CN102697737A - 负载肿瘤靶向药物的颗粒 - Google Patents

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Abstract

一种用于将肿瘤治疗剂递送至患者的组合物，其包括肿瘤细胞凋亡诱导剂的快释制剂、肿瘤治疗剂的缓释制剂以及可药用载体。可药用载体中的细胞凋亡诱导剂可以先行给药或伴随给药。也可以使用治疗剂(例如，帕利他西)的纳米颗粒或微粒(例如，交联明胶)。所述纳米颗粒或微粒可以涂布有生物粘附剂涂层。还可以使用如下的微粒，其能够聚集以阻塞膀胱淋巴管的入口，从而延迟清除淋巴系统中的微粒。

Description

负载肿瘤靶向药物的颗粒
本申请是中国发明专利申请(申请日：2004年4月2日；申请号：200480015684.7(国际申请号：PCT/US2004/010230)；发明名称：负载肿瘤靶向药物的颗粒的分案申请。
相关信息
本申请要求2003年4月3日提交的序列号为No.60/460,827且名称为"Paclitaxel-Loaded Particles for Enhancing Delivery of therapeutic Agents toTissue"的美国临时专利申请的优先权。本申请中引用的所有专利、专利申请和参考文献的内容通过引用全部并入本文。
政府资助研究
该工作部分地得到美国健康和公共事业局(United States Department ofHealth and Human Services)的资助(资助号R37CA49816)。
发明综述
成功的癌症化学疗法需要将足够浓度的有效药物递送至肿瘤细胞，同时不对患者造成无法忍受的毒性。本发明描述两种被设计成靶向肿瘤的负载药物的颗粒。第一种是用于治疗腹膜癌症的负载药物的微粒，其中将所述颗粒向腹膜内给药至腹腔(peritoneal cavity)。这些颗粒还可以局部给药至其它携带肿瘤的器官。第二种是用于膀胱内治疗膀胱癌的负载药物的纳米颗粒，所述颗粒向膀胱内给药至膀胱空腔。该纳米颗粒还可以全身给药以靶向肾脏。
背景技术
负载药物的微粒
多种癌症起源于腹腔内的器官，例如胰腺癌、肝癌、直肠癌和卵巢癌。在疾病后期，腹腔还是起源于腹腔外部的器官的癌症转移的区域，例如肺癌。在腹腔内，会在骨盆和腹膜表面、其它腹膜器官(例如肠系膜、膀胱、网膜、膈膜(diaphragm)、淋巴结和肝脏)中发现肿瘤。肿瘤细胞阻碍膈膜或腹部淋巴管引流，导致腹膜液的流出减少，造成癌扩散或腹水。
腹腔内化学疗法(其中药物直接滴注进入腹腔)已经用于治疗腹膜癌，例如晚期卵巢癌和结肠癌(Otto,S.E.,J Intraven.Nurs.,18:170-176,1995;Collins,J.M.,J Clin Oncol,2:498-504,1984)。腹膜内给药铂酸盐化合物(例如，顺氯氨铂(cisplatin)和
Figure BDA00001776645800021
可购买的帕利他西(paclitaxel)的制剂)已经对患者发挥了一些益处且延长存活时间约20%(Gadducci,et al.,Gynecol Oncol,76:157-162,2000;Markman,et al.,J Clin Oncol,19:1001-1007,2001)。但是，腹腔内化学疗法具有限制其应用的以下缺点。腹膜内治疗通常经留置导管(indwelling catheter)给药，每3周6次治疗。两个主要的副作用是与导管的长时间使用相关的感染和由于腹腔内存在的高浓度药物而导致的腹痛(Francis,et al.,J Clin Oncol,13:2961-2967,1995)。而且，腹膜内给药需要住院治疗且涉及高昂费用。这些原因导致医疗机构不愿使用腹膜内治疗，尽管该治疗方法具有明确的存活优势。本发明克服了所述各种缺陷。
在一项早期的发明(美国专利申请序列号No.09/547,825)中，申请人指出当将抗癌药物(例如，帕利他西，阿霉素(doxorubicin))给药至实体瘤外部时(这是部位腹膜内治疗的情况)，药物进入实体瘤是非常缓慢的且限于肿瘤外围。申请人进一步公开了一种方法，以克服这一进入问题。该方法包括使用细胞凋亡诱导(apoptosis induction)治疗(例如，使用帕利他西或阿霉素的治疗)来扩大肿瘤的空隙空间，从而改善当前和后续给药的药物进入和分布在整个实体瘤中。在本申请中，该方法称作"肿瘤激活(tumor priming)"法且具有两个要求。第一个要求是药物浓度必须足够诱导细胞凋亡。申请人已经指出，使用200nM帕利他西治疗3小时足以诱导多个人体肿瘤细胞中的细胞凋亡(Au,et al.,Cancer Res.,58:2141-2148,1998)。第二个要求是诱导细胞凋亡的预治疗和后续治疗之间的时间间隔必须足以允许发生细胞凋亡，例如，对于帕利他西是16-24小时(Au,et al.,Cancer Res.,1998;Jang,et al.,J.Pharmacol.Exper.Therap.,296:1035-1042,2001)。这些要求记录在本发明中。
申请人还发现，在腹膜内给药之后，市售的
Figure BDA00001776645800022
制剂被迅速地清除出腹腔，这是由于经由腹膜(位于腹腔内的薄膜)的迅速吸收以及经由淋巴系统的排泄造成的(见下文的实施例4和6)。
基于上述各种考虑和发现，申请人得出以下结论：如果治疗满足一些或大部分以下所需性能，则可以实现治疗上有用的腹膜内化学疗法。第一，药物应当具有针对预期靶向的癌症类型的活性。第二，治疗应当容易实施，不需要长时间(例如，不大于一天或两天)使用留置导管，且不需要频繁给药(例如，每周不多于1次)。第三，应当优化药物提供速率(rate of drug presentation)，使得腹腔内的药量以及药物浓度足够高以对疾病具有充分控制，但是同时又足够低从而不产生显著的局部毒性。第四，药物或药物制剂必须能够进入实体瘤中并广泛地分布在其中。第五，药物或药物制剂应当在存在肿瘤的腹腔内具有长的保留时间。第六，药物或药物制剂应当对肿瘤细胞具有高的亲合力并固定在肿瘤表面或存在于肿瘤块(tumor mass)内。第七，在腹腔或器官内，药物或药物制剂的分布应当与肿瘤细胞的分布或传播相似。大部分或所有上述所需特征都记录在本发明中，即，负载药物的微粒。
负载药物的微粒被设计以两种速率释放药物；速释，以提供足够高的药物浓度从而诱导细胞凋亡，和缓释，以对肿瘤提供持续的药物递送。细胞凋亡诱导促进残余微粒和随后从缓释颗粒释放的剩余药物的进入和分布。长时间(例如，数天、数周或数月)的药物缓释为患者提供了单一给药的便利性，减少了治疗频率，排除了住院治疗的必要，降低了护理费用、排除了使用留置腹腔内的导管的必要，从而减少了感染的危险并提高了患者的生活质量，同时减少了由于一次性快速药丸给药全部剂量而导致的腹腔内的局部高浓度而造成的局部毒性。由于其尺寸和性能，这些颗粒保留在腹腔内，粘结至肿瘤上，在腹腔或器官内表现出相似的分布。
所述颗粒还可以是两种或多种类型的颗粒的组合，其中至少一种类型迅速释放药物以诱导细胞凋亡，同时其它类型较为缓慢地释放药物。针对在携带腹膜肿瘤的小鼠中产生优异的靶向肿瘤的和抗肿瘤活性，与市售帕利他西制剂即
Figure BDA00001776645800031
(帕利他西溶解在克列莫佛(cremophor)和乙醇中)相比，提供负载广泛使用的抗癌药物帕利他西药物的微粒的实例以显示这些颗粒的效用。
申请人还发现，可以将其它药物或试剂配制在相同的微粒中，用于治疗腹膜癌。
申请人还描述了可以使用负载药物的颗粒来治疗位于容易通过局部或部位给药而到达的器官或部位中的肿瘤。
本发明使用由明胶和PLGA聚合物制成的可生物降解的且负载有治疗效用的试剂的颗粒。配制在明胶和PLGA颗粒中的一种试剂是帕利他西。已经开发了多种结合有可生物降解聚合物的帕利他西制剂，且所述制剂已经在动物模型中显示出以最小的体系毒性抑制肿瘤生长和细胞凋亡的作用；但是，这些体系中的帕利他西的释放动力学(在约50天内释放约10-25%的药物)很可能对于临床使用不是最佳的(美国专利No.6,447,796)。而且，大多数早期研究的目的是实现系统的(systemic)而不是部位的药物递送。使用可生物降解的聚合物作为具有治疗效用的试剂的载体的优点是本领域公认的(美国专利No.6,447,796)，包括：(1)完全生物降解，在药物供给耗尽时不需要后续手术除去药物载体；(2)组织生物相容性；(3)给药便易性；(4)在聚合物水解时包衣药物的受控持续释放；(5)对于部位使用，最小化或排除系统毒性，例如嗜中性白血球减少症；以及(6)就多功能性而言，可生物降解体系本身的便易性。相似地，许多上述优点都适用于明胶药物释放颗粒。
用于膀胱内治疗膀胱癌的负载帕利他西的纳米颗粒
膀胱内化学疗法用于减少膀胱癌的发病和/或发展(Kurth,K.H.,Semin.Urol.Oncol.,14:30-35,1996)。膀胱内化学疗法提供以下优点：选择性地以高浓度向携带肿瘤的膀胱递送药物，同时减少体系的暴露。申请人已经指出，接受化学疗法(例如，丝裂霉素C(mitomycin C)，例如阿霉素)的浅表性(superficial)膀胱癌患者的治疗失败部分地是由于低浓度的药物被递送至位于膀胱组织内的肿瘤而造成的(Dalton,et al.,Cancer Res.,51:5144-5152,1991;Schmittgen,et al.,Cancer Res.,51:3849-3856,1991;Wientjes,et al.,Pharm.Res.,8:168-173,1991;Wientjes,et al.,Cancer Res.,51:4347-4354,1991;Wientjes,et al.,Cancer Res.,53:3314-3320,1993;Chai,et al.,J Urol.,152:374-378,1994;Wientjes,et al.,Cancer Chemother Pharmacol.37:539-546,1996;Au,et al.,J.Natl.Cancer Inst.,93:597-604,2001;U.S.Patent No.6,286,513B1)。而低浓度药物递送是由以下几个原因造成的。第一，只有一部分丝裂霉素C或阿霉素剂量例如~3%-~5%能够进入覆盖膀胱腔内表面的膀胱上皮。第二，当给药药物时，药物浓度被存在的残余尿液和治疗间隔例如2小时期间产生的尿液所稀释。第三，由于患者需要清空他或她的膀胱，因此肿瘤细胞暴露至药物例如丝裂霉素C的总时间受限于治疗间隔的时间长度。第四，药物例如丝裂霉素C的膀胱组织内的停留时间受到治疗持续时间的控制且主要在患者清空他或她的膀胱之后的数分钟之内终止。
基于上述考虑和发现，申请人得出以下结论：如果治疗满足一些或大部分以下所需性能，则可以实现治疗上有用的膀胱内化学疗法。第一，药物应当具有针对膀胱癌的活性。第二，存在于尿液中的大部分药物必须能够进入膀胱上皮。第三，药物在膀胱组织中的停留时间应当超过治疗持续时间。第四，尿液中的药物浓度应当不依赖于尿液体积。帕利他西对于膀胱癌是有活性的(Roth,B.,J.Semin.Oncol.,22:1-5,1995)，且如申请人所指出的，容易经由膀胱上皮分隔例如50%的剂量(Song,et al.,Cancer Chemother.Pharmacol.,40:285-292,1997)。申请人还发现，在从细胞外基质中除去药物之后，帕利他西保留在肿瘤细胞中(Kuh,et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,293:761-770,2000)，这是提供延长药物作用超过2小时治疗持续时间的机会的性能。但是，市售帕利他西制剂例如
