同性至少为70%(例如,至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)。相同性百分数是基于所比较序列中的较短序列。可利用熟知的程序如BLASTN(2.0.8)(Altschul等(1997)Nucl.Acids.Res.25:3389-3402)采用默认参数无过滤来进行序列比较。由于遗传编码的简并性,核酸序列相同性(例如,编码相同氨基酸序列的两个不同多核苷酸之间)可以低于氨基酸序列相同性的百分数。
编码本发明多肽的多核苷酸中的核酸序列示例包括SEQ ID NO:2(人LOX-衍生的),SEQ ID NO:4(人LOX2-衍生的),SEQ ID NO:6(鼠LOX-衍生的)和SEQ ID NO:8(鼠LOX2-衍生的)。也可在表达载体中提供这些核酸序列。
本文提供的表达载体含有前述核酸和/或多核苷酸。这些表达载体可含有启动子(例如,T7启动子、T3启动子、SP6启动子、大肠杆菌(E.coli)RNA聚合酶启动子、CMV启动子、SV40启动子、PGK启动子、EF-1α启动子),转录终止信号(例如,SV40终止信号),剪接位点(例如,SV40剪接位点、β-珠蛋白剪接位点),核糖体结合位点,信号序列(例如,免疫球蛋白κ信号序列),表位标签(例如,myc),纯化标签(例如,His6),复制起点和药物选择标记。在本文所述载体中,还可将编码接头氨基酸和/或含有限制性酶识别位点的接头序列或任何其它类型的接头序列,与编码主题多肽的核酸操作性连接。下文详述载体及其应用。
制备本发明多肽的方法
本发明的多肽可用任何适当方法制得,包括重组和非重组方法(例如,化学合成)。主题多肽可用本领域熟知的固相合成方法(例如,Fmoc-或t-Boc化学法)制备,例如Merrifield(1963)J.Am.Chem.Soc.85:2149和Methods inMolecular Biology(《分子生物学方法》)第35卷Peptide Synthesis Protocols(《肽合成方法》)中所述的那些方法。
用重组技术制备所述多肽时,所述方法可包括任何适当构建物和任何适当宿主细胞,其可以是原核或真核细胞(例如,细菌宿主细胞、酵母宿主细胞或培养的哺乳动物宿主细胞)。例如,将遗传物质引入宿主细胞中的方法包括转化、电穿孔、脂质转染、接合、磷酸钙法等。可选择转移的方法以提供所引入的多肽编码核酸的稳定表达。所述多肽编码核酸可作为可遗传的游离元件(例如质粒)提供,或可经基因组整合。
用于转移多肽编码核酸的合适载体在组成上可有变化。整合载体可以是条件性复制或自杀质粒、噬菌体等。所述构建体可包括各种元件,包括例如,启动子、选择性遗传标记(例如,提供抗生素抗性的基因(例如,新霉素、G418、氨甲喋呤、氨苄青霉素、卡那霉素、红霉素、氯霉素或庆大霉素))、复制起点(以促进在宿主细胞如细菌宿主细胞中的复制)等。对载体的选择取决于各种因素,如需要增殖的细胞类型和增殖的目的。某些载体可用于扩增和制备大量所需DNA序列。其它载体适用于在培养的细胞中表达蛋白。还有其它载体适用于在整个动物的细胞中进行转移和表达。对合适载体的选择是本领域众所周知的技术。很多这样的载体可市售购得。
所用载体可以是基于附加体质粒的表达载体,所述质粒包含选择性药物抗性标记和用于在不同宿主细胞内提供自主复制的元件。本领域技术人员熟知的大量出版物详细描述了载体,所述出版物包括例如,Short Protocols in MolecularBiology(《分子生物学简明实验方案》)(1999)F.Ausubel等编,韦利父子出版公司(Wiley&Sons)。载体可提供编码主题多肽的核酸的表达,可提供主题核酸的增殖,或两者均可。
可通过例如将感兴趣的多核苷酸插入到构建体主链中,通常采用DNA连接酶结合载体中经切割限制性酶位点来制备构建体。或者,插入所需核苷酸序列可通过同源重组或位点特异性重组,或可通过一种或多种扩增方法(例如,PCR)。通常通过将同源区域与载体在所需核苷酸序列侧翼连接来完成同源重组,而通过采用促进位点特异性重组的序列(例如,cre-lox、att位点等)来完成位点特异性重组。可通过例如连接寡核苷酸或采用同时包含同源区域和所需核苷酸序列一部分的引物进行聚合酶链反应来加入包含这类序列的核酸。
就感兴趣多肽的表达而言,可采用表达盒。因此,本发明提供包含主题核酸的重组表达载体。所述表达载体可提供转录和翻译调节序列,还可提供用于诱导型或组成型表达,其中编码区操作性置于转录起始区(例如,启动子或增强子)和转录与翻译终止区的转录控制下。这些控制区可以相对主题多肽得以衍生的赖氨酰氧化酶型酶为天然的,或者可以衍生自外源性来源。如此,来自外源性来源的控制区可视为操作性连接编码主题多肽的核酸的异源元件。通常,所述转录和翻译调节序列可包括但不限于,启动子序列、核糖体结合序列、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活序列。启动子可以是组成型或诱导型,并可以是强组成型启动子(例如T7等)。
表达载体通常具有位于启动子序列附近的便捷限制性位点,其,以便插入编码感兴趣蛋白质的核酸序列。可存在表达宿主中可操作的选择性标记以促进对包含所述载体的细胞的选择。此外,所述表达构建体可包含其它元件。例如,所述表达载体可具有一个或多个复制系统,由此使其能保持于例如用于表达的哺乳动物或昆虫细胞中和用于克隆和扩增的原核宿主中。此外,所述表达构建体可包含选择性标记基因以能够选择转化的宿主细胞。选择基因在本领域中熟知,随采用的宿主细胞而变化。
应注意,本发明所述多肽还可包含其它元件,如可检测标记,例如,放射性标记、荧光标记、生物素标记、免疫学可检测标记(例如,血凝素(HA)标签、多组氨酸标签)等。可提供其它元件(例如,在融合多肽的形式中)以通过多种方法促进本发明所述多肽的表达(例如,N-末端甲硫氨酸和/或促进宿主细胞中表达的异源信号序列)和/或分离(例如,生物素标签、免疫学可检测标签)。所述多肽还能可选地通过共价或非共价连接固定在支撑物上。编码主题多肽的示例性核酸可含有SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16。所述核酸可编码衍生自人或鼠赖氨酰氧化酶型酶的具有myc标签、His6标签和/或接头序列的多肽。
可根据本领域已知方法完成主题多肽的分离和纯化。术语“分离的”旨在表示某化合物(例如,多肽或多核苷酸)与其全部或某些天然伴随成分相分离。“分离的”还指某化合物与其全部或某些制备中(例如,化学合成、重组表达、生长培养基等)的伴随成分相分离的状态。
例如,本发明所述多肽可分离自经遗传改良以表达主题多肽的细胞裂解液,分离自细胞生长培养基上清,或分离自合成反应混合物。分离还可以通过免疫亲和纯化实现,所述方法通常包括使样品接触针对所述多肽的某表位(例如,与衍生自赖氨酰氧化酶型酶的氨基酸序列融合的异源表位)的抗体(可选为固定化的),清洗除去非特异性结合物质,并洗脱特异性结合的多肽。分离的多肽还可通过透析和蛋白质纯化中常规采用的其它方法纯化,例如金属螯合层析、离子交换和尺寸排阻法。
本发明还考虑含有编码一种或多种本发明所述多肽的外源多核苷酸的重组宿主细胞。
筛选方法
本发明所述具有赖氨酰氧化酶催化活性的多肽可用于赖氨酰氧化酶型酶活性的调节剂的筛选方法。表达足量前述主题多肽可用于提供底物给下述的筛选试验。
赖氨酰氧化酶型酶活性的调节剂(和待测试调节活性的候选化合物)可包括大分子,例如蛋白质(如抗体、转录因子)和核酸(如形成三链体的寡核苷酸,反义寡核苷酸,核酶,siRNA,shRNA);以及有机小分子,例如由合成有机方法和/或组合化学所得分子。
赖氨酰氧化酶型酶活性的调节剂包括激活剂(激动剂)和抑制剂(拮抗剂),并可用多种筛选试验选出。在一种实施方式中,调节剂可通过确定测试化合物是否结合本文所述多肽的催化域来鉴定;其中,若发生结合,则所述化合物为候选调节剂。任选地,可对此类候选调节剂进行其它测试。或者,候选化合物可接触本文所述多肽,并分析所述多肽的生物活性;改变所述多肽生物活性的化合物为赖氨酰氧化酶型酶的调节剂。通常,降低所述多肽生物活性的化合物是该酶的抑制剂。
鉴定赖氨酰氧化酶型酶活性的调节剂的其它方法包括将候选化合物在细胞培养物中孵育并分析所述细胞的一种或多种生物活性或特征,其中所述细胞表达一种或多种本发明的多肽。改变培养物中所述细胞的生物活性或特征的化合物是赖氨酰氧化酶型酶活性的潜在调节剂。可供分析的生物活性包括例如,赖氨酸氧化、过氧化物生成、氨生成、赖氨酰氧化酶型酶的水平、编码赖氨酰氧化酶型酶的mRNA水平、本发明所述多肽的水平、编码本发明所述多肽的mRNA水平和/或某赖氨酰氧化酶型酶特异的一种或多种功能。
在前述试验的其它实施方式中,在不与候选化合物接触的情况下,将所述一种或多种生物活性或细胞特征与一种或多种赖氨酰氧化酶型酶的水平或活性相关联。例如,所述生物活性可以是细胞功能如迁移,趋化,上皮-间充质转化(EMT)或间充质-上皮转化(MET),且所述变化通过与一种或多种对照或参比样品的比较测得。
