CN102703333A - 一种与杜鹃幼苗高效共生的菌根真菌菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物学领域，提供了一种与杜鹃幼苗高效共生的菌根真菌菌株，解决了现有技术中的杜鹃人工育苗中幼苗生长缓慢、死亡率高、叶片发黄等问题。本发明的真菌菌株，保藏号为CGMCCNo:6010，所述的菌株属于子囊菌纲、壳霉目、杯霉科、树粉孢属。本发明的菌株可以与杜鹃幼苗高效共生，苗期接种杜鹃花幼苗，菌根侵染率高，可以显著促进幼苗的生长，提高幼苗成活率，而且该菌株接种苗在土壤的pH5.5~7.2时，均能有效地促进幼苗生长。
Description
技术领域：
本发明涉及微生物学领域，尤其涉及一种真菌菌株，特别涉及一种杜鹃花类菌根真菌菌株，具体来说是一种与杜鹃幼苗高效共生的菌根真菌菌株。
背景技术：
杜鹃花是我国十大传统名花之一，具有‘花中西施’的美誉，观赏价值高，一直深受人们的喜爱。同时我国是世界杜鹃花的主要分布中心，分布着世界上约70%的杜鹃花物种资源，其中有许多珍贵杜鹃花资源为我国独有。杜鹃花是许多自然保护区、森林旅游景区或森林公园植被的重要组成成分，形成特色突出植被景观，具有重要的生态价值和旅游开发价值。而且许多杜鹃花的根、茎、叶黄酮类化合物含量较高，也是具有药用开发价值的植物。但是我国许多珍贵杜鹃花资源仅在原生境绽放光彩，如何充分利用和开发这类重要植物资源成为园林绿化及相关部门的重要任务，而人工育苗技术的突破则是利用和开发珍贵杜鹃花资源的前提条件。
许多野生杜鹃花结实率高，种子采摘方便，因此播种繁殖成为人工育苗的常用方法，而且播种实生苗的培育也是杜鹃杂交育种及品种选择培育的基础。当前，杜鹃花播种育苗常采用灭菌处理过的栽培基质。灭菌处理可以降低幼苗病害发生率，同时也杀死了基质中的有益菌类，不利于杜鹃幼苗的生长。另外，杜鹃花是酸性土植物，最适土壤pH值为4.5~5.5，而在人工繁育环境中，栽培土壤很难维持在pH 4.5~5.5的酸性环境，经常土壤pH偏高，影响杜鹃花幼苗的营养吸收。由于以上两个原因的影响，杜鹃幼苗常生长缓慢、叶片发黄、死亡率高，成为野生杜鹃花杂交育种及种苗繁育的瓶颈。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题是提供一种与杜鹃幼苗高效共生的菌根真菌菌株，所述的这种菌株能解决现有技术中的杜鹃幼苗生长缓慢、叶片发黄、死亡率高等问题。
本发明一种与杜鹃幼苗高效共生的菌根真菌菌株（OBJF31），其保藏号为CGMCCNo.6010，所述的菌株属于子囊菌纲、壳霉目、杯霉科、树粉孢属,分类命名Oidiodendronsp.。
进一步的，本发明还提供了上述的真菌菌株在促进杜鹃幼苗生长中的用途。
本发明的一种与杜鹃幼苗高效共生的菌根真菌菌株，其分类命名为Oidiodendron sp.，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号（中科院微生物研究所），保藏日期为2012年4月20号，保藏号为CGMCC No：6010。
本发明的真菌rDNA（核糖体脱氧核糖核酸）ITS（内转录间隔区）序列全长559bp（碱基），与Oidiodendron sp.shylm72和Oidiodendron maius isolate TR088的ITS序列相似度为99%，经ITS序列比对最相近物种为树粉孢属（Oidiodendron）的真菌，鉴定为新的杜鹃花菌根真菌菌株。
本发明的菌株可以与杜鹃幼苗高效共生，苗期接种杜鹃花幼苗，菌根侵染率高，可以显著促进幼苗的生长，提高幼苗成活率，而且该菌株接种苗在土壤pH5.5~7.2时，均能有效地促进幼苗生长。
说明书附图：
图1是本发明的一种与杜鹃幼苗高效共生的菌根真菌菌株菌落形态的照片。
图2是本发明的一种与杜鹃幼苗高效共生的菌根真菌菌株在光学显微镜400倍下菌丝体形态和孢子形状的照片。
具体实施方式：
实施例1 杜鹃花菌根真菌的分离与鉴定：
一、分离根系材料：采取上海滨江森林公园杜鹃花品种‘紫鹤’的生活根，连同泥土保湿放置在冰桶内，放在4℃冰箱保存待用。