Figure BDA00001776645800051
是没有用的，因为通过将帕利他西夹带在胶束(micelles)中用于增溶帕利他西的克列莫佛减少帕利他西的游离部分，且因此减少进入膀胱组织的药物(Knemeyer,et al.,Cancer Chemother.Pharmacol.,44:241-248,1999)。
因此，申请人发明了负载帕利他西的纳米颗粒，其满足在申请人的发现中所指出所有所需性能。这些纳米颗粒在2小时的治疗间隔内释放大部分的药物载荷(drug load)，以至于组织中的帕利他西浓度足以在人的膀胱肿瘤中产生抗肿瘤活性(例如实施例8)。从纳米颗粒中释放的帕利他西的量受到药物在尿液中的溶解度的限制。因此，尿液中的药物浓度保持相对恒定且与尿液体积无关(例如实施例10)。从纳米颗粒释放并进入膀胱的帕利他西也保留在膀胱组织中达超过2小时治疗持续时间(例如，实施例8)。最后，申请人确定，所述纳米颗粒针对宠物狗中自然出现的膀胱癌是有效的(例如实施例10)。
申请人还发现改性负载药物的纳米颗粒以延长这些颗粒在膀胱腔和膀胱组织中的保留时间超过治疗持续时间的方法，例如通过使用生物粘附分子(bioadhesive molecule)涂布明胶结构体(gelatin framework)(例如实施例7)。
申请人还发现，可以将其它亲脂性化合物配制在相同的明胶纳米颗粒中。
最后，申请人发现，膀胱内给药明胶纳米颗粒导致肾脏中的药物含量局部增大(例如实施例1)。因此，还提供用于选择性将药物递送至肾脏的方法和组合物。
具体地，本发明涉及以下方面：
项1.一种用于将肿瘤治疗剂递送至患者的组合物，包括：
(a)肿瘤细胞调亡诱导剂的快释制剂；
(b)肿瘤治疗剂的缓释制剂；以及
(c)可药用载体。
项2.项1的组合物，其中所述细胞调亡诱导剂包括帕利他西。
项3.项1的组合物，其中所述快释制剂在约1小时或更短期间内释放至少约50nM的帕利他西。
项4.项1的组合物，其中提供所述细胞调亡诱导剂，其量足以将肿瘤的上皮细胞密度降低约20%或更高。
项5.项1的组合物，其中提供所述细胞调亡诱导剂，其量足以在给药后的约16-24小时内将肿瘤的上皮细胞密度降低约20%或更高。
项6.项1的组合物，其中提供所述细胞调亡诱导剂，其量足以诱导肿瘤的上皮细胞中约10%或更多调亡。
项7.项1的组合物，其中提供所述细胞调亡诱导剂，其量足以在给药后的约16-24小时内诱导肿瘤的上皮细胞中约10%或更多调亡。
项8.项1的组合物，其中所述治疗剂是一种或多种帕利他西或阿霉素。
项9.项1的组合物，其中所述治疗剂是化学治疗剂、抗生素或基因转移构成成分中的一种或多种。
项10.项1的组合物，其适用于静脉注射、局部给药或部位给药中的一种或多种。
项11.一种用于治疗肿瘤的试剂盒，包括：
(d)在可药用载体中的细胞调亡诱导剂；
(e)在可药用载体中的肿瘤治疗剂；以及
(f)使用所述细胞调亡诱导剂和所述治疗剂治疗肿瘤的说明。
项12.项11的试剂盒，其中所述肿瘤治疗剂包括：
(d)肿瘤细胞调亡诱导剂的快释制剂；
(e)肿瘤治疗剂的缓释制剂；以及
(f)可药用载体。
项13.项11的试剂盒，其中单一的一种或多种纳米颗粒或微粒制剂包括所述快释制剂(a)和缓释制剂(b)两者。
项14．项1的试剂盒，其中所述治疗剂是一种或多种帕利他西或阿霉素。
项15．一种治疗患者的肿瘤以改善化学治疗剂进入所述肿瘤的方法，包括以下步骤：
(a)给药细胞调亡诱导剂至肿瘤；
(b)允许经过足够时间，以在肿瘤中发生细胞调亡；以及
(c)在发生显著的细胞调亡时给药肿瘤治疗剂至肿瘤，以获得治疗剂至肿瘤的改善进入。
项16．项15的方法，其中使用快释制剂用于细胞调亡诱导剂，使用缓释制剂用于治疗剂，伴随递送细胞调亡诱导剂和治疗剂。
项17．项15的方法，其中所述治疗剂经由腹腔内递送，且所述肿瘤是在腹腔内的一种或多种组织中生长或在连接腹腔的组织中生长的肿瘤。
项18．项14的方法，其中细胞调亡诱导剂经由静脉递送，治疗剂经由腹腔内递送，且所述肿瘤是在腹腔内的一种或多种组织中生长或在连接腹腔的组织中生长的肿瘤。
项19．项16的方法，其中治疗剂经由腹腔内递送，且所述肿瘤是在腹腔内的一种或多种组织中生长或在连接腹腔的组织中生长的肿瘤。
项20．项17的方法，其中肿瘤是腹水肿瘤。
项21．项19的方法，其中肿瘤是腹水肿瘤。
项22．项17的方法，其中肿瘤是来自主要器官的转移性肿瘤，其在腹腔内的一种或多种组织中生长或在与肿瘤伸入其中的腹腔相邻的组织中生长。
项23．项19的方法，其中肿瘤是来自主要器官的转移性肿瘤，其在腹腔内的一种或多种组织中生长或在与肿瘤伸入其中的腹腔相邻的组织中生长。
项24．项16的方法，其中所述快释制剂在一天内释放大于约50%的细胞调亡诱导剂的药物成分。
项25．项16的方法，其中待治疗的患者是患有已经散布到腹腔中的胰腺癌的患者。
项26．项25的方法，其中通过经由导管输注递送悬浮物形式的携带所述肿瘤治疗剂的微粒，所述导管的递送出口位于胰腺附近。
项27.一种将一种或多种细胞调亡诱导剂或肿瘤治疗剂递送至具有肿瘤的患者的组合物，包括：
选择性地粘附至肿瘤的一种或多种纳米颗粒或微粒，其用于将治疗剂递送至肿瘤附近；从而，与在所述的没有选择性地粘附至肿瘤的一种或多种纳米颗粒或微粒中的递送相比，实现所述治疗剂在肿瘤中的更高水平的聚集。
项28．一种将肿瘤治疗剂递送至具有肿瘤的患者的组合物，其包括：
诱导至少部分肿瘤细胞调亡的一种或多种纳米颗粒或微粒，用于进入肿瘤和释放肿瘤治疗剂。
项29．项28的组合物，其中所述一种或多种纳米颗粒或微粒粘附至所述肿瘤。
项30．项28的组合物，其中所述一种或多种纳米颗粒或微粒包含细胞调亡诱导剂和所述肿瘤治疗剂。
项31．项29的组合物，其中组织粘附性已经通过使用生物粘附涂层涂布一种或多种纳米颗粒或微粒而增大。
项32．项31的组合物，其中所述生物粘附涂层是下述一种或多种：聚赖氨酸、纤维蛋白原、部分酯化的聚丙烯酸聚合物、多糖、果胶，或硫酸化蔗糖和氢氧化铝的混合物。
项33．一种治疗患者的肿瘤的方法，包括向所述患者给药项21、28、29、30、31或32中的一种或多种。
项34．一种含帕利他西的微球的组合物，包括以下一种或多种：
(1)直径为约3-5μm的粘附肿瘤的微球，其提供细胞调亡诱导剂的速释；
(2)直径为约3-5μm的粘附肿瘤的微球，其提供治疗剂的缓释；
(3)直径为约30-50μm的微球，其提供治疗剂的缓释。
项35.一种实现改善递送肿瘤治疗剂至已经散布在腹腔中的肿瘤的方法，包括以下步骤：
给药含在一种或多种纳米颗粒或微粒中的所述治疗剂至腹腔，其中一种或多种纳米颗粒或微粒在最经常出现转移性肿瘤的腹腔区域聚集。
项36.一种实现改善含肿瘤治疗剂的微粒在腹腔内空腔中的保留性的方法，包括以下步骤：
在一种或多种以下物质中配制肿瘤治疗剂：
(c)适于形成直径大于约10μm的聚集体的微粒，其中在递送所述微粒进入腹腔时形成聚集体；或者
(d)直径大于约10μm的微粒，
其中一种或多种聚集体或微粒经由淋巴系统的清除被延迟。
项37.项36的方法，其中所述微粒包括PLGA微粒。
项38.一种含有肿瘤治疗剂的微粒的组合物，包括：
(a)适于形成直径大于约10μm的聚集体的微粒，其中在递送所述微粒进入腹腔时形成聚集体；或者
(b)直径大于约10μm的微粒，
其中一种或多种聚集体或微粒经由淋巴系统的清除被延迟。
项39.项38的组合物，其中含有肿瘤治疗剂的微粒包括由约50%丙交酯和约50%乙交酯构成的PLGA，且尺寸为约3-5μm。
项40.一种组合物，包括：
含有肿瘤治疗剂的一种或多种纳米颗粒或微粒，所述一种或多种纳米颗粒或微粒具有以下组合性能：
(1)提供药物的速释，然后是药物的缓释；
(2)选择性地粘附至肿瘤组织；以及
(3)集中在腹腔。
项41.一种将帕利他西递送至患有浅表性膀胱癌的患者的膀胱壁的方法，包括以下步骤：
(a)在不含克列莫佛的制剂中配制所述帕利他西；以及
(b)静脉滴注所述不含克列莫佛的帕利他西，其中所述帕利他西由于不含克列莫佛，更容易进入膀胱壁。
项42.一种适于静脉滴注至患有浅表性膀胱癌的患者的膀胱壁中的帕利他西组合物，包括：
在不含克列莫佛的制剂中的滴注液剂量的帕利他西。
项43.项42的组合物，其中所述帕利他西制剂包含在交联的明胶纳米颗粒中。
项44.一种治疗膀胱疾病的组合物，包括：
包含在交联的明胶纳米颗粒中的有效量的帕利他西，该纳米颗粒上涂布由生物粘附涂层。
项45.项44的组合物，其中所述生物粘附涂层是下述一种或多种：聚赖氨酸、纤维蛋白原、部分酯化的聚丙烯酸聚合物、多糖、果胶或硫酸化蔗糖和氢氧化铝的混合物。
项46.一种将治疗剂递送至具有膀胱疾病和限定尿液容量的膀胱中的方法，包括以下步骤：
(1)将一定剂量的治疗剂配制在明胶纳米颗粒中，以使治疗剂的剂量超过治疗剂在所述限定尿液体积中的溶解度；以及
(2)滴注治疗剂剂量至膀胱，以便在不依赖于患者产生的尿液体积的情况下，在膀胱内达到治疗剂的饱和浓度并保持。
项47.项46的方法，其中所述治疗剂难溶于尿液。
项48.一种用于治疗具有限定尿液容量的膀胱中的膀胱疾病的组合物，包括：
含有难溶于尿液的治疗剂的明胶纳米颗粒，治疗剂的剂量超过治疗剂在所述限定体积中的溶解度。
项49.项48的组合物，其中所述膀胱疾病是以下一种或多种：膀胱癌、间质性膀胱炎、尿失禁或尿路感染。
项50.项48的组合物，其可直接注射到膀胱中。
项51.项48的组合物，其中所述治疗剂包含帕利他西。
项52.项51的组合物，其中所述帕利他西与共溶剂组合。
项53.项52的组合物，其中所述共溶剂是二甲基亚砜或聚乙二醇中的一种或多种。
项54.一种增大帕利他西在患者的膀胱中的溶解度的方法，包括对所述患者施加过热。
项55.一种用于治疗在腹腔、膀胱组织、脑组织、前列腺组织或肺组织中的或与其相邻的一种或多种组织中的肿瘤的方法，包括：
给药一种或多种负载有肿瘤药物的纳米颗粒或微粒，其中所述一种或多种纳米颗粒或微粒由一种或多种明胶或聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)形成。
项56.项55的方法，其中所述肿瘤药物包括帕利他西。
项57.项55的方法，其中所述一种或多种纳米颗粒或微粒上涂布有生物粘附剂。
项58.项55的方法，其中所述一种或多种纳米颗粒或微粒包括快释肿瘤药物制剂和缓释肿瘤药物制剂。
项59.项55的方法，其中PLGA微粒的所述缓释制剂包括约50:50LA:GA，具有30-50μm的平均直径和低于体温的玻璃化转变温度，含有约4%的帕利他西，在第一天内表现出约20%的初始突然药物释放速率，然后缓释，在约7周内产生约70%的总累积释放。
项60.项55的方法，其中PLGA微粒的所述缓释制剂包含75:25LA:GA，具有3-5μm的平均直径和高于体温的玻璃化转变温度，含有约4%的帕利他西，在第一天内表现出约5%的初始突然药物释放速率，然后缓释，在约7周内产生约30%的总累积释放。
项61.项55的方法，其中PLGA微粒的所述快释制剂包括约50:50LA:GA，具有3-5μm的平均直径和低于体温的玻璃化转变温度，含有约4%的帕利他西，在约一天内表现出约70%的药物释放速率。
项62.项59的方法，其中PLGA微粒的所述快释制剂包括约50:50LA:GA，具有3-5μm的平均直径和低于体温的玻璃化转变温度，含有约4%的帕利他西，在约一天内表现出约70%的药物释放速率。
项63.项60的方法，其中PLGA微粒的所述快释制剂包括约50:50LA:GA，具有3-5μm的平均直径和低于体温的玻璃化转变温度，含有约4%的帕利他西，在约一天内表现出约70%的药物释放速率。.
