KR100849911B1 - 종양-표적화 약물-로딩된 입자 - Google Patents

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Abstract

환자에게 종양 치료제를 전달하기 위한 조성물은 종양 세포자멸사 유도제의 신속-방출성 제제, 종양 치료제의 서방성 제제, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 약학적으로 허용가능한 담체중 세포자멸사-유도제를 미리 또는 동시에 투여할 수 있다. 치료제의 나노입자 또는 미립자(예: 가교결합된 젤라틴)도 사용할 수 있다. 나노입자 또는 미립자를 생체 결합성 코팅으로 코팅시킬 수 있다. 응집되어 방광의 림프관 입구를 폐색시킴으로써 림프계를 통한 미립자의 제거를 지연시키는 미소구도 사용할 수 있다. 본 발명은 또한 약물-로딩된 젤라틴 및 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)(PLGA) 나노입자 및 미립자를 사용하여 복강, 방광 조직 및 신장의 종양으로의 약물 전달을 표적화시킨다.
종양 세포자멸사 유도제, 파클리탁셀, PLGA, 종양 표적화, 약물-로딩된 미립자, 복막암, 방광암.

Description

종양-표적화 약물-로딩된 입자{TUMOR-TARGETING DRUG-LOADED PARTICLES}
암의 성공적인 화학요법은 환자에게 허용될 수 없는 독성을 야기하지 않으면서 충분한 농도의 효과적인 약물을 종양 세포에 전달해야 한다. 본 발명은 종양을 표적화하도록 디자인된 약물-로딩된 두가지 입자를 기재한다. 제 1 입자는 복강으로 복강내 투여되는, 복막암을 치료하기 위한 약물-로딩된 미립자이다. 이들 입자는 또한 다른 종양-함유 기관에 국부 투여될 수 있다. 제 2 입자는 방광 강으로 방광내 투여되는, 방광암의 방광내 치료를 위한 약물-로딩된 나노입자이다. 나노입자는 또한 신장을 표적화하도록 전신 투여될 수 있다.
본원은 2003년 4월 3일자로 출원된 미국 특허 가출원 제 60/460,827 호(발명의 명칭: "조직으로의 치료제 전달을 향상시키기 위한 파클리탁셀(paclitaxel)-로딩된 입자")에 대해 우선권을 주장한다. 본원 전체에 인용된 모든 특허, 특허출원 및 참조문헌의 내용은 본원에 참고로 포함된다.
정부가 지원한 연구
본 발명은 부분적으로는 미국 건강 복지부(United States Department of Health and Human Services)로부터 지원을 받았다(승인번호 R37CA49816).
약물- 로딩된 미립자
복강 내에 위치하는 기관으로부터 다양한 유형의 암, 예컨대 췌장암, 간암, 직장결장암 및 난소암이 발병한다. 복강은 또한 질환의 후기 단계 동안 복강 외부의 기관으로부터 발병된 암, 예컨대 폐암의 전이 부위이기도 하다. 복강 내에서, 종양은 골반 및 복막 표면, 다른 복막 기관, 예컨대 창자사이막, 방광, 그물막, 횡경막, 림프절 및 간에서 발견될 수 있다. 종양 세포에 의해 횡경막 또는 복부 림프를 통한 배출이 폐색되면 복막액의 유출을 감소시켜 암종증 또는 복수를 야기한다.
약물을 직접 복강 내로 점적 주입하는 복강내 화학요법을 이용하여 복막암, 예를 들어 진행성 난소암 및 결장암을 치료하였다[오토(Otto, S. E.), J Intraven . Nurs., 18: 170-176, 1995; 콜린스(Collins, J. M.), J. Clin Oncol, 2: 498-504, 1984]. 백금화된 화합물, 예컨대 시스플라틴 및 탁솔(Taxol; 등록상표)(시판중인 파클리탁셀의 제제)을 복강내 투여하여 환자에게서 몇 가지 이점을 창출하였고 생존시간을 약 20%까지 연장시켰다[가두치(Gadducci) 등, Gynecol Oncol, 76:157-162, 2000; 마크맨(Markman) 등, J Clin Oncol, 19: 1001-1007, 2001]. 그러나, 복강내 화학요법은 그의 사용을 제한하는 다음과 같은 단점을 갖는다: 복강내 치료제는 통상 6회 치료시 매 3주 동안 유치 카테터를 통해 투여된다. 두가지 주요한 부작용은 카테터의 장시간 사용에 수반되는 감염증 및 복강내에 높은 약물 농도를 제공함으로 인한 복통이다[프랜시스(Francis) 등, J Clin Oncol, 13: 2961-2967, 1995]. 또한, 복강내 투여하기 위해서는 입원해야 하고, 상당한 비용이 필요하다. 이러한 이유로 인해, 복강내 치료의 입증된 생존상의 이점에도 불구하고 의료계에 서 복강내 치료의 이용을 꺼린다. 본 발명은 이들 다양한 결함을 극복한다.
이전 발명(미국 특허출원 제 09/547,825 호)에서, 본 출원인은 국소(regional) 복강내 요법에서 그러한 것처럼 항암제(예: 파클리탁셀, 독소루비신)를 고형 종양의 외부에 투여하는 경우, 고형 종양 내로의 약물 침투가 매우 느리고 종양 주변부로만 한정됨을 밝혀냈다. 본 출원인은 또한 이 침투 문제점을 극복하는 방법을 개시하였다. 이 방법은 세포자멸사 유도 처리(예컨대, 파클리탁셀 또는 독소루비신을 사용한 처리)를 이용하여 종양 내의 사이질 공간을 확장시킴으로써 약물 투여와 동시에 또한 약물 투여 후에 고형 종양 전체에 걸친 침투 및 분포를 개선시키는 것으로 이루어진다. 이 방법은 본원에서 "종양 시동(Tumor Priming)"이라고 일컬으며, 두 가지 조건이 필요하다. 첫번째 조건은 약물 농도가 세포자멸사를 유도하기에 충분해야 한다는 것이다. 본 출원인은 3시간동안 200nM 파클리탁셀로 처리하면 여러 인간 종양 세포에서 세포자멸사를 유도하는데 충분함을 발견하였다[오(Au) 등, Cancer Res., 58: 2141-2148, 1998]. 두번째 조건은 세포자멸사-유도 전처리와 후속 치료 사이의 시간 간격이 세포자멸사가 일어나기에 충분해야 한다는 것이다[예컨대, 파클리탁셀의 경우 16 내지 24시간; 오 등, Cancer Res., 1998; 장(Jang) 등, J. PHarmacol. Exper. Therap., 296: 1035-1042, 2001]. 본 발명에서는 이러한 조건을 획득하였다.
본 출원인은 또한 복강내 투여 후, 복강을 둘러싸는 얇은 막인 복막을 통한 신속한 흡수 및 림프계를 통한 배출로 인해, 시판되는 탁솔(등록상표) 제제가 복강으로부터 신속하게 없어짐을 발견하였다(상기 문헌 실시예 4 및 6 참조).
이러한 다양한 고려사항 및 발견내용에 기초하여, 본 출원인은 복강내 화학요법이 하기 바람직한 특성중 일부 또는 대부분을 충족시킨다면 치료 면에서 유용한 복강내 화학요법을 달성할 수 있다는 결론에 도달하였다. 첫째, 약물은 의도되는 표적 암 유형에 대해 활성을 가져야 한다. 둘째, 치료제는 투여하기 용이해야 하고, 장시간(예컨대 하루 또는 이틀보다 더 긴 시간)동안 유치 카테터의 사용을 필요로 하지 않아야 하며, 빈번한 투여(예를 들어 일주일에 1회보다 더 자주)를 필요로 하지 않아야 한다. 셋째, 복강내의 약물의 양, 따라서 약물의 농도가 질환을 적절하게 억제할 정도로 충분히 높은 동시에 심각한 국부(local) 독성을 생성시키지 않을 정도로 충분히 낮도록, 약물 제공 속도가 최적화되어야 한다. 넷째, 약물 또는 약물 제제가 고형 종양 내로 침투하고 고형 종양 내에 광범위하게 분포될 수 있어야 한다. 다섯째, 약물 또는 약물 제제가 종양이 위치하는 복강 내에서 장시간 체류해야 한다. 여섯째, 약물 또는 약물 제제가 종양 세포에 대해 높은 친화성을 가져야 하고 종양 표면상에 또는 종양 덩어리 내에 편재되어야 한다. 일곱째, 약물 또는 약물 제제의 분포가 복강 또는 기관 내에서 종양 세포의 분포 또는 유포와 유사해야 한다. 본 발명(즉, 약물-로딩된 미립자)에서는 이들 바람직한 특징중 대부분 또는 모두를 획득한다.
약물-로딩된 미립자는 다음 두 가지 속도로 약물을 방출시키도록 디자인된다: 세포자멸사를 유도하기에 충분히 높은 약물 농도를 제공하기 위한 신속한 방출 및 종양으로의 지속적인 약물 전달을 제공하기 위한 보다 느린 방출. 세포자멸사 유도는 나머지 미립자 및 서방성 입자로부터 후속 방출되는 나머지 약물의 침투 및 분포를 촉진시킨다. 장시간(예컨대 수일, 수주일 또는 수개월)에 걸친 느린 약물 방출은 환자에게 1회 투여의 편리함을 제공하고, 치료 빈도를 감소시키며, 입원할 필요가 없게 만들며, 건강 관리 비용을 감소시키고, 유치 복강내 카테터를 사용할 필요가 없게 함으로써 감염의 위험을 감소시키고 환자의 생활의 질을 개선시키며, 전체 투여량을 모두 한꺼번에 신속하게 급속 주입시킴으로써 야기되는 복강내의 높은 국부 농도로 인한 국부 독성을 감소시킨다. 이들 입자는 그 크기 및 특성 때문에 복강 내에 보유되며 종양에 결합하고 복강 또는 기관 내에서 유사한 분포를 나타낸다.
입자는 또한 두 가지 유형 이상의 입자의 조합일 수 있는데, 그중 적어도 하나의 유형은 약물을 신속하게 방출시켜 세포자멸사를 유도하는 반면, 나머지 유형은 약물을 보다 서서히 방출한다. 광범위하게 사용되는 항암제 파클리탁셀이 로딩된 미립자의 예를 제공하여, 파클리탁셀이 크레모포어(Cremophor) 및 에탄올에 용해된 시판되는 파클리탁셀 제제(즉, 탁솔; 등록상표)에 비해, 복막 종양에 걸린 마우스에서 탁월한 종양 표적화 및 항암 활성을 나타내는 것과 관련하여 이들 입자의 유용성을 입증한다.
본 출원인은 또한 복막암을 치료하기 위하여 다른 약물 또는 약제를 동일한 미립자 내에 제형화시킬 수 있다고 개시한다.
본 출원인은 국부 투여 또는 국소 투여에 의해 용이하게 접근가능한 기관 또는 영역에 위치한 종양을 치료하는데 약물-로딩된 입자를 사용할 수 있는 것으로 기재한다.
본 발명에서는 치료용 약제가 로딩된, 젤라틴 및 PLGA 중합체로 제조된 생분해성 입자를 사용한다. 젤라틴 및 PLGA 입자 내에 제형화되는 약제중 하나는 파클리탁셀이다. 다양한 생분해성 중합체 결합된 파클릭탁셀 제제가 개발되어 왔으며, 최소한의 전신 독성으로 동물 모델에서 종양 성장 및 혈관 형성을 억제하는 것으로 밝혀졌으나; 약 50일에 약물의 약 10 내지 25%가 방출되는 이들 시스템에서의 파클리탁셀의 방출 동역학은 임상적 사용에 최적이지 않다(미국 특허 제 6,447,796 호). 또한, 이들 이전 연구의 대부분의 목적은 약물의 국소 전달이 아닌 약물의 전신 전달을 달성하는 것이었다. 치료용 약제의 담체로서의 생분해성 중합체의 이점은 당해 기술 분야에서 인식하고 있으며(미국 특허 제 6,447,796 호); (1) 약물 공급이 고갈될 때 약물 담체를 제거하기 위한 후속 수술을 필요로 하지 않는 완벽한 생분해; (2) 조직 생체 적합성; (3) 투여의 용이성; (4) 중합체의 가수분해시 캡슐화된 약물의 조절되고 지속적인 방출; (5) 국소 용도의 경우, 호중성 백혈구 감소증 같은 전신 독성의 최소화 또는 부재; 및 (6) 다양성(versability) 면에서 생분해성 중합체 시스템 자체의 편리함을 포함한다. 이러한 많은 이점은 젤라틴 약물 방출 입자에도 유사하게 적용된다.
방광암의 방광내 요법을 위한 파클리탁셀 - 로딩된 나노입자
방광암 재발 및/또는 진행을 감소시키기 위하여 방광내 요법을 이용한다[커쓰(Kurth, K. H.) Semin . Urol . Oncol ., 14: 30-35, 1996]. 방광내 화학요법은 전신 노출을 최소화시키면서 약물을 고농도로 종양-함유 방광에 선택적으로 전달하는 이점을 제공한다. 본 출원인은 화학 치료제(예: 마이토마이신 C, 예컨대 독소루비신)에 대한 표층 방광암 환자에서의 치료 실패가 부분적으로는 방광 조직에 위치된 종양으로의 낮은 약물 전달에 기인함을 밝혔다[달톤(Dalton) 등, Cancer Res., 51: 5144-5152, 1991; 슈미트겐(Schmittgen) 등, Cancer Res., 51: 3849-3856, 1991; 위엔테스(Wientjes) 등, Pharm . Res., 8: 168-173, 1991; 위엔테스 등, Cancer Res., 51: 4347-4354, 1991; 위엔테스 등, Cancer Res., 53:3314-3320, 1993; 차이(Chai) 등, J Urol., 152: 374-378, 1994; 위엔테스 등, Cancer Chemother Pharmacol. 37: 539-546, 1996; 오 등, J. Natl . Cancer Inst ., 93: 597-604, 2001; 미국 특허 제 6,286,513 B1 호]. 낮은 약물 전달은 또 몇몇 이유 때문이었다. 첫째, 마이토마이신 C 또는 독소루비신 투여량의 일부, 예컨대 ∼3% 내지 ∼5%만이 방광 강의 내면을 둘러싸는 요로상피를 침투할 수 있었다. 둘째, 약물이 투여될 때 잔류하는 뇨의 존재에 의해 또한 치료 간격(예컨대, 2시간) 동안 생성된 뇨에 의해 약물의 농도가 희석되었다. 셋째, 환자가 방광을 비워야 했기 때문에 종양 세포가 약물, 예컨대 마이토마이신 C에 노출되는 총 시간이 치료 간격의 길이만큼으로 한정되었다. 넷째, 방광 조직에서의 약물, 예컨대 마이토마이신 C의 체류가 치료 간격에 의해 한정되고, 환자가 방광을 비운 후 수분내에 대부분 종결된다.