还可使用对照。作为示例,阴性对照样品可包括具有减弱水平的本发明多肽的培养物(或不表达本发明多肽的培养物),其中加有候选化合物;或者是与测试培养物具有等量本发明多肽的培养物,但不添加候选化合物。对照可包括添加模拟候选化合物或已知激活或抑制赖氨酰氧化酶活性的试剂。在一些实施方式中,含有不同水平的本发明多肽的单独培养物接触候选化合物。若观察到生物活性的变化,并且若所述变化在具有高水平所述多肽的培养物中更大,则所述化合物鉴定为赖氨酰氧化酶型酶活性的调节剂。确定所述化合物是否是赖氨酰氧化酶型酶的激活剂或抑制剂可以由所述化合物引发的表型凸显,或可能需要进一步试验,例如测试所述化合物对一种或多种赖氨酰氧化酶型酶的酶促活性的影响。
本领域已知获得赖氨酰氧化酶型酶的生化或重组方法,以及细胞培养和酶促试验方法以鉴定上述赖氨酰氧化酶型酶活性的调节剂。
赖氨酰氧化酶型酶的酶促活性可以用多种不同方法测试。例如,评价赖氨酰氧化酶的酶促活性可通过检测和/或定量分析过氧化氢、氨离子和/或醛的生成,通过分析赖氨酸氧化和/或胶原交联,或通过测量细胞侵袭能力、细胞粘附、细胞生长或转移性生长进行。参见例如,Trackman等(1981)Anal.Biochem.113:336-342;Kagan等(1982)Meth.Enzymol.82A:637-649;Palamakumbura等(2002)Anal.Biochem.300:245-251;Albini等(1987)Cancer Res.47:3239-3245;Kamath等(2001)Cancer Res.61:5933-5940;美国专利第4,997,854号和美国专利申请公开号2004/0248871。
例如,测试化合物包括但不限于:有机小化合物(例如分子量在约50-2,500Da的有机分子),如核酸或蛋白质。所述化合物或多种化合物可以由化学合成或微生物制备和/或包含在例如样品中,例如来自植物、动物或微生物的细胞提取物。用于分析赖氨酰氧化酶型酶的反应混合物可以是无细胞的提取物,或者可以含有细胞培养物或组织培养物。例如,多种化合物可以加至反应化合物、加至生长培养基、注入细胞内或给予转基因动物。例如,试验中所用细胞或组织可以是细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞、脊椎动物细胞、哺乳动物细胞、灵长类动物细胞、人细胞,或可含有或取自非人的转基因动物。
若在本发明所述方法中鉴定含有某化合物或多种化合物的样品,则可能从鉴定为含有能抑制或激活主题多肽的化合物的初始样品中分离出所述化合物,或可以进一步细分所述初始样品,例如若该样品由多种不同化合物组成时,从而减少每个样品中的不同物质数量,并对所述初始样品的细分物重复所述方法。取决于所述样品的复杂性,上述步骤可进行数次(例如,通过有限稀释法),直至按本发明所述方法鉴定的样品仅包含有限数量或仅一种物质。在一些实施方式中,所述样品包含具有相似化学和/或物理性质的物质,而在一些实施方式中,所述物质相同。
此外,上述方法可用于构建衍生自赖氨酰氧化酶型酶的结合表位。类似方法已成功描述用于抗-p24(HIV-1)单克隆抗体的肽抗原,参见Kramer(1997)Cell 97:799-809。Kramer(1995)Mol.Immunol.32:459-465中描述了采用聚集的氨基酸肽文库进行肽-抗体相互作用的指纹分析的通用途径。此外,赖氨酰氧化酶型酶的拮抗剂可由与本发明所述肽特异性反应的单克隆抗体按Doring(1994)Mol.Immunol.31:1059-1067中所述方法衍生和鉴定。
本领域技术人员已知多种方法能用于产生和筛选大型文库以鉴定对某靶标如赖氨酰氧化酶型酶或本发明所述多肽具有特定亲和性的化合物。这些方法包括噬菌体展示方法,其中随机肽由噬菌体展示并采用固定化受体通过亲和层析进行筛选。参见例如,WO 91/17271、WO 92/01047和美国专利第5,223,409号。在另一方法中,用光刻法合成固定在固相支撑物(如“芯片(chip)”)上的聚合物组合文库。参见如美国专利第5,143,854号,WO 90/15070和WO 92/10092。固定化聚合物接触带标记的多肽(例如,赖氨酰氧化酶型酶或本发明所述多肽),并扫描支撑物以确定标记的位置,从而鉴定结合所述多肽的聚合物。
例如,在Kramer(1998)Methods Mol.Biol.87:25-39中描述了在连续纤维素膜支撑物上合成并筛选肽文库,其能用于鉴定感兴趣多肽(例如,赖氨酰氧化酶型酶或本发明所述多肽)的结合配体(例如,激活剂或抑制剂)。由此试验鉴定的配体是感兴趣蛋白的候选调节剂,并可选用于进一步测试。例如,该方法还可用于测得感兴趣蛋白的结合位点和识别基序。参见例如,Rudiger(1997)EMBO J.16:1501-1507和Weiergraber(1996)FEBS Lett。
WO 98/25146描述了用于筛选具有所需性质的化合物复合物文库的其它方法,所需性质如激活、结合或拮抗多肽或其结合伴侣的能力。这种文库中的复合物包括待测试的化合物,记录所述化合物合成中至少一步的标签,和易被报道分子修饰的系留部分(tether)。采用系留部分的修饰来凸显某复合物含有具备某所需性质的化合物。可解码所述标签以显示该化合物合成中的至少一步。用于鉴定与赖氨酰氧化酶型酶(或与本发明所述多肽)相互作用的化合物的其它方法有例如,用噬菌体展示系统的体外筛选,滤膜结合实验,和相互作用的″实时″测定,采用如BIAcore仪器(法玛西亚公司(Pharmacia))。
所有这些方法可按本发明所述用于鉴定赖氨酰氧化酶型酶或相关多肽的活化剂/激动剂和抑制剂/拮抗剂。
用于此类活化剂或抑制剂基本结构的各种来源可采用和包含,例如,本发明所述多肽的模拟类似物。例如,本发明所述多肽或其生物活性片段的模拟类似物可通过用例如立体异构体即D-氨基酸取代预期对生物活性关键的氨基酸;参见例如Tsukida(1997)J.Med.Chem.40:3534-3541。此外,对于用多肽片段设计生物活性类似物的情况,可将前模拟物(pro-mimetic)组分纳入肽以重建可能在去除初始多肽的部分时丧失的至少某些构象性质;参见例如Nachman(1995)Regul.Pept.57:359-370。
天然氨基酸序列的这种假肽类似物能很有效地模拟母体蛋白质。Benkirane(1996)J.Biol.Chem.271:33218-33224。例如,将易得的非手性o-氨基酸残基掺入本发明所述多肽或其片段可使酰胺键被脂链的聚亚甲基单元取代,从而提供构建肽模拟物的便捷策略。Banerjee(1996)Biopolymers 39:769-777。其它系统中小肽激素的强效拟肽类似物也已有描述。Zhang(1996)Biochem.Biophys.Res.Commun.224:327-331。
也可通过由连续酰胺烷化合成肽模拟物组合文库,然后测试所得化合物,例如测试其结合和免疫学性质,来鉴定肽模拟物。拟肽类组合文库的产生和使用方法已有描述。参见例如,Ostresh,(1996)Methods in Enzymology267:220-234和Dorner(1996)Bioorg.Med.Chem.4:709-715。此外,本发明所述多肽的三维和/或晶体结构可用于设计肽模拟物。Rose(1996)Biochemistry35:12933-12944;Rutenber(1996)Bioorg.Med.Chem.4:1545-1558。
基于结构的设计和合成模拟天然生物性多肽活性的低分子量合成分子的进一步描述可参见例如,Dowd(1998)Nature Biotechnol.16:190-195;Kieber-Emmons(1997)Current Opinion Biotechnol.8:435-441;Moore(1997)Proc.West Pharmacol.Soc.40:115-119;Mathews(1997)Proc.West Pharmacol.Soc.40:121-125和Mukhija(1998)European J.Biochem.254:433-438。
本领域技术人员还熟知可以设计、合成并评估有机小化合物的模拟物,例如,能作为赖氨酰氧化酶型酶或本发明所述多肽的底物或配体的模拟物。例如,已描述海帕洛素(hapalosin)的D-葡萄糖模拟物在细胞毒性中拮抗多药耐药相关蛋白方面显示与海帕洛素类似的功效。Dinh(1998)J.Med.Chem.41:981-987。
可以研究赖氨酰氧化酶型酶或本文所述多肽的结构,用来指导选择调节剂,例如,小分子、肽、肽模拟物和抗体。赖氨酰氧化酶型酶和本发明所述多肽的结构性质有助于鉴定能结合赖氨酰氧化酶型酶或作为其配体、底物、结合伴侣或受体的天然或合成分子。参见例如,Engleman(1997)J.Clin.Invest.99:2284-2292。例如,可采用适当的计算机程序对赖氨酰氧化酶型酶结构基序进行折叠模拟和计算机重新设计。Olszewski(1996)Proteins 25:286-299;Hoffman(1995)Comput.Appl.Biosci.11:675-679。蛋白质折叠的计算机模拟可用于详细的肽和蛋白质结构的构象与能量分析。Monge(1995)J.Mol.Biol.247:995-1012;Renouf(1995)Adv.Exp.Med.Biol.376:37-45。适当的程序可用于利用计算机协助搜索互补肽序列来鉴定赖氨酰氧化酶型酶上和/或本发明所述多肽上与配体和结合伴侣相互作用的位点。Fassina(1994)Immunomethods5:114-120。本领域描述了用于设计蛋白质和肽的其它系统,例如Berry(1994)Biochem.Soc.Trans.22:1033-1036;Wodak(1987),Ann.N.Y.Acad.Sci.501:1-13;和Pabo(1986)Biochemistry 25:5987-5991。上述结构分析所得结果可用于,例如,制备能对一种或多种赖氨酰氧化酶型酶的活性起调节剂作用的有机分子、肽和肽模拟物,和用于制备本发明所述多肽的模拟物。