项64.一种用于治疗在腹腔、膀胱组织、脑组织、前列腺组织或肺组织中的或与其相邻的一种或多种组织中的肿瘤的组合物，包括：
一种或多种负载有肿瘤药物的纳米颗粒或微粒，其中所述一种或多种纳米颗粒或微粒由一种或多种明胶或聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)形成。
项65.项4的组合物，其中所述肿瘤药物包括帕利他西。
项66.项64的组合物，其中所述一种或多种纳米颗粒或微粒涂布有生物粘附剂。
项67.项64的组合物，其中所述一种或多种纳米颗粒或微粒包括快释肿瘤药物制剂和缓释肿瘤药物制剂。
项68.项67的组合物，其中PLGA微粒的所述缓释制剂包括约50:50LA:GA，具有30-50μm的平均直径和低于体温的玻璃化转变温度，含有约4%的帕利他西，在第一天内表现出约20%的初始突然药物释放速率，然后缓释，在约7周内产生约70%的总累积释放。
项69.项67的组合物，其中PLGA微粒的所述缓释制剂包含75:25LA:GA，具有3-5μm的平均直径和高于体温的玻璃化转变温度，含有约4%的帕利他西，在第一天内表现出约5%的初始突然药物释放速率，然后缓释，在约7周内产生约30%的总累积释放。
项70.项67的组合物，其中PLGA微粒的所述快释制剂包括约50:50LA:GA，具有3-5μm的平均直径和低于体温的玻璃化转变温度，含有约4%的帕利他西，在约一天内表现出约70%的药物释放速率。
项71.项68的组合物，其中PLGA微粒的所述快释制剂包括约50:50LA:GA，具有3-5μm的平均直径和低于体温的玻璃化转变温度，含有约4%的帕利他西，在约一天内表现出约70%的药物释放速率。
项72.项69的组合物，其中PLGA微粒的所述快释制剂包括约50:50LA:GA，具有3-5μm的平均直径和低于体温的玻璃化转变温度，含有约4%的帕利他西，在约一天内表现出约70%的药物释放速率。
项73.项67、68、69、70、71和72中任一项的组合物，其额外包括释放增强剂，所述释放增强剂是以下一种或多种：Tween 20、Tween 80、肉豆蔻酸异丙酯、β-乳糖或苯二甲酸二乙酯。
项74.一种改善递送治疗剂至肾脏的方法，包括以下步骤：
(a)在明胶纳米颗粒中配制治疗剂；以及
(b)通过静脉路径给药明胶纳米颗粒，其中，与递送没有配制在明胶纳米颗粒中的试剂相比，所述治疗剂以更高的量递送至肾脏。
项75.项74的组合物，其中明胶纳米颗粒的尺寸为约600-1000nm。
项76.项74的组合物，其中治疗剂包括帕利他西，明胶纳米颗粒是由Bloom数为约175的明胶制备的，具有约600nm-约1000nm的平均直径和约0.14%-2.0%的药物载荷。
定义
为了提供对本发明的清楚和一致的理解，为方便起见，这里汇集说明书、实施例和权利要求书中使用的特定术语。
如这里所使用的，术语"异常生长"是指细胞表型，其与细胞的正常表型不同，特别是直接或间接与疾病例如癌症相关的细胞表型。
如这里所使用的，术语"给药"是指将试剂引入细胞中，所述细胞例如是生物体外细胞、哺乳动物细胞，例如生物体内细胞，或者后来放回动物体内的细胞(例如取自活体的)。
如这里所使用的，术语"试剂"、"药物"、"化合物试剂"、"抗癌试剂"、"化学治疗剂"、"抗肿瘤药"和"抗肿瘤试剂"可以互换使用，是指具有抑制或减少异常细胞生长例如癌症的性能的试剂(除非进一步限定)。上述术语还包括细胞毒素试剂、杀细胞试剂或细胞抑制试剂。术语"试剂"包括小分子、大分子(例如，肽、蛋白质、抗体或抗体片断)以及核酸(例如，基因治疗结构成分(gene therapy construct))、重组病毒、核酸片断(包括，例如合成核酸片断)。
如这里所使用的，术语"细胞调亡"是指任何非坏死的、良好调节形式的细胞死亡，如本领域已经确立的标准所限定的。
如这里所使用的，术语"良性"、"癌症前的(premalignant)"和"恶性"具有它们在本领域中共知的含义。
如这里所使用的，术语"癌症"、"肿瘤细胞"、"肿瘤"、"白血病"或"白血病细胞"可以互换使用，是指任何异常新生物(″新生长")，例如癌(来自上皮细胞)、腺癌(来自腺组织)、肉瘤(来自结缔组织)、淋巴瘤(来自淋巴组织)，或者血癌(例如，白血病或者红白血病)。术语癌症或肿瘤细胞还试图包括癌变组织或肿瘤块，后者应当理解为癌细胞或肿瘤细胞的汇集。而且，术语癌症或肿瘤细胞试图包括可能是良性、癌症前的或恶性的肿瘤或细胞。通常，癌症或肿瘤细胞表现出各种领域公知的特点，例如，生长因子独立性、缺乏细胞/细胞接触生长抑制，和/或变异染色体组型。通过对比，正常细胞通常仅能够在培养基中进行有限次的传代和/或表现出各种领域公知的归因于正常细胞的特点(例如，生长因子依赖性、接触抑制，和/或正常染色体组型)。
如这里所使用的，术语"细胞"包括任何真核细胞，例如身体或种系哺乳动物细胞，或细胞系，如，HeLa细胞(人)、NIH3T3细胞(鼠科)、胚胎干细胞，和细胞类型，例如造血干细胞、成肌细胞、肝细胞、淋巴细胞和上皮细胞，以及，例如这里描述的细胞系。
如这里所使用的，术语"腹膜的"、"腹膜内的"、"腹膜地"或"腹膜内地"可以互换使用，且涉及腹膜或腹腔。
如这里所使用的，术语"局部地"、"部位地"、"系统地"分别是指"局部"治疗给药例如进入肿瘤物质，"部位"治疗给药例如进入常见的疑为接种有转移瘤的肿瘤区域，或者"系统"治疗给药，例如口服或膀胱内给药，目的是试剂可以广泛地在受治疗者体内散布。
如这里所使用的，术语"可药用载体"是本领域公知的，包括适用于给药本发明的化合物至哺乳动物的、可药用材料、组合物或赋性剂。
如这里所使用的，术语"药物组合物"包括适用于对哺乳动物例如人给药的制剂。当将本发明的组合物作为药物给药至哺乳动物例如人时，可以它们本身的形式给药或者作为含有例如0.1-99.5%(更优选地，0.5-90%)的活性成分(例如，治疗有效量)的药物组合物与可药用载体组合给药。
如这里所使用的，术语"受治疗者"试图包括人和非人类动物(例如，小鼠、鼠、兔子、猫、狗、牲畜和灵长类动物)。
优选的人类动物包括具有特征在于异常细胞生长,例如癌症的紊乱的人类患者。
如这里所使用的，术语"微粒"是指尺寸为约0.1μm-约100μm，约0.5μm-约50μm，0.5μm-约20μm的颗粒，有利地，尺寸为约1μm-约10μm，约5μm的颗粒，或其混合物。所述微粒例如可以包括大分子、基因治疗结构成分或化学治疗剂。通常，微粒例如可以局部或部位给药。
如这里所使用的，术语"纳米颗粒"是指尺寸为约0.1nm-约1μm，约1nm-约1μm，约10nm-约1μm，50nm-约1μm的颗粒，约100nm-约1μm，约250-900nm，有利地，约600-800nm。所述纳米颗粒例如可以包括大分子、基因治疗结构成分或化学治疗剂。通常，纳米颗粒例如可以经局部、部位或系统给药方式给药至患者。
如这里所使用的，术语"颗粒"是指纳米颗粒、微粒或者纳米颗粒和微粒两者。
如这里所使用的，术语"制剂"是指本领域公知的、以剂量形式引入治疗活性剂中的组合物。
如这里所使用的，术语"快释制剂"和"速释制剂"是指在一天内释放优选>10%，更优选>20%，更优选>30%，更优选>40%，更优选>50%，且进一步优选>60%的药物成分的药物制剂。快释制剂的实例包括微粒和纳米颗粒制剂。用于制备这些制剂的方法描述于实施例3和7中。
如这里所使用的，术语"缓释制剂"是指将药物递送至需要位置达持续时间的药物制剂，包括保持释放其药物成分优选几天，更优选几周或更长时间的制剂。
如这里所使用的，术语"肿瘤激活法"是指通过使用细胞调亡诱导试剂"激活"肿瘤来减小肿瘤细胞密度并增加治疗剂对肿瘤物质的可接近性的增强治疗药物的进入的方法。该方法涉及使用细胞调亡诱导剂，例如帕利他西，使用计量和时间足以导致组织内的细胞调亡，从而允许增强肿瘤治疗剂(或简单地，"治疗剂")进入组织(例如通过在组织内产生通道)。这样，在治疗剂的治疗剂量被递送至组织之前，细胞调亡诱导剂用作预治疗，与不使用预治疗的情况相比，该预治疗能够增强治疗剂进入组织。该细胞调亡诱导剂还可以具有治疗活性，因此还可以用作治疗剂(即，同样的药物可以用作细胞调亡诱导剂和治疗剂)。或者，细胞调亡诱导剂可以用于增强将治疗用的其它类型的药物或赋性剂的递送至组织中(即，细胞调亡诱导剂和治疗剂可以是不同的药物，或者治疗剂可以含在纳米颗粒或微粒中，与不使用预治疗的情况相比，在那里，纳米颗粒或微粒向肿瘤组织的递送得到增强)。
如这里所使用的，术语"PLGA"或"聚(丙交酯-共-乙交酯)″是指由各种比例的乳酸或丙交酯(LA)和乙醇酸或乙交酯(GA)构成的共聚物。所述共聚物可以具有不同的平均链长，导致不同的特性粘度和聚合物性质的差别。PLGA用于制备通常含有治疗剂的微粒或纳米颗粒。制备这些颗粒的方法描述于实施例3中。
如这里所使用的，术语"明胶"是指结缔组织蛋白胶原的变性形式。通过交联蛋白质链来稳定在溶液中形成的明胶聚集体。使用实施例7的制备方法，明胶形成明胶纳米颗粒，通常负载有帕利他西。可获得的明胶具有不同的蛋白质链长，用不同的Bloom数表示。较大的Bloom数表示较长的链长。
如这里所使用的，术语"IC50"是指导致50%的药物作用的药物浓度或剂量。
如这里所使用的，术语"突然释放(burst release)"是指本领域公知的，对来自制剂的部分药物载荷的初始迅速释放的定义，所述释放通常跟随有药物载荷残余物的缓释。
如这里所使用的，术语"局部化"和"集中"可以互换使用，表示在特定位置例如肿瘤组织处的优先分布。
如这里所使用的，术语"生物粘附剂"是指粘结且优选强力粘结至诸如皮肤、粘膜和肿瘤等的表面的天然、合成或半合成物质。合适的生物粘附剂包括聚赖氨酸、纤维蛋白原、由部分酯化的聚丙烯酸聚合物制备的物质，包括聚丙烯酸聚合物、天然或合成多糖，例如纤维素衍生物，例如甲基纤维素、纤维素乙酸酯、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、果胶，以及硫酸化蔗糖和氢氧化铝的混合物。
如这里所使用的，术语"间质性膀胱炎"是指本领域公知的、膀胱壁的慢性且疼痛发炎症状。
如这里所使用的，术语"可生物降解的"或"可生物腐蚀的"聚合物是指能够降解成低分子量化合物的聚合物，已知其通常被包括在代谢途径中。该术语还包括在生物环境中能够受到攻击的聚合物体系，以至于体系的完整性以及有些情况下大分子自身被影响且提供能够从它们的作用位置除去(但是不必从机体上除去)的碎片或其它降解副产物。
发明内容
一种用于将肿瘤治疗剂递送至患者的组合物，其包括肿瘤细胞凋亡诱导剂的快释制剂、肿瘤治疗剂的缓释制剂以及可药用载体。可药用载体中的细胞凋亡诱导剂可以先行给药或伴随给药。也可以使用治疗剂(例如，帕利他西)的纳米颗粒或微粒(例如，交联明胶)。所述纳米颗粒或微粒可以涂布有生物粘附剂涂层。还可以使用如下的微粒，其能够聚集以阻塞膀胱淋巴管的入口，从而延迟通过淋巴系统清除微粒。
本发明还使用负载药物的明胶以及聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)纳米颗粒和微粒将药物递送靶向腹腔、膀胱组织和肾脏中的肿瘤。
附图说明
图1.PLGA微粒靶向肿瘤
在小鼠体内植入腹膜内的人Hs766T胰脏异种移植肿瘤。在肿瘤生长后(21天)向腹膜内给药荧光素异氰酸盐(FITC)标记颗粒的剂量。FITC在紫外光下显示出绿色荧光。在第24天，麻醉动物并暴露腹腔。左侧给出房间照明下的照片。注意多个肿瘤，其呈白色/黄色和不规则形状的节块，散布在整个腹腔中。右侧给出在紫外光下的照片。注意绿色荧光表示的颗粒在肿瘤节块(tumor nodules)上的定位。
图2.使用帕利他西激活肿瘤促进微粒进入实体瘤以及在其中的分布
在小鼠体内植入腹膜内的人SKOV-3卵巢异种移植肿瘤。在肿瘤生长后(42天)给动物腹膜内注射PLGA微粒(~3μm的直径，50:50LA:GA)；使用绿色荧光化合物(吖啶橙)标记这些颗粒。动物接受快释的负载帕利他西的微粒(其含有10mg/kg的帕利他西剂量)，或者接受不含帕利他西的空白微粒。三天后，麻醉动物，肿瘤附着在冷冻的网膜上，进行切片。表示颗粒位置的荧光纤维图像重叠在显示肿瘤轮廓的相差显微图像上。左侧给出由经历帕利他西激活肿瘤的动物获得的肿瘤的代表性切片，右侧给出由接受不含帕利他西的空白微粒的动物获得的肿瘤切片。微粒为绿色荧光环。注意微粒的量越大，则微粒在使用肿瘤激活帕利他西治疗方法所治疗的肿瘤中的分布越均匀。相反，在没有使用帕利他西治疗的肿瘤中，微粒限于肿瘤外围。以200X的放大率拍照。白条表示100μm的距离。