이러한 다양한 고려사항 및 발견내용에 기초하여, 본 출원인은 치료가 하기 목적하는 특성중 몇 가지 또는 대부분을 충족시킨다면 치료 면에서 유용한 방광내 화학요법을 달성할 수 있다는 결론에 도달하였다. 첫째, 약물은 방광암에 대해 활성을 가져야 한다. 둘째, 뇨에 존재하는 약물의 상당 부분이 요로상피를 침투할 수 있어야 한다. 셋째, 방광 조직에서의 약물의 체류 시간이 치료 지속기간을 초 과하여야 한다. 넷째, 뇨중 약물 농도가 뇨의 부피와 무관하여야 한다. 파클리탁셀은 방광암에 대해 활성이고[로쓰(Roth, B.), J. Semin . Oncol ., 22: 1-5, 1995], 본 출원인에 의해 밝혀졌듯이, 용이하게 요로상피를 가로질러 분배된다(예컨대, 투여량의 50%)[송(Song) 등, Cancer Chemother . Pharmacol ., 40: 285-292, 1997]. 본 출원인은 또한 약물이 세포외 기질로부터 제거된 후에 파클리탁셀이 종양 세포에 보유됨을 발견하였으며[쿠(Kuh) 등, J. Pharmacol . Exp . Ther ., 293: 761-770, 2000], 이 특성은 약물 작용이 2시간동안의 치료 지속기간보다 더 길게 연장되는 기회를 제공한다. 그러나, 시판중인 파클리탁셀 제제, 예컨대 탁솔(등록상표)은 파클리탁셀을 용해시키는데 사용되는 크레모포어가 파클리탁셀을 미셀에 포획함으로써 유리 파클리탁셀 부분을 제거하고 결과적으로 방광 조직 내로의 약물 침투를 저하시키기 때문에 유용하지 않다[네메이여(Knemeyer) 등, Cancer Chemother . Pharmacol ., 44: 241-248, 1999].
따라서, 본 출원인은 본 출원인의 발견에서 확인된 목적하는 특성을 모두 충족시키는 파클리탁셀-로딩된 나노입자를 발명하였다. 이들 나노입자는 조직내의 파클리탁셀 농도가 인간의 방광 종양에서 항종양 활성을 나타내기에 충분하도록 약물 로드(load)중 상당한 부분을 2시간의 치료 간격 내에 방출시킨다(예컨대, 실시예 8). 나노입자로부터 방출되는 파클리탁셀의 양은 뇨중 약물의 용해도에 의해 한정된다. 따라서, 뇨중 약물 농도는 비교적 일정하게 유지되며, 뇨 부피에 무관하다(예컨대, 실시예 10). 나노입자로부터 방출되어 방광 내로 침투하는 파클리탁셀은 2시간의 치료 지속기간보다 더 길게 연장되는 기간동안 방광 조직에 보유된다 (예를 들어, 실시예 8). 마지막으로, 본 출원인은 나노입자가 애완견에서 자연 발생되는 방광암에 대해 효과적이었다고 결론지었다(예컨대, 실시예 10).
본 출원인은 또한 예를 들어 생체 결합성 분자로 젤라틴 골격을 코팅함으로써, 약물-로딩된 나노입자를 개질시켜, 방광 강 또는 방광 조직내에서의 이들 입자의 체류를 치료 지속기간보다 더 길게 연장시키는 방법을 개시한다(예를 들어, 실시예 7).
본 출원인은 다른 친유성 화합물을 동일한 젤라틴 나노입자 내에 제형화시킬 수 있음도 개시한다.
마지막으로, 본 출원인은 젤라틴 나노입자의 정맥내 투여에 의해 신장에 편재되는 약물 함량을 증가시켰음을 개시한다(예컨대, 실시예 11). 따라서, 신장으로의 선택적인 약물 전달을 위한 방법 및 조성물이 또한 제공된다.
정의
본 발명을 명확하고 조리있게 이해하도록 하기 위하여, 상세한 설명, 실시예 및 청구의 범위에 사용되는 특정 용어를 편의상 여기에 모은다.
본원에 사용되는 용어 "이상 성장"은 세포의 정상적인 표현형과는 상이한 세포 표현형, 특히 암 같은 질환에 직접 또는 간접적으로 수반되는 세포 표현형을 일컫는다.
본원에 사용되는 용어 "투여하는"은 세포에(예컨대, 시험관내), 포유동물의 세포에(즉, 생체내), 또는 나중에 다시 동물에 재배치될 세포에(즉, 생체외) 약제를 도입함을 나타낸다.
본원에 사용되는 용어 "약제", "약물", "화합물", "항암제", "화학치료제", "항신생물제" 및 "항종양제"는 호환성 있게 사용되며, 이상 세포 성장, 예컨대 암을 억제 또는 감소시키는 특성을 갖는 약제(들)(추가로 제한하지 않는 한)를 일컫는다. 전술한 용어는 또한 세포 독성제, 세포 파괴제, 세포증식 억제제를 포함하고자 한다. 용어 "약제"는 작은 분자, 거대분자(예컨대, 펩타이드, 단백질, 항체 또는 항체 분절) 및 핵산(예컨대, 유전자 요법 구조물), 재조합 바이러스, 핵산 분절(예컨대 합성 핵산 분절 포함)을 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "세포자멸사"는 당해 기술 분야에서 잘 확립된 기준에 의해 정의되는 세포사의 비-괴사성의 잘 조절된 형태를 일컫는다.
본원에 사용되는 용어 "양성", "전악성" 및 "악성"은 당해 분야에서 인식하고 있는 의미를 갖는다.
본원에 사용되는 용어 "암", "종양 세포", "종양", "백혈병" 또는 "백혈병 세포"는 호환성 있게 사용되며, 암종(상피세포로부터 유도됨), 선암종(선 조직으로부터 유도됨), 육종(결합조직으로부터 유도됨), 림프종(림프 조직으로부터 유도됨) 또는 혈액암(예컨대, 백혈병 또는 적백혈병) 같은 임의의 신생물("신규 성장")을 일컫는다. 용어 암 또는 종양 세포는 또한 암세포 또는 종양 세포의 집합체로서 간주되는 암 조직 또는 종양 덩어리를 포괄하고자 한다. 또한, 용어 암 또는 종양 세포는 양성, 전악성 또는 악성일 수 있는 암 또는 세포를 포괄하고자 한다. 전형적으로, 암 또는 종양 세포는 예를 들어 성장 인자 독립성, 세포/세포 접촉 성장 억제의 결핍 및/또는 이상 핵형 같은 당해 분야에서 인식된 다양한 특징을 나타낸다. 대조적으로, 정상 세포는 전형적으로 한정된 세대수로 계대배양될 수 있고/있거나 정상 세포에 기여하는 당해 분야에서 인식된 다양한 특징(예컨대, 성장 인자 의존성, 접촉 억제, 및/또는 정상 핵형)을 나타낸다.
본원에 사용되는 용어 "세포"는 포유동물의 체세포 또는 배아세포 또는 세포주, 예컨대 HeLa 세포(인간), NIH3T3 세포(쥐과 동물), 배아 줄기 세포, 및 조혈 줄기 세포, 근육모세포, 간세포, 림프구 및 상피 세포와 예컨대 본원에 기재된 세포주 같은 세포 유형 등의 임의의 진핵세포를 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "복막", "복강내", "복막으로" 또는 "복강내로"는 호환성 있게 사용되며, 복막 또는 복강과 관련되어 있다.
본원에 사용되는 용어 "국부", "국소", "전신"은 각각 치료제를 "국부", 즉 종양 덩어리 내로의 투여, "국소", 예컨대 전이될 것으로 의심되는 전반적인 종양 부분 또는 구역에서의 투여, 또는 "전신", 예를 들어 약제를 환자 전신에 걸쳐 광범위하게 유포시키고자 하는 의도로 경구 또는 정맥내 투여함을 일컫는다.
본원에 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 당해 분야에 알려져 있고, 본 발명의 화합물을 포유동물에게 투여하기 적합한, 약학적으로 허용가능한 물질, 조성물 또는 비히클을 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "약학 조성물"은 포유동물, 예를 들어 인간에게 투여하기에 적합한 제제를 포함한다. 본 발명의 화합물을 약제로서 포유동물, 예컨대 인간에게 투여할 때, 이들은 그 자체로, 또는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 활성 성분 0.1 내지 99.5%(더욱 바람직하게는 0.5 내지 90%)(예컨대, 치료 유효량) 를 함유하는 약학 조성물로서 제공될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "환자"는 인간 및 인간이 아닌 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 고양이, 개, 가축 및 영장류 동물)을 포함하고자 한다. 바람직한 인간은 이상 세포 성장이 특징인 장애, 예컨대 암을 갖는 인간 환자를 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "미립자"는 크기가 약 0.1 내지 약 100㎛, 약 0.5 내지 약 50㎛, 0.5 내지 약 20㎛인 입자, 유리하게는 크기가 약 1 내지 약 10㎛, 약 5㎛인 입자 또는 이들의 혼합물을 일컫는다. 미립자는 예를 들어 거대 분자, 유전자 요법 구조물 또는 화학 치료제를 포함할 수 있다. 전형적으로, 미립자는 예컨대 국부 또는 국소 투여될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "나노입자"는 크기가 약 0.1nm 내지 약 1㎛, 1nm 내지 약 1㎛, 약 10nm 내지 약 1㎛, 약 50nm 내지 약 1㎛, 약 100nm 내지 약 1㎛, 약 250 내지 900nm, 또는 유리하게는 약 600 내지 800nm인 입자를 말한다. 나노입자는 예컨대 거대분자, 유전자 요법 구조물 또는 화학 치료제를 포함할 수 있다. 전형적으로, 나노입자는 국부, 국소 또는 전신 투여를 통해 환자에게 투여될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "입자"는 나노입자, 미립자 또는 나노입자와 미립자 둘 다를 일컫는다.
본원에 사용되는 용어 "제제"는 치료 활성제가 투여형에 혼입되어 있는 당해 분야에 알려져 있는 조성물을 일컫는다.
본원에 사용되는 용어 "신속-방출성 제제" 및 "급속-방출 제제"는 1일 내에 그의 약물 함량의 바람직하게는 >10%, 더욱 바람직하게는 >20%, 더욱 바람직하게는 >30%, 더욱 바람직하게는 >40%, 더욱 바람직하게는 >50%, 더더욱 바람직하게는 >60%를 방출하는 약물의 제제를 일컫는다. 신속-방출성 제제의 예는 미립자 제제 및 나노입자 제제를 포함한다. 이들 제제를 제조하는 방법은 실시예 3 및 7에 기재되어 있다.
본원에 사용되는 용어 "서방성 제제"는 지속적인 기간동안 해당 부위에 약물을 전달하는 약물의 제제를 말하며, 바람직하게는 수일동안, 더욱 바람직하게는 수주일 이상동안 그의 약물 함량 방출을 유지하는 제제를 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "종양 시동 방법"은 세포자멸사 유도제로 종양을 "시동"시켜 종양 세포 밀도를 감소시키고 종양 덩어리로의 치료제 접근성을 증가시킴으로써 치료 약물의 침투를 향상시키는 방법을 일컫는다. 이 방법은 조직에서 세포자멸사를 유발시킴으로써 종양 치료제(또는 간단히 "치료제")의 조직 내로의 침투(예컨대, 조직 내에 채널을 형성시킴으로써)를 향상시키는데 충분한 투여량으로 충분한 시간동안 파클리탁셀 같은 세포자멸사 유도제를 사용함을 포함한다. 따라서, 세포자멸사 유도제는 치료제의 치료 투여량을 조직에 전달하기 전에 전처리제로서 사용되며, 이 전처리에 의해 치료제의 조직 내로의 침투를 전처리를 이용하지 않은 경우에 비해 향상시킬 수 있다. 세포자멸사 유도제는 또한 치료 활성도 가질 수 있어서 치료제로도 사용될 수 있다(즉, 동일한 약물을 세포자멸사 유도제 및 치료제로서 사용할 수 있다). 다르게는, 세포자멸사 유도제를 사용하여 다른 유형의 치료용 약물 또는 비히클의 조직으로의 전달을 향상시킬 수 있다(즉, 세포자멸사 유도제와 치료제가 상이한 약물일 수 있거나, 또는 나노입자 또는 미립자의 종양 조직으로의 전달이 전처리를 이용하지 않은 경우에 비해 향상되는 경우 치료제를 나노입자 또는 미립자 내에 함유시킬 수 있다).
본원에 사용되는 용어 "PLGA" 또는 "폴리(락타이드-코-글리콜라이드)"는 다양한 비의 락트산 또는 락타이드(LA) 및 글리콜산 또는 글리콜라이드(GA)로 구성된 공중합체를 일컫는다. 공중합체는 상이한 평균 쇄 길이를 가져, 상이한 내부 점도 및 중합체 특성의 차이를 야기한다. PLGA는 통상 치료제를 함유하는 미립자 또는 나노입자의 제조에 사용된다. 이들 입자를 제조하는데 이용되는 방법은 실시예 3에 기재되어 있다.
본원에 사용되는 용어 "젤라틴"은 결합조직 단백질 콜라겐의 변성된 형태를 일컫는다. 용액에서 제조된 젤라틴 응집물은 단백질 쇄를 가교결합시킴으로써 안정화된다. 실시예 7의 제조 방법을 이용하여, 젤라틴은 통상 파클리탁셀이 로딩된 젤라틴 나노입자를 형성한다. 젤라틴은 상이한 단백질 쇄 길이(이는 상이한 블룸(Bloom) 수에 의해 표시됨)로 입수된다. 보다 큰 블룸 수는 보다 긴 쇄 길이를 나타낸다.
본원에 사용되는 용어 "IC50"은 약물 효과의 50%를 유발시키는 약물 농도 또는 투여량을 말한다.
본원에 사용되는 용어 "파열 방출"은 당해 기술 분야에서 인식하고 있는, 제제로부터의 약물 로드중 일부의 최초의 급속한 방출의 정의를 나타내며, 이 후에는 전형적으로 약물 로드중 나머지의 보다 느린 방출이 뒤따른다.
본원에 사용되는 용어 "편재화" 및 "집중"은 특정 부위, 예를 들어 종양 조직에서의 우선적인 분포를 나타내기 위하여 호환성 있게 사용된다.
본원에 사용되는 용어 "생체 결합제"는 피부, 점막 및 종양 같은 표면에 결합, 바람직하게는 강하게 결합하는 천연, 합성 또는 반합성 물질을 의미한다. 적합한 생체 결합제는 폴리(리신), 피브리노겐, 폴리아크릴산 중합체를 비롯한 부분적으로 에스테르화된 폴리아크릴산 중합체로부터 제조된 것, 천연 또는 합성 폴리사카라이드(예: 메틸셀룰로즈, 셀룰로즈 아세테이트, 카복시메틸셀룰로즈, 하이드록시에틸셀룰로즈를 비롯한 셀룰로즈 유도체, 펙틴) 및 황화된 슈크로즈와 수산화알루미늄의 혼합물을 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "사이질 방광염"은 방광 벽의 만성적인 통증이 있는 염증 상태의 당해 분야에서 인식된 의학적 상태를 일컫는다.
본원에 사용되는 용어 "생분해성" 또는 "생체 침식성(bioerodible)" 중합체는 통상적으로 대사 경로에 포함되는 것으로 알려져 있는, 저분자량 화합물로 분해될 수 있는 중합체를 일컫는다. 이 용어는 또한 생체 환경에서 공격을 받아서 시스템의 일체성, 일부 경우에는 거대 분자 자체가 영향을 받음으로써, 작용 부위로부터(그러나 반드시 신체로부터는 아님) 멀리 이동될 수 있는 분절 또는 다른 분해 부산물을 제공할 수 있는 중합체 시스템도 포함한다.
발명의 개요
본 발명은 종양 세포자멸사 유도제의 신속-방출성 제제, 종양 치료제의 서방성 제제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 환자에게 종양 지료제를 전달 하기 위한 조성물에 관한 것이다. 약학적으로 허용가능한 담체중의 세포자멸사 유도제를 이전에 또는 동시에 투여할 수 있다. 치료제(예컨대, 파클리탁셀)의 나노입자 또는 미립자(예컨대, 가교결합된 젤라틴)도 사용할 수 있다. 나노입자 또는 미립자를 생체 결합성 코팅으로 코팅할 수 있다. 응집되어 방광의 림프관의 입구를 폐색시킴으로써 림프계를 통한 미립자의 제거를 지연시키는 미소구도 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 약물-로딩된 젤라틴 및 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)(PLGA) 나노입자 및 미립자를 사용하여 복강, 방광 조직 및 신장에서 종양으로의 약물 전달을 표적화시킨다.