本文中待筛选的抑制剂例如抗体,可以是竞争性抑制剂、无竞争性抑制剂、混合型抑制剂或非竞争性抑制剂。竞争性抑制剂通常和底物具有结构相似性,往往结合活性位点,且通常在较低底物浓度下更有效。存在竞争性抑制剂时,表观KM有提高。无竞争性抑制剂通常结合酶-底物复合物或结合底物结合活性位点后可用的位点,并可能使活性位点变形。存在无竞争性抑制剂时,表观KM和Vmax都降低,且底物浓度对抑制的影响很小或没有。因此,无竞争性抑制剂的抑制通常在高底物浓度下最显著。混合型抑制剂既能结合游离酶,也能结合酶-底物复合物,并因此对底物结合与催化活性都有影响。非竞争性抑制是混合型抑制的特例,其中此类抑制剂以相等亲和力结合酶与酶-底物复合物,抑制不受底物浓度影响。非竞争性抑制剂通常与酶在活性位点外的区域结合。对于酶抑制的更多细节可参见例如,Voet等,同上。对于酶如赖氨酰氧化酶型酶而言,其天然底物(例如,胶原蛋白、弹性蛋白)通常在体内以极大过量存在(与任何抑制剂在体内能实现的浓度相比),非竞争性抑制剂因为不受底物浓度影响而具有优势。
抗体制备
本发明还提供本发明所述多肽的特异性抗体的制备方法。所述抗体可以是分离的,例如,处于其天然产生环境以外的环境中。对主题多肽特异的合适抗体包括任意同种型的抗体、单链Fv、Fab、Fab、Fv、F(ab’)2、人工抗体、人源化抗体,其片段,等等。
合适的抗体可通过用包含全部或部分主题多肽的肽免疫宿主动物来获得。当要免疫动物时,本发明提供了含有主题多肽的免疫原性组合物。主题免疫原性组合物可包括主题多肽和佐剂。佐剂为本领域已知,且可包括适用于人或其它哺乳动物的那些佐剂。
供免疫的合适宿主动物包括小鼠、大鼠、绵羊、山羊、仓鼠、兔、驴等。本领域熟知免疫动物的方法,包括所用佐剂、加强方案、注射位点、适当动物等(例如,Harlow等Antibodies:A Laboratory Manual(《抗体:实验室手册》)(1988),纽约州冷泉港),以及对多种哺乳动物和鸟类描述了将活细胞给予动物,例如McKenzie等(1989)Oncogene 4:543-548;Scuderi等(1985)Med.Oncol.Tumor Pharmacother 2:233-242;Roth等(1984)Surgery 96:264-272和Drebin等(1984)Nature 312:545-548。免疫后,生成产抗体的细胞群。所述细胞群可用本领域技术人员熟知的杂交瘤方法产生(参见例如,Harlow,同上)。将表达抗体的细胞与永生化细胞如骨髓瘤或转化细胞融合,永生化细胞能在细胞培养中无限复制,从而产生永生的免疫球蛋白分泌型细胞系。所用永生细胞系可选择成缺乏利用某些营养素所必需酶的细胞系。本领域技术人员已知很多此类细胞系(如骨髓瘤),包括例如:胸苷激酶(TK)-缺陷型或次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT)-缺陷型细胞系。这些缺陷使得能够选择融合细胞,例如,按细胞在次黄嘌呤/氨基蝶呤/胸苷(HAT)培养基中生长的能力选择。在替代实施方式中,表达单克隆抗体的细胞群可用噬菌体展示方法制得。
针对主题多肽的抗体还可通过基因工程制得。在该技术中,与标准杂交瘤过程相同,将产抗体的细胞对所需抗原或免疫原致敏。用分离自免疫脾细胞或杂交瘤的信使RNA作为模板利用PCR扩增产生cDNA。通过将所扩增免疫球蛋白cDNA的适当部分插入表达载体产生载体文库,载体各自含有保留了初始抗原特异性的一条重链基因和一条轻链基因。可通过组合所述重链基因文库与轻链基因文库构建组合文库。这产生共同表达重链和轻链(类似于抗体分子的Fab片段或抗原结合片段)的克隆库。将携带这些基因的载体共同转染入宿主(例如,细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞或其它适当的产蛋白宿主细胞)。在转染宿主中诱导抗体基因合成时,重链和轻链蛋白自体装配产生能通过用抗原或免疫原筛选来测定的活性抗体。
生成抗体的另一方法涉及噬菌体展示。噬菌体展示用于蛋白质相互作用的高通量筛选。该方法中,利用噬菌体来展示抗体库或组合抗体文库(例如,人或鼠的)表达的抗原结合域。利用多肽靶标,例如用带标记的多肽或在固体表面或珠粒上结合或捕获的多肽来选择或鉴定表达能结合感兴趣主题多肽的抗原结合域的噬菌体。这些方法中所用噬菌体通常为丝状噬菌体,包括fd和M13。结合域可包含与噬菌体基因III或基因VIII蛋白重组融合的Fab、Fv(来自轻链或重链的个体Fv区)或二硫稳定化的Fv抗体结构域。例如,EP 368684B1;美国专利5,969,108,Hoogenboom,H.R.和Chames(2000)Immunol.Today 21:371;Nagy等(2002)Nat.Med.8:801;Huie等(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:2682;Lui等(2002)J.Mol.Biol.315:1063中提供了示例性方法,这些文献各通过引用纳入本文。多篇文献(例如,Marks等(1992)Bio/Technology 10:779-783)描述了用链改组以及重组感染和体内重组作为大型噬菌体文库的构建策略来生成高亲和性人抗体。
在相关实施方式中,可以用核糖体展示作为展示平台。参见例如,Hanes等(2000)Nat.Biotechnol.18:1287;Wilson等(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:3750和Irving等(2001)J.Immunol.Methods 248:31)。
可从细胞表面文库筛选抗体(Boder等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:10701;Daugherty等(2000)J.Immunol.Methods 243:211。此类过程提供了传统杂交瘤技术的替代方法以用于单克隆抗体的分离和后续克隆。
在噬菌体展示法中,功能性抗体结构域展示在携带其编码多核苷酸序列的噬菌体颗粒表面上。例如,从动物cDNA文库(例如,人或鼠的淋巴组织cDNA文库)或合成cDNA文库扩增或另行分离编码重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的DNA序列。编码VH和VL区的DNA可以通过scFv接头相连(例如,通过PCR)并克隆入噬菌粒载体(如p CANTAB 6或pComb 3HSS)。将该载体电穿孔到大肠杆菌中,用辅助噬菌体感染该大肠杆菌。编码VR或VL区的序列通常与噬菌体的基因III或基因VIII序列重组融合。表达能结合感兴趣抗原(即,主题多肽)的抗原结合域的噬菌体可以用抗原选择或鉴定,如利用带标记抗原或者在固体表面或珠粒上结合或捕获的抗原。
噬菌体展示法的其它示例包括下述中公开的方法:PCT申请号PCT/GB91/01134;PCT公开WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982、WO 95/20401;和美国专利号5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743和5,969,108;各通过引用全文纳入本文。
制剂、药盒和给予途径
还提供包含本文所述催化域的治疗组合物。这些组合物通常包含所述催化域(或编码所述催化域的核酸)和药学上可接受的载体。补充的活性化合物也可纳入所述组合物。
本文所用的术语“治疗有效量”或“有效量”指单独或与另一治疗剂联合给予细胞、组织或对象(例如哺乳动物如人或非人动物,如灵长类动物、啮齿动物、牛、马、猪、羊等)时,有效防止或缓解疾病病症或疾病进展的治疗剂含量。治疗有效剂量还指足以引起症状完全或部分缓解如治疗、治愈、防止或缓解相关医学病症或者治疗、治愈、防止或缓解这些病症的速度提高的化合物量。试剂的有效量是,当以单次或多次剂量给予时,导致个体内赖氨酰氧化酶型酶相关的一种或多种症状的严重程度比没有所述试剂治疗时所述一种或多种症状的严重程度减轻至少约5%、至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或超过90%。这种严重程度减轻可表现为,例如,改善伤口愈合或促进血管生成。
赖氨酰氧化酶型酶催化域(例如,LOX或LOXL2催化域)的治疗有效量随疾病或紊乱类型、疾病或紊乱的广泛性、患有疾病或紊乱的生物体大小而改变。