具体实施方式
本发明提供了用于将治疗剂递送至肿瘤和肾脏组织的方法和其中使用的组合物，其中所述方法能够提高治疗剂靶向和进入多层组织(例如固体组织或肿瘤)内部。
在第一方面，本发明提供一种促进化学治疗剂或颗粒进入(penetration)肿瘤的方法。该方法包括使用细胞凋亡诱导剂例如帕利他西，其剂量和时间足以导致组织中的细胞凋亡。然后当发生大量细胞凋亡时，将治疗剂或颗粒递送至组织，导致增强治疗剂或颗粒机进入组织中。因此，在将治疗剂或颗粒递送至组织之前，将细胞凋亡诱导剂用作预治疗，并且与不使用预治疗的情况相比，该预治疗能够增强治疗剂或颗粒进入组织。该细胞调亡诱导剂还可以具有治疗活性，因此还可以用作治疗剂(即，同样的药物可以用作细胞调亡诱导剂和治疗剂)。或者，细胞调亡诱导剂可以用于增强将其它类型的药物递送至组织中(即，细胞调亡诱导剂和治疗剂可以是不同的药物)。
在一个实施方案中，本发明使用允许伴随给药细胞凋亡诱导剂和治疗剂的制剂。在该实施方案中，将细胞凋亡诱导剂配制成快释制剂，将治疗剂配制成在一种或多种缓释制剂。给药后，快释制剂导致组织内的细胞凋亡，缓释制剂允许在实现显著程度的细胞凋亡后递送治疗剂总量的大部分。
在相关实施方案中，所述制剂是单一制剂，其提供细胞凋亡诱导剂的初始突然释放，然后是用作治疗剂的剩余药物载荷的缓释。
在相关实施方案中，上述制剂用于治疗腹腔中的肿瘤和连接腹腔的组织中的肿瘤。
在另一个相关实施方案中，上述组合制剂用于治疗腹水肿瘤。
在又一个相关实施方案中，这些制剂用于治疗来自任何来源的转移性肿瘤，其在腹腔或在与肿瘤所伸入的腹腔相邻的组织中生长。
在相关实施方案中，这些制剂用于治疗位于容易通过直接给药而达到的器官或部位处的肿瘤，例如，在一种或多种以下组织内：腹腔内的或与腹腔相邻的组织、膀胱组织、脑组织、前列腺组织、或肺组织。
在另一个实施方案中，待治疗的肿瘤位于受治疗者的腹腔内或者生长在与腹腔相邻的组织内。
在相关实施方案中，待治疗的肿瘤位于容易通过直接给药到达的器官或部位，例如前列腺、膀胱、脑。
在另一个实施方案中，微粒是通过腹膜内的路径以悬浮液的形式递送的。
在另一个实施方案中，微粒是通过直接局部注射至容易到达的器官或者通过直接部位注射到与容易到达的器官相邻的器官以悬浮液的形式递送的。
在又一个实施方案中，受治疗者是哺乳动物，优选人。
在另一个实施方案中，待治疗的患者是患有已经散布至腹腔的胰腺癌或卵巢癌的患者。
在第二方面，本发明提供用在上述方法中的组合物。这些组合物由各种负载药物的PLGA颗粒构成，所述颗粒随时间释放细胞凋亡诱导剂和治疗剂，并提供细胞凋亡诱导剂的初始速释，然后提供治疗剂的缓释。
在一个具体的实施方案中，所述制剂由快释组分构成，所述组分在一天内释放优选>10%，更优选>20%，更优选>30%，更优选>40%，更优选>50%，且进一步优选>60%的细胞凋亡诱导剂的成分，导致组织内的细胞凋亡，且所述制剂进一步由一种或多种缓释成分构成，所述成分持续释放治疗剂优选达几天，更优选达几周或更长。
在相关实施方案中，所述组合物可以是帕利他西的单一制剂，其由初始突然释放和随后的残余药物载荷的缓释构成。
在具体的实施方案中，所述组合物还可以是帕利他西的两种或多种制剂的组合，其中至少一种制剂提供帕利他西的速释，至少一种制剂提供帕利他西的缓释。在相关实施方案中，与具有早期突然释放的单一制剂获得的效果相比，该组合制剂提供更好受控的药物释放，其由早期的快释和后期的长时间释放构成。
在又一个相关实施方案中，如果不同试剂用作细胞凋亡诱导剂和治疗剂，则该组合制剂是特别有利的。
在另一个实施方案中，所述颗粒是PLGA颗粒，其被配制成含有细胞凋亡诱导剂或治疗剂。典型制剂包含不大于50%，优选不大于30%，更优选不大于20%的所述试剂，基于制剂的总重。有时，有利地加入释放增强剂，例如Tween 20、Tween 80、肉豆蔻酸异丙酯、β-乳糖或苯二甲酸二乙酯，从而获得应用所需的释放速率。
在优选实施方案中，快释PLGA微粒由50:50LA:GA构成，其平均直径为3-5μm，玻璃化转变温度低于体温(例如，30℃)、帕利他西的载荷为~4%以及一天内药物的释放速率为~70%。该组合物的实例是表1中描述的批次8。
在优选实施方案中，缓释PLGA微粒由50:50LA:GA构成，其平均直径为30-50μm，玻璃化转变温度低于体温(例如，30℃)、帕利他西的载荷为~4%以及第一天内药物的初始突然释放速率为~20％，然后在7周内缓释产生70%的总累积释放。该组合物的实例是表1中描述的批次7。
在优选实施方案中，缓释PLGA微粒由75:25LA:GA构成，其平均直径为3-5μm，玻璃化转变温度高于体温(例如，50℃)、帕利他西的载荷为~4%以及第一天内药物的初始突然释放速率为~5％，然后在7周内缓释产生30%的总累积释放。该组合物的实例是表1中描述的批次4。
在第三方面，本发明提供一种通过在存在肿瘤的位置局部给药含药物的纳米颗粒或微粒，实现改善递送试剂至肿瘤的方法，其中，与在没有选择性粘附至肿瘤的纳米颗粒或微粒中的递送相比，纳米颗粒或微粒选择性地粘附至肿瘤组织，由此在肿瘤内产生更高药物水平。
在一个实施方案中，含药物的纳米颗粒或微粒选择性地粘附至肿瘤组织，并且由于细胞调亡诱导剂的释放，便于它们自身进入肿瘤。例如，实施例5的颗粒示出大量进入肿瘤。该进入是由于细胞调亡诱导剂的释放导致的，因为不负载有细胞调亡诱导剂的等同颗粒不进入肿瘤内。在进入肿瘤后，颗粒携带的药物载荷的残余物随时间而释放，导致肿瘤组织高度集中地暴露至释放的药物。药物释放速率被组织环境所阻碍，增加肿瘤组织暴露的时间。因此，本实施方案的方法是治疗肿瘤的有效方法，该方法使用局部给药肿瘤粘附颗粒，所述颗粒在初始药物释放之后进入肿瘤组织。而且，本实施方案不依赖于快释或缓释治疗剂的使用，但是适用于使用任何治疗肿瘤的治疗剂，因为颗粒携带有细胞调亡诱导剂。
在第四方面，本发明提供用在上述方法中的组合物。
在一个实施方案中，这些组合物由玻璃化转变温度(Tg)低于患者体温的PLGA颗粒构成，从而增强颗粒对肿瘤组织的选择性粘附。
在优选实施方案中，快释PLGA微粒由约50%丙交酯和约50%乙交酯构成，其玻璃化转变温度低于体温(例如，30℃)。该组合物的实例是表1中描述的批次8。
在具体的实施方案中，所述颗粒由含有约50%丙交酯和约50%乙交酯的PLGA配制而成，并负载有所述试剂，其中所述试剂的总重量达到不大于制剂总重量的50%，优选不大于30%。
在另一个实施方案中，可以通过以下方法获得粘附至肿瘤组织的颗粒：使用聚赖氨酸进行交联来提高颗粒的生物粘附性能；使用纤维蛋白原涂布颗粒；或者其它本领域公知的方法。这些颗粒可以是明胶纳米颗粒或PLGA微粒。
在第五方面，本发明提供一种通过给药含药物的微粒进入腹腔，实现改善递送试剂至已经分布在腹腔内的肿瘤的方法，其中微粒聚集在最经常出现转移性肿瘤的腹腔区域，从而，与在没有最经常出现转移性肿瘤的位置聚集的制剂中递送药物的情况相比，将更大的药物量递送至肿瘤。
在第六方面，本发明提供用于上述方法的组合物，即，PLGA微粒，在给药至腹腔时，该微粒集中(localize)在最经常出现转移性肿瘤的腹腔区域，例如网膜、肠系膜、膈膜和小腹。
在优选实施方案中，PLGA微粒具有约3-5μm的平均直径。这些颗粒优先集中在网膜、肠系膜、膈膜和小腹附近。这些组合物的实例是表1所述的批次4和8。
在优选实施方案中，PLGA微粒具有约30-50μm的平均直径。这些颗粒优先集中在小腹附近。这些组合物的实例是表1所述的批次2、3、5、6和7。
在一个实施方案中，微粒集中在肠系膜内、网膜上、膈膜上，以及作为转移性肿瘤的生长位置的其它位置上。
在相关实施方案中，颗粒的尺寸与单个肿瘤细胞或者肿瘤细胞的小聚集体的尺寸相似，即，直径为约3-约30μm。
在第七方面，本发明提供实现改善含试剂的微粒在腹腔内的保留性的方法，通过在玻璃化温度(Tg)低于患者体温的PLGA微粒中配制试剂，以促进颗粒聚集体的形成，从而，与Tg高于体温的微粒相比，减少通过淋巴管引流导致的这些颗粒的清除。
在第八方面，本发明提供用于上述方法的组合物，其由负载药物的微粒构成，所述微粒已经延迟了淋巴清除。
在优选实施方案中，PLGA微粒由约50%丙交酯和约50%乙交酯制成，其玻璃化转变温度低于体温(例如，30°C)。该组合物的实例是表1中描述的批次6、7和8。
在第九方面，本发明提供实现改善含试剂的微粒在腹腔中的保留性的方法，通过在颗粒尺寸足够大的PLGA微粒中配制试剂，从而，与没有将试剂负载在微粒上而给药试剂的情况相比，减少通过淋巴管引流清除这些颗粒。
在第十方面，本发明提供用于上述方法的组合物，其由负载药物的微粒构成，所述微粒具有足够大的尺寸，以延迟通过淋巴管引流而实现的清除。
在优选实施方案中，PLGA微粒的平均直径为至少10μm。这些组合物的实例是表1中所述的批次2、3、5、6和7。
在第十一方面，本发明提供用于实现改善含试剂的微粒在腹腔内的保留性的方法，通过在PLGA微粒中配制试剂，与没有负载到微粒上而给药该试剂的情况相比，所述微粒的尺寸减少由于经由腹膜吸附而导致的从腹腔清除试剂。
在第十二方面，本发明提供用于上述方法的组合物，其由负载药物的微粒构成，所述微粒已经延迟经由腹膜的吸收。
在优选实施方案中，PLGA微粒的平均直径为至少10μm。这些组合物的实例是表1中描述的批次2、3、5、6和7。
在第十三方面，本发明提供具有至少两种以下所需性能的组合物：(1)提供药物的速释，然后是缓释，(2)选择性地粘附至肿瘤组织，(3)在最经常发生转移性肿瘤的腹腔区域集中，(4)通过淋巴管引流而少量清除，和(5)经由腹膜的低吸收。
在优选实施方案中，所述组合物含有快释和缓释PLGA颗粒。快释PLGA颗粒由50%丙交酯和50%乙交酯制成，平均直径为3-5μm，玻璃化转变温度低于体温(例如，30℃)，且在数小时之内释放细胞凋亡诱导量的细胞凋亡诱导药物。缓释PLGA微粒由50%丙交酯和50%乙交酯制成，平均直径为30-50μm，玻璃化转变温度低于体温(例如，30℃)，释放治疗剂，在第一天释放优选少于30％，更优选少于20%的药物载荷，然后缓释，在数周内累积释放>60％，优选>70%。
在进一步优选的实施方案中，细胞凋亡诱导剂和治疗剂都是帕利他西。
在第十四方面，本发明提供一种将亲脂试剂递送至患者的膀胱壁的方法。该方法使用明胶纳米颗粒用于试剂的制剂，其中所述制剂比给药自由药物具有若干优点。由于将试剂配制在明胶纳米颗粒内，因此与其它可能的情况相比，可以给药更大药量的许多难溶试剂。而且，配制在明胶纳米颗粒中的药物用作持续药物释放的储备，以至于与给药自由试剂相比，可以维持更高的药物浓度。而且，即使当尿液排空时，负载药物的明胶纳米颗粒也可以保留在膀胱腔内，从而增大肿瘤对药物的总体暴露。
在优选实施方案中，本发明提供一种通过膀胱内滴注将帕利他西递送至患有浅表性膀胱癌的患者的膀胱壁的方法，其中含克列莫佛的制剂中不含帕利他西，且由于这个原因，更容易进入膀胱壁。
在另一个实施方案中，可以使用该方法给药其它高度亲脂性试剂，用于治疗浅表性膀胱癌或用于治疗间质性膀胱炎(interstitial cystitis)。预期能够使用该方法产生改进的治疗结果的试剂包括但不限于多西他奇(docetaxel)。
在第十五方面，本发明提供组合物，将帕利他西配制成适用于膀胱内滴注的递送形式，其中该递送形式满足以下标准：(1)在小体积的滴注剂中含有足够剂量的帕利他西，(2)该递送形式能够快速和有效地将帕利他西递送至膀胱壁，以及(3)在膀胱壁内获得大量和治疗有效量的帕利他西活性浓度。
在一个实施方案中，该组合物由交联的明胶纳米颗粒构成，所述颗粒负载有帕利他西。
在相关实施方案中，配制明胶纳米颗粒以提供帕利他西的溶解度限制释放，且因此将保持尿液中的帕利他西的溶解浓度。因此，将会不依赖于会另外导致稀释和降低药物浓度的过程(包括但不限于，在药物滴注时存在残余尿液，或者在治疗持续期间或之后产生尿液)，保持帕利他西的恒定和有效浓度。
在优选实施方案中，由Bloom数为175的明胶制备明胶纳米颗粒，其平均直径为约600nm-约1000nm，且药物载荷为0.4%-2.0%，更优选药物载荷为0.5%-1.0%。明胶的交联可以通过以下方法实现：使用实施例7所述的戊二醛，或者其它方法，例如使用本领域公知的氧化多糖分子(美国专利No.6,132,759)。表3中提供了这些纳米颗粒的实例，且实施例7中描述了它们的性能。
在另一个相关实施方案中，所述纳米颗粒制剂进一步含有其它成分以增大帕利他西的溶解度，因此增大可获得的用于治疗肿瘤的帕利他西的浓度。这些成分的实例是共溶剂，例如二甲基亚砜或聚乙二醇。