도 1은 PLGA 미립자에 의한 종양 표적화 결과를 도시한다. 마우스에 복강내 인간 Hs766T 췌장 이종이식 종양을 이식시켰다. 종양을 확립시킨 후(제21일), 소정 투여량의 형광 이소티오시아네이트(FITC)-라벨링된 입자를 복강내 투여하였다. FITC는 UV광 하에서 녹색 형광을 나타낸다. 제24일에, 동물을 마취시키고 복강을 노출시켰다. 왼쪽 패널은 실내등 하에서의 사진을 나타낸다. 복강을 통해 널리 흩어진 백색/황색 및 불규칙한 모양의 결절로서 나타나는 여러 종양에 주목한다. 오른쪽 패널은 UV광 하에서의 사진을 나타낸다. 녹색 형광으로 표시되는, 종양 결절상의 입자의 편재화에 주목한다.
도 2는 고형 종양에서 미립자의 침투 및 분포를 촉진시키는 종양 시동 결과를 도시한다. 마우스에 복강내 인간 SKOV-3 난소 이종이식 종양을 이식하였다. 종양이 확립된 후(제42일), 동물에게 PLGA 미립자(직경 ∼3㎛, 50:50 LA:GA)를 복강내 주사하였으며; 이들 입자는 녹색 형광 화합물(아크리딘 오렌지)로 라벨링시켰다. 10mg/kg의 파클리탁셀 투여량을 함유하는 신속-방출성 파클리탁셀-로딩된 미립자, 또는 파클리탁셀이 없는 블랭크 미립자를 동물에게 제공하였다. 3일 후, 동물을 마취시키고 그물막에 부착된 종양을 동결시킨 후 절제하였다. 입자의 위치를 나타내는 형광 현미경 이미지를 종양의 윤곽을 나타내는 위상차 현미경 이미지 위에 겹쳐놓았다. 왼쪽 패널은 파클리탁셀을 사용한 종양 시동이 진행중인 동물로부터 수득된 종양의 대표적인 단면도이고, 오른쪽 패널은 파클리탁셀 없이 블랭크 미립자를 제공받은 동물로부터 수득된 종양의 단면도이다. 미립자는 녹색 형광 원으로 보여진다. 종양 시동 파클리탁셀 처리로 처리된 종양 전체에 걸쳐 미립자가 더욱 균일하게 분포되어 있고 미립자의 양이 더 많음에 주목한다. 대조적으로, 파클리탁셀로 처리되지 않은 종양에서는, 미립자가 종양 주변부에만 제한되었다. 사진은 200배 배율에서 찍었다. 백색 바는 100㎛의 거리를 나타낸다.
본 발명은 종양 및 신장 조직에 치료제를 전달하기 위한 방법 및 본원에서 사용되는 조성물을 제공하며, 이 때 상기 방법에 의해서 고형 조직 또는 종양 같은 다층 조직의 내부로의 치료제의 표적화 및 침투가 향상될 수 있다.
제 1 요지에서, 본 발명은 종양 내로의 화학 치료제 또는 입자의 침투를 촉진시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 조직에서 세포자멸사를 유발시키기에 충분한 투여량으로 충분한 기간동안 파클리탁셀 같은 세포자멸사 유도제를 사용함을 포함한다. 상당한 세포자멸사가 이루어졌을 때, 조직 내로 치료제 또는 입자를 후속 전달하면, 치료제 또는 입자의 조직 내로의 침투가 향상된다. 따라서, 세포자멸사 유도제는 치료제 또는 입자를 조직에 전달하기 전에 전처리제로서 사용되며, 이 전처리에 의해 치료제 또는 입자의 조직 내로의 침투가 전처리가 이용되지 않은 경우에 비해 향상된다. 세포자멸사-유도제는 또한 치료 활성을 가질 수도 있으며, 따라서 치료제로서도 사용될 수 있다(즉, 동일한 약물을 세포자멸사 유도제 및 치료제로서 사용할 수 있다). 다르게는, 세포자멸사 유도제는 다른 유형의 약물의 조직 내로의 전달을 향상시키는데 사용될 수 있다(즉, 세포자멸사 유도제 및 치료제는 상이한 약물일 수 있다).
한 실시태양에서, 본 발명은 세포자멸사-유도제 및 치료제를 동시 투여할 수 있는 제제를 사용한다. 이 실시태양에서, 세포자멸사 유도제는 신속-방출성 제제로서 제형화되고 치료제는 하나 이상의 서방성 제제로 제형화된다. 투여 후, 신속 방출 제제로 인해 조직에서 세포자멸사가 일어나고, 서방성 제제로 인해 상당한 정도의 세포자멸사가 달성된 후 치료제 총량의 대부분이 전달된다.
관련 실시태양에서, 제제는 세포자멸사-유도제의 최초 파열 방출을 제공한 후 치료제로서의 역할을 하는 나머지 약물 로드의 보다 느린 방출을 제공하는 단일 제제이다.
관련된 실시태양에서, 상기 기재된 제제는 복강 및 복강에 인접한 조직에서 종양을 치료하는데 사용된다.
다른 관련된 실시태양에서는, 상기 기재된 조합 제제를 복수 종양 치료에 사용한다.
또 다른 관련 실시태양에서는, 이들 제제를 사용하여 복강 또는 복강에 인접한 조직에서 성장하는 임의의 기원으로부터의 전이 종양(이는 복강 내로 돌출됨)을 치료한다.
관련된 실시태양에서는, 이들 제제를 사용하여 직접 투여에 의해 용이하게 접근가능한 기관 또는 영역, 예를 들어 복강, 방광 조직, 뇌 조직, 전립선 조직 또는 폐 조직 내의 또는 그에 인접하는 하나 이상의 조직에 위치된 종양을 치료한다.
다른 실시태양에서, 치료되는 종양은 환자의 복강 내에 있거나 또는 복강에 인접한 조직에서 성장한다.
관련 실시태양에서, 치료되는 종양은 직접 투여에 의해 용이하게 접근가능한 기관 또는 영역, 예를 들어 전립선, 방광, 뇌에 위치한다.
다른 실시태양에서는, 미립자를 현탁액으로서 복강내 경로에 의해 전달한다.
또 다른 실시태양에서는, 용이하게 접근가능한 기관 내로의 직접적인 국부 주사에 의해, 또는 용이하게 접근가능한 기관에 인접한 직접적인 국소 주사에 의해 미립자를 현탁액으로서 전달한다.
또 다른 실시태양에서, 환자는 포유동물, 바람직하게는 인간이다.
다른 실시태양에서, 치료되는 환자는 복강으로 퍼진 전립선암 또는 난소암에 걸린 환자이다.
두번째 요지에서, 본 발명은 상기 방법에 사용되는 조성물을 제공한다. 이들 조성물은 시간의 경과에 따라 세포자멸사-유도제와 치료제를 방출하고 세포자멸사-유도제의 초기 급속 방출에 이어 치료제의 보다 느린 방출을 제공하는, 다양한 약물-로딩된 PLGA 입자로 구성된다.
특정 실시태양에서, 제제는 1일 내에 세포자멸사-유도체 함량의 바람직하게는 >10%, 더욱 바람직하게는 >20%, 더욱 바람직하게는 >30%, 더욱 바람직하게는 >40%, 더욱 바람직하게는 >50%, 더더욱 바람직하게는 >60%를 방출하는 신속-방출성 성분으로 이루어지며, 또한 바람직하게는 수일동안, 더욱 바람직하게는 수주일 이상동안 치료제 방출을 유지하는 하나 이상의 서방성 성분으로 추가로 구성된다.
관련 실시태양에서, 조성물은 초기 파열 방출에 이어 나머지 약물 로드의 보다 느린 방출로 구성되는 파클리탁셀의 단일 제제일 수 있다.
특정 실시태양에서, 조성물은 또한 하나 이상의 제제가 파클리탁셀의 급속 방출을 제공하고 하나 이상의 제제가 파클리탁셀의 보다 느린 방출을 제공하는, 파클리탁셀의 둘 이상의 제제의 조합일 수 있다. 관련 실시태양에서, 조합 제제는 초기 급속 방출에 이어 초기 파열 방출되는 단일 제제에 의해 수득될 수 있는 것보다 연장된 후기 방출로 이루어지는, 보다 우수한 조절된 약물 방출을 제공한다.
또 다른 관련 실시태양에서, 조합 제제는 세포자멸사 유도제 및 치료제로서 상이한 약제가 사용되는 경우 특히 유리하다.
다른 실시태양에서, 입자는 세포자멸사-유도제 또는 치료제를 함유하도록 제형화된 PLGA 입자이다. 전형적인 제제는 제제의 총 중량의 50% 이하, 바람직하게는 30% 이하, 더욱 바람직하게는 20% 이하를 약제 형태로 함유한다. 때때로, 투여에 바람직한 방출 속도를 달성하기 위하여, 트윈(Tween) 20, 트윈 80, 이소프로필 미리스테이트, β-락토즈 또는 디에틸프탈레이트 같은 방출 향상제를 첨가하는 것이 유리하다.
바람직한 실시태양에서, 신속-방출성 PLGA 미립자는 50:50 LA:GA로 제조되며, 3 내지 5㎛의 평균 직경, 체온 미만의 유리전이온도(예컨대, 30℃), ∼4%의 파클리탁셀 로드 및 1일에 ∼70%의 약물 방출 속도를 갖는다. 이 조성물의 예는 표 1에 기재된 배치(Batch) 8이다.
바람직한 실시태양에서, 서방성 PLGA 미립자는 50:50 LA:GA로 제조되고, 30 내지 50㎛의 평균 직경, 체온 미만의 유리전이온도(예컨대, 30℃), ∼4%의 파클리탁셀 로드 및 1일에 ∼20%의 초기 파열 약물 방출 속도에 이은 7주에 70%의 총 누적 방출을 생성시키는 보다 느린 방출을 갖는다. 이 조성물의 예는 표 1에 기재된 배치 7이다.
바람직한 실시태양에서, 서방성 PLGA 미립자는 75:25 LA:GA로 제조되고, 3 내지 5㎛의 평균 직경, 체온보다 높은 유리전이온도(예컨대, 50℃), ∼4%의 파클리탁셀 로드 및 1일에 ∼5%의 초기 파열 약물 방출 속도에 이은 7주에 30%의 총 누적 방출을 생성시키는 보다 느린 방출을 갖는다. 이 조성물의 예는 표 1에 기재된 배치 4이다.
제 3 요지에서, 본 발명은 나노입자 또는 미립자가 종양 조직에 선택적으로 결합함으로써 종양에 선택적으로 결합하지 않는 나노입자 또는 미립자에서의 전달에 비해 종양에 보다 높은 약물 수준을 생성시키는, 종양이 위치된 곳에 약물-함유 나노입자 또는 미립자를 국부 투여함으로써 종양으로의 약제 전달을 향상시키는 방법을 제공한다.
한 실시태양에서, 약물-함유 나노입자 또는 미립자는 종양 조직에 선택적으로 결합하고, 이들의 세포자멸사-유도제 방출로 인해 이들 입자 자체의 종양 내로의 침투를 용이하게 한다. 예를 들어, 실시예 5의 입자는 종양내로의 광범위한 침투를 나타낸다. 이 침투는, 세포자멸사-유도제를 함유하지 않는 상응하는 입자가 종양 내로 침투하지 못했던 바, 세포자멸사-유도제의 방출 때문이었다. 종양 내로 침투한 후, 입자에 의해 운반되는 나머지 약물 로드를 시간의 경과에 따라 방출시켰고, 종양 조직을 방출된 약물에 매우 집중적으로 노출시켰다. 약물 방출 속도는 조직의 주위 환경에 의해 방해를 받아서, 종양 조직의 노출 지속시간을 증가시키게 된다. 따라서, 초기 약물 방출 후 종양 조직 내로 침투하는 종양 결합 입자의 국부 투여를 이용하는 본 실시태양의 방법은 종양을 치료하는 효과적인 방법이다. 이러한 실시태양은 또한 신속-방출성 치료제 또는 서방성 치료제의 사용에 의존하지 않으며, 입자가 세포자멸사-유도제를 함유하기 때문에 종양을 치료하기 위한 임의의 치료제의 사용에 적용될 수 있다.
제 4 요지에서, 본 발명은 상기 방법에 사용되는 조성물을 제공한다.
한 실시태양에서, 이들 조성물은 환자의 체온 미만의 유리전이온도(Tg)를 가져서 종양 조직으로의 입자의 선택적인 결합을 향상시키는 PLGA 입자로 구성된다.
바람직한 실시태양에서, 신속 방출 PLGA 미립자는 약 50% 락타이드 및 약 50% 글리콜라이드로 제조되고, 체온 미만의 유리전이온도(예컨대, 30℃)를 갖는다. 이러한 조성물의 예는 표 1에 기재된 배치 8이다.
특정 실시태양에서, 입자는 약 50% 락타이드 및 약 50% 글리콜라이드를 함유하는 PLGA로 제형화되고, 약제가 로딩된다(이 경우, 약제의 총 중량은 제제 총 중량의 50% 이하, 바람직하게는 30% 이하를 구성함).
다른 실시태양에서는, 폴리(리신)을 사용한 가교결합을 이용하여 생체 결합 특성을 증가시킴으로써, 피브리노겐으로 입자를 코팅함으로써, 또는 당해 분야에서 인지되어 있는 다른 방법에 의해서, 종양 조직에 결합하는 입자를 수득할 수 있다. 이들 입자는 젤라틴 나노입자 또는 PLGA 미립자일 수 있다.
제 5 요지에서, 본 발명은 약물-함유 미립자를 복강 내로 투여함으로써 복강 내에 퍼진 종양으로의 약물 전달을 향상시키는 방법을 제공하며, 이 경우 미립자는 전이 종양이 가장 자주 발생되는 복강 구역에 집중됨으로써 약물이 전이 종양이 가장 자주 발생되는 위치에 집중되지 않는 제제로 전달될 때보다 더 높은 약물 수준을 종양에 전달한다.
제 6 요지에서, 본 발명은 복강 내로 투여될 때 전이 종양이 가장 자주 발생되는 복강 구역, 예를 들어 그물막, 창자사이막, 횡경막 및 하복부에 편재되는 상기 방법을 위한 조성물, 즉 PLGA 미립자를 제공한다.
바람직한 실시태양에서, PLGA 미립자는 약 3 내지 5㎛의 평균 직경을 갖는다. 이들 입자는 그물막, 창자사이막, 횡경막 및 하복부 근처에 우선적으로 편재된다. 이들 조성물의 예는 표 1에 기재된 배치 4 및 8이다.
바람직한 실시태양에서, PLGA 미립자는 약 30 내지 50㎛의 평균 직경을 갖는다. 이들 입자는 하복부에 우선적으로 편재된다. 이들 조성물의 예는 표 1에 기재되어 있는 배치 2, 3, 5, 6 및 7이다.
한 실시태양에서, 미립자는 창자사이막, 그물막, 횡경막 및 전이 복막 종양의 성장 위치인 다른 부위에 집중된다.
관련 실시태양에서, 입자는 단일 종양 세포 또는 종양 세포의 작은 응집체의 크기와 유사한 크기, 즉 직경 약 3 내지 약 30㎛이다.