根据本公开,本领域技术人员已知各种药物组合物和其制备及应用技术。合适药物组合物和其给予技术的详细列表可参见以下文本,例如:Remington′sPharmaceutical Sciences(《雷明顿药物科学》),第17版,1985;Brunton等“Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics(《古德曼吉尔曼治疗学的药理学基础》)”,麦格劳希尔公司(McGraw-Hill),2005;费城科学大学(编),“Remington:The Science and Practice of Pharmacy(《雷明顿:药物科学和实践》)”,LWW出版社(Lippincott Williams&Wilkins),2005;及费城科学大学(编),“Remington:The Principles of Pharmacy Practice(《雷明顿:药物实践原理》)”LWW出版社,2008。
公开的治疗组合物还包括药学上可接受的材料、组合物或载剂,如液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料,即运载体。这些运载体参与将主题组合物从一个器官或机体区域转运到另一器官或机体区域。各运载体从与制剂的其它成分的相容性和对患者无害的意义上而言应“可接受”。能用作药学上可接受运载体的材料的一些示例包括:糖,如乳糖、葡萄糖和蔗糖;淀粉,如玉米淀粉和土豆淀粉;纤维素和其衍生物,如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素;黄蓍胶粉;麦芽;明胶;滑石;赋形剂,如可可油和栓剂蜡;油,如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油;二醇,如丙二醇;多元醇,如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇;酯,如油酸乙酯和月桂酸乙酯;琼脂;缓冲剂,如氢氧化镁和氢氧化铝;藻酸;无热原水;等渗盐水;林格溶液;乙醇;磷酸盐缓冲液;和药物制剂中采用的其它无毒相容性物质。所述组合物中还可存在湿润剂,乳化剂和润滑剂如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁,以及着色剂,释放剂,涂覆剂,甜味剂,增味剂和芳香剂,防腐剂和抗氧化剂。
本发明的另一方面涉及用于给予对象本文所述赖氨酰氧化酶型酶催化域或编码此类催化域的核酸的药盒。在一种实施方式中,所述药盒包含配制于药学运载体中的赖氨酰氧化酶型酶的催化域(或编码赖氨酰氧化酶型酶催化域的核酸)。
制剂和递送方法一般根据待治疗疾病的位置和类型调整。示例性制剂包括但不限于适于胃肠外给药例如静脉内、动脉内、眼内、肌肉内或皮下给药的制剂,包括包封于胶束、脂质体或药物释放胶囊(活性剂纳入设计用于缓释的生物相容性包衣内)的制剂;可摄取的制剂;外用制剂,如乳膏、油膏和凝胶;和其它制剂如吸入剂、气溶胶和喷雾剂。本文的化合物剂量根据治疗需求的程度和严重性、所给予组合物的活性、对象的整体健康状况和技术人员熟知的其它考量而变化。
在其它实施方式中,本文所述组合物局部递送。局部递送可使组合物非全身递送到例如伤口或纤维化区域,比全身递送降低了组合物的身体负担。例如,这种局部递送可通过使用各种医疗植入装置实现或者通过注射或手术实现,所述装置包括但不限于支架和导管。本领域已确立包封、植入、包埋、和使所需药剂附于医疗装置如支架和导管的其它方法,本文已考虑这些方法。
植入式支架已用于携带药用试剂,例如血栓溶解剂。美国专利号5,163,952公开了在支架自身材料中配制携带药用试剂的热记忆膨胀塑料支架器件。美国专利号5,092,877公开了一种聚合物材料的支架,其具有与化合物递送相关的涂层。涉及利用生物可降解和生物可吸收聚合物型器件的其它专利包括美国专利号4,916,193和美国专利号4,994,071。举例而言,美国专利号5,304,121公开了一种用于支架的涂层,其由水凝胶聚合物和预选的化合物如细胞生长抑制剂或肝素组成。美国专利号5,464,650描述了携带治疗性物质的涂层血管内支架的制备方法,其中聚合物涂层材料溶解于溶剂,而所述治疗性物质分散在所述溶剂中。然后在接触所述支架后挥发所述溶剂。
美国专利号6,120,536描述了用于包括支架在内的多种假体器件的其它类型涂层。可用于给予本文所述组合物的其它医用或假体器件的示例包括但不限于:换血装置、血管通口、中央静脉导管、心血管导管、体外回路、人造血管、泵、心脏瓣膜和心血管缝线。
应用涂覆有本文所述组合物的器件(包括支架和导管),使得所述组合物能递送到特定或局部位点。此类位点特异性递送可提供手段来使用那些由于溶解度、全身毒性顾虑或其它问题而原本不适合全身递送的组合物和/或其剂量。举例而言,已知β-氨基丙腈(BAPN)可用作赖氨酰氧化酶型酶的抑制剂,但该化合物为高度毒性,对其全身给药时的有效应用造成了问题。将支架、导管或其它医疗器件用于递送活性药剂或化合物如BAPN,使得能以靶向或局部方式以有效剂量应用所述化合物,从而降低与此类化合物相关的全身毒性。
用途
本文所述多肽有多种用途。例如,它们可用作测试赖氨酰氧化酶的酶活性(例如,胶原蛋白交联)的标准品(例如,阳性对照)。此类测试的一种用途是用于如LOX或LOXL2蛋白和/或其基因的突变分析。包含具有赖氨酰氧化酶活性的催化域的所述多肽还可用于鉴定赖氨酰氧化酶型酶的新型和已有抗体。
本文公开的多肽还可用于鉴定能结合例如LOX和/或LOXL2催化域的分子,例如有机小分子或大分子(例如,多肽)。这些结合分子中的某些可起到催化活性调节剂的作用(即,激活剂或抑制剂)。
本文公开的主题多肽还能用于产生抗体特异性针对人和鼠LOX和LOXL2蛋白及其它赖氨酰氧化酶型酶的催化活性区。此类抗体可用于例如以赖氨酰氧化酶活性水平的病理性提高为特征的疾病或紊乱的医疗和/或治疗应用。
此外,主题多肽可用于需要胶原蛋白交联的医疗和/或治疗应用:例如伤口愈合和治疗糖尿病性溃疡。分离的催化域尺寸较小(与全长蛋白相比),有助于其用作治疗剂,例如提高稳定性和加快吸收。
实施例
实施例1:人LOX催化域
包括人LOX蛋白催化域的多肽含有207个氨基酸残基,并具有以下氨基酸序列:
GLPDLVADPYYIQASTYVQKMSMYNLRCAAEENCLASTAYRADVRDYDH
RVLLRFPQRVKNQGTSDFLPSRPRYSWEWHSCHQHYHSMDEFSHYDLLDA
NTQRRVAEGHKASFCLEDTSCDYGYHRRFACTAHTQGLSPGCYDTYGADI
DCQWIDITDVKPGNYILKVSVNPSYLVPESDYTNNVVRCDIRYTGHHAYAS
GCTISPY(SEQ ID NO:1)
在某些实施方式中,含有人LOX催化域的多肽不包括以上所示序列中的起始甘氨酸和亮氨酸残基(“GL”)。
编码含所述LOX催化域的主题多肽的人DNA序列为:
GGTCTCCCAGACCTGGTGGCCGACCCCTACTACATCCAGGCGTCCACGT
ACGTGCAGAAGATGTCCATGTACAACCTGAGATGCGCGGCGGAGGAAA
ACTGTCTGGCCAGTACAGCATACAGGGCAGATGTCAGAGATTATGATCA
CAGGGTGCTGCTCAGATTTCCCCAAAGAGTGAAAAACCAAGGGACATC
AGATTTCTTACCCAGCCGACCAAGATATTCCTGGGAATGGCACAGTTGT
CATCAACATTACCACAGTATGGATGAGTTTAGCCACTATGACCTGCTTG
ATGCCAACACCCAGAGGAGAGTGGCTGAAGGCCACAAAGCAAGTTTCT
GTCTTGAAGACACATCCTGTGACTATGGCTACCACAGGCGATTTGCATG
TACTGCACACACACAGGGATTGAGTCCTGGCTGTTATGATACCTATGGT
GCAGACATAGACTGCCAGTGGATTGATATTACAGATGTAAAACCTGGAA
ACTATATCCTAAAGGTCAGTGTAAACCCCAGCTACCTGGTTCCTGAATCT
GACTATACCAACAATGTTGTGCGCTGTGACATTCGCTACACAGGACATC
ATGCGTATGCCTCAGGCTGCACAATTTCACCGTATTAG(SEQ ID NO:2)
实施例2:人LOXL2催化域
包括人LOXL2蛋白催化域的多肽具有以下氨基酸序列:
TAPDLVLNAEMVQQTTYLEDRPMFMLQCAMEENCLSASAAQTDPTTGYR
RLLRFSSQIHNNGQSDFRPKNGRHAWIWHDCHRHYHSMEVFTHYDLLNLN
GTKVAEGHKASFCLEDTECEGDIQKNYECANFGDQGITMGCWDMYRHDID
CQWVDITDVPPGDYLFQVVINPNFEVAESDYSNNIMKCRSRYDGHRIWMY
NCHIGGSFSEETEKKFEHFSGLLNNQLSPQ(SEQ ID NO:3)
在某些实施方式中,含有人LOXL2催化域的多肽不包括以上所示序列中的起始苏氨酸和丙氨酸残基(“TA”)。
编码所述LOXL2催化域的人DNA序列为:
ACCGCCCCTGACCTGGTCCTCAATGCGGAGATGGTGCAGCAGACCACCT
ACCTGGAGGACCGGCCCATGTTCATGCTGCAGTGTGCCATGGAGGAGAA
CTGCCTCTCGGCCTCAGCCGCGCAGACCGACCCCACCACGGGCTACCGC
CGGCTCCTGCGCTTCTCCTCCCAGATCCACAACAATGGCCAGTCCGACTT