在又一个相关实施方案中，通过施加过高热可以增大帕利他西在尿液中的溶解度。
在另一个实施方案中，在患有浅表性膀胱癌的患者体内经常观察到，颗粒粘附至正常的膀胱壁和/或发炎的膀胱壁，和/或暴露在膀胱壁表面上的肿瘤组织。通过使用生物粘附分子涂布纳米颗粒可以增大该粘附，所述生物粘附分子包括但不限于聚赖氨酸、纤维蛋白原、聚丙烯酸聚合物、甲基纤维素、纤维素乙酸酯、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素或果胶。
在相关实施方案中，纳米颗粒粘附至膀胱壁能够保持膀胱腔内的有效药物浓度，甚至是在患者已经清空他或她的膀胱后。
在具体的实施方案中，粘附至膀胱壁的颗粒是负载有亲脂性治疗剂且涂布有生物粘附分子的明胶纳米颗粒。
在优选实施方案中，所述颗粒是明胶纳米颗粒，负载有帕利他西并涂布有聚赖氨酸。
在进一步优选的实施方案中，明胶纳米颗粒是由Bloom数为175的明胶制成的颗粒，平均直径为约600nm-约1000nm，药物载荷为约0.4%-2%，更优选为约0.5%-1%，其含有占其重量的5%的聚赖氨酸，其中明胶分子和聚赖氨酸分子可以使用实施例7中所述的戊二醛或者其它本领域公知的交联方法交联。
在另一个实施方案中，适用于膀胱内滴注的递送形式由快释PLGA微粒构成。
在另一个实施方案中，治疗剂进入膀胱内容物中的释放速率受到试剂的水溶性的限制。
在优选实施方案中，所述试剂是帕利他西。
在另一个实施方案中，快释PLGA微粒的平均直径为100nm-6000nm，优选500-5000nm，更优选3000-4000nm。
在优选实施方案中，快释PLGA微粒由50:50LA:GA构成，平均直径为3000-5000nm，玻璃化转变温度低于体温(例如，30°C)，含有约4%的帕利他西，且在漏槽状态(sink condition)下在一天内具有约70%的药物释放速率。
在另一个实施方案中，PLGA微粒上涂布有生物粘附分子。
在第十六方面，本发明提供一种当通过静脉内途径给药试剂时，增大试剂向肾脏的递送的方法。与静脉给药的试剂的分布相比，该方法基于明胶纳米颗粒对肾脏的选择性分布。
在一个实施方案中，通过静脉给药配制在明胶纳米颗粒中的试剂实现选择性地靶向肾脏组织。
在优选实施方案中，选择性靶向肾脏的方法描述于实施例1中。
在进一步优选的实施方案中，使用具有约600-900nm的平均尺寸并负载有治疗上有用的试剂的明胶纳米颗粒靶向受治疗者的肾脏。
在另一个实施方案中，配制在明胶纳米颗粒中的试剂包括用于治疗肾癌的化学治疗试剂、用于预防肾癌的化学预防试剂、用于治疗肾病的基因治疗结构成分，以及其它有利于选择性给药至肾脏的试剂。
在第十七方面，本发明提供一种组合物，用于将帕利他西或其它试剂配制成适用于选择性地静脉靶向肾脏的递送形式。该组合物由交联的明胶纳米颗粒构成，所述颗粒负载有待递送的试剂。
在优选实施方案中，所述试剂是帕利他西。
在进一步优选的实施方案中，明胶纳米颗粒由Bloom数为175的明胶构成，平均直径为约600nm-约1000nm，药物载荷为0.4%-2.0%，更优选药物载荷为0.5%-1.0%。明胶的交联可以通过以下方法实现：使用实施例7所述的戊二醛，或者其它方法，例如使用本领域公知的氧化多糖分子(美国专利No.6,132,759)。表3中提供了这些纳米颗粒的实例，且实施例7中描述了它们的性能。
在另一个实施方案中，所述试剂是用于选择性地将基因结构成分递送至肾脏细胞的基因产物。
在第十七方面，本发明提供一种用于将试剂递送至患者的膀胱壁的方法。该方法使用明胶纳米颗粒来配制试剂，其中所述制剂比给药自由药物具有若干优点。由于将试剂配制在明胶纳米颗粒内，因此与其它可能的情况相比，可以给药更大药量的试剂。
在优选实施方案中，配制在明胶纳米颗粒中的药物用作持续药物释放的储备，以至于与给药自由试剂相比，可以维持更高的药物浓度。而且，即使当尿液排空时，负载药物的明胶纳米颗粒也可以保留在膀胱腔内，从而增大肿瘤对药物的总体暴露。
在另一个实施方案中，可以使用该方法给药用于治疗浅表性膀胱癌的其它高度亲脂性试剂。预期能够使用该方法产生改进的治疗结果的试剂包括但不限于多西他奇。
在另一个实施方案中，可以使用该方法给药其它用于治疗浅表性膀胱癌的试剂。所述试剂包括但不限于，苏拉明(suramin)、干扰素(例如，α、γ、ω干扰素)、多西他奇、阿霉素和其它蒽环类抗生素、噻替派(thiotepa)、丝裂霉素(例如，丝裂霉素C)、芽孢杆菌(Bacillus)Calmette Guerin、顺氯氨铂、甲氨蝶呤(methotrexate)、长春碱(vinblastine)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、醋酸亮丙瑞林(leuprolide)、氟他米特(flutamide)、二乙基乙烯雌酚(diethylstibestrol)、雌氮芥(estramustine)、甲地孕酮乙酸盐(megestrol acetate)、环孕酮(cyproterone)、氟他米特和环磷酰胺(cyclophosphamide)。
在另一个实施方案中，可以使用该方法给药用于治疗间质性膀胱炎的试剂。预期能够使用该方法产生改进的治疗结果的试剂包括但不限于，戊聚糖聚硫酸盐及其钠盐、抗组胺剂(例如，羟嗪及其盐、色甘酸及其钠盐)、三环抗抑郁剂(例如，阿密曲替林(amitriptyline)、地昔帕明(desipramine)、去甲替林(nortriptyline)、多虑平(doxepin)和丙咪嗪(imipramines))、选择性的血清素再摄取抑制剂(例如，帕罗西汀(paroxetine))、疼痛治疗药(例如，加巴喷丁(gabapentin)、氯硝西泮(clonazepam))、肌肉弛缓剂(例如，地西泮(diazepam)、巴氯芬(Baclofen))、抗惊厥剂(例如，加巴喷丁、氯硝西泮)、麻醉性镇痛剂(例如，vicodin、盐酸羟考酮和对乙酰氨基酚片剂(percocet)、奥施康定(oxycontin))、其它镇痛剂(例如，盐酸利多卡因(lidocaine hydrochlorid),盐酸普鲁卡因(procaine hydrochloride)、水杨醇、盐酸潘妥卡因(tetracaine hydrochloride)、盐酸非那吡啶(phenazopyridine hydrochloride)、扑热息痛(acetaminophen)、阿司匹林(acetylsalicylic acid)、氟苯柳(flufenisal)、布洛芬(ibuprofen)、吲哚布洛芬(indoprofen)、吲哚美辛(indomethacin)、甲氧萘丙酸(naproxen)、可待因(codeine)、xycodone和枸橼酸芬太尼(fentanyl citrate))、解痉药(例如，Urimax、Pyridiμm、Urised、黄酮哌酯(flavoxate)、双环胺、丙胺太林(propantheline))、抗胆碱能类(例如，Detrol、盐酸奥昔布宁(Ditropan)、硫酸莨菪碱(Levsin)、硫酸莨菪碱(hyoscyamine))、H2阻滞剂(例如，泰胃美(Tagamet)、善得胃(Zantac))、尿碱化剂、adrenetic blocks(例如，卡度雷(Cardura)、Flomax、高特灵(Hytrin))、白细胞三烯抑制剂(leukotriene inhibitors)(例如，孟鲁司特(montelukast))以及具有多种作用的试剂(例如，二甲基亚砜、肝素、oxychlorosend及其钠盐、硝酸银、卡介苗(bacillus calmette-guerin)、透明质酸钠、resiniferatoxin、botulinumtoxic)。
在另一个实施方案中，所述试剂可用于治疗膀胱感染，所述试剂例如是抗生素、抗真菌剂、抗原虫药、抗病毒药和其它抗感染试剂。用于治疗这些感染的合适药物包括丝裂霉素、环丙沙星(ciprofloxacin)、氟哌酸(norfloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、methanamine、呋喃妥因(nitrofurantoin)、氨比西林(ampicillin)、阿莫西林(amoxicillin)、乙氧萘青霉素(nafcillin)、甲氧苄啶(trimethoprim)、磺胺类药(sulfa)、甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异噁唑(trimethoprimsulfamethoxazole)、乙琥红霉素(erythromycin)、脱氧土霉素(doxycycline)、灭滴灵(metronidazole)、四环素(tetracycline)、卡那霉素(kanamycin)、青霉素类(penicillins)、先锋霉素类(cephalosporins)和氨基糖甙类(aminoglycosides)。
在又一个实施方案中，所述试剂可以用于治疗欲望性尿失禁或发炎。合适的药物包括双环胺、去氨基精加压素(desmopressin)、奥昔布宁(oxybutynin)、雌激素(estrogen)、特罗地林(terodiline)、丙胺太林(propantheline)、多虑平、米帕明(imipramine)、黄酮哌酯、苯丙醇胺(phenylpropanolamine)、特拉唑嗪(terazosin)、praxosin、假麻黄碱(pseudoephedrine)、氨甲酰甲胆碱(bethanechol)、抗胆碱能药(anticholinergics)、镇痉剂(antispasmodic agents)、抗毒蕈碱剂(antimuscarinic agents)、β-2激动剂、去甲肾上腺素吸收抑制剂、血清素吸收抑制剂、钙通道阻滞剂、钾通道开放剂，也可以使用肌肉弛缓剂。用于治疗失禁的合适药物包括奥昔布宁、S-奥昔布宁、emeproniμm、维拉帕米(verapamil)、米帕明(imipramine)、黄酮哌酯、阿托品(atropine)、丙胺太林、托特罗定(tolterodine)、罗西维林(rociverine)、克仑特罗(clenbuterol)、达非那新(darifenacin)、特罗地林、trospium、天仙子胺(hyoscyamin)、丙哌凡林(propiverine)、去氨基精加压素、伐米胺(vamicamide)(Fujiwara Co.,Japan)、YM-46303(Yamanouchi Co.,Japan)、兰吡立松(lanperisone)(Nippon Kayaku Co.,Japan)、NS-21(Nippon Shinyaku Orion,Formenti,Japan/Italy)、NC-1800(NipponChemiphar Co.,Japan)、ZD-6169(Zeneca Co.,United Kingdom)和司洛碘铵(stiloniμm iodide)。
在另一个实施方案中，所述试剂可以用于增强膀胱收缩性，或减少尿液在膀胱内的保留时间。
实施例1
鉴定对人肿瘤细胞具有活性的帕利他西浓度和治疗时间
本发明描述了设计方法以及负载帕利他西的颗粒的组合物，该组合物在治疗期间释放细胞毒素水平的帕利他西，所述水平足以导致细胞毒性。该实施例鉴定对抗人肿瘤细胞有效的帕利他西浓度和治疗时间。
申请人评估了帕利他西(溶解在水中，96小时的治疗)在三种人胰腺癌细胞(PANC1、MIA-PaCa和Hs766T)和人膀胱RT4肿瘤细胞中的细胞毒性。使用微四唑盐染料还原(microtetrazolium dye reduction,MTT)分析确定药物效应。在这些细胞中产生50%的细胞毒性(IC50)所需的浓度分别是1.5、0.7、0.7nM。这些IC50值与人乳腺MCF7和卵巢SKOV3癌细胞中的帕利他西的IC50相当(Au,et al.,Cancer Res.,58:2141-2148,1998)。该数据表明胰腺癌细胞对帕利他西是高度敏感的。这是令人吃惊的，因为静脉给药的
Figure BDA00001776645800271
(溶解在克列莫佛和乙醇中的帕利他西)在晚期胰腺癌患者体内没有表现出显著的活性(Gebbia and Gebbia,Eur.J.Cancer,32A:1822-1823,1996;Schnall andMacdonald.Semin.Oncol.,23:220-228,1996)。RT4细胞中的帕利他西的IC50是4.0±0.4nM(96小时的治疗)。