제 7 요지에서, 본 발명은 약제-함유 미립자의 응집체 형성을 촉진시킴으로써 체온보다 높은 Tg를 갖는 미립자와 비교하여 림프를 통한 배출에 의한 이들 입자의 제거를 감소시키기 위하여, 환자의 체온 미만의 유리전이온도(Tg)를 갖는 PLGA 미립자 내에 약제를 제형화시킴으로써, 복강에서의 약제-함유 미립자의 체류를 향상시키는 방법을 제공한다.
제 8 요지에서, 본 발명은 림프를 통한 제거가 지연되는 약물-로딩된 미립자로 구성되는, 상기 방법을 위한 조성물을 제공한다.
바람직한 실시태양에서, PLGA 미립자는 약 50% 락타이드 및 약 50% 글리콜라이드로 제조되며, 체온 미만의 유리전이온도(예를 들어, 30℃)를 갖는다. 이들 조성물의 예는 표 1에 기재된 배치 6, 7 및 8이다.
제 9 요지에서, 본 발명은 입자의 크기가 약제가 미립자 내로 로딩되지 않고서 투여될 때에 비해 림프를 통한 배출에 의한 약제의 제거를 감소시키기에 충분히 큰, PLGA 미립자 내에 약제를 제형화시킴으로써, 복강에서의 약제-함유 미립자의 체류를 향상시키는 방법을 제공한다.
제 10 요지에서, 본 발명은 림프를 통한 배출에 의한 제거를 지연시키기에 충분히 큰 크기를 갖는 약물-로딩된 미립자로 구성되는, 상기 방법을 위한 조성물을 제공한다.
바람직한 실시태양에서, PLGA 미립자는 10㎛ 이상의 평균 직경을 갖는다. 이들 조성물의 예는 표 1에 기재된 배치 2, 3, 5, 6 및 7이다.
제 11 요지에서, 본 발명은 PLGA 미립자 내에 약제를 제형화시킴으로써 복강에서의 약제-함유 미립자의 체류를 향상시키는 방법을 제공하며, 이 때 입자의 크기는 약제를 미립자 내로 로딩시키지 않고 투여할 경우에 비해 복막을 통한 흡수로 인한 복강으로부터의 약제의 제거를 감소시킨다.
제 12 요지에서, 본 발명은 복막을 통한 흡수가 지연된 약물-로딩된 미립자로 구성된, 상기 방법을 위한 조성물을 제공한다.
바람직한 실시태양에서, PLGA 미립자는 10㎛ 이상의 평균 직경을 갖는다. 이들 조성물의 예는 표 1에 기재되어 있는 배치 2, 3, 5, 6 및 7이다.
제 13 요지에서, 본 발명은 (1) 급속 약물 방출 후 느린 약물 방출을 제공하는 특성, (2) 종양 조직에 선택적으로 결합하는 특성, (3) 전이 종양이 가장 흔히 발생되는 복강 구역에 편재화되는 특성, (4) 림프를 통한 배출에 의한 제거가 낮은 특성, (5) 복막을 통한 흡수가 낮은 특성 등의 목적하는 특성중 둘 이상을 갖는 조성물을 제공한다.
바람직한 실시태양에서, 조성물은 신속-방출성 PLGA 입자 및 서방성 PLGA 입자를 함유한다. 신속-방출성 PLGA 입자는 50% 락타이드 및 50% 글리콜라이드로 제조되고, 3 내지 5㎛의 평균 직경, 체온 미만의 유리전이온도(예컨대, 30℃)를 가지며, 수시간 내에 세포자멸사-유도량의 세포자멸사-유도제를 방출한다. 서방성 PLGA 미립자는 50% 락타이드 및 50% 글리콜라이드로 제조되고, 30 내지 50㎛의 평균 직경, 체온 미만의 유리전이온도(예컨대, 30℃)를 가지며, 첫째 날에 그의 약물 로드의 바람직하게는 30% 미만, 더욱 바람직하게는 20% 미만의 치료제를 방출하는데 이어, 수주일 동안에 >60%, 바람직하게는 >70%의 총 누적 방출량을 방출시킨다.
더욱 바람직한 실시태양에서, 세포자멸사-유도제 및 치료제는 둘 다 파클리탁셀이다.
제 14 요지에서, 본 발명은 환자의 방광 벽으로 친유성 약제를 전달하는 방법을 제공한다. 이 방법에서는 유리 약물의 투여에 비해 몇 가지 이점을 갖는 약제의 제제를 위해 젤라틴 나노입자를 사용한다. 젤라틴 나노입자중 약제의 제제로 인해, 다른 방법에 의해 가능한 것보다 많은 약물 양의 가용성이 불량한 다수의 약제를 투여할 수 있다. 또한, 젤라틴 나노입자 내에 제형화된 약물은 지속적인 약물 방출을 위한 용기로서 작용하여, 유리 약제의 투여와 비교하여 보다 높은 약물 농도를 유지할 수 있다. 또한, 약물-로딩된 젤라틴 나노입자는 뇨를 방출할 때에도 방광 강 내에 보유됨으로써 약물에 대한 전체 종양 노출을 향상시킬 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명은 파클리탁셀이 크레모포어-함유 제제에 함유되지 않고 이 때문에 방광 벽을 침투하는데 더욱 용이하게 이용될 수 있는, 방광내 점적 주입에 의해 표층 방광암에 걸린 환자의 방광 벽에 파클리탁셀을 전달하는 방법을 제공한다.
다른 실시태양에서는, 이 방법을 이용하여 표층 방광암 치료 또는 사이질 방광염 치료용의 다른 고도로 친유성인 약제를 투여할 수 있다. 이 방법을 이용하여 개선된 치료 결과를 나타낼 것으로 예상되는 약제는 도세탁셀을 포함하지만 이것으로 한정되지는 않는다.
제 15 실시태양에서, 본 발명은 전달 형태가 (1) 적은 부피의 점적 주입액에 충분한 투여량의 파클리탁셀이 함유될 수 있고, (2) 전달 형태가 파클리탁셀을 방광 벽에 신속하고 효과적으로 전달하며, (3) 방광 벽에서 파클리탁셀의 상당한 치료 활성 농도가 달성되는 기준을 충족시키는, 방광내 점적 주입에 적합한 전달 형태로 파클리탁셀을 제형화시키기 위한 조성물을 제공한다.
한 실시태양에서, 조성물은 파클리탁셀이 로딩된, 가교결합된 젤라틴 나노입자로 구성된다.
관련 실시태양에서, 젤라틴 나노입자는 파클리탁셀의 용해도-제한되는 방출을 제공하도록 제형화되며, 따라서 뇨중 파클리탁셀의 용해도 농도를 유지한다. 이로 인해, 다른 경우에는 약물 농도의 희석 및 저하를 야기하는 과정(약물 점적 주입시 기존 잔류 뇨 또는 치료 지속기간동안 및 그 후의 뇨 생성을 포함하지만 이들로 한정되지는 않음)과 무관하게 일정한 효과적인 파클리탁셀 농도가 유지된다.
바람직한 실시태양에서, 젤라틴 나노입자는 175의 블룸 수를 갖는 젤라틴으로부터 제조되고, 약 600nm 내지 약 1000nm의 평균 직경을 갖고, 0.4% 내지 2.0%, 더욱 바람직하게는 0.5% 내지 1.0%의 약물 로딩을 갖는다. 실시예 7에 기재되어 있는 바와 같이 글루타르알데히드를 사용함으로써, 또는 다른 방법에 의해, 예컨대 당해 기술 분야에 통상적으로 인식되어 있는 바와 같이(미국 특허 제 6,132,759 호) 산화된 폴리사카라이드 분자를 사용함으로써 젤라틴을 가교결합시킬 수 있다. 이들 나노입자의 예는 표 3에 제공되어 있으며, 이들의 특성은 실시예 7에 기재되어 있다.
다른 관련 실시태양에서, 나노입자 제제는 파클리탁셀의 용해도를 향상시켜 결과적으로 종양을 치료하는데 이용될 수 있는 파클리탁셀의 농도를 증가시키기 위한 성분을 추가로 함유한다. 이러한 성분의 예는 디메틸 설폭사이드 또는 폴리에틸렌 글리콜 같은 보조용매이다.
또 다른 관련 실시태양에서는, 온열요법을 적용시킴으로써 뇨중 파클리탁셀의 용해도를 증가시킬 수 있다.
다른 실시태양에서, 입자는 정상적인 방광 벽 및/또는 표층 방광암 환자에게서 종종 발견되는 염증이 있는 방광 벽 및/또는 방광 벽 표면상에 노출된 종양 조직에 결합한다. 폴리(리신), 피브리노겐, 폴리아크릴산 중합체, 메틸셀룰로즈, 셀룰로즈 아세테이트, 카르복시메틸셀룰로즈, 히드록시에틸셀룰로즈 또는 펙틴을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는 생체 결합성 분자로 나노입자를 코팅함으로써 이러한 결합을 증가시킬 수 있다.
관련 실시태양에서는, 나노입자가 방광 벽에 결합함으로써 환자가 방광을 비운 후에도 방광 강 내에서 효과적인 약물 농도를 유지할 수 있다.
특정 실시태양에서, 방광 벽에 결합하는 입자는 친유성 치료제가 로딩되고 생체 결합성 분자로 코팅된 젤라틴 나노입자이다.
바람직한 실시태양에서, 입자는 파클리탁셀이 로딩되고 폴리(리신)으로 코팅된 젤라틴 나노입자이다.
더욱 더 바람직한 실시태양에서, 젤라틴 나노입자는 175의 블룸 수를 갖는 젤라틴으로부터 제조되고, 약 600 내지 1000nm의 평균 직경, 약 0.4 내지 2%, 더욱 바람직하게는 약 0.5 내지 1%의 약물 로딩을 가지며, 폴리(리신)중 그의 중량의 5%를 함유하며, 이 때 젤라틴 분자 및 폴리(리신) 분자는 실시예 7에 기재되어 있는 바와 같이 글루타르알데히드를 사용함으로써, 또는 당해 기술 분야에서 인식되어 있는 가교결합 방법을 이용함으로써 가교결합된다.
다른 실시태양에서, 방광내 점적 주입에 적합한 전달 형태는 신속-방출성 PLGA 미립자로 구성된다.
또 다른 실시태양에서, 방광 내용물 내로의 치료제의 방출 속도는 약제의 수용해도에 의해 제한된다.
바람직한 실시태양에서, 약제는 파클리탁셀이다.
다른 실시태양에서, 신속-방출성 PLGA 미립자는 100 내지 6000nm, 바람직하게는 500 내지 5000nm, 더욱 바람직하게는 3000 내지 4000nm의 평균 직경을 갖는다.
바람직한 실시태양에서, 신속-방출성 PLGA 미립자는 50:50 LA:GA로 제조되고, 3000 내지 5000nm의 평균 직경, 체온 미만의 유리전이온도(예컨대, 30℃)를 갖고, 약 4% 파클리탁셀을 함유하며, 씽크 조건하에서 하루에 약물 함량의 약 70%를 방출하는 약물 방출 속도를 갖는다.
다른 실시태양에서, PLGA 미립자는 생체 결합성 분자로 코팅된다.
제 16 요지에서, 본 발명은 약제가 정맥내 경로에 의해 투여되는, 신장으로의 약제의 전달을 증가시키는 방법이다. 이 방법은 정맥내 투여되는 약제의 분포와 비교하여 젤라틴 나노입자의 신장으로의 선택적인 분포에 기초한다.
한 실시태양에서는, 젤라틴 나노입자 내에 제형화된 약제의 정맥내 투여에 의해 신장 조직의 선택적인 표적화를 달성한다.
바람직한 실시태양에서, 신장의 선택적 표적화 방법은 실시예 11에 기재되어 있다.
더욱 더 바람직한 실시태양에서는, 600 내지 900nm의 대략적인 평균 크기를 갖고 치료 면에서 유용한 약제가 로딩된 젤라틴 나노입자를 사용하여 환자에서 신장을 표적화시킨다.
다른 실시태양에서, 젤라틴 나노입자 내에 제형화되는 약제는 신장암 치료용 화학 치료제, 신장암 예방용 화학 예방제, 신장 질환 치료용 유전자요법 구조물 및 신장에 선택적으로 투여하는 것이 유리한 다른 약제를 포함한다.
제 17 요지에서, 본 발명은 신장의 선택적인 정맥내 표적화에 적합한 전달 형태로 파클리탁셀 또는 다른 약제를 제형화시키기 위한 조성물을 제공한다. 이 조성물은 전달될 약제가 로딩된 가교결합된 젤라틴 나노입자로 구성된다.
바람직한 실시태양에서, 약제는 파클리탁셀이다.
더욱 더 바람직한 실시태양에서, 젤라틴 나노입자는 블룸 수 175의 젤라틴으로부터 제조되고, 약 600 내지 약 1000nm의 평균 직경을 가지며, 0.4% 내지 2.0%, 더욱 바람직하게는 0.5% 내지 1.0%의 약물 로딩을 갖는다. 실시예 7에 기재된 바와 같이 글루타르알데히드를 사용함으로써 또는 다른 방법에 의해, 예를 들어 당해 기술 분야에서 통상적으로 인식하는 바와 같이(미국 특허 제 6,132,759 호) 산화된 폴리사카라이드 분자를 사용함으로써 젤라틴을 가교결합시킬 수 있다. 이들 나노입자의 예는 표 3에 제공되어 있으며, 이들의 특성은 실시예 7에 기재되어 있다.
다른 실시태양에서, 약제는 신장 세포로의 유전자 구조물의 선택적인 전달을 위한 유전자 생성물이다.
제 17 요지에서, 본 발명은 환자의 방광 벽으로 약제를 전달하는 방법을 제공한다. 이 방법에서는 약제의 제형화를 위해 젤라틴 나노입자를 사용하며, 이 때 제제는 유리 약물의 투여에 비해 몇 가지 이점을 갖는다. 젤라틴 나노입자에서의 약제의 제형화로 인해, 다른 경우에 가능한 것보다 더 많은 약물 양의 약제를 투여할 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 젤라틴 나노입자 내에 제형화된 약물은 지속적인 약물 방출을 위한 용기로서 작용하여, 유리 약제의 투여와 비교하여 더 높은 약물 농도를 유지할 수 있다. 또한, 뇨를 방출할 때에도 방광 강에 약물-로딩된 젤라틴 나노입자를 보유함으로써 약물에 대한 총 종양 노출을 향상시킬 수 있다.
다른 실시태양에서는, 이 방법을 이용하여 표층 방광암 치료용의 다른 고도로 친유성인 약제를 투여할 수 있다. 이 방법을 이용하여 개선된 치료 결과를 나타낼 것으로 예상되는 약제는 도세탁셀을 포함하지만 이것으로 한정되지는 않는다.
다른 실시태양에서는, 이 방법을 이용하여 표층 방광암 치료용의 다른 약제를 투여할 수 있다. 약제는 수라민, 인터페론(예컨대, 인터페론 알파, 감마 또는 오메가), 도세탁셀, 독소루비신 및 다른 안트라사이클린, 티오테파, 마이토마이신(예를 들어, 마이토마이신 C), 바실루스 칼메트 구에린(Bacillus Calmette Guerin), 시스플라틴, 메토트렉세이트, 빈블라스틴, 5-플루오로우라실, 류프롤라이드, 플루타미드, 디에틸스틸베스트롤, 에스트라무스틴, 메게스트롤 아세테이트, 시프로테론, 플루타미드 및 시클로포스파미드를 포함하지만 이들로 국한되지는 않는다.