CCGGCCCAAGAACGGCCGCCACGCGTGGATCTGGCACGACTGTCACAG
GCACTACCACAGCATGGAGGTGTTCACCCACTATGACCTGCTGAACCTC
AATGGCACCAAGGTGGCAGAGGGCCACAAGGCCAGCTTCTGCTTGGAG
GACACAGAATGTGAAGGAGACATCCAGAAGAATTACGAGTGTGCCAAC
TTCGGCGATCAGGGCATCACCATGGGCTGCTGGGACATGTACCGCCATG
ACATCGACTGCCAGTGGGTTGACATCACTGACGTGCCCCCTGGAGACTA
CCTGTTCCAGGTTGTTATTAACCCCAACTTCGAGGTTGCAGAATCCGATT
ACTCCAACAACATCATGAAATGCAGGAGCCGCTATGACGGCCACCGCAT
CTGGATGTACAACTGCCACATAGGTGGTTCCTTCAGCGAAGAGACGGAA
AAAAAGTTTGAGCACTTCAGCGGGCTCTTAAACAACCAGCTGTCCCCGC
AGTAA(SEQ ID NO:4)
实施例3:鼠LOX催化域
包括鼠LOX蛋白的催化域的多肽具有以下氨基酸序列:
GLPDLVPDPYYIQASTYVQKMSMYNLRCAAEENCLASSAYRADVRDYDHR
VLLRFPQRVKNQGTSDFLPSRPRYSWEWHSCHQHYHSMDEFSHYDLLDAN
TQRRVAEGHKASFCLEDTSCDYGYHRRFACTAHTQGLSPGCYDTYAADID
CQWIDITDVQPGNYILKVSVNPSYLVPESDYTNNVVRCDIRYTGHHAYASG
CTISPY(SEQ ID NO:5)
在某些实施方式中,含有鼠LOX催化域的多肽不包括以上所示序列中的起始甘氨酸和亮氨酸残基(“GL”)。
编码含所述LOX催化域的多肽的鼠DNA序列为:
GGTCTCCCGGACCTGGTGCCCGACCCCTACTACATCCAGGCTTCCACGT
ACGTCCAGAAGATGTCTATGTACAACCTGAGATGCGCTGCGGAAGAAA
ACTGCCTGGCCAGTTCAGCATATAGGGCGGATGTCAGAGACTATGACCA
CAGGGTACTGCTACGATTTCCGCAAAGAGTGAAGAACCAAGGGACATC
GGACTTCTTACCAAGCCGCCCTCGGTACTCCTGGGAGTGGCACAGCTGT
CACCAACATTACCACAGCATGGACGAATTCAGCCACTATGACCTGCTTG
ATGCCAACACACAGAGGAGAGTGGCTGAAGGCCACAAAGCAAGCTTCT
GTCTGGAGGACACGTCCTGTGACTATGGGTACCACAGGCGCTTTGCGTG
CACTGCACACACACAGGGATTGAGTCCTGGATGTTATGACACCTATGCG
GCAGACATAGACTGCCAGTGGATTGATATTACAGATGTACAACCTGGAA
ACTACATTCTAAAGGTCAGTGTAAACCCCAGCTACCTGGTGCCTGAATC
AGACTACACTAACAATGTTGTACGCTGTGACATTCGCTACACAGGACAT
CATGCCTATGCCTCAGGCTGCACAATTTCACCGTATTAG
(SEQ ID NO:6)
实施例4:鼠LOXL2催化域
包括鼠LOXL2蛋白的催化域的多肽具有以下氨基酸序列:
TAPDLVLNAEIVQQTAYLEDRPMSLLQCAMEENCLSASAVHTDPTRGHRRL
LRFSSQIHNNGQSDFRPKNGRHAWIWHDCHRHYHSMEVFTYYDLLSLNGT
KVAEGHKASFCLEDTECEGDIQKSYECANFGEQGITMGCWDMYRHDIDCQ
WIDITDVPPGDYLFQVVINPNYEVPESDFSNNIMKCRSRYDGYRIWMYNCH
VGGAFSEETEQKFEHFSGLLNNQLSVQ(SEQ ID NO:7)
在某些实施方式中,含有鼠LOXL2催化域的多肽不包括以上所示序列中的起始苏氨酸和丙氨酸残基(“TA”)。
编码含所述LOXL2催化域的多肽的鼠DNA序列为:
ACTGCACCTGACCTGGTGCTTAATGCTGAGATTGTCCAGCAGACTGCCT
ACCTGGAGGACAGGCCCATGTCCTTGCTGCAGTGTGCCATGGAGGAGAA
CTGCCTCTCCGCCTCCGCTGTGCACACCGACCCCACCAGAGGCCACCGG
CGCCTTTTACGCTTCTCCTCCCAGATCCACAACAATGGCCAGTCTGACTT
CCGCCCCAAGAATGGCCGCCATGCGTGGATTTGGCACGACTGCCACAGG
CACTACCACAGCATGGAAGTCTTCACTTACTATGACCTGCTGAGCCTCA
ACGGCACCAAGGTGGCTGAGGGCCACAAGGCCAGCTTCTGCCTGGAGG
ACACTGAGTGTGAGGGAGACATTCAGAAGAGTTACGAGTGTGCCAACTT
TGGAGAACAAGGCATCACCATGGGCTGCTGGGACATGTACCGTCATGAC
ATTGACTGCCAGTGGATAGACATCACCGATGTGCCCCCTGGAGACTACC
TGTTCCAGGTTGTCATTAACCCCAACTATGAAGTGCCAGAATCAGATTTC
TCTAACAACATCATGAAGTGCAGGAGCCGCTATGATGGCTACCGCATCT
GGATGTACAACTGTCACGTAGGTGGAGCCTTCAGTGAGGAGACAGAAC
AGAAGTTCGAACACTTCAGTGGACTTCTAAATAACCAGCTCTCTGTACA
GTAA(SEQ ID NO:8)
实施例5:哺乳动物细胞中人LOX催化域的表达
用于表达含人LOX催化域的多肽的表达盒利用人LOX cDNA(GenBankNM_002317,获自复能基因公司(Genecopoeia),马里兰州德国镇)为模板通过PCR扩增构建得到。将含有编码所述催化域的序列的扩增产物克隆入pSecTag2/Hygro B载体(英杰公司(Invitrogen),加利福尼亚州卡尔斯巴德),产生pSecTag2hygro-hLOX MCD(也称作phLOXMCD)质粒。该克隆用T7RNA聚合酶转录产生的mRNA编码含(从N-末端至C-末端依次)免疫球蛋白κ信号序列、人LOX催化域、myc表位标签和His6纯化标签的多肽。该多肽的氨基酸序列如下:
METDTLLLWVLLLWVPGSTGD GLPDLVADPYYIQASTYVQKMSMY
NLRCAAEENCLASTAYRADVRDYDHRVLLRFPQRVKNQGTSDFLPSRPRYS
WEWHSCHQHYHSMDEFSHYDLLDANTQRRVAEGHKASFCLEDTSCDYGY
HRRFACTAHTQGLSPGCYDTYGADIDCQWIDITDVKPGNYILKVSVNPSYL
HHH(SEQ ID NO:9)
所述信号肽和myc标签的序列标有下划线。斜体格式的序列代表氨基酸序列部分或全部由载体序列和用于克隆的限制性位点编码(AAQP和GP)与接头序列编码(NSAVD)。
编码该多肽的DNA序列(其中标有下划线的序列表示编码信号序列和myc标签的核苷酸,而接头序列用小写字母表示)为:
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAG
GTTCCACTGGTGACgcggcccagccggccGGTCTCCCAGACCTGGTGGCCGACC
CCTACTACATCCAGGCGTCCACGTACGTGCAGAAGATGTCCATGTACAA
CCTGAGATGCGCGGCGGAGGAAACTGTCTGGCCAGTACAGCATACAG
GGCAGATGTCAGAGATTATGATCACAGGGTGCTGCTCAGATTTCCCCAA
AGAGTGAAAAACCAAGGGACATCAGATTTCTTACCCAGCCGACCAAGA
TATTCCTGGGAATGGCACAGTTGTCATCAACATTACCACAGTATGGATG
AGTTTAGCCACTATGACCTGCTTGATGCCAACACCCAGAGGAGAGTGGC
TGAAGGCCACAAAGCAAGTTTCTGTCTTGAAGACACATCCTGTGACTAT
GGCTACCACAGGCGATTTGCATGTACTGCACACACACAGGGATTGAGTC
CTGGCTGTTATGATACCTATGGTGCAGACATAGACTGCCAGTGGATTGA
TATTACAGATGTAAAACCTGGAAACTATATCCTAAAGGTCAGTGTAAAC
CCCAGCTACCTGGTTCCTGAATCTGACTATACCAACAATGTTGTGCGCTG
TGACATTCGCTACACAGGACATCATGCGTATGCCTCAGGCTGCACAATT
TCACCGTATgggcccGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGaatagcgcc
gtcgacCATCATCATCATCATCATTGA(SEQ ID NO:10)
将phLOXMCD表达载体如下转染入HEK293细胞。将7x105个细胞接种到6孔培养皿的孔内,37℃,5%CO2下生长于完全DMEM(达氏修正依氏培养基+10%胎牛血清+2mM L-谷氨酰胺)中。培养过夜后,采用Lipofectamine2000(英杰公司,加利福尼亚州卡尔斯巴德)按生产商说明用phLOXMCD转染所述细胞。四小时后,吸出培养基,更换为2ml完全DMEM,将转染细胞培养过夜。通过在完全DMEM(cDMEM)+0.8mg/ml潮霉素B(hygro)中有限稀释选择稳定细胞系。将选择中存活的个体克隆如下扩增并筛选hLOX催化域的表达。通过将细胞克隆在6孔培养皿中培养至75%汇合实现扩增。此时吸出培养基并添加新鲜的cDMEM+hygro。五天后,收集培养基,如下所述直接分析LOX催化域的存在。通过添加PBS+5mM EDTA至培养皿将细胞从培养皿表面移除。离心脱落的细胞液。将约5x105个沉淀细胞(来自总量~1x106)在0.1mlM-PER哺乳动物蛋白抽提试剂(皮尔斯公司(Pierce),伊利诺斯州罗克福德)中裂解。冰上孵育20分钟后,将细胞裂解液在台式离心机中15,000rpm离心10分钟。收集可溶组分(上清液),并如下所述分析LOX催化域的存在。将不溶性组分(沉淀)用M-PER清洗2次,重悬于M-PER并如下所述分析LOX催化域的存在。
实施例6:通过蛋白质免疫印迹法检测人LOX催化域
通过免疫印迹法分析六个不同克隆的培养基、可溶组分和不溶性组分的样品中存在的phLOXMCD表达载体所表达的LOX催化域。对于培养基的分析,将150ul条件培养基和50ul NuPAGE4X LDS样品缓冲液(英杰公司,加利福尼亚州卡尔斯巴德)混合,取20ul所得混合物上样于凝胶(见下文)。对于可溶和不溶性胞内组分,各样品对应于1x105个细胞。将胞内组分的样品与NuPAGE4X LDS样品缓冲液(英杰公司,加利福尼亚州卡尔斯巴德)和NuPAGE10X还原试剂混合至两种试剂的终浓度均为1X,煮沸5分钟,然后在NuPAGENovex Bis-Tris凝胶(4-12%丙烯酰胺)上电泳。电泳缓冲液是NuPAGEMOPS缓冲液(英杰公司,加利福尼亚州卡尔斯巴德)。电泳结束后,用iBlot设备(英杰公司,加利福尼亚州卡尔斯巴德)将蛋白质从凝胶转移至PVDF。
为了检测,将印迹用3%牛血清白蛋白(BSA)在PBS+0.01%吐温中室温封闭3小时。然后将印迹与小鼠抗His5抗体(凯杰公司(Qiagen),加利福尼亚州瓦伦西亚)在室温下孵育1小时,然后与辣根过氧化物酶(HRP)-偶联的驴抗小鼠抗体(杰克逊免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch,PA),宾夕法尼亚州西格罗夫)在室温下孵育1小时并用Chemi-Glow(阿尔法新技术公司(Alpha Innotech),加利福尼亚州圣莱安德罗)显影。
图1显示六个克隆(标为23-28)的结果。最左侧的图显示生长培养基的分析,表明除克隆23(箭头标示)有少量分泌产物外,所述催化域极少或没有分泌。分泌的蛋白显示的表观分子量为29kD,是未加工多肽的特征分子量。这可能是由于缺少信号肽的切割(或不完全切割)或是由于分泌多肽的翻译后修饰。
来自瞬时转染phLOXMCD表达载体的HEK293细胞的生长培养基的三氯乙酸沉淀发现在所述生长培养基中存在不溶性LOX催化域。
在6个克隆中的5个检测到可溶和不溶性组分(图1,居中和右侧小图)中的催化域胞内表达。此外,在不溶性胞内组分中测得高分子量聚集体。
因为溶解度可指示正确折叠和加工的多肽,存在可溶性胞内多肽产物表明转染细胞中可能产生正确折叠、具有酶促活性的催化域。
在HEK293细胞外,还在其它细胞类型中观察到LOX催化域的表达。phLOXMCD表达载体在CHOk1细胞中的暂时表达产生所述催化域的胞内表达(在全细胞裂解液中测得),但未测得所述催化域的分泌。SW620细胞中的暂时表达也产生胞内表达而无可测分泌。
实施例7:哺乳动物细胞中人LOXL2催化域的表达
用于含人LOXL2催化域的多肽表达的表达盒(复能基因公司,马里兰州德国镇)利用人LOXL2cDNA为模板通过PCR扩增构建得到。将含有编码所述催化域的序列的扩增产物克隆入pSecTag2/Hygro B载体(英杰公司,加利福尼亚州卡尔斯巴德),产生pSecTag2hygro-hLOXL2MCD(也称作phLOXL2MCD)表达载体。该克隆用T7RNA聚合酶转录产生的mRNA编码含(从N-末端至C-末端依次)免疫球蛋白κ信号序列、人LOXL2催化域、myc表位标签和His6纯化标签的多肽。该多肽的氨基酸序列如下:
YLEDRPMFMLQCAMEENCLSASAAQTDPTTGYRRLLRFSSQIHNNGQSDFR
PKNGRHAWIWHDCHRHYHSMEVFTHYDLLNLNGTKVAEGHKASFCLEDT
ECEGDIQKNYECANFGDQGITMGCWDMYRHDIDCQWVDITDVPPGDYLFQ
VVINPNFEVAESDYSNNIMKCRSRYDGHRIWMYNCHIGGSFSEETEKKFEH
所述信号肽和myc标签的序列标有下划线。斜体格式的序列代表氨基酸序列部分或全部由载体序列和用于克隆的限制性位点编码(AAQPARRARRTKL和SRGGP)与接头序列编码(NSAVD)。
编码该多肽的DNA序列(其中标有下划线的序列表示编码前导和myc标签的那些,而接头序列用小写字母表示)为:
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAG
GTTCCACTGGTGACgcggcccagccggccaggcgcgcgcgccgtacgaagcttACCGCCCCT
GACCTGGTCCTCAATGCGGAGATGGTGCAGCAGACCACCTACCTGGAGG
ACCGGCCCATGTTCATGCTGCAGTGTGCCATGGAGGAGAACTGCCTCTC
GGCCTCAGCCGCGCAGACCGACCCCACCACGGGCTACCGCCGGCTCCTG
CGCTTCTCCTCCCAGATCCACAACAATGGCCAGTCCGACTTCCGGCCCA
AGAACGGCCGCCACGCGTGGATCTGGCACGACTGTCACAGGCACTACCA
CAGCATGGAGGTGTTCACCCACTATGACCTGCTGAACCTCAATGGCACC
AAGGTGGCAGAGGGCCACAAGGCCAGCTTCTGCTTGGAGGACACAGAA
TGTGAAGGAGACATCCAGAAGAATTACGAGTGTGCCAACTTCGGCGATC
AGGGCATCACCATGGGCTGCTGGGACATGTACCGCCATGACATCGACTG
CCAGTGGGTTGACATCACTGACGTGCCCCCTGGAGACTACCTGTTCCAG
GTTGTTATTAACCCCAACTTCGAGGTTGCAGAATCCGATTACTCCAACA
ACATCATGAAATGCAGGAGCCGCTATGACGGCCACCGCATCTGGATGTA
CAACTGCCACATAGGTGGTTCCTTCAGCGAAGAGACGGAAAAAAAGTTT
GAGCACTTCAGCGGGCTCTTAAACAACCAGCTGTCCCCGCAGtctcgaggagg
gcccGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGaatagcgccgtcgacCATCAT
CATCATCATCATTGA(SEQ ID NO:12)
HEK293细胞用phLOXL2MCD表达载体进行转染,通过有限稀释选出稳定细胞系,并用实施例5中就phLOXMCD载体所述的相同方法扩增克隆。收集培养基用于分析,细胞如实施例5中所述脱落并沉淀。
实施例8:通过蛋白质免疫印迹法检测人LOXL2催化域
通过免疫印迹分析如实施例7所述获得的约含5x105个细胞的沉淀细胞样品。将约含5x105个细胞的细胞悬液以6,000rpm离心10分钟,吸除上清液。将沉淀重悬于100ul M-PER裂解缓冲液,然后冰上孵育20分钟。15,000rpm离心20分钟去除不溶性细胞碎片,取75ul上清液(澄清的细胞裂解液)与30ulNuPAGE4X LDS样品缓冲液(英杰公司,加利福尼亚州卡尔斯巴德)和10ulNuPAGE10X还原试剂混合。混合物煮沸5分钟,然后置于冰上直至上样到凝胶。通常,将20ul各样品(对应于~1x105个细胞)在NuPAGENovex Bis-Tris凝胶(4-12%丙烯酰胺)上进行电泳。电泳缓冲液是NuPAGEMOPS缓冲液(英杰公司,加利福尼亚州卡尔斯巴德)。电泳结束后,用iBlot设备(英杰公司,加利福尼亚州卡尔斯巴德)将蛋白质从凝胶转移至PVDF。
为了检测,将印迹如实施例6中就phLOXMCD表达产物所述进行处理。
图2左侧小图所示结果表明LOXL2催化域在9个不同克隆中的胞内表达。单体和聚集体形式的蛋白均有测得,单体形式为主。