实施例2
建立人胰腺和卵巢异体移植肿瘤模型以测试负载帕利他西的微粒的功 效
该实施例示例建立人腹膜肿瘤模型以测试负载帕利他西的微粒的功效。
申请人使用来自淋巴腺转移瘤的人胰腺Hs766T细胞在无胸腺的小鼠体内移植生长正位和腹膜内肿瘤。对于正交模型，将2×106肿瘤细胞正交移植到胰腺内。2-3周后肿瘤移植生长(~1.5cm-~2cm的直径)。对于腹膜内肿瘤，申请人通过系列再移植由被给与Hs766T细胞的IP注射的腹膜洗液收集到的细胞，建立了转移亚系(metastatic subline)。在6周大的雌性Balb/c(系)小鼠体内再移植Hs766T细胞IP导致递增的肿瘤遍布整个腹腔。2-3周后，在网膜上发现直径为~1cm-~1.5cm的肿瘤节块，在肠系膜、小腹、腹膜后腔和膈膜上发现~3mm-~5mm的多个节块。还存在腹水肿瘤。在3-4周动物死亡。
对于卵巢肿瘤模型而言，如对于Hs766T肿瘤所描述的，申请人建立了人卵巢SKOV3细胞的转移亚系。再移植转移的SKOV3细胞导致肿瘤在2周内生长在网膜上，在4周内生长在肠系膜上，然后肿瘤入侵内脏器官的薄壁组织，例如肝和肾，且在后期(6周后)肿瘤存在于膈膜上。在2周时，腹膜液中的蛋白质浓度从正常小鼠的3%增加至携带肿瘤的小鼠的约6%。4周后，腹膜液的体积增加7-10倍，且含有肿瘤细胞的聚集体。腹水肿瘤的尺寸为40-几百μm。5-6周后，动物出现显著的体重减轻(10-15%)，一些小鼠出现腹膜膨胀(胸围增大20%，6.3cm-7.6cm)以及肠梗阻。肿瘤植入后7-9周动物死亡。
携带胰腺和卵巢肿瘤的小鼠体内的疾病发展与所报道的患者体内的疾病发展相似。例如，卵巢癌患者的腹腔内表现出相似的肿瘤散布和发展，肿瘤出现在肠膜、肝周和脾周韧带、膈膜、肠系膜和网膜内。它们还表现出在腹膜液中的高蛋白质浓度(晚期为4.46g/dl)，原因是血清蛋白泄漏和/或腹腔内存在腹水(Lee,et al.,Cancer,70:2057-2060,1992)。患者体内的恶性腹水示出与SKOV3腹水肿瘤中相似尺寸的肿瘤细胞聚集体(Tauchi,et al.,ActaCyto/.,40:429-436,1996;Monte,et al.,Acta Cytol.,31:448-452,1987)。
实施例3
鉴定PLGA微粒的性能对它们在腹腔内的分布和保留性的影响
本发明公开了负载药物的PLGA颗粒，其靶向腹膜肿瘤。该实施例示例PLGA微粒的不同性能对其在腹腔内的分布和保留性的影响，以帮助鉴定具有所需保留性和分布特性的PLGA微粒。实施例4-6描述使用帕利他西(广泛使用的抗癌药物)作为实例制备和应用所述负载药物的PLGA微粒。
PLGA微粒尺寸的影响。申请人在腹膜内给药后，比较了两种具有不同直径(即，~3和~30μm)的微粒制剂的分布。这些微粒负载有吖啶橙，因此在紫外光下是可见的。24小时后，对小鼠实施无痛致死，打开其腹部(每种制剂使用三只小鼠)。结果如图1所示。在网膜、肠系膜、膈膜和小腹内发现小的微粒，而大的微粒集中在小腹内。
玻璃化转变温度对从腹腔淋巴清除微粒的影响。申请人评估了玻璃化转变温度(Tg)对通过淋巴流从腹腔清除微粒的影响。向小鼠进行腹膜内注射75:25LA:GA微粒的混合物(即，表1中的批次1)和50:50LA:GA微粒的混合物(即，表1中的批次8)。50:50和75:25的微粒具有相同的尺寸(直径为3μm)，但是具有不同的Tg。Tg决定聚合物链的运动；在高于Tg的温度产生运动，但是在低于Tg时不产生运动。聚合物链段的运动导致微粒的聚集和粘结。因此，具有低于体温的Tg(即，30℃vs 37℃)的50:50LA:GA微粒在腹膜内给药后形成聚集体，而具有高于体温的Tg(即，53℃)的75:25LA:GA微粒不形成聚集体。微粒聚集导致更大的有效直径。75:25LA:GA的微粒包含在吖啶橙(绿色荧光)中，而50:50LA:GA的微粒包含在若丹明(rhodamine)(红色荧光)中。
注射后，对小鼠实施无痛致死，切除膈膜并用水洗涤。冷冻一半膈膜，通过荧光显微术研究冷冻部分。将另一半固定在福尔马林中，并使用扫描电镜进行分析。两种分析示出1小时时膈膜内部的淋巴血管内的少量微粒和在24小时时明显更多的微粒，表明随时间的推移微粒排泄至淋巴系统中。在1和24小时的样品中，淋巴血管中存在比75:25LA:GA微粒约多三倍的50:50LA:GA微粒。在纵隔的淋巴结中获得相似的发现，证实较少量地淋巴清除50:50LA:GA微粒。
表1
负载帕利他西的PLGA微粒的性能和活性
特性粘度与玻璃化转变温度(Tg)直接相关。
Figure BDA00001776645800291
Figure BDA00001776645800301
PLGA微粒优先保留在腹腔内。使用负载若丹明的荧光微粒研究腹膜内给药后PLGA微粒在腹腔内的聚集和沉积。将该沉积与若丹明在溶液中的沉积进行对比。负载若丹明的微粒(直径为3μm，50:50LA:GA)最初分布在整个腹膜内的空腔(例如，在15分钟时)内，然后在肠系膜、网膜和膈膜中聚集(例如，在24小时和96小时时)。相反，溶液中的若丹明在15分钟时分布在整个腹膜内的空腔中，但是在24小时时不再能观察到伴随若丹明的荧光。该数据表明，与溶液相比，颗粒优先保留在腹腔内。
PLGA微粒优先聚集在腹膜肿瘤节块上。使用吖啶橙标记的荧光微粒研究腹膜内给药后PLGA微粒在腹腔内的聚集和沉积。这些颗粒的直径为~3μm，且由50:50LA:GA构成。对小鼠进行腹膜内植入人胰腺HS 766T-细胞的细胞悬浮物。在第21天或当疾病处于晚期(平均存活时间为24天)时给药一定剂量的吖啶橙标记的微粒。在第24天，麻醉动物，打开腹腔，借助其荧光估计微粒的分布。图1的左侧是肿瘤节块在腹腔内的分布；肿瘤主要聚集在肠系膜内、网膜上以及膈膜上。图1的右侧示出绿色荧光的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的微粒在散布在整个腹腔的肿瘤节块上的聚集。使用若丹明或吖啶橙标记相同PLGA微粒所进行的类似研究得出相似的结果。相反，给药溶液形式的这些荧光染料(即，没有结合在微粒上)不表现出在肿瘤组织上的聚集，表明所述聚集是微粒的独特性能。该性能是有利的，因为其提供了活性肿瘤靶向作用。
总结。基于这些发现，申请人确定，与溶液形式的试剂相比(例如，不伴随颗粒)，负载在PLGA微粒上的试剂优先保留在腹腔内；通过淋巴管引流，由50:50LA:GA构成的微粒缓慢地从腹腔中排放；与大颗粒(~30μm的直径)相比，小颗粒(~3μm的直径)更均匀地分布在腹腔内；与具有较高Tg的PLGA颗粒相比，具有较低Tg的PLGA颗粒优先聚集在腹腔内；颗粒尺寸决定经由淋巴管引流的清除和/或经由腹膜的吸收；以及PLGA微粒(~3μm的直径，50:50LA:GA)优先集中在腹腔内的肿瘤节块上。
实施例4
负载帕利他西的PLGA微粒
该实施例示例负载帕利他西的PLGA微粒的制备和表征方法。PLGA微粒是由各种比例的乳酸或丙交酯和乙醇酸或乙交酯构成的共聚物。该实施例进一步示例微粒性能对从微粒释放药物的影响，以帮助发现提供所需药物释放速率的PLGA微粒。帕利他西用作负载在微粒上的药物的实例。相似的步骤可用于在这些微粒上负载其它药物或试剂。
制备方法。申请人使用乳化/蒸发方法制备负载帕利他西的PLGA微粒。简言之，对于水包油包水(W/O/W)的双乳化法，将PLGA和帕利他西共溶解在5ml的二氯甲烷中。通过匀浆化30秒将该溶液乳化在1ml水中，并加入20ml的1%聚乙烯醇(PVA)溶液中。对于水包油(O/W)乳化法，将药物-聚合物溶液直接加入20ml的1%PVA溶液中。对于两种方法，在于38℃预热的500ml的0.1%PVA溶液中稀释所得的乳液，连续搅拌直至结束溶剂蒸发。30分钟后，通过离心收集微粒，水洗三次，低压冻干。
为了确定药物载荷，将微粒溶解在乙腈中。加入内标物三尖杉宁碱(cephalomannine)(100μl的20μg/ml甲醇)。在空气流中干燥该混合物。将残余物重新溶解在0.1ml的乙腈中，然后加入0.1ml的水。离心后，使用高效液相色谱法分析上清液的帕利他西浓度。相似地处理由空白PLGA微粒和已知量的帕利他西的混合物构成的参照样品。负载药物的微粒的上清液中的帕利他西浓度与参照样品中的帕利他西浓度的比率表示药物载荷。
表征。使用扫描电镜研究负载帕利他西的PLGA微粒的表面形态和内部结构。微粒呈球形且表面光滑。使用O/W方法制备的微粒(批次2)表示出均相的、充填内部结构，而使用O/W/O方法(批次3)制备的微粒表现出多孔、多区域内部结构。表1示出负载帕利他西的微粒的特性。
鉴定产生所需药物释放速率的PLGA微粒的性能。申请人评估了微粒性能与含有0.1%的Tween80的37°C的磷酸盐缓冲盐水中帕利他西的释放之间的关系。下面示出的结果表明，从微粒释放帕利他西的速率和程度可以通过改变微粒的性能而很好地调整。
PLGA颗粒尺寸的影响。释放速率和程度与微粒尺寸是反向相关的。例如，对于使用50:50摩尔比的LA:GA制备的微粒，直径为~4μm的批次8与具有~30μm的更大直径的批次6相比表现出更高水平的释放。相似地，仅仅在尺寸上与批次2不同的批次8(直径为~3vs~60μm)表现出更为快速的释放。与大微粒相比，较小的微粒具有较高的表面积-体积比。表面积的增大导致帕利他西更大程度地暴露至水性介质，导致更大的初始突然释放。而且，较小的微粒具有较短的扩散路径长度，导致更快速的药物释放和基质降解。
PLGA微粒内部结构的影响。与具有充填结构的微粒相比，具有多孔多区域结构的微粒表现出更高的释放速率。这很可能是由于多区域微粒中较短的扩散路径长度导致的。例如，以50:50LA:GA作为载体，与具有充填内部结构的微粒相比，具有多区域结构的微粒表现出更高水平的初始释放(即，批次7vs批次6)。同样地，以75:25LA:GA作为载体，与具有充填内部结构的微粒相比，具有多区域结构的微粒表现出更快速的释放(即，批次3vs批次2)。
PLGA微粒的特性粘度的影响。由聚合物的分子量决定的特性粘度与释放速率反向相关。例如，使用W/O/W制备批次3和7，它们具有相同的颗粒尺寸。表现出更高的特性粘度的批次3释放帕利他西的速率要慢3.5倍。
PLGA微粒的聚合物构成的影响。用50:50LA:GA制备的微粒比用75:25LA:GA制备的微粒表现出更高的释放速率。这很可能是因为50:50LA:GA微粒是更加无定形的(即，较低的结晶性)。由于其低的水溶性，流体扩散进入或离开微粒在从微粒释放帕利他西方面发挥作用。结晶性的降低改善了流体向微粒内的扩散。改善的流体扩散还加速了聚合物的降解，导致更快的药物释放(Alonso,et al.,Vaccine,12:299-306,1994)。
实施例5
进入肿瘤的负载帕利他西的PLGA微粒
该实施例示例了具有不同药物释放形式的微粒制剂混合物的用途，其中一种制剂迅速释放帕利他西(例如，24小时内)以诱导细胞凋亡，从而改善PLGA微粒进入肿瘤。
微粒进入腹膜肿瘤。在小鼠腹膜内植入人Hs766T胰腺异体移植肿瘤细胞。当腹膜内的肿瘤生长时(第21天)，用一定剂量的负载帕利他西的微粒(直径为~3μm)治疗该动物，该微粒使用吖啶橙标记，用于方便地检测颗粒进入肿瘤内。这些微粒快速释放帕利他西(24小时内~70%)，从而诱导细胞凋亡，这进而促进微粒进入肿瘤。使用由相同方法但是不采用帕利他西制备的空白微粒治疗另一组动物。在第24天，获得网膜和粘附的肿瘤。网膜是分离腹腔和腹膜后腔的韧带，且是小鼠和人患者体内肿瘤聚集的位置。冷冻肿瘤并切片。通过荧光显微术确定在肿瘤不同深度处的颗粒进入，该方法可以看到吖啶橙标记的颗粒。图2示出结果。大量的颗粒进入，且在实体瘤内均匀分布。相反，使用空白微粒治疗来自动物的肿瘤，而不使用帕利他西进行肿瘤激活治疗，微粒保留在肿瘤周围。
腹膜肿瘤内帕利他西的浓度。在IP滴注负载帕利他西的微粒(批次8)或
Figure BDA00001776645800331
后，申请人对比了位于网膜上的实体瘤内的帕利他西浓度。与可购得的
Figure BDA00001776645800332
制剂(3.2μg/g，在第24小时获得)相比，来自微粒的峰值帕利他西浓度明显更高(13μg/g)，且在稍后的时间(即，3天)实现。这些浓度是自由药物和包埋药物的总浓度。使用线性梯形法则计算的微粒的浓度-时间曲线下面的面积(其是总药物暴露量的指标)高出16倍(82vs 5μg-天/g)，表明负载帕利他西的PLGA微粒具有显著的肿瘤靶向优点。
实施例6
负载帕利他西的PLGA微粒的生物活性