다른 실시태양에서는, 이 방법을 이용하여 사이질 방광염 치료용 약제를 투여할 수 있다. 이 방법을 이용하여 개선된 치료 결과를 나타낼 것으로 예상되는 약제는 펜토산 폴리설페이트 및 그의 나트륨 염, 항히스타민제(예: 히드록시진 및 그의 염, 크로몰린 및 그의 나트륨 염), 삼환상 항우울제(예: 아미트립틸린, 데시프라민, 노르트립틸린, 독세핀 및 이미프라민), 선택적인 세로토닌 재흡수 억제제(예: 파록세틴), 통증 약물(예: 가바펜틴, 클로나제팜), 근육 이완제(예: 디아제팜, 바클로펜), 항경련제(예: 가바펜틴, 클로나제팜), 아편 진통제(예: 비코딘, 페르코세트, 옥시콘틴), 다른 진통제(예: 리도카인 히드로클로라이드, 프로카인히드로클로라이드, 살리실 알콜, 테트라카인 히드로클로라이드, 펜아조피리딘 히드로클로라이드, 아세트아미노펜, 아세틸살리실산, 플루페니살, 이부프로펜, 인도프로펜, 인도메타신, 나프록센, 코데인, 옥시코돈 및 펜타닐 시트레이트), 항연축제(예: 우리맥스, 피리듐, 우리세드, 플라복세이트, 디시클로민, 프로판텔린), 항콜린제(예: 데트롤, 디트로판, 레브신, 히오시아민), H2 차단제(예: 타가메트, 잔탁), 뇨 알칼리화제, 아드레날린 차단제(예: 카두라, 플로맥스, 히트린), 류코트리엔 저해제(예: 몬텔루카스트) 및 다양한 작용을 갖는 약제(예: 디메틸 설폭사이드, 헤파린, 옥시클로로센드 및 그의 나트륨 염, 질산은, 바실루스 칼메트-구에린, 히알루론산나트륨, 레시니페라톡신, 보툴리눔 독소)를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.
다른 실시태양에서는, 방광 감염증을 치료하기 위해 약제, 예를 들어 항생제, 항진균제, 항원생동물제, 항바이러스제 및 다른 항감염제를 사용할 수 있다. 이러한 감염증을 치료하는데 적합한 약물은 마이토마이신, 시프로플록사신, 노르플록사신, 오플록사신, 메탄아민, 니트로푸란토인, 암피실린, 아목시실린, 나프실린, 트리메토프림, 설파, 트리메토프림설팜에톡사졸, 에리트로마이신, 독시사이클린, 메트로니다졸, 테트라사이클린, 카나마이신, 페니실린, 세팔로스포린 및 아미노글리코사이드를 포함한다.
또 다른 실시태양에서는, 절박 요실금 또는 감염증을 치료하는데 약제를 사용할 수 있다. 적합한 약물은 특히 디시클로민, 데스모프레신, 옥시부티닌, 에스트로겐, 테로딜린, 프로판텔린, 독세핀, 이미프라민, 플라복세이트, 페닐프로판올아민, 테라조신, 프락소신, 슈도에페드린, 베탄에콜, 항콜린제, 항연축제, 항무스카린제, 베타-2 작용제, 노르에피네프린 재흡수 억제제, 세로토닌 흡수 억제제, 칼슘 채널 차단제, 칼륨 채널 개방제 및 근육 이완제를 포함한다. 요실금 치료에 적합한 약물은 옥시부티닌, S-옥시부티닌, 에메프로늄, 베라파밀, 이미프라민, 플라복세이트, 아트로핀, 프로판텔린, 톨테로딘, 로시베린, 클렌부테롤, 다리페나신, 테로딜린, 트로스퓸, 히오시아민, 프로피베린, 데스모프레신, 바미카미드[후지와라 캄파니(Fujiwara Co.), 일본], YM-46303[야마노우치 캄파니(Yamanouchi Co.), 일본], 란페리손[닛폰 가야쿠 캄파니(Nippon Kayaku Co.), 일본], NS-21[닛폰 신야쿠 오리온, 포멘티(Nippon Shinyaku Orion, Formenti), 일본/이탈리아], NC-1800[닛폰 케미파 캄파니(Nippon Chemiphar Co.), 일본], ZD-6169[제네카 캄파니(Zeneca Co.), 영국] 및 요오드화스틸로늄을 포함한다.
다른 실시태양에서는, 약제를 사용하여 방광 수축성을 향상시키거나 방광에서의 뇨의 체류를 감소시킬 수 있다.
실시예 1
파클리탁셀 농도 및 인간 종양 세포에 대해 활성인 치료 지속 기간의 확인
본 발명은 세포 독성을 야기하기에 충분한 지속기간에 걸쳐 세포 독성 수준의 파클리탁셀을 방출시키는 파클리탁셀-로딩된 입자를 디자인하는 방법 및 이들 입자의 조성물을 기재한다. 본 실시예에서는 인간 종양 세포에 대해 효과적인 파클리탁셀 농도 및 치료 지속 기간을 확인한다.
본 출원인은 세 가지 인간 췌장암 세포(PANC1, MIA-PaCa 및 Hs766T) 및 인간 방광 RT4 종양 세포에서 파클리탁셀(물에 용해됨, 96시간 처리)의 세포 독성을 평가하였다. 마이크로테트라졸륨 염료 감소(MTT) 분석을 이용하여 약물 효과를 측정하였다. 이들 세포에서 50% 세포 독성을 나타내는데 필요한 개별적인 농도(IC50)는 1.5, 0.7, 0.7nM이었다. 이들 IC50 값은 인간 유방 MCF7 암세포 및 난소 SKOV3 암세포에서의 파클리탁셀의 IC50에 필적한다(오 등, Cancer Res., 58: 2141-2148, 1998]. 이 데이터는 췌장암 세포가 파클리탁셀에 매우 민감함을 나타낸다. 정맥내 투여된 탁솔(등록상표)(크레모포어 및 에탄올에 용해된 파클리탁셀)이 진행성 췌장암 환자에서 인지할만한 활성을 보이지 않았기 때문에[게비아(Gebbia) 및 게비아, Eur . J. Cancer, 32A: 1822-1823, 1996; 쉬날(Schnall) 및 맥도날드(Macdonald), Semin . Oncol . 23: 220-228, 1996], 이는 놀랄만한 것이다. RT4 세포에서의 파클리탁셀의 IC50은 4.0±0.4nM이었다(96시간 처리).
실시예 2
파클리탁셀 - 로딩된 미립자의 효능을 시험하기 위한 인간 췌장 및 난소 이종 이식 종양 모델의 제작
본 실시예는 파클리탁셀-로딩된 미립자의 효능을 시험하기 위한 복막 종양 모델의 제작을 보여준다.
본 출원인은 림프절 전이로부터 유도되는 인간 췌장 Hs766T 세포를 사용하여, 흉선을 제거한 쥐에서 동소이식 종양 및 복강내 종양을 확립시켰다. 동소이식 모델의 경우, 2×106개의 종양 세포를 췌장 본체 내로 동소 이식시켰다. 종양은 2 내지 3주 후에 자리잡았다(직경 ∼1.5 내지 ∼2cm). 복강내 종양의 경우, 본 출원인은 Hs766T 세포를 복강내 주사한 마우스의 복막 세척액으로부터 수거된 세포를 연속적으로 재이식시킴으로써 전이 계통(subline)을 확립하였다. 6주령 암컷 Balb/c 마우스에게 전이 Hs766T 세포를 복강내로 재이식하면, 복강 전체에 걸쳐 진행성 종양이 확산되었다. 2 내지 3주 후, 직경 ∼1 내지 ∼1.5cm의 종양 결절이 그물막에서 발견되었으며, ∼3 내지 ∼5mm의 복수 결절이 창자사이막, 하복부, 복막뒤 강 및 횡경막에서 발견되었다. 복수 종양도 존재하였다. 동물은 3주와 4주 사이에 죽었다.
복강내 난소 종양 모델의 경우, 본 출원인은 Hs766T 종양에 대해 기재된 바와 같이 인간 난소 SKOV3 세포의 전이 계통을 확립하였다. 전이 SKOV3 세포의 재이식에 의해, 2주째에 그물막에, 4주째에 창자사이막에 종양이 생성되었고, 이어 간 및 신장 같은 내장 기관의 실질을 침범하는 종양이 출현하였으며, 후기 단계(6주 후)에는 횡경막에 위치하는 종양이 출현하였다. 복막액중 단백질 농도는 2주째에 정상적인 마우스의 3%에서 종양-함유 마우스의 약 6%로 증가하였다. 복막액의 부피는 4주 후에 7 내지 10배로 증가되었으며, 종양 세포의 응집체를 함유하였다. 이들 복수 종양의 크기는 40㎛ 내지 수백㎛에 이르렀다. 5 내지 6주 후, 동물은 상당한 체중 감량(10 내지 15%)을 나타내었고, 몇몇 마우스는 복부 팽만(몸통 둘레가 6.3cm에서 7.6cm로 20% 증가하였음) 및 장 폐색을 나타내었다. 동물은 종양 이식 후 7주에서 9주 사이에 죽었다.
췌장 종양 및 난소 종양-함유 마우스에서의 질환 진행은 환자에서 보고된 것과 유사하다. 예를 들어, 난소암 환자는 장막, 간주위 및 비장주위 인대, 횡경막, 창자사이막 및 그물막에서 종양이 나타나는 등, 복강에서 유사한 종양 유포 및 진행을 보인다. 이들은 또한 복강 내에서 혈청 단백질의 누출 및/또는 복수의 존재로 인해 복막액중 높은 단백질 농도(후기 단계에서 4.45g/dl)를 나타낸다[리(Lee) 등, Cancer, 70: 2057-2060, 1992]. 환자에서의 악성 복수는 SKOV3 복수 종양에서 와 같이 유사한 크기의 종양 세포 응집체를 나타낸다[타우치(Tauchi) 등, Acta Cytol., 40: 429-436, 1996; 몬트(Monte) 등, Acta Cytol ., 31: 448-452, 1987].
실시예 3
복강에서의 분포 및 체류에 대한 PLGA 미립자 특성의 효과의 확인
본 발명은 복막 종양을 표적화하는 약물-로딩된 PLGA 입자의 조성물을 개시한다. 본 실시예는 목적하는 체류 및 분포 특징을 갖는 PLGA 미립자의 확인을 돕기 위하여, 복강내에서의 미립자의 분포 및 체류에 대한 PLGA 미립자의 상이한 특성의 효과를 나타낸다. 실시예 4 내지 6은 예로서 항암제로서 널리 사용되는 파클리탁셀을 사용하는 이러한 약물-로딩된 PLGA 미립자의 제조 및 용도를 기재한다.
PLGA 미립자 크기의 효과 . 본 출원인은 복강내 투여 후 상이한 직경, 즉 ∼3㎛ 및 ∼30㎛를 갖는 두 미립자 제제의 분포를 비교하였다. 이들 미립자를 아크리딘 오렌지와 함께 로딩시켰으며, 따라서 UV 광 하에서 가시화될 수 있었다. 24시간 후, 마우스를 안락사시키고 개복하였다(하나의 제제당 마우스 3마리). 도 1은 그 결과를 보여준다. 작은 미립자는 그물막, 창자사이막, 횡경막 및 하복부에서 발견된 반면, 큰 미립자는 하복부에 편재되었다.
복강으로부터의 미립자의 림프를 통한 제거에 대한 유리전이온도의 효과 . 본 출원인은 림프 유동에 의해 복강으로부터 미립자가 제거되는데 대한 유리전이온도(Tg)의 효과를 평가하였다. 마우스에게 75:25 LA:GA(즉, 표 1의 배치 1) 미립자와 50:50 LA:GA(즉, 표 1의 배치 8) 미립자의 혼합물을 복강내 주사하였다. 50:50 미립자 및 75:25 미립자는 크기가 동일하였으나(직경 3㎛) Tg가 상이하였다. Tg는 중합체 쇄 이동을 결정하며; 이동은 Tg보다 높지만 Tg 미만은 아닌 온도에서 발생된다. 중합체 분절의 이동은 미립자의 응집 및 결합을 야기한다. 따라서, 체온보다 낮은 Tg(즉, 30℃ 대 37℃)를 갖는 50:50 LA:GA 미립자는 복강내 투여된 후 응집체를 형성하는 반면, 체온보다 높은 Tg(즉, 53℃)를 갖는 75:25 LA:GA 미립자는 그러하지 않다. 미립자의 응집은 보다 큰 유효 직경을 생성시킨다. 75:25 LA:GA 미립자는 아크리딘 오렌지(녹색 형광)를 함유한 반면, 50:50 LA:GA 미립자는 로다민(적색 형광)을 함유하였다.
주사 후, 마우스를 안락사시키고 횡경막을 절제한 후 물로 세정하였다 횡경막의 1/2을 동결시키고, 동결된 부분을 형광 현미경으로 검사하였다. 나머지 1/2은 포르말린에 고정시키고 주사 전자 현미경을 이용하여 분석하였다. 두 분석은 모두 1시간째에 횡경막 내부의 림프관에 몇 개의 미립자를 나타내었고 24시간째에 상당히 더 많은 미립자를 나타내어, 림프계 내로의 미소구 배출이 시간에 따라 증가하였음을 보여주었다. 1시간째 샘플과 24시간째 샘플 둘 다에서, 50:50 LA:GA 미립자에 비해 75:25 LA:GA 미립자가 약 3배 더 많이 림프관에 존재하였다. 세로칸 림프절에서도 유사한 관찰 결과가 수득되어, 50:50 LA:GA 미립자가 림프를 통한 배출에 의해 더 적게 제거됨을 확인시켜 주었다.
파클리탁셀-로딩된 PLGA 미립자의 특성 및 활성 고유 점도는 유리전이온도(Tg)에 직접적으로 관련되어 있다.
배치 번호 및 제조 방법 고유 점도 (dl/g) Tg (℃) LA:GA 비 직경 (㎛) (평균±SD) 실제 로딩 (%) 수율 (%) 포획 효율 (%) 누적 방출 (%) SKOV3 세포에서의 IC50 (nM)
1일 49일
1(0/W) 0.70 53 75:25 3.1±1.4 1.81 72 65.2 5.7 31.2 -
2(O/W) 0.70 53 75:25 62.2±33.3 1.83 74 67.7 0.25 3.7 >1000
3(W/O/W) 0.70 53 75:25 35.0±21.9 1.08 73 39.4 3.8 19.8 -
4(O/W) 0.70 53 75:25 4.2±2.1 3.91 72 56.3 4.7 28.7 107.8
5(O/W) 0.44 47 50:50 36.8±14.7 4.95 75 74.3 4.5 37.6 -
6(O/W) 0.18 30 50:50 30.4±22.0 3.53 71 50.1 13.6 72.6 18.5
7(W/O/W) 0.18 30 50:50 36.0±20.4 4.05 62 50.2 18.7 71.7 -
8(O/W) 0.18 30 50:50 3.8±2.6 4.25 72 61.2 70.5 96.6 5.0
복강에서의 PLGA 미립자의 우선적인 보유 . 로다민-로딩된 형광 미립자를 사용하여 복강내 투여 후 복강 내에서의 PLGA 미립자의 편재 및 배치를 연구하였다. 이 배치를 용액중 로다민의 배치와 비교하였다. 로다민-로딩된 미립자(직경 3㎛, 50:50 LA:GA)는 먼저 복강 전체에 걸쳐 분포된(예컨대, 15분) 다음, 창자사이막, 그물막 및 횡경막(예컨대 24시간 및 96시간)에 편재되었다. 대조적으로, 용액중 로다민은 15분째에 복강 전체에 광범위하게 분포되었지만 24시간째에 로다민에 수반되는 형광은 복강에서 더 이상 관찰되지 않았다. 이 데이터는 입자가 용액에 비해 복강 내에 우선적으로 보유됨을 나타낸다.