为确定是否分泌人LOXL2催化域,按实施例7就phLOXMCD-转染细胞所述获得的细胞克隆在cDMEM+hygro中培养90小时,此时取15ul培养基与5ul 4X LDS样品缓冲液+还原试剂(NuPAGE,英杰公司,加利福尼亚州卡尔斯巴德)混合,煮沸5分钟,如上文就全细胞裂解液所述进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并分析。图2右侧小图所示结果显示,与人LOX催化域相反,HEK293细胞分泌人LOXL2催化域的量在未浓缩生长培养基中可以测得。
实施例9:哺乳动物细胞中鼠LOX催化域的表达
用于表达含鼠LOX催化域的多肽的表达盒利用小鼠LOX cDNA(GenBankBC018439,获自加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)为模板通过PCR扩增构建得到。将含有编码所述催化域的序列的扩增产物克隆入pSecTag2/Hygro B载体(英杰公司,加利福尼亚州卡尔斯巴德),产生pSecTag2hygro-mLOX MCD(也称作pmLOXMCD)表达载体。该克隆用T7RNA聚合酶转录产生的mRNA编码含(从N-末端至C-末端依次)免疫球蛋白κ信号序列、鼠LOX催化域、myc表位标签和His6纯化标签的多肽。该多肽的氨基酸序列如下:
NLRCAAEENCLASSAYRADVRDYDHRVLLRFPQRVKNQGTSDFLPSRPRYS
WEWHSCHQHYHSMDEFSHYDLLDANTQRRVAEGHKASFCLEDTSCDYGY
HRRFACTAHTQGLSPGCYDTYAADIDCQWIDITDVQPGNYILKVSVNPSYL
HHH(SEQ ID NO:13)
所述信号肽和myc标签的序列标有下划线。斜体格式的序列代表氨基酸序列部分或全部由载体序列或用于克隆的限制性位点编码(AAQP和GP)和接头序列编码(NSAVD)。
编码该多肽的DNA序列(其中标有下划线的序列表示编码前导和myc标签的那些,而接头序列用小写字母表示)为:
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAG
GTTCCACTGGTGACgcggcccagccggccGGTCTCCCGGACCTGGTGCCCGACC
CCTACTACATCCAGGCTTCCACGTACGTCCAGAAGATGTCTATGTACAA
CCTGAGATGCGCTGCGGAAGAAAACTGCCTGGCCAGTTCAGCATATAGG
GCGGATGTCAGAGACTATGACCACAGGGTACTGCTACGATTTCCGCAAA
GAGTGAAGAACCAAGGGACATCGGACTTCTTACCAAGCCGCCCTCGGTA
CTCCTGGGAGTGGCACAGCTGTCACCAACATTACCACAGCATGGACGAA
TTCAGCCACTATGACCTGCTTGATGCCAACACACAGAGGAGAGTGGCTG
AAGGCCACAAAGCAAGCTTCTGTCTGGAGGACACGTCCTGTGACTATGG
GTACCACAGGCGCTTTGCGTGCACTGCACACACACAGGGATTGAGTCCT
GGATGTTATGACACCTATGCGGCAGACATAGACTGCCAGTGGATTGATA
TTACAGATGTACAACCTGGAAACTACATTCTAAAGGTCAGTGTAAACCC
CAGCTACCTGGTGCCTGAATCAGACTACACTAACAATGTTGTACGCTGT
GACATTCGCTACACAGGACATCATGCCTATGCCTCAGGCTGCACAATTT
CACCGTATgggcccGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGaatagcgccgt
cgacCATCATCATCATCATCATTGA(SEQ ID NO:14)
HEK293细胞用pmLOXMCD表达载体进行转染,通过有限稀释选出稳定细胞系,并用实施例5中就phLOXMCD载体所述的相同方法扩增克隆。收集培养基用于分析,细胞如实施例5中所述脱落、沉淀并分成可溶和不溶性组分。
采用实施例6中就人催化域分析所述的相同方法通过免疫印迹分析鼠LOX催化域的表达。图3所示结果表明鼠LOX催化域以可检测量分泌(左侧小图),这与人LOX催化域相反。mLOX催化域的胞内表达概况与hLOX催化域类似,单体蛋白在可溶和不溶性组分中都有,而聚集体存在于不溶性组分。
实施例10:由哺乳动物细胞分泌人LOX催化域
图4所含示意图显示人(顶部)和鼠(底部)LOX催化域的氨基酸序列之间的差异。可见两种序列仅在4个位置上有差异。如上所示,并如图4中左侧小图所证实,采用十倍浓缩的条件生长培养基(10X CM),转染有鼠LOX催化域(M)编码载体的细胞分泌该催化域,而人LOX催化域(H)不分泌。因此,若需要分泌人LOX催化域,可以将残基7、38、146或160(编号参照本文所述phLOXMCD和pmLOXMCD表达载体中所表达催化域的氨基酸序列中的位置)中任意残基,或这些残基的任意组合,或所有这四个残基从人序列改变成鼠序列。例如,可进行下列氨基酸序列改变中的任一种或全部或任意组合:A7P、T38S、G146A、K160Q。
相反地,若需要减少鼠LOX催化域的分泌,从而将该多肽更多保留在胞内,则可以将残基7、38、146和160从鼠序列改变为人序列。因此,例如,可进行下列氨基酸序列改变中的任一种或全部或任意组合:P7A、S38T、A146G、Q160K。
实施例11:哺乳动物细胞中鼠LOXL2催化域的表达
用于表达含鼠LOXL2催化域的多肽的表达盒利用小鼠LOXL2cDNA(根据GenBank NM033325商业合成)为模板通过PCR扩增构建。将含有编码所述催化域的序列的扩增产物克隆入pSecTag2/Hygro B载体(英杰公司,加利福尼亚州卡尔斯巴德),产生pSecTag2hygro-mLOXL2MCD(也称作pmLOXL2MCD)表达载体。该克隆用T7RNA聚合酶转录产生的mRNA编码含(从N-末端至C-末端依次)免疫球蛋白κ信号序列、鼠LOXL2催化域、myc表位标签和His6纯化标签的多肽。该多肽的氨基酸序列如下(前导序列和myc标签标有下划线):METDTLLLWVLLLWVPGSTGD TAPDLVLNAEIVQQTAYLEDRPMSLLQCAMEENCLSASAVHTDPTRGHRRLLRFSSQIHNNGQSDFRPKNGRHAWIWHDCHRHYHSMEVFTYYDLLSLNGTKVAEGHKASFCLEDTECEGDIQKSYECANFGEQGITMGCWDMYRHDIDCQWIDITDVPPGDYLFQVVINPNYEVPESDFSNNIMKCRSRYDGYRIWMYNCHVGGAFSEETEQKFEHFSGLLNNQLSVQ EOKLISEEDL HHHHHH(SEQ ID NO:15)
所述信号肽和myc标签的序列标有下划线。斜体格式的序列代表氨基酸序列部分或全部由载体序列和用于克隆的限制性位点编码(AAQP和GP)和接头序列编码(NSAVD)。
编码该多肽的DNA序列(其中标有下划线的序列表示编码前导和myc标签的那些,而接头序列用小写字母表示)为:
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAG
GTTCCACTGGTGACgcggcccagccggccACTGCACCTGACCTGGTGCTTAATG
CTGAGATTGTCCAGCAGACTGCCTACCTGGAGGACAGGCCCATGTCCTT
GCTGCAGTGTGCCATGGAGGAGAACTGCCTCTCCGCCTCCGCTGTGCAC
ACCGACCCCACCAGAGGCCACCGGCGCCTTTTACGCTTCTCCTCCCAGA
TCCACAACAATGGCCAGTCTGACTTCCGCCCCAAGAATGGCCGCCATGC
GTGGATTTGGCACGACTGCCACAGGCACTACCACAGCATGGAAGTCTTC
ACTTACTATGACCTGCTGAGCCTCAACGGCACCAAGGTGGCTGAGGGCC
ACAAGGCCAGCTTCTGCCTGGAGGACACTGAGTGTGAGGGAGACATTCA
GAAGAGTTACGAGTGTGCCAACTTTGGAGAACAAGGCATCACCATGGG
CTGCTGGGACATGTACCGTCATGACATTGACTGCCAGTGGATAGACATC
ACCGATGTGCCCCCTGGAGACTACCTGTTCCAGGTTGTCATTAACCCCA
ACTATGAAGTGCCAGAATCAGATTTCTCTAACAACATCATGAAGTGCAG
GAGCCGCTATGATGGCTACCGCATCTGGATGTACAACTGTCACGTAGGT
GGAGCCTTCAGTGAGGAGACAGAACAGAAGTTCGAACACTTCAGTGGA
CTTCTAAATAACCAGCTCTCTGTACAGgggcccGAACAAAAACTCATCTCA
GAAGAGGATCTGaatagcgccgtcgacCATCATCATCATCATCATTGA