该实施例表明，在生物体外和生物体内，负载帕利他西的PLGA微粒是具有生物活性的。在包裹在微球中之后，帕利他西的生物活性没有变化。而且，负载帕利他西的PLGA微球由于其肿瘤靶向性能和其在肿瘤内的持续保留性，比可购得的制剂在生物体内表现出更高的功效。
体外生物活性。使用人卵巢SKOV3癌细胞进行该研究。使用磺基若丹明B分析确定药物效应(Au,et al.,Cancer Chemother.Pharmacol.,41:69-74,1997)。在治疗96小时后，该研究比较了水溶液中的自由帕利他西(即，帕利他西溶解在培养基质中)和四种负载帕利他西的PLGA微粒制剂(即，表1中的批次2、4、6和8)的浓度响应曲线。四种制剂的生物活性的级别次序与药物释放速率的级别次序相同，其中速释制剂的活性更高。例如，在96小时内释放81.5%的批次8的活性最高，然后是释放28.5%的批次6和释放10.9%的批次4。释放0.25%的批次2没有细胞毒性作用。50%细胞毒性所需的浓度分别是5.0、18.5、108和>1000nM。
体内生物活性。申请人比较了帕利他西PLGA微粒和可购得的制剂的抗肿瘤活性。对微粒，剂量是120mg/kg帕利他西当量，对剂量是40mg/kg帕利他西当量。在这些剂量下，这两种制剂是毒性相当的(equi-toxic)，在两天之内产生约10%的体重减轻，之后，动物恢复体重。所述微粒由三种制剂构成，一种快速释放帕利他西(批次8，70.5％，在1天内)，其它两种缓慢释放帕利他西(批次6，72.6%，在49天内，以及批次4，28.7％，在49天内)。实施例2中更为详细地描述了颗粒性能。结果表明，微粒具有明显的存活优势，对于赋形剂治疗的对照组，平均存活时间是47天，对于
Figure BDA00001776645800341
组是85.5天，对于微粒组是15.5天(
Figure BDA00001776645800342
和微粒之间的差值p<0.01)。注意，该研究在晚期疾病(植入后4周)中进行，使用具有不同尺寸(约3-4μm和约30μm)的两种缓释微粒的组合。
在携带腹膜晚期胰腺癌的动物中获得相似的结果。对小鼠植入了IP人胰腺Hs766T肿瘤。在肿瘤生长后，在肿瘤植入后的第10天，使用生理盐水、
Figure BDA00001776645800343
(60mg/kg)或帕利他西颗粒(快释和两种缓释制剂的组合)治疗动物。平均存活时间分别是24、33和57天。空白微粒显示出与盐水控制相似的数据。
给药两种制剂后的血浆和组织浓度。使用高效液相色谱法测定血浆和腹膜内组织的帕利他西浓度，使用线性梯形法则计算从0-168小时的浓度-时间曲线下的面积(area-under-the-concentration-time curve,AUC)。结果如表2所示，结果表明，与
Figure BDA00001776645800344
相比，给药负载在PLGA微粒内的帕利他西在腹膜组织内产生高出2.5-6倍的浓度。同时，血浆浓度只升高1.5倍，表明使用帕利他西微粒的优先组织靶向。
表2
在腹膜内给药毒性相当的剂量配制成微粒(120mg/kg)或
Figure BDA00001776645800345
(40mg/kg)的帕利他西后，血浆和腹膜内组织中的帕利他西浓度
使用线性梯形法则计算AUC0->168小时
*血浆AUC＝(μg/ml·hr)
**腹腔灌洗AUC＝(初始剂量的百分比·hr)
该研究使用单独的和毒性相当剂量的微粒和
Figure BDA00001776645800347
借助这一标准，微粒的帕利他西当量剂量比
Figure BDA00001776645800351
的剂量高。这是因为药物的持续释放降低了剂量强度，因此，降低了毒性并增大了最高耐药剂量。尽管重复给药很可能会提高该组中的治疗效果，但是不需要重复给药帕利他西微粒。后者代表微粒的优势之一，其减少了频繁计量的需要。
实施例7
负载帕利他西的明胶纳米颗粒的制备和表征
该实施例示例负载帕利他西的明胶纳米颗粒的制备和表征。
负载帕利他西的明胶纳米颗粒的制备。使用具有不同Bloom数s(75-100、175和300)的明胶并使用解溶剂化方法制备纳米颗粒(Oppenheim,R.C.,Int.J.Pharm.,8:217-234,1981)。将明胶(200mg)溶解在含有2%Tween 20的10ml水中。将该溶液加热至40°C并持续以300rpm搅拌。向该溶液中缓慢加入2ml 20%的硫酸钠水溶液，然后加入1ml含有2mg帕利他西的异丙醇。加入另一等份的硫酸钠溶液(5.5-6ml)直至溶液变浑浊，表明形成明胶聚集体。然后加入约1ml蒸馏水直至溶液变清。加入戊二醛的水溶液(25%,0.4ml)，使明胶交联。5分钟后加入偏亚硫酸钠溶液(12%,5mi)以终止交联反应。1小时后，在Sephadex G-50colμmn柱上纯化粗产物。在冷冻干燥器中冻干含纳米颗粒的级分48小时以上。
涂布聚赖氨酸和负载帕利他西的明胶纳米颗粒的制备。使用与未涂布的纳米颗粒相似的方法制备纳米颗粒。在形成纳米颗粒后的交联反应的后期，加入重量相当于约5%-约10%的明胶重量的聚赖氨酸，得到涂布聚赖氨酸的纳米颗粒。纯化步骤与上述用于未涂布纳米颗粒的步骤相同。
明胶纳米颗粒中的帕利他西载荷的测定。将2mg负载帕利他西的纳米颗粒分散在0.5ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，使用0.5ml链霉蛋白酶(1mg/ml，在PBS中)在代谢振动器中于37°C消化。约1小时后或当获得透明溶液时，加入内标物三尖杉宁碱(50μl 20μg/ml甲醇)，然后用两份每份3ml的乙酸乙酯萃取。倾出乙酸乙酯层，在空气流下干燥，重新溶解在乙腈中。比较萃取液中的帕利他西浓度和参照样品中的帕利他西浓度，以确定帕利他西载荷。按照上述用于纳米颗粒的方法处理由空白明胶纳米颗粒和已知量的帕利他西构成的参照样品。
表3示出帕利他西纳米颗粒的不同制剂的物理性能。纳米颗粒的产率为40-82%，且随明胶分子量的降低而下降。实际药物载荷是理论载荷的33-78%。
表3
负载帕利他西的明胶纳米颗粒的负载效率
Bloom数越大表明分子量越高(3种制剂的平均
Figure BDA00001776645800361
标准偏差)
Figure BDA00001776645800362
*产率是在制备和凝胶过滤后冷冻干燥的明胶纳米颗粒的重量，用与明胶初始重量的百分比表示。
使用高分子量明胶制备的纳米颗粒形成大聚集体；聚集体的直径为10μm至>30μm。在柱色谱纯化步骤中除去这些聚集体导致低产率和低的药物包埋效率(entrapment efficiency)。在使用低分子量明胶制备的纳米颗粒中也观察到低的包埋效率。使用中等分子量明胶(175bloom)获得最佳和最高产率以及包埋效率。随后的研究使用175bloom的明胶制备负载帕利他西的纳米颗粒。
负载帕利他西的纳米颗粒的表征。将明胶纳米颗粒和蒸馏水(~50μl)的混合物放置在箔纸上，干燥，涂布金并在Philips XL 30扫描电镜(SEM)上观察。为研究颗粒尺寸分布，使用从4-6个区域取出的SEM图像研究1000个以上的纳米颗粒。由冷冻干燥的明胶纳米颗粒的重量计算产率，并用与明胶的初始重量的百分比表示。SEM结果表明，纳米颗粒是球形的，平均尺寸为600-1,000nm。
使用Scintag PAD-V衍射仪获得纯帕利他西、帕利他西(2％，重量%)与空白明胶纳米颗粒的混合物以及负载帕利他西的纳米颗粒(1.62%载荷)的广角X射线衍射(WAXD)光谱。以1°/min的扫描速率在5°-60°扫描样品。WAXD结果示出自由帕利他西、帕利他西和空白明胶纳米颗粒的混合物的X射线衍射光谱中出现锐峰，但是负载帕利他西的明胶纳米颗粒不出现。这表明，包埋在纳米颗粒中的帕利他西以无定型状态而不是结晶状态存在。由于其快速的溶解速率，无定型状态是需要的。
从明胶纳米颗粒释放帕利他西。将帕利他西纳米颗粒(12mg)分散在100ml PBS中并在37°C下培养。取出一系列样品(1ml)，使用Beckman L-70超离心机以40,000rpm离心15分钟。取出400μl不含纳米颗粒的上清液，并用3ml乙酸乙酯萃取两次。通过高效液相色谱法分析乙酸乙酯萃取液的帕利他西浓度。
吸附研究结果表明，约4.5%的负载在纳米颗粒上的帕利他西总量吸附在纳米颗粒上。从纳米颗粒上释放帕利他西进入PBS是迅速的，在37°C下，在15分钟、2小时和3小时后分别释放55%、87%和92%。
负载帕利他西的纳米颗粒的生物活性。从American Type CultureCollection(Rockville,MD)中获得人RT4膀胱移行膀胱癌细胞，并在McCoy's基质中在37°C和在空气中含5%的CO2的潮湿气氛中培养，所述基质中补充有9%胎牛血清、2mM L-谷酰胺、90μg/ml庆大霉素(gentamicin)和90μg/ml头孢噻肟钠。使用胰岛素从分汇合培养基获得细胞并再次悬浮在新鲜基质中。使用通过锥虫蓝排除法(trypan blue exclusion)测定的具有大于90%存活率的细胞。在96孔(well)的微孔滴定板(~2,000细胞/孔)上种植细胞，使其粘附在板表面24小时。申请人已经指出，帕利他西产生即时和延迟的细胞毒性(Au,et a/.,Cancer Res.,58:2141-2148,1998)。为进行即时作用评估，用0.2ml培养基培养细胞48和96小时，所述培养基含有具有相等的帕利他西剂量的帕利他西(称作自由帕利他西)或负载帕利他西的颗粒的水溶液的等分试样。治疗后立即测量药物效应。为进行延迟作用评估，相似地处理细胞15分钟和2小时，用PBS洗涤一次，然后用不含药物的基质培养总计96小时，此时测量药物效应。
对于自由药物，通过首先在乙醇中溶解帕利他西，然后使用培养基连续稀释来制备帕利他西的储备溶液。最终乙醇浓度小于0.1%。
使用磺基若丹明B分析测量治疗后剩余的细胞数目(Au,et al.,CancerChemother.Pharmacol.,41:69-74,1997)。使用非线性回归，分析S型浓度响应曲线获得产生50%的抑制率的药物浓度(IC50)。
对即时作用，使用自由帕利他西或纳米颗粒包埋的帕利他西导致在48小时60%的最大抑制率和在96小时84%的最大抑制率。最大帕利他西细胞毒性随治疗时间的增加与申请人以前的观察结果是一致的(Au,et al.,CancerRes.,58:2141-2148,1998)。针对48和96小时的治疗，自由帕利他西的IC50值分别为1.0±0.4和4.0±0.4nM，负载帕利他西的纳米颗粒的IC50值为9.6±1.1和4.0±0.3nM帕利他西当量(平均值±两种制剂的三次试验的SD(标准偏差))。两种制剂的IC50差值并不明显(不成对的t-试验，48小时p=0.15，且96小时p=0.71)。
对延迟作用(即，在96小时测量的作用)，使用自由帕利他西或纳米颗粒包埋帕利他西治疗15分钟和2小时产生74%-85%的最大抑制率。对于15分钟和2小时的治疗，自由帕利他西的IC50分别值为156.7±6.6和33.0±4.8nM，负载帕利他西的纳米颗粒的IC50值为165.7±33.5和31.4±1.8nM帕利他西当量(平均值±两种制剂的三次试验的SD)。两种制剂的相应IC50值的差值也不明显(不成对的t-试验，15分钟，p=0.70，2小时，p=0.64)。该数据表明从纳米颗粒快速释放帕利他西且负载帕利他西的纳米颗粒与溶解在乙醇和水中的自由帕利他西(不存在克列莫佛)是同等有效的。
实施例8
在膀胱内滴注负载帕利他西的明胶纳米颗粒后递送高浓度的帕利他西 至膀胱壁
该实施例表明，当滴注到膀胱腔内时，负载帕利他西的明胶纳米颗粒递送高浓度的帕利他西至膀胱壁。
如同其它部分所述，在滴注负载帕利他西的明胶纳米颗粒后，确定帕利他西向膀胱壁的递送(Wientjes,et al.,Cancer Res.,51:4347-4354,1991;Song,D.,et al.,Cancer Chemother.Pharmacol.,40:285-292,1997)。简言之，在2小时内将负载帕利他西的明胶纳米颗粒的溶液(在总重250mg中含有1mg帕利他西)滴注在被麻醉的狗的膀胱。之后，取出膀胱，快速冷冻，使用低温切片机平行于膀胱上皮表面将其切成40μm的切片。称重后，如上所述，使用高效液相色谱法分析冷冻组织样品的帕利他西浓度(Song and Au,J.Chromatogr.,663:337-344,1995)。结果表明膀胱壁中的帕利他西浓度从膀胱上皮(即，膀胱的内表面)的约50μg/g(约等于60μm)降低至在距离膀胱上皮500μm深处为约1μg/g，且在大于500μm的组织深度处保持约0.5μg/g相对恒定。膀胱上皮的浓度超过尿液中的游离浓度约20倍，表明帕利他西进入膀胱壁的效果良好。这些组织浓度还超过在人膀胱RT4癌细胞中产生细胞毒性的帕利他西浓度(即，对于2小时处理，~33nM，见实施例1)。