二、分离与鉴定培养基：
（1）分离培养基：使用马丁~孟加拉红培养基(简称MA)，对其酸碱度进行调整改良。配方为：葡萄糖10克、胰蛋白胨5克、磷酸氢二钾1克、硫酸镁0.5克、孟加拉红0.033克，琼脂20克，蒸馏水定容至1000毫升，调节PH值至5.0，然后121℃高压灭菌20分钟，冷却至60℃以下时加入0.03克链霉素，混合均匀，倒平板待用。
（2）菌株鉴定培养基：使用麦芽提取物培养基（MEA），配方为：麦芽提取物20g、胰蛋白胨1克、葡萄糖20克、琼脂20克，蒸馏水定容至1000毫升，然后121℃高压灭菌20分钟，冷却至60℃以下时加入0.03克链霉素。
（3）菌丝体鉴定培养基（PDA培养基）：配方为：重量含量为20%的马铃薯汁为1000克、葡萄糖为20克、硫酸镁为0.6克、磷酸二氢钾为0.6克、维生素B1为0.2克、琼脂20克，培养基的pH=5.0。
三、分离与形态鉴定方法：
菌根真菌菌株的分离：从冰箱中取出杜鹃花品种‘紫鹤’的生活根，用自来水轻轻冲洗掉泥土，挑取健康的生活细根。清洗干净后，用72%酒精冲洗一下，放于10%家用84消毒液中洗涤15~20分钟，无菌水冲洗3~5次后，剪切成0.3~0.5厘米根段，置于装有MA培养基的培养皿中，每个培养皿中放置5个根段，然后置于25℃培养箱中黑暗培养2至4周，共培养100个根段。
菌落形态和菌丝体显微特征观察鉴定：待菌落从根段中长出来，用牙签挑取菌落至MEA培养基，继续进行菌落形态鉴定。每个菌落点6个菌斑，培养2周后观察菌落形态的一致性和均匀性，并记录菌落的基本特征。若菌落形态有差异，进行二次分离和鉴定。菌落形态特征稳定的菌株用牙签挑取至PDA平板22℃培养箱中黑暗培养2周，然后于4℃培养箱中黑暗培养2周，光学显微镜100~400倍下观察菌丝体形态和孢子形状。本实施例所使用培养箱为赛福恒温恒湿培养箱HWS－350，光学显微镜为莱卡光学显微镜Leica DM2000。
四、分子鉴定方法：
菌丝的收集：MEA培养基活化菌株，接种至MEA液体培养基摇菌10~15天（150rpm，25℃），滤纸过滤收集菌丝，用于基因组DNA提取。总DNA提取使用CTAB法。
ITS区段的PCR扩增：rDNA ITS区段的扩增采用通用引物ITS1（5′TCC GTA GGTGAA CCT GCG G 3′），ITS4（5′TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3′）。PCR反应体系的组成为10×Buffer 5μl 25μmol/LM g2+3μl，10mmol/L dNTP 1μl，10μmol/L引物各1μl，模板DNA1μl（终浓度在50ng/l左右），Taq酶1U（0.25μl），用无菌纯水定容至50μl。PCR反应采用BIORAD DNA Engine型PCR仪，循环参数为：预变性95℃，2min，变性94℃，40s，退火60℃，40s，延伸72℃，45s；补平72℃，5min。共进行35个循环。
产物纯化及测序：PCR产物经试剂盒纯化后使用载体是PMD18~T转化连接，测序引物为M13R（~48），使用测序仪器ABI 3730Xl进行测序（测序工作由上海英骏生物技术有限公司完成）。所得序列使用PRIMER3软件进行网上比对，并辅以人工校对，确定序列的可靠性。得到的序列在NCBI上BLAST，使用数据库为GenBank+EMBL+DDBJ+PDB。
五、鉴定结果：
菌株形态特征：本发明菌株的菌落特征为灰白色至棕色绒毡状，呈圆形，中央微隆起，直径2.0~2.5cm；菌丝直径2.0~3.0μm，分生孢子椭圆形，大小2.5~3.5μm*1.5~2.0μm，具分生孢子梗，长度80~120μm。（如图1和2所示）
六、分子鉴定结果：
ITS序列：如SEQ ID NO:3所示。
序列经BLAST比对，与Oidiodendron sp.shylm72和Oidiodendron maius isolate TR088的ITS序列相似度为99%，经ITS序列比对最相近物种为树粉孢属（Oidiodendron）的真菌，鉴定为新的杜鹃花菌根真菌菌株，保藏号为CGMCC No：6010。
实施例2