복막 종양 결절에서의 PLGA 미립자의 우선적인 편재 . 아크리딘 오렌지-라벨링된 형광 미립자를 사용하여, 복강내 투여 후 복강내에서의 PLGA 미립자의 편재 및 배치를 연구하였다. 이들 입자는 직경이 ∼3㎛였고, 50:50 LA:GA로 구성되었다. 마우스에게 인간 췌장 HS 766 T-세포의 세포 현탁액을 복강내 이식하였다. 소정 투여량의 아크리딘 오렌지-라벨링된 미립자를 21일째에 또는 질병이 후기 단계일 때(중간 생존 시간이 24일임) 복강내 투여하였다. 24일째에, 동물을 마취시키고 복강을 연 다음 미립자의 형광에 의해 미립자의 분포를 평가하였다. 도 1의 왼쪽 패널은 복강 내에서의 종양 결절의 분포를 보여주는데, 종양은 창자사이막, 그물 막 및 횡경막에 주로 편재되었다. 도 1의 오른쪽 패널은 복강 전체에 걸쳐 유포된 종양 결절상의 녹색 형광 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-라벨링된 입자의 편재화를 보여준다. 동일한 PLGA 미립자를 라벨링시키는데 로다민 또는 아크리딘 오렌지를 사용하는 유사한 연구는 유사한 결과를 나타내었다. 대조적으로, 용액중 이들 형광 염료의 투여(즉, 미립자에 결합되지는 않음)는 종양 조직에 편재화되지 않음을 보여주어, 편재화가 미립자의 독특한 특성임을 나타낸다. 이러한 특성은 활성 종양 표적화를 제공하므로 유리하다.
요약 . 이러한 발견에 기초하여, 본 출원인은 PLGA 미립자내로 로딩된 약제가 용액중 약제(예컨대 입자에 수반되지 않음)와 비교하여 복강 내에 우선적으로 보유되고, 50:50 LA:GA로 구성된 미립자가 림프를 통한 배출에 의해 복강으로부터 서서히 배출되며, 작은 입자(직경 ∼3㎛)가 큰 입자(직경 ∼30㎛)에 비해 복강 내에 더욱 균일하게 분포되고, 보다 낮은 Tg를 갖는 PLGA 입자가 보다 높은 Tg를 갖는 PLGA 입자에 비해 복강에 우선적으로 편재되며, 입자 크기가 림프를 통한 배출 및/또는 복막을 통한 흡수에 의한 제거를 결정하며, PLGA 미립자(직경 ∼3㎛, 50:50 LA:GA)가 복강에서 종양 결절에 우선적으로 편재되는 것으로 결론지었다.
실시예 4
파클리탁셀 - 로딩된 PLGA 미립자
본 실시예는 파클리탁셀-로딩된 PLGA 미립자의 제조 방법 및 PLGA 미립자의 특징 결정 방법을 보여준다. PLGA는 다양한 비의 락트산 또는 락타이드 및 글리콜산 또는 클리콜라이드로 이루어지는 공중합체이다. 본 실시예는 목적하는 약물 방출 속도를 제공하는 PLGA 미립자를 발견하는데 도움을 주기 위하여, 미립자로부터의 약물 방출에 대한 미립자 특성의 효과를 추가로 보여준다. 미립자에 로딩되는 약물의 예로서 파클리탁셀을 사용하였다. 유사한 절차를 이용하여 다른 약물 또는 약제를 이들 미립자 내로 로딩시킬 수 있다.
제조 . 본 출원인은 파클리탁셀-로딩된 PLGA 미립자를 제조하는데 유화/증발 방법을 이용하였다. 간단히, 수중유중수적형(W/O/W) 이중 유화 방법의 경우에는, PLGA 및 파클리탁셀을 염화메틸렌 5ml에 함께 용해시켰다. 30초간 균질화시킴으로써 용액을 물 1ml에 유화시키고 1% 폴리비닐 알콜(PVA) 용액 20ml에 첨가하였다. 수중유적형(O/W) 유화 방법의 경우에는, 약물-중합체 용액을 직접 1% PVA 용액 20ml에 첨가하였다. 두 방법 모두에서, 생성된 유화액을 38℃로 예열된 0.1% PVA 용액 500ml 내로 희석시키고 용매 증발이 완료될 때까지 계속 교반하였다. 30분 후, 원심분리에 의해 미립자를 수거하고 물로 3회 세척한 다음 동결건조시켰다.
약물 로드를 결정하기 위하여, 미립자를 아세토니트릴에 용해시켰다. 내부 기준물인 세팔로만닌(20㎍/ml 메탄올 100㎕)을 첨가하였다. 혼합물을 기류 하에서 건조시켰다. 잔류물을 아세토니트릴 0.1ml에 재용해시킨 다음 물 0.1ml를 첨가하였다. 원심분리 후, 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 상청액을 파클리탁셀 농도에 대해 분석하였다. 블랭크 PLGA 미소구 및 공지량의 파클리탁셀로 구성된 참조 샘플을 유사하게 처리하였다. 약물-로딩된 미립자 상청액중 파클리탁셀의 농도 대 참조 샘플중 파클리탁셀 농도의 비는 약물 로드를 나타내었다.
특징 결정 . 주사 전자 현미경을 사용하여 파클리탁셀-로딩된 PLGA 미립자의 표면 형태 및 내부 구조를 연구하였다. 미립자는 형태가 구형이고 표면이 매끈하였다. O/W 방법을 이용하여 제조된 미립자(배치 2)는 균질하게 충진된 내부 구조를 보인 반면, W/O/W 방법을 이용하여 제조된 미립자(배치 3)는 다공성의 다-구획 내부 구조를 보였다. 표 1은 파클리탁셀-로딩된 미립자의 특징을 보여준다.
목적하는 약물 방출 속도를 나타내는 PLGA 미립자 특성의 확인 . 본 출원인은 미립자 특성과 37℃에서 트윈 80(pH 7.4) 0.1%를 함유하는 인산염-완충된 염수중에서의 파클리탁셀의 방출 사이의 관계를 평가하였다. 아래 개략적으로 기재된 결과는 미립자의 특성을 변화시킴으로써 미립자로부터의 파클리탁셀의 방출 속도 및 방출 한도를 미세하게 조정할 수 있음을 나타낸다.
PLGA 입자 크기의 효과 . 방출 속도 및 방출 한도는 미립자의 크기에 반비례하였다. 예를 들어, 50:50 몰비의 LA:GA를 사용하여 제조된 미립자의 경우, ∼4㎛의 직경을 갖는 배치 8이 ∼30㎛의 더 큰 직경을 갖는 배치 6에 비해 더 높은 방출을 나타내었다. 유사하게, 크기 면에서만 배치 2와 상이한 배치 1(직경 ∼3㎛ 대 ∼60㎛)은 더욱 신속한 방출을 나타내었다. 보다 작은 미립자가 큰 미립자에 비해 더 높은 표면적 대 부피 비를 가졌다. 표면적의 증가는 파클리탁셀을 수성 매질에 더욱 많이 노출시켜 더 큰 초기 파열을 야기하였다. 뿐만 아니라, 더 작은 미립자는 더 짧은 확산 경로 길이를 가져, 더욱 신속한 약물 방출 및 기질 분해를 나타내었다.
PLGA 미립자의 내부 구조의 효과 . 다공성의 다-구획 구조를 나타내는 미립자는 충전된 구조의 미립자에 비해 더 높은 방출 속도를 나타내었다. 이는 다-구획 미립자에서의 더 짧은 확산 경로 길이에 의해 야기될 수 있다. 예를 들어, 담체로서 50:50 LA:GA를 사용하는 경우, 다-구획 내부 구조를 나타내는 미립자는 충진된 내부 구조를 갖는 미립자에 비해 더 높은 초기 방출을 보여주었다(즉, 배치 7 대 배치 6). 마찬가지로, 담체로서 75:25 LA:GA를 사용하는 경우, 다-구획 내부 구조를 나타내는 미립자는 충진된 내부 구조를 갖는 미립자에 비해 더 신속한 방출을 보여주었다(즉, 배치 3 대 배치 2).
PLGA 미립자의 고유 점도의 효과 . 중합체 분자량에 의해 결정되는 고유 점도는 방출 속도에 반비례한다. 예를 들어, 배치 3 및 7은 W/O/W를 이용하여 제조되었고 동일한 입자 크기를 가졌다. 더 높은 고유 점도를 나타내는 배치 3이 3.5배 더 느리게 파클리탁셀을 방출시켰다.
PLGA 미립자의 중합체 조성의 효과 . 50:50 LA:GA로 제조된 미립자는 75:25 LA:GA를 사용하여 제조된 미립자보다 더 높은 방출 속도를 나타내었다. 이는 50:50 LA:GA 미립자가 더욱 비정질(즉, 더 낮은 결정화도)이기 때문이다. 그의 낮은 수용해도로 인해, 미립자 내부 또는 외부로의 유체 확산이 미립자로부터의 파클리탁셀의 방출을 담당한다. 결정화도 감소는 미립자 내로의 유체의 확산을 향상시킨다. 향상된 유체 확산은 또한 중합체의 열화를 가속화시켜 보다 신속한 약물 방출을 나타낸다[알론소(Alonso) 등, Vaccine, 12: 299-306, 1994].
실시예 5
파클리탁셀 - 로딩된 PLGA 미립자의 종양-침투
본 실시예는 상이한 약물 방출 프로파일을 갖는 미립자 제제의 혼합물의 사용을 보여주며, 이 때 하나의 제제는 파클리탁셀을 신속하게 방출시켜(예컨대, 24시간 내에 70%) 세포자멸사를 유도함으로써 PLGA 미립자의 종양 침투를 향상시킨다.
복막 종양에서 미립자의 침투 . 인간 Hs766T 췌장 이종 이식 종양 세포를 마우스에 복강내 이식하였다. 복강내 종양이 자리를 잡으면(21일째), 종양 내로의 입자 침투를 용이하게 검출하기 위해 아크리딘 오렌지-라벨링된 직경 ∼3㎛의 파클리탁셀-로딩된 미립자 소정 투여량으로 동물을 처리하였다. 이들 미립자는 파클리탁셀을 신속하게 방출하였으며(24시간에 ∼70%) 이에 따라 세포자멸사를 유도하였고, 다시 세포자멸사에 의해 종양 내로의 미립자의 침투가 용이해졌다. 파클리탁셀 없이 동일한 방법을 이용하여 제조된 블랭크 미립자로 동물의 다른 군을 처리하였다. 24일째에, 그물막 및 부착된 종양을 수획하였다. 그물막은 복강과 복막뒤를 분리하는 인대이고, 마우스 및 인간 환자에서 종양이 집중되는 부위이다. 종양을 동결시키고 절제하였다. 아크리딘 오렌지-라벨링된 입자를 가시화시키는 형광 현미경법에 의해, 종양 내로의 상이한 깊이에서의 입자 침투를 결정하였다. 도 2는 그 결과를 보여준다. 입자 침투는 광범위하였고, 분포는 고형 종양 전체에 걸쳐 균일하였다. 대조적으로, 파클리탁셀을 사용한 종양 시동 처리 없이 블랭크 미립자로 처리된 동물로부터의 종양에서는, 미립자가 종양 주변부에만 보유되었다.
복막 종양에서의 파클리탁셀 농도 . 본 출원인은 파클리탁셀-로딩된 미립자(배치 8) 또는 탁솔(등록상표)의 복강내 점적 주입 후, 그물막상에 위치된 고형 종양에서의 파클리탁셀의 농도를 비교하였다. 미립자로부터 유도되는 피크 파클리탁셀 농도는 시판중인 탁솔(등록상표) 제제(24시간째에 달성된 3.2㎍/g)에 비해 상당히 더 높았고(13㎍/g) 더 오랜 시간(즉, 3일) 후에 달성되었다. 이들 농도는 유리 약물과 포획 약물의 총계이다. 1차 사다리꼴 방식을 이용하여 계산된, 총 약물 노출의 지표인 농도-시간-곡선 아래의 면적은 미립자의 경우가 16배 더 높아서(82 대 5㎍-일/g), 파클리탁셀-로딩된 PLGA 미립자의 상당한 종양 표적화 이점을 나타내었다.
실시예 6
파클리탁셀 - 로딩된 PLGA 미립자의 생물학적 활성
본 실시예는 파클리탁셀-로딩된 PLGA 미립자가 시험관내 조건 및 생체내 조건에서 생물학적으로 활성임을 보여준다. 미소구 내로 캡슐화시킨 후 파클리탁셀의 생물학적 활성에는 변화가 없다. 또한, 파클리탁셀 로딩된 PLGA 미소구는 그의 종양 표적화 특성 및 종양에서의 지속적인 보유로 인해 시판중인 탁솔(등록상표) 제제보다 탁월한 생체내 효능을 나타내었다.
시험관내 생물학적 활성 . 인간 난소 SKOV3 암세포를 사용하여 이를 연구하였다. 설포로다민 B 분석을 이용하여 약물 효과를 측정하였다(오 등, Cancer Chemother. Pharmacol ., 41: 69-74, 1997). 이 연구에서는 처리한지 96시간 후에, 수용액중 유리 파클리탁셀(즉, 배지에 용해된 파클리탁셀) 및 4가지 파클리탁셀-로딩된 PLGA 미립자 제제(즉, 표 1의 배치 2, 4, 6 및 8)의 농도-응답 곡선을 비교하였다. 4가지 제제의 생물학적 활성의 등급 순서는 약물 방출 속도의 등급 순서와 동일하고, 신속한 방출 제제가 더욱 활성이었다. 예를 들어, 96시간에 81.5%를 방출한 배치 8이 가장 활성이었고, 그 다음으로는 28.5%를 방출한 배치 6 및 10.9%를 방출한 배치 4였다. 0.25%를 방출한 배치 2는 세포 독성 효과를 갖지 않았다. 50% 세포 독성에 필요한 개별 농도는 5.0, 18.5, 108 및 >1000nM이었다.
생체내 생물학적 활성 . 본 출원인은 시판중인 탁솔(등록상표) 제제의 항종양 활성에 대해 파클리탁셀 PLGA 미립자의 항종양 활성을 비교하였다. 투여량은 미립자의 경우 120mg/kg(파클리탁셀에 상응함)이었고, 탁솔(등록상표)의 경우 40mg/kg이었다. 이들 투여량에서, 이들 두 제제는 독성이 동일하였고, 2일 내에 약 10% 체중 감량을 나타내었으며, 그 후 동물은 체중을 회복하였다. 미립자는 세 가지 제제, 즉 파클리탁셀을 급속하게 방출하는 제제(배치 8, 1일에 70.5%) 및 서서히 파클리탁셀을 방출하는 두 제제(배치 6, 49일에 72.6%; 배치 4, 49일에 28.7%)로 구성되었다. 입자 특성은 실시예 3에 자세히 기재되어 있다. 결과는 미립자의 상당한 생존 이점을 보여주는데; 비히클-처리된 대조군의 경우 중간 생존 시간은 47일이었고, 탁솔(등록상표) 군은 85.5일, 미립자 군은 115.5일이었다(탁솔(등록상표)과 미립자 사이의 차이의 경우 p<0.01). 이 연구가 후기 단계 질환(이식 후 4주일)에서 수행되었고 상이한 크기(약 3 내지 4㎛ 및 약 30㎛)의 두 서방성 미립자의 조합을 사용하였음에 주목한다.
복막 진행성 췌장암을 갖는 동물에서도 유사한 결과가 얻어졌다. 인간 췌장 Hs766T 종양을 마우스에게 복강내 이식시켰다. 이식한 후 10일째에 종양이 자리잡은 후, 동물을 생리 식염수, 탁솔(등록상표)(60mg/kg) 또는 파클리탁셀 입자(급속 방출 제제와 두 서방성 제제의 조합)로 처리하였다. 개별적인 중간 생존 시간은 23, 33 및 57일이었다. 블랭크 미립자는 염수 대조용과 유사한 데이터를 나타내었다.