通过在2小时的治疗结束后和在计量溶液排出后24小时(即，从计量给药24小时)分析膀胱组织浓度，研究在其它狗中，在给药明胶纳米颗粒后的帕利他西组织保留性。膀胱上皮中的帕利他西浓度为0.14μg/g(约165nM)，在500μm深度处缓慢下降至0.01μg/g。该数据表明在膀胱组织中帕利他西的显著保留性；药物消失的半存留期估计为~150分钟，该时间比丝裂霉素C在人膀胱组织中的小于5分钟的半存留期大30倍(Wientjes,et al.,Cancer Res.,53:3314-3320,1993)。
实施例9
负载帕利他西的明胶纳米颗粒在来自狗患者的膀胱肿瘤的组织培养基 (histocultures)中的功效
通过经尿道切除从被诊断患有膀胱癌的三只狗患者的膀胱中获得膀胱肿瘤。将肿瘤切成1mm的片，在作为组织培养基的胶原凝胶上培养(Au,et al.,Cancer Chemother.Pharmacol.,41:69-74,1997)，用负载帕利他西的纳米颗粒治疗2小时。用帕利他西当量表示的、对于溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine)标记的抑制率—IC50值，在来自其中一只狗的肿瘤中是2.2μm，在来自另两只狗的肿瘤中是>10μm。
三向比较IC50、膀胱组织中的药物浓度(见实施例8)以及对这三只狗的临床结果(见实施例10)表明，具有最敏感的肿瘤(即，最低IC50值)且因此将接受足够的药物以产生治疗益处的狗有利地响应使用负载帕利他西的纳米颗粒的治疗，其中肿瘤尺寸减小50%以上。相反，另两只狗中的IC50超过可获得的膀胱组织浓度，这些动物中的肿瘤表现出发展的疾病(即，尺寸增大50%以上(Helfand,et al.,J.Am.Anim.Hosp.Assoc.,30:270-275,1994)。
该实施例显示膀胱肿瘤对配制在明胶纳米颗粒中的帕利他西的敏感性以及生物体外和生物体内结果的相关性。值得注意，人浅表性膀胱肿瘤中的帕利他西的IC50值低于狗中的相应值，且作为直接膀胱内滴注的参加者的人患者中的膀胱肿瘤是浅表的，没有进入膀胱壁的粘膜层。对于从人患者得到的T0和T1膀胱肿瘤阶段，申请人以前获得的人膀胱肿瘤的IC50值是1.2μm(calculated from data in Au,et al.,Cancer Chemother.Pharmacol.,41:69-74,1997)。这表明人患者的临床结果好于狗。
实施例10
负载帕利他西的明胶纳米颗粒在患有膀胱癌的狗患者中的功效
具有膀胱的移行细胞癌(TCC)和没有转移酶证据的狗是合格的。在常用的麻醉条件下，存在于20ml盐水中的1mg负载帕利他西的明胶纳米颗粒悬浮液经由Foley导管静脉给药，每周一次，持续三周。剂量是250mg明胶中1mg帕利他西。所有患者都接受预防性抗生素和地拉考昔(deracoxib)。在2小时治疗之前和期间收集血液和尿液样品。通过柱交换HPLC分析尿液和组织的帕利他西浓度。使用腹部超音波扫描监控肿瘤响应。
治疗六只狗；四名患者以前没有接受过治疗。在所有时间点，血浆浓度都低于HPLC检测极限。平均初始和最终尿液浓度分别是27.51±8.59g/ml(n＝16)和1.16±8.63g/ml(n＝15)。游离帕利他西的浓度恒定地保持在0.8-1μg/ml，该值约是帕利他西在体温下的最大水溶性。整体响应是2个部分响应，2名患者患有稳定的疾病(即，没有部分响应和发展的疾病)，2名患者患有发展的疾病；实施例9中描述了临床响应或效果的定义。没有有关系统药物吸收或毒性的证据。患者的目标响应速率为2/6(33%)，高于在用于使用其它化学治疗剂进行静脉治疗的文献中报道的响应速率(12.5%)(0-20%的范围，平均12.5%；Mutsaers,et al.,J.Vet.Intern.Med.,17:136-144,2003)。
实施例1
静脉给药后明胶纳米颗粒的肾脏靶向
通过对比负载帕利他西的明胶纳米颗粒的分布与可购得的
Figure BDA00001776645800401
制剂的分布，研究明胶纳米颗粒的肾脏靶向优势。制备明胶纳米颗粒并在1分钟内经由尾部小静脉静脉给药至小鼠。帕利他西剂量是10mg/kg。24小时后对动物实施无痛致死。取出器官，均质化，萃取，并使用高效液相色谱法分析帕利他西浓度。如实施例7中所述实施这些步骤。纳米颗粒(664nm的直径，4%的载荷)快速释放帕利他西(于37°C下24小时内释放70%)。血液中的帕利他西(自由和游离)总浓度下降，主要半存留期为14小时。帕利他西分布和保留在器官中，以最高水平保留在肝脏、小肠和肾脏中(表4)。组织-血液浓度比的顺序为：肝脏>小肠>肾脏>>大肠>脾脏=胃>肺>心脏。这与
Figure BDA00001776645800402
的分布不同，的分布具有以下顺序的组织分布：肝脏>小肠>大肠>胃>肺≥肾脏>脾脏>心脏。计算选择保留性，作为给药纳米颗粒后组织浓度的比或者作为校正血浆浓度后的(表4)。在肾脏中的选择保留性是7.86倍，是所有器官中最高的。在给药纳米颗粒后肾脏中的帕利他西浓度的最终半存留期为13.7小时，与给药
Figure BDA00001776645800412
后的1.94小时相比。该数据表明，明胶纳米颗粒优先保留在肾脏内。
表4
由明胶纳米颗粒制剂和克列莫佛/乙醇(即，
Figure BDA00001776645800413
)制剂递送的帕利他西的血液和组织药物动力学。给予小鼠静脉剂量(10mg/kg帕利他西当量)的负载帕利他西的纳米颗粒或溶解在克列莫佛和乙醇中的帕利他西。研究从给药后5分钟-24小时的9个时间点。每个时间点使用三只动物。在0-24小时计算浓度-时间曲线下的面积(AUC)。C组织∶C血液的比率是所有9个时间点的平均值。
Figure BDA00001776645800414
等同方案
本领域的普通技术人员应当认识到可以不仅仅使用常规试验手段和与这里具体描述的本发明的许多等同方案。权利要求书试图涵盖这些等同方案。

Claims (34)

1.一种用于治疗肿瘤的试剂盒，包括：
(a)在可药用载体中的细胞凋亡诱导剂；
(b)在可药用载体中的肿瘤治疗剂；以及
(c)使用所述细胞凋亡诱导剂和所述治疗剂治疗肿瘤的说明。
2.权利要求1的试剂盒，其中所述肿瘤治疗剂包括：
(a)肿瘤细胞凋亡诱导剂的快释制剂；
(b)肿瘤治疗剂的缓释制剂；以及
(c)可药用载体。
3.权利要求1的试剂盒，其中单一的一种或多种纳米颗粒或微粒制剂包括所述快释制剂(a)和缓释制剂(b)两者。
4.权利要求1的试剂盒，其中所述治疗剂是一种或多种帕利他西或阿霉素。
5.一种将一种或多种细胞凋亡诱导剂或肿瘤治疗剂递送至具有肿瘤的患者的组合物，包括：
选择性地粘附至肿瘤的一种或多种纳米颗粒或微粒，其用于将治疗剂递送至肿瘤附近；从而，与在所述的没有选择性地粘附至肿瘤的一种或多种纳米颗粒或微粒中的递送相比，实现所述治疗剂在肿瘤中的更高水平的聚集。
6.一种将肿瘤治疗剂递送至具有肿瘤的患者的组合物，其包括：
诱导至少部分肿瘤细胞凋亡的一种或多种纳米颗粒或微粒，用于进入肿瘤和释放肿瘤治疗剂。
7.权利要求6的组合物，其中所述一种或多种纳米颗粒或微粒粘附至所述肿瘤。
8.权利要求6的组合物，其中所述一种或多种纳米颗粒或微粒包含细胞凋亡诱导剂和所述肿瘤治疗剂。
9.权利要求7的组合物，其中组织粘附性已经通过使用生物粘附涂层涂布一种或多种纳米颗粒或微粒而增大。
10.权利要求9的组合物，其中所述生物粘附涂层是下述一种或多种：聚赖氨酸、纤维蛋白原、部分酯化的聚丙烯酸聚合物、多糖、果胶，或硫酸化蔗糖和氢氧化铝的混合物。
11.一种含帕利他西的微球的组合物，包括以下一种或多种：
(1)直径为约3-5μm的粘附肿瘤的微粒，其提供细胞凋亡诱导剂的速释；
(2)直径为约3-5μm的粘附肿瘤的微粒，其提供治疗剂的缓释；
(3)直径为约30-50μm的微粒，其提供治疗剂的缓释。
12.一种含有肿瘤治疗剂的微粒的组合物，包括：
在一种或多种以下物质中配制肿瘤治疗剂：
(a)适于形成直径大于约10μm的聚集体的微粒，其中在递送所述微粒进入腹腔时形成聚集体；或者
(b)直径大于约10μm的微粒，
其中一种或多种聚集体或微粒经由淋巴系统的清除被延迟。
13.权利要求12的组合物，其中含有肿瘤治疗剂的微粒包括由约50%丙交酯和约50%乙交酯构成的PLGA，且尺寸为约3-5μm。
14.一种组合物，包括：
含有肿瘤治疗剂的一种或多种纳米颗粒或微粒，所述一种或多种纳米颗粒或微粒具有以下组合性能：
(1)提供药物的速释，然后是药物的缓释；
(2)选择性地粘附至肿瘤组织；以及
(3)集中在腹腔。
15.一种适于静脉滴注至患有浅表性膀胱癌的患者的膀胱壁中的帕利他西组合物，包括：
在不含克列莫佛的制剂中的滴注液剂量的帕利他西。
16.权利要求15的组合物，其中所述帕利他西制剂包含在交联的明胶纳米颗粒中。
17.一种治疗膀胱疾病的组合物，包括：
包含在交联的明胶纳米颗粒中的有效量的帕利他西，该纳米颗粒上涂布由生物粘附涂层。
18.权利要求17的组合物，其中所述生物粘附涂层是下述一种或多种：聚赖氨酸、纤维蛋白原、部分酯化的聚丙烯酸聚合物、多糖、果胶或硫酸化蔗糖和氢氧化铝的混合物。
19.一种用于治疗具有限定尿液容量的膀胱中的膀胱疾病的组合物，包括：
含有难溶于尿液的治疗剂的明胶纳米颗粒，治疗剂的剂量超过治疗剂在所述限定体积中的溶解度。
20.权利要求19的组合物，其中所述膀胱疾病是以下一种或多种：膀胱癌、间质性膀胱炎、尿失禁或尿路感染。
21.权利要求19的组合物，其可直接注射到膀胱中。
22.权利要求19的组合物，其中所述治疗剂包含帕利他西。
23.权利要求22的组合物，其中所述帕利他西与共溶剂组合。
24.权利要求23的组合物，其中所述共溶剂是二甲基亚砜或聚乙二醇中的一种或多种。
25.一种用于治疗在腹腔、膀胱组织、脑组织、前列腺组织或肺组织中的或与其相邻的一种或多种组织中的肿瘤的组合物，包括：
一种或多种负载有肿瘤药物的纳米颗粒或微粒，其中所述一种或多种纳米颗粒或微粒由一种或多种明胶或聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)形成。
26.权利要求25的组合物，其中所述肿瘤药物包括帕利他西。
27.权利要求25的组合物，其中所述一种或多种纳米颗粒或微粒上涂布有生物粘附剂。
28.权利要求25的组合物，其中所述一种或多种纳米颗粒或微粒包括快释肿瘤药物制剂和缓释肿瘤药物制剂。
29.权利要求28的组合物，其中PLGA微粒的所述缓释制剂包括约50:50LA:GA，具有30-50μm的平均直径和低于体温的玻璃化转变温度，含有约4%的帕利他西，在第一天内表现出约20%的初始突然药物释放速率，然后缓释，在约7周内产生约70%的总累积释放。
30.权利要求28的组合物，其中PLGA微粒的所述缓释制剂包含75:25LA:GA，具有3-5μm的平均直径和高于体温的玻璃化转变温度，含有约4%的帕利他西，在第一天内表现出约5%的初始突然药物释放速率，然后缓释，在约7周内产生约30%的总累积释放。
31.权利要求28的组合物，其中PLGA微粒的所述快释制剂包括约50:50LA:GA，具有3-5μm的平均直径和低于体温的玻璃化转变温度，含有约4%的帕利他西，在约一天内表现出约70%的药物释放速率。
32.权利要求29的组合物，其中PLGA微粒的所述快释制剂包括约50:50LA:GA，具有3-5μm的平均直径和低于体温的玻璃化转变温度，含有约4%的帕利他西，在约一天内表现出约70%的药物释放速率。
33.权利要求30的组合物，其中PLGA微粒的所述快释制剂包括约50:50LA:GA，具有3-5μm的平均直径和低于体温的玻璃化转变温度，含有约4%的帕利他西，在约一天内表现出约70%的药物释放速率。
34.权利要求28、29、30、31、32和33中任一项的组合物，其额外包括释放增强剂，所述释放增强剂是以下一种或多种：Tween 20、Tween 80、肉豆蔻酸异丙酯、β-乳糖或苯二甲酸二乙酯。
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