本发明菌株分离自上海滨江森林公园的杜鹃花品种‘紫鹤’的根系，为子囊菌纲树粉孢属（Oidiodendron）OBJF31，可以采用平板培养和液体培养，使用MEA培养基，配方为：麦芽提取物20g、胰蛋白胨1g、葡萄糖20g，培养适宜培养液pH值5.1，培养温度22~24℃。
该菌株培养宏观特征为：菌落生长缓慢，起初为灰白色，10天后菌落中央颜色变深，呈棕色，菌落质地为绒毡状，呈圆形，中央微隆起，平板培养14天菌落直径2.0~2.5cm。显微特征：菌丝直径2.0~3.0μm，具单细胞分生孢子，椭圆形，表面光滑，大小2.5~3.5μm*1.5~2.0μm，具分生孢子梗，长度80~120μm。菌株ITS序列比对最相近物种为树粉孢属（Oidiodendron）的真菌，与菌丝形态特征鉴定结果一致，确定该菌株为树粉孢属真菌，保藏号为CGMCC No：6010。
无菌培养9周的云锦杜鹃播种苗，高约2~4cm，分别接种菌株OBJF31和4个文献（张春英等，2010;于芳等，2008）中筛选的同类型优良菌株，并设不接种对照。在幼苗根系两侧分别打洞，各埋入约直径0.5mm的圆形菌块1个（保藏号为CGMCC No.6010），每个菌株接种处理幼苗30棵，不接种对照幼苗30棵，幼苗放置在培养室内培养，温度25℃。接种处理20周后，检测幼苗侵染率和生物量，菌株OBJF31接种苗侵染率、平均苗高、平均生物量和成活率均高于其它菌株接种苗和对照幼苗（表1）。
表1 不同菌株接种处理20周后幼苗生长表现指标
实施例3
无菌培养9周的云锦杜鹃播种苗，高约2~4cm，移栽在灭菌处理的不同pH值的基质中。栽培基质pH值的调整方法：以栽培基质原始pH值为基础，按基质体积比分别添加一定量CaCO3（添加比例按照0、3、5kg/m3），调整栽培基质pH值分别为5.5、6.8、7.2。幼苗移栽后接种，接种菌株为OBJF31（保藏号为CGMCC No.6010）和HS04，接种方法和幼苗培养条件同实施例1，每个处理接种30棵，并分别设置不接种对照。接种20周后，检测苗木的侵染率和生物量（表2），菌株OBJF31的接种苗在3个pH值基质中生物量和成活率均高于菌株HS04接种苗和对照非接种苗，且叶色墨绿。
表2 不同pH基质中不同菌株对云锦杜鹃幼苗生长的影响
序列表
<110> 上海市园林科学研究所
<120> 一种与杜鹃幼苗高效共生的菌根真菌菌株
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 引物ITS1
<400> 1
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<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物ITS4
<400> 2
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<210> 3
<211> 559
<212> DNA
<213> OBJF31真菌核糖体脱氧核糖核酸内转录间隔区
<400> 3
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accctcaagc ctcgcttggt gttgggccct gcccgccgcg gccggcccta aagatagtgg 420
cggcgccgcc tggccctcag cgtagtacag ctctcgctcc agggtccggc ggtagcctgc 480
cagaaccccc aactctatgg ttgacctcgg atcaggtagg gatacccgct gaacttaagc 540
atatcaataa ggcggagga 559
Claims (2)
1.一种与杜鹃幼苗高效共生的菌根真菌菌株，保藏号为CGMCC No:6010，所述的菌株属于子囊菌纲、壳霉目、杯霉科、树粉孢属。
2.权利要求1所述的真菌菌株在促进杜鹃幼苗生长中的用途。
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