두 제제의 투여 후 혈장 및 조직 농도 . 고성능 액체 크로마토그래피 분석을 이용하여 혈장 및 복강내 조직의 파클리탁셀 농도를 결정하였으며, 1차 사다리꼴 방식을 이용하여 0 내지 168시간의 농도-시간 곡선 아래의 면적(AUC)을 계산하였다. 결과는 표 2에 기재되어 있으며, PLGA 미립자 내로 로딩된 파클리탁셀의 투여가 탁솔(등록상표)과 비교할 때 복막 조직에서 2.5 내지 6배 더 높은 농도를 나타내었음을 보여준다. 동시에, 혈장 농도는 1.5배만 높아져서 파클리탁셀 미립자의 사용에 의한 우선적인 조직 표적화를 보여준다.
미립자로서 제형화된 파클리탁셀(120mg/kg) 또는 탁솔(등록상표)(40mg/kg)의 동일 독성 투여량을 복강내 투여한 후 혈장 및 복강내 조직의 파클리탁셀 농도. AUC0 →168시간은 1차 사다리꼴 방식을 이용하여 계산하였다.
조직 AUC0 →168시간(㎍/g·시간) 비
미립자 탁솔
혈장* 8.15 5.43 1.50
복막 세척액** 960 257 3.73
간 319 130 2.46
소장 210 60.2 3.49
대장 171 38.3 4.48
결합 조직 1389 227 6.12
* 혈장 AUC = (㎍/ml· 시간) ** 복막 세척액 AUC = (최초 투여량·시간의 %)
본 연구에서는 미립자 및 탁솔(등록상표)의 동일 독성 단일 투여량을 사용하였다. 이 기준에 의해, 미립자의 파클리탁셀-상응 투여량은 탁솔(등록상표)의 투여량보다 더 높았다. 이는 약물의 서방성이 투여 강도를 감소시켰고, 따라서 독성을 감소시키고 최대 허용 투여량을 증가시켰기 때문이다. 탁솔(등록상표)의 반복투여가 이 군에서의 치료 결과를 개선시켰지만, 파클리탁셀-로딩된 미립자의 경우에는 반복 투여가 필요하지 않았다. 후자는 미립자의 이점중 하나를 제공하며, 이에 따라 빈번한 투여의 필요가 감소된다.
실시예 7
파클리탁셀 - 로딩된 젤라틴 나노입자의 제조 및 특징 결정
본 실시예는 파클리탁셀-로딩된 젤라틴 나노입자의 제조 및 특징 결정을 보여준다.
파클리탁셀 - 로딩된 젤라틴 나노입자의 제조 . 상이한 블룸 수(75 내지 100, 175 및 300)를 갖는 젤라틴의 몇 가지 제제를 사용하고 탈용매화 방법[오펜하임(Oppenheim, R. C.), Int . J. Pharm ., 8: 217-234, 1981]을 이용하여, 나노입자를 제조하였다. 2% 트윈 20을 함유하는 물 10ml에 젤라틴(200mg)을 용해시켰다. 300rpm에서 일정하게 교반하면서 용액을 40℃로 가열하였다. 이 용액에 황산나트륨 20% 수용액 2ml를 서서히 첨가한 후 파클리탁셀 2mg을 함유하는 이소프로판올 1ml를 첨가하였다. 두번째 분취량의 황산나트륨 용액(5.5 내지 6ml)을 용액이 혼탁해질 때까지(이는 젤라틴 응집체의 형성을 나타냄) 첨가하였다. 용액이 투명해질 때까지 증류수 약 1ml를 첨가하였다. 글루타르알데히드의 수용액(25%, 0.4ml)을 첨가하여 젤라틴을 가교결합시켰다. 메타중아황산나트륨 용액(12%, 5ml)을 5분 후에 첨가하여 가교결합 과정을 중단시켰다. 1시간 후, 조질 생성물을 세파덱스(Sephadex) G-50 칼럼에서 정제시켰다. 나노입자-함유 분획을 48시간에 걸쳐 동결건조기에서 동결건조시켰다.
폴리 (리신) 코팅되고 파클리탁셀 - 로딩된 젤라틴 나노입자의 제조 . 유사한 방법을 이용하여 나노입자를 코팅되지 않은 나노입자로서 제조하였다. 나노입자가 형성된 후 가교결합의 후기 단계 동안, 폴리(리신)을 젤라틴 중량의 약 5% 내지 약 10%에 상응하는 중량으로 첨가하여, 폴리(리신)-코팅된 나노입자를 생성시켰다. 정제 단계는 상기 기재된 코팅되지 않은 나노입자의 경우에 이용된 단계와 동일하였다.
젤라틴 나노입자중 파클리탁셀 로딩의 결정 . 파클리탁셀-로딩된 나노입자 2mg을 인산염-완충된 염수(PBS) 0.5ml에 분산시키고 37℃에서 대사 쉐이커에서 프로나제(PBS중 1mg/ml) 0.5ml로 분해시켰다. 약 1시간 후 또는 투명한 용액이 수득된 후, 내부 기준물인 세팔로만닌(20㎍/ml 메탄올 50㎕)을 첨가한 다음, 각각 3ml의 에틸 아세테이트 두 부피로 추출하였다. 에틸 아세테이트 층을 모으고 기류하에서 건조시킨 다음 아세토니트릴에 재용해시켰다. 추출물중 파클리탁셀 농도를 참조 샘플중 농도에 비교하여 파클리탁셀 로딩을 결정하였다. 블랭크 젤라틴 나노입자 및 공지량의 파클리탁셀의 혼합물로 이루어진 참조 샘플을 나노입자에 대해 상기 기재된 바와 같이 처리하였다.
표 3은 파클리탁셀 나노입자의 상이한 제제의 물리적 특성을 보여준다. 나노입자의 수율은 40 내지 82%였고, 젤라틴 분자량의 증가에 따라 감소되었다. 실제 약물 로딩은 이론적인 로딩의 33 내지 78%였다.
파클리탁셀-로딩된 젤라틴 나노입자의 로딩 효율. 보다 높은 블룸 수는 보다 높은 분자량을 나타낸다(3가지 제제의 평균±표준편차).
젤라틴 분자량(블룸 수) 수율*(%) 이론적인 로딩(중량%) 실제 로딩(중량%)
75-100 75.9±8.0 0.99 0.46±0.08
175 82.7±7.5 0.99 0.74±0.07
300 52.0±7.5 0.99 0.33±0.05
175 56.6±9.3 1.96 1.54±0.09
300 39.7±8.6 1.96 0.76±0.06
* 수율은 젤라틴 출발 중량의 %로서 표현된, 제조 및 겔 여과 후 수득된 동결건조된 젤라틴 나노입자의 중량이다.
높은 분자량의 젤라틴을 사용하여 제조된 나노입자는 큰 응집체를 형성하였으며; 응집체의 직경은 10 내지 >30㎛였다. 칼럼 크로마토그래피에 의한 정제 단계 동안 이들 응집체를 제거한 결과, 낮은 수율 및 낮은 약물 포획 효율을 나타내었다. 낮은 포획 효율은 또한 낮은 분자량의 젤라틴을 사용하여 제조된 나노입자에서도 관찰되었다. 중간 분자량 젤라틴(175블룸)을 사용하여 최적 및 최고 수율 및 포획 효율이 달성되었다. 후속 연구에서는 175블룸을 갖는 젤라틴을 사용하여 파클리탁셀-로딩된 나노입자를 제조하였다.
파클리탁셀 - 로딩된 나노입자의 특징 결정 . 젤라틴 나노입자와 증류수(∼50㎕)의 혼합물을 호일 종이 위에 놓고 건조시킨 후 금으로 코팅시키고 필립스(Philips) XL 30 주사 전사 현미경(SEM) 하에서 관찰하였다. 입자 크기 분포의 경우, 4 내지 6개의 시역으로부터 취한 SEM 이미지를 사용하여 1,000개가 넘는 나노입자를 검사하였다. 생산 수율은 동결 건조된 젤라틴 나노입자의 중량으로부터 계산하였고 젤라틴 출발 중량의 %로서 표현하였다. SEM 결과는 나노입자의 형상이 구형이고 평균 크기가 600 내지 1,000nm임을 보여주었다.
신탁(Scintag) PAD-V 회절계를 사용하여, 순수한 파클리탁셀, 파클리탁셀(2%, 중량%)과 블랭크 젤라틴 나노입자의 혼합물 및 파클리탁셀-로딩된 나노입자(1.62% 로딩)의 광각 X-선 회절(WAXD) 스펙트럼을 수득하였다. 1°/분의 주사 속도로 샘플을 5°에서 60°까지 주사시켰다. WAXD 결과는 유리 파클리탁셀 및 유리 파클리탁셀과 블랭크 젤라틴 나노입자의 혼합물에 대해서는 X-선 회절 스펙트럼에서 날카로운 피크를 보여주었지만 파클리탁셀-로딩된 젤라틴 나노입자에 대해서는 그러지 않았다. 이는 나노입자에 포획된 파클리탁셀이 결정질 상태가 아닌 비정질 상태로 존재함을 나타낸다. 급속한 해리 속도 때문에 비정질 상태가 바람직하다.
젤라틴 나노입자로부터의 파클리탁셀의 방출 . 파클리탁셀 나노입자(12mg)를 100ml PBS에 분산시키고 37℃에서 항온처리하였다. 일련의 샘플(1ml)을 회수하고 벡크만(Beckman) L-70 원심분리기를 이용하여 40,000rpm에서 15분동안 원심분리시켰다. 나노입자를 함유하지 않는 상청액 400㎕를 제거하고 3ml 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 에틸 아세테이트 추출물을 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 파클리탁셀 농도에 대해 분석하였다.
흡착 연구의 결과는 나노입자에 로딩된 파클리탁셀 총량의 약 4.5%가 나노입자 상에 흡착되었음을 보여주었다. 나노입자로부터 PBS 내로의 파클리탁셀의 방출은 신속하여, 각각 37℃에서 15분 후, 2시간 후 및 3시간 후에 55%, 87% 및 92%를 방출하였다.
파클리탁셀 - 로딩된 나노입자의 생물학적 활성 . 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)(메릴랜드주 록크빌)에서 인간의 RT4 방광 전이 방광암 세포를 수득하고, 공기중 5% CO2의 습한 대기중에서 37℃에서 9% 태아 송아지 혈청, 2mM L-글루타민, 90㎍/ml 젠타마이신 및 90㎍/ml 세포탁심 소듐이 보충된 맥코이(McCoy's) 배지에서 배양하였다. 트립신을 사용하여 아융합성(subconfluent) 배양액으로부터 세포를 수획하고 새로운 배지에 재현탁시켰다. 트립신 블루 배제에 의해 결정될 때 90%보다 높은 생존력을 갖는 세포를 사용하였다. 세포를 96개-웰 마이크로타이터(microtiter) 플레이트에 접종하고(∼2,000개 세포/웰) 24시간동안 플레이프 표면에 부착시켰다. 본 출원인은 파클리탁셀이 즉각적인 세포 독성 및 지연된 세포 독성을 나타냄을 밝혀내었다(오 등, Cancer Res., 58: 2141-2148, 1998). 즉각적인 효과의 평가를 위하여, 동일한 파클리탁셀 투여량의 파크리탁셀 수용액(유리 파클리탁셀이라고 함) 또는 파클리탁셀-로딩된 나노입자 분취량을 함유하는 0.2ml 배지에서 48시간 및 96시간동안 세포를 배양하였다. 처리한 후 즉시 약물 효과를 측정하였다. 지연된 효과의 평가를 위하여, 세포를 15분 및 2시간동안 유사하게 처리하고 PBS로 한 번 세척한 다음 약물을 함유하지 않는 배지에서 총 96시간동안 배양하고 약물 효과를 측정하였다.
유리 약물의 경우, 먼저 파클리탁셀을 에탄올에 용해시킨 다음 배지를 사용하여 연속적으로 희석시킴으로써 파클리탁셀의 모용액을 제조하였다. 최종 에탄올 농도는 0.1% 미만이었다.
설포로다민 B 분석을 이용하여 처리 후 잔류하는 세포 수를 측정하였다(오 등, Cancer Chemother . Pharmacol ., 41: 69-74, 1997). 비선형 회귀를 이용하여 S자형 농도-응답 곡선을 분석함으로써, 50% 억제를 나타내는 약물 농도(IC50)를 수득하였다.
즉각적인 효과의 경우, 유리 파클리탁셀 또는 나노입자-포획된 파클리탁셀을 이용한 처리는 48시간에 60%, 96시간에 84%의 최대 억제를 나타내었다. 처리 시간에 따른 최대 파크리탁셀 세포 독성의 증가는 본 출원인의 이전의 관찰과 일치한다(오 등, Cancer Res., 58: 2141-2148, 1998). 48시간 처리 및 96시간 처리에 있어서, 개별적인 IC50 값은 유리 파클리탁셀의 경우 11.0±0.4nM 및 4.0±0.4nM이었고, 파클리탁셀-로딩된 나노입자의 경우 9.6±1.1nM 및 4.0±0.3nM(파클리탁셀에 상응)이었다(두 제제 모두에서 3회 실험의 평균±SD). 이들 두 제제의 IC50 값 사이의 차이는 유의하지 않다(48시간의 경우 p=0.15, 96시간의 경우 p=0.71, 쌍을 이루지 않은 t-시험).
지연된 효과(즉, 96시간에 측정된 효과)의 경우, 유리 파클리탁셀 또는 나노입자-포획된 파클리탁셀을 이용하여 15분 및 2시간동안 처리하면 74% 내지 85%의 최대 억제를 나타내었다. 15분 처리 및 2시간 처리에 있어서, 개별적인 IC50 값은 유리 파클리탁셀의 경우 156.7±6.6nM 및 33.0±4.8nM이었고, 파클리탁셀-로딩된 나노입자의 경우 165.7±33.5nM 및 31.4±1.8nM(파클리탁셀에 상응)이었다(두 제제 모두에서 3회 실험의 평균±SD). 이들 두 제제의 상응하는 IC50 값 사이의 차이는 유의하지 않다(15분 처리의 경우 p=0.70, 2시간 처리의 경우 p=0.64, 쌍을 이루지 않은 t-시험). 이 데이터는 나노입자로부터의 파클리탁셀의 급속한 방출을 나타내고, 파클리탁셀-로딩된 나노입자가 에탄올 및 물에 용해된 유리 파클리탁셀(크레모포어의 부재하에서)과 똑같이 효과적임을 나타낸다.
실시예 8
파클리탁셀 - 로딩된 젤라틴 나노입자의 방광내 점적 주입 후 방광 벽으로의 높은 파클리탁셀 농도의 전달
본 실시예에서는 방광 강 내로 점적 주입될 때 파클리탁셀-로딩된 젤라틴 나노입자가 방광 조직으로 고농도의 파클리탁셀을 전달함을 입증한다.