(SEQ ID NO:16)
HEK293细胞用pmLOXL2MCD表达载体转染,通过有限稀释选出稳定细胞系,并用实施例5中就phLOXMCD载体所述的相同方法扩增克隆。收集培养基用于分析,细胞如实施例5中所述脱落、沉淀并分成可溶和不溶性组分。
采用实施例6中就人催化域分析所述的相同方法通过免疫印迹分析鼠LOXL2衍生多肽的表达。
实施例12:由瞬时转染的细胞产生具酶活性的人LOXL2催化域
将293F细胞(HEK293细胞系的亚克隆,适于悬浮培养,加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)按生产商方案在旋转瓶中培养。一旦培养物密度达到0.8-1.2x106细胞/毫升,就把细胞培养物转移入CB22袋(WAVE,GE医疗保健公司(GE Health),新泽西州皮斯卡特维)。采用293fectin试剂(英杰公司,加利福尼亚州卡尔斯巴德)用8mg phLOXL2载体转染8升细胞培养物。转染细胞在CB22袋中培养3天,此后所述细胞培养液在Allegra 6R台式离心机(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter Co.))中以水平转子3,000rpm离心10分钟。收集上清液并通过0.22mm PES膜过滤。
从所述细胞培养上清液在镍-琼脂糖凝胶(Ni-Sepharose)树脂(GE医疗保健公司,新泽西州皮斯卡特维)上纯化出所述LOXL2-衍生多肽。所述树脂经pH8.0的0.1M Tris-Cl平衡。将条件培养基(即,细胞培养上清液)上样到经平衡树脂上,然后用10倍柱体积的0.1M Tris-Cl,pH 8.0、0.25M NaCl、0.02M咪唑清洗该柱。用5倍柱体积的0.1M Tris-Cl,pH 8.0、0.15M NaCl、0.3M咪唑洗脱带His-标签的催化域。洗脱液在Amicon Ultra 1510kD MWCL(密理博公司(Millipore),马塞诸塞州比尔瑞卡)上浓缩,浓缩物质用pH 8.0的0.05M硼酸盐于4℃透析过夜。样品在SDS聚丙烯酰胺凝胶(4-12%梯度Bis-Tris凝胶,加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司,)上以还原条件分析。
实施例13:人LOXL2催化域的酶促活性
如上文实施例12所述生成含有人LOXL2催化域的多肽。采用将过氧化物生成(1,5-二氨基戊烷脱氨后由LOXL2释放)与HRP-催化Amplex红转化成荧光产物(试卤灵)相偶联的生化试验来评估酶活性。Palamakumbura等(2002)Anal.Biochem.300:245-251。反应板从康宁公司(Corning)获得。Amplex红试剂来自英杰公司(加利福尼亚州卡尔斯巴德)。辣根过氧化物酶(HRP)、1,5-二氨基戊烷和消泡剂来自西格玛公司(Sigma,密苏里州圣路易斯)。所有其它试剂均为现有最优质试剂。
通过将10uL合并的峰组分(见实施例12)加入40uL试验溶液(62.5mM硼酸钠,pH 8.0,5单位/毫升HRP,10ppm消泡剂)来装配酶混合液。底物溶液含50mM硼酸钠,100uM Amplex红试剂,20mM 1,5-二氨基戊烷,10ppm消泡剂。通过混合50ul酶混合液与50ul底物溶液启动反应。一个反应还含有2mM βAPN(β-氨基丙腈,赖氨酰氧化酶和LOXL2的催化活性的抑制剂)。反应混合液在分子仪器公司(Molecular Devices)M5酶标仪中于37℃孵育,酶标仪设置成以动力学模式持续1小时测量荧光(激发=544nm,发射=590nm)。数据记录为随时间变化的荧光斜率。
图5以试卤灵生成的时间过程形式显示该试验的结果,试卤灵生成以相对荧光单位(RFU)表示。所述人LOXL2-衍生多肽显示可测的酶活性,且所述活性被βAPN抑制。因此,所述多肽包含LOXL2的酶活性催化域。
Claims (48)
1.包含人LOX(SEQ ID NO:1)催化域的氨基酸序列的多肽,所述多肽不含有位于人LOX催化域外的序列。
2.包含编码权利要求1所述多肽的核苷酸序列的多核苷酸。
3.如权利要求2所述的多核苷酸,其特征在于,所述多核苷酸具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
4.包含人LOXL2(SEQ ID NO:3)催化域的氨基酸序列的多肽,所述多肽不含有位于人LOXL2催化域外的序列。
5.包含编码权利要求4所述多肽的核苷酸序列的多核苷酸。
6.如权利要求5所述的多核苷酸,其特征在于,所述多核苷酸具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
7.包含鼠LOX(SEQ ID NO:5)催化域的氨基酸序列的多肽,所述多肽不含有位于鼠LOX催化域外的序列。
8.包含编码权利要求7所述多肽的核苷酸序列的多核苷酸。
9.如权利要求8所述的多核苷酸,其特征在于,所述多核苷酸具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
10.包含鼠LOXL2(SEQ ID NO:7)催化域的氨基酸序列的多肽,所述多肽不含有位于鼠LOXL2催化域外的序列。
11.包含编码权利要求10所述多肽的核苷酸序列的多核苷酸。
12.如权利要求11所述的多核苷酸,其特征在于,所述多核苷酸具有SEQ IDNO:8所示的核苷酸序列。
13.包含信号序列、人LOX的催化域、表位标签和纯化标签的多肽,所述多肽不含有位于人LOX催化域外的序列。
14.如权利要求13所述的多肽,其特征在于,所述信号序列是免疫球蛋白κ信号序列。
15.如权利要求13所述的多肽,其特征在于,所述表位标签是myc标签。
16.如权利要求13所述的多肽,其特征在于,所述纯化标签是His6标签。
17.如权利要求13所述的多肽,其特征在于,所述多肽的氨基酸序列为SEQ IDNO:9中所示序列。
18.包含编码权利要求13所述多肽的核苷酸序列的多核苷酸。
19.如权利要求18所述的多核苷酸,其特征在于,所述多核苷酸具有SEQ IDNO:10所示的核苷酸序列。
20.包含权利要求18所述多核苷酸的表达载体。
21.包含权利要求19所述多核苷酸的表达载体。
22.包含信号序列、人LOXL2的催化域、表位标签和纯化标签的多肽,所述多肽不含有位于人LOXL2催化域外的序列。
23.如权利要求22所述的多肽,其特征在于,所述信号序列是免疫球蛋白κ信号序列。
24.如权利要求22所述的多肽,其特征在于,所述表位标签是myc标签。
25.如权利要求22所述的多肽,其特征在于,所述纯化标签是His6标签。
26.如权利要求22所述的多肽,其特征在于,所述多肽的氨基酸序列为SEQ IDNO:11中所示序列。
27.包含编码权利要求22所述多肽的核苷酸序列的多核苷酸。
28.如权利要求27所述的多核苷酸,其特征在于,所述多核苷酸具有SEQ IDNO:12所示的核苷酸序列。
29.包含权利要求27所述多核苷酸的表达载体。
30.包含权利要求28所述多核苷酸的表达载体。
31.包含信号序列、鼠LOX的催化域、表位标签和纯化标签的多肽,所述多肽不含有位于鼠LOX催化域外的序列。
32.如权利要求31所述的多肽,其特征在于,所述信号序列是免疫球蛋白κ信号序列。
33.如权利要求31所述的多肽,其特征在于,所述表位标签是myc标签。
34.如权利要求31所述的多肽,其特征在于,所述纯化标签是His6标签。
35.如权利要求31所述的多肽,其特征在于,所述多肽的氨基酸序列为SEQ IDNO:13中所示序列。
36.包含编码权利要求31所述多肽的核苷酸序列的多核苷酸。
37.如权利要求36所述的多核苷酸,其特征在于,所述多核苷酸具有SEQ IDNO:14所示的核苷酸序列。
38.包含权利要求36所述多核苷酸的表达载体。
39.包含权利要求37所述多核苷酸的表达载体。
40.包含信号序列、鼠LOXL2的催化域、表位标签和纯化标签的多肽,所述多肽不含有位于鼠LOXL2催化域外的序列。
41.如权利要求40所述的多肽,其特征在于,所述信号序列是免疫球蛋白κ信号序列。
42.如权利要求40所述的多肽,其特征在于,所述表位标签是myc标签。
43.如权利要求40所述的多肽,其特征在于,所述纯化标签是His6标签。
44.如权利要求40所述的多肽,其特征在于,所述多肽的氨基酸序列为SEQ IDNO:15中所示序列。
45.包含编码权利要求40所述多肽的核苷酸序列的多核苷酸。
46.如权利要求45所述的多核苷酸,其特征在于,所述多核苷酸具有SEQ IDNO:16所示的核苷酸序列。
47.包含权利要求45所述多核苷酸的表达载体。
48.包含权利要求46所述多核苷酸的表达载体。
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PEROUTKA ET AL.: "Enhanced protein expression in mammalian cells using engineered SUMO fusions: Secreted phospholipase A2", 《PROTEIN SCIENCE》 * |
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