다른 문서(위엔테스 등, Cancer Res., 51: 4347-4354, 1991; 송 등, Cancer Chemother. Pharmacol ., 40: 285-292, 1997)에 기재되어 있는 바와 같이, 파클리탁셀-로딩된 젤라틴 나노입자의 점적 주입 후 방광 조직으로의 파클리탁셀의 전달을 결정하였다. 간략히, 파클리탁셀-로딩된 젤라틴 나노입자의 용액(총 중량 250mg중에 1mg 파클리탁셀을 함유함)을 2시간동안 마취된 개의 방광 내로 점적 주입하였다. 그 후, 방광을 제거하고 증발(flash) 동결시킨 후, 동결박편기를 사용하여 요로상피 표면에 평행하게 절단하여 40㎛ 슬라이스를 만들었다. 중량을 측정한 다음, 이미 기재한 바와 같이(송 및 오, J. Chromatogr., 663: 337-344, 1995) 고성능 액체 크로마토그래피 분석을 이용하여, 동결된 조직 샘플을 파클리탁셀 농도에 대해 분석하였다. 결과는 방광 벽에서의 파클리탁셀 농도가 요로상피, 즉 방광의 내면에서의 약 50㎍/g(대략 60μM에 상응함)으로부터 요로상피로부터 500㎛ 떨어진 깊이에서의 약 1㎍/g로 감퇴되었고, 500㎛보다 더 깊은 조직 깊이에서는 약 0.5㎍/g으로 비교적 일정하게 유지되었음을 보여준다. 요로상피 농도는 뇨중 결합되지 않은 농도를 약 20배 초과하여, 파클리탁셀이 방광 벽 내로 우수하게 침투하였음을 나타내었다. 이들 조직 농도는 또한 인간 방광 RT4 암세포에서 세포 독성을 나타내는 파클리탁셀 농도(즉, 2시간 처리에서 ∼33nM, 실시예 1 참조)를 초과하였다.
2시간 처리를 종결시키고 투여 용액을 배출시킨 후 22시간째에(즉, 투여량 투여후 24시간째) 방광 조직 농도를 분석함으로써 다른 개에서 젤라틴 나노입자 내에서 투여된 후 파클리탁셀의 조직 보유를 연구하였다. 파클리탁셀 농도는 요로상피에서 0.14㎍/g(약 165nM)이었고, 500㎛의 깊이에서의 0.01㎍/g까지 서서히 감퇴되었다. 이 데이터는 방광 조직에서의 파클리탁셀의 상당한 보유를 나타내었고; 약물 소멸의 반감기는 ∼150분인 것으로 평가되었으며, 이는 인간 방광 조직에서의 마이토마이신 C의 경우 5분 미만의 반감기(위엔테스 등, Cancer Res., 53:3314-3320, 1993)와 비교할 때 30배 이상 더 길다.
실시예 9
개 환자의 방광 종양으로부터 유도된 조직 배양액중 파클리탁셀 - 로딩된 젤라틴 나노입자의 효능
방광암에 걸린 것으로 진단된 개 환자 3마리의 방광으로부터 경요도 절제에 의해 방광 종양을 수득하였다. 종양을 1mm 조각으로 절단하고 콜라겐 겔에서 조직 배양액으로서 배양한(오 등, Cancer Chemother . Pharmacol ., 41: 69-74, 1997) 후, 파클리탁셀-로딩된 나노입자로 2시간동안 처리하였다. 파클리탁셀에 상응하는 값으로 표현된 브로모데옥시우리딘 라벨링 저해의 IC50 값은 1마리 개로부터의 종양에서 2.2μM이었고, 나머지 2마리 개로부터의 종양에서 >10μM이었다.
IC50 값, 방광 조직에서의 약물 농도(실시예 8 참조) 및 이들 개 3마리에서의 임상 결과(실시예 10 참조)의 3-방식 비교는 가장 감수성인 종양(즉, 가장 낮은 IC50 값)을 갖는, 따라서 치료 이점을 나타내기에 충분한 약물을 수용한 개가 파클리탁셀-로딩된 나노입자를 사용한 치료에 바람직하게 응답함(종양 크기가 50% 이상 감소되었음)을 보여준다. 대조적으로, 나머지 두 개에서의 IC50 값은 획득가능한 방광 조직 농도를 초과하였고, 이들 동물의 종양은 진행성 질환을 나타내었다[즉, 50% 이상의 크기 증가; 헬판드(Helfand) 등, J. Am. Anim . Hosp . Assoc ., 30: 270-275, 1994].
본 실시예는 젤라틴 나노입자 내에 제형화된 파크리탁셀에 대한 방광 조직의 감수성 및 시험관내 결과 및 생체내 결과 사이의 상관관계를 보여준다. 인간 표층 방광 종양에서의 파클리탁셀의 IC50 값이 개에서보다 낮고, 직접적인 방광내 점적 주입에 대한 지원자인 인간 환자에서의 방광 종양이 방광 벽의 점막 층을 지나 침투하지 않고 표면적임은 주목할만하다. 인간 방광 종양에 대해 본 출원인이 이전에 수득한 IC50 값은 인간 환자로부터 수득된 T0 및 T1 방광 종양의 단계에서 1.2μM이다[오 등의 문헌(Cancer Chemother . Pharmacol ., 41: 69-74, 1997)에 기재되어 있는 데이터로부터 계산됨]. 이는 인간 환자에서의 임상 결과가 개에서보다 더욱 우수할 것임을 암시한다.
실시예 10
방광암에 걸린 개 환자에서 파클리탁셀 - 로딩된 젤라틴 나노입자의 효능
방광의 이행 세포 암종(TCC)을 갖지만 전이의 증거가 없는 개가 적합하였다. 20ml 염수 현탁액중 파클리탁셀-로딩된 나노입자 1mg을 전신 마취하에 폴리(Foley) 카테터를 통해 방광내로 3주일동안 매주 1회 투여하였다. 투여량은 젤라틴 250mg중 파클리탁셀 1mg이었다. 모든 환자에게 예방용 항생제 및 데라콕시브를 투여하였다. 2시간 처리 전 및 2시간 처리 동안 혈액 샘플 및 뇨 샘플을 수거하였다. 칼럼-스위칭 HPLC에 의해 뇨중 파클리탁셀 농도 및 조직 파클리탁셀 농도를 분석하였다. 복부 초음파 검사를 이용하여 종양 응답을 모니터링하였다.
개 6마리를 치료하였으며, 4마리의 환자는 이전에 치료를 받지 않았다. 혈장 농도는 모든 시점에서 HPLC 검출 한도 미만이었다. 평균 초기 뇨 농도 및 평균 최종 뇨 농도는 각각 27.51±8.59g/ml(n=16) 및 11.16±8.63g/ml(n=15)이었다. 미결합 파크리탁셀의 농도는 0.8 내지 1㎍/ml의 농도에서 일정하게 유지되었으며, 이는 대략 체온에서 파클리탁셀의 최대 수용해도이다. 전체 응답은 2마리의 부분적인 응답, 안정한 질환을 갖는 환자 2마리(즉, 부분 응답 및 진행성 질환이 아님) 및 진행성 질환을 갖는 환자 2마리였으며; 임상적 응답 또는 결과의 정의는 실시예 9에 기재되어 있다. 전신 약물 흡수 또는 독성의 증거는 없었다. 환자중 2/6의 객관적인 응답율(33%)은 다른 화학 치료제를 사용한 방광내 치료에 대해 문헌에 보고된 응답율(12.5%)[0 내지 20%, 평균 12.5%; 무챌스(Mutsaers) 등, J. Vet. Intern. Med. 17: 136-144, 2003]보다 높다.
실시예 11
정맥내 투여 후 젤라틴 나노입자에 의한 신장 표적화
파클리탁셀-로딩된 젤라틴 나노입자의 분포를 시판중인 탁솔(등록상표) 제제의 분포와 비교함으로써 젤라틴 나노입자에 의한 신장 표적화 이점을 연구하였다. 젤라틴 나노입자를 제조하여 1분간에 걸쳐 꼬리 정맥을 통해 마우스에 정맥내 투여하였다. 파클리탁셀 투여량은 10mg/kg이었다. 동물을 24시간 후에 안락사시켰다. 기관을 제거하고 균질화 및 추출시킨 다음, 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 파클리탁셀 농도에 대해 분석하였다. 실시예 7에 기재되어 있는 바와 같이 이들 절차를 수행하였다. 나노입자(직경 664nm, 4% 로딩)는 파클리탁셀을 신속하게(37℃에서 24시간에 70%) 방출시켰다. 혈액중 파클리탁셀(유리 및 결합)의 총 농도는 감퇴하였으며, 주요 반감기는 14시간이었다. 파클리탁셀은 간, 소장 및 신장에서 최고 수준으로 분포 및 보유되었다(표 4). 조직 대 혈액 농도의 비는 간>소장>신장>>대장>비장=위장>폐>심장의 등급 순서였다. 이는 간>소장>대장>위장>폐≥신장>비장>심장의 조직 분포 등급 순서를 갖는 탁솔(등록상표)의 분포와 상이하다. 혈장 농도에 대해 정규화시킨 후 나노입자로서 또는 탁솔(등록상표)로서의 투여 후의 조직 농도의 비로서 선택적인 보유를 계산하였다. 신장에서의 선택적인 보유는 7.86배였으며, 모든 기관 중에서 최고였다. 나노입자로서의 투여 후 신장에서의 파클리탁셀 농도의 최종 반감기는 탁솔(등록상표)로서의 투여의 경우 1.94시간에 비해 13.7시간이었다. 이 데이터는 젤라틴 나노입자가 신장에 우선적으로 보유됨을 나타낸다.
젤라틴 나노입자 제제 및 크레모포어/에탄올(즉, 탁솔(등록상표)) 제제에 의해 전달되는 파클리탁셀의 혈액 및 조직 약동학. 파클리탁셀-로딩된 나노입자 또는 크레모포어 및 에탄올에 용해된 파크리탁셀을 마우스에게 정맥내 투여하였다(파클리탁셀 10mg/kg에 상응함). 투여 후 5분 내지 24시간에 걸친 9개 시점을 연구하였다. 각 시점당 동물 3마리를 이용하였다. 0 내지 24시간의 농도-시간 곡선 아래의 면적(AUC)을 계산하였다. C조직:C혈액 비는 9개의 시점 모두의 평균값이었다.
혈액 간 비장 폐 심장 신장 위장 소장 대장
나노입자
AUC(혈액의 경우 g/ml; 조직의 경우 mg·hr/kg) 4.78 379 64.8 36.1 18.6 165 65.8 288 75.0
C조직:C혈액 비 1.00 67.0 12.5 6.87 2.89 30.3 11.9 59.3 21.3
AUC조직:AUC혈액 비 1.00 79.2 13.5 7.59 3.88 34.4 13.8 60.1 15.7
크레모포어/에탄올 제제
AUC(mg·hr/kg) 6.73 164 31.9 33.8 16.0 33.7 55.0 120 88.6
C조직:C혈액 비 1.00 16.3 2.93 4.20 1.76 3.23 3.94 10.5 3.21
AUC조직:AUC혈액 비 1.00 24.4 4.73 5.03 2.38 5.01 8.17 17.8 13.2
C조직:C혈액 비 및 AUC조직:AUC혈액 비의 평균
나노입자 1.00 73.1 13.0 7.23 3.39 32.4 12.9 59.7 18.5
크레모포어/에탄올 제제 1.00 20.6 3.83 4.62 2.07 4.12 6.06 14.1 8.19
나노입자:크레모포어/에탄올 1.00 3.60 3.40 1.57 1.63 7.86 2.12 4.23 2.26
등가물
당해 분야의 숙련자는 통상적인 실험을 이용하여 본원에 구체적으로 기재된 본 발명의 특정 실시태양의 다수의 등가물을 인식하거나 확인할 수 있다. 이러한 등가물은 하기 청구의 범위의 영역 내에 포괄하고자 한다.

Claims (77)

  1. (a) 1일 내에 종양 세포자멸사(apoptosis) 유도제의 10 중량% 이상을 방출하는, 파클리탁셀(paclitaxel) 또는 독소루비신(doxorubicin) 종양 세포자멸사 유도제를 함유하고 40㎛ 미만의 평균 입자 직경을 갖는 젤라틴 또는 폴리(락타이드-코-글리콜라이드) 입자의 신속-방출성(fast-release) 제제; (b) 파클리탁셀, 카르보플라틴(carboplatin), 독소루비신 또는 도세탁셀(docetaxel)중 하나 이상인 종양 치료제를 함유하고, 40㎛ 미만의 평균 입자 직경을 갖고, 신속-방출성 제제 내에 함유된 종양 세포자멸사 유도제의 방출 속도의 절반 미만의 방출 속도로 종양 치료제를 방출하는 폴리락타이드-코글리콜라이드 공중합체 입자의 서방성(slow-release) 제제; 및 (c) 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 종양 세포자멸사 유도제 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 종양 치료제와 함께 조합되는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 1시간 이하에 걸쳐 50nM 이상의 파클리탁셀을 방출하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 종양의 상피세포 밀도를 20% 이상 감소시키는 양으로 제공되는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 투여 후 16 내지 24시간 이내에 종양의 상피세포 밀도를 20% 이상 감소시키는 양으로 제공되는 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 종양의 상피세포의 10% 이상에서 세포자멸사를 유도하는 양으로 제공되는 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 투여 후 16 내지 24시간 이내에 종양의 상피세포의 10% 이상에서 세포자멸사를 유도하는 양으로 제공되는 조성물.
  8. 제2항에 있어서, 상기 치료제가 화학 치료제, 항생제, 단백질, 항체 또는 유전자 치료 구조물중 하나 이상인 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 정맥내 주사, 국부(local) 투여 또는 국소(regional) 투여중 하나 이상에 의해 투여되는 조성물.
  10. 제2항에 있어서, 상기 종양 세포자멸사 유도제 또는 종양 치료제중 하나 또는 둘다를 250 내지 900nm의 평균 입자 직경을 갖는 나노입자 또는 3 내지 40㎛의 평균 입자 직경을 갖는 미립자중 하나 이상으로 제제화하는 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 종양에 인접한 곳 내로 상기 종양 세포자멸사 유도제 또는 종양 치료제중 하나 또는 둘다를 전달하기 위해 상기 미립자가 종양에 결합하는 조성물.
  12. 제2항에 있어서, 상기 종양 세포자멸사 유도제 또는 종양 치료제중 하나 또는 둘다를 (1) 3 내지 5㎛의 평균 직경을 갖는 미립자, 또는 (2) 10 내지 40㎛의 평균 직경을 갖는 미립자중 하나 이상으로 제제화하는 조성물.
  13. 제2항에 있어서, 상기 종양 세포자멸사 유도제 또는 종양 치료제중 하나 또는 둘다를 함유하는, 250 내지 900nm의 평균 입자 직경을 갖는 나노입자 또는 3 내지 40㎛의 평균 입자 직경을 갖는 미립자중 하나 이상을 추가로 포함하고, 상기 250 내지 900nm의 평균 입자 직경을 갖는 나노입자 또는 3 내지 40㎛의 평균 입자 직경을 갖는 미립자중 하나 이상은 (1) 종양 조직에 결합하는 특성, 및 (2) 복강에 집중되는 특성이 조합된 특성을 갖는 조성물.
  14. 제2항에 있어서, 상기 종양 치료제가 50:50 중량비로 락트산:글리콜산을 포함하고, 30 내지 40㎛의 평균 입자 직경, 체온 미만의 유리전이온도를 갖으며, 5 중량% 이하의 파클리탁셀을 함유하고, 1일째에 파클리탁셀 함량 4% 이상의 초기 파열 약물 방출 속도에 이어 7주 내에 파클리탁셀 함량 70% 이하의 총 누적 방출을 제공하는 느린 방출을 나타내는 폴리(락타이드-코-글리콜라이드) 미립자 내에 제제화된 파클리탁셀인 조성물.
  15. 제2항에 있어서, 상기 종양 치료제가 75:25 중량비로 락트산:글리콜산을 포함하고, 3 내지 5㎛의 평균 입자 직경, 체온보다 높은 유리전이온도를 갖으며, 5 중량% 이하의 파클리탁셀을 함유하고, 1일째에 파클리탁셀 함량 5%의 초기 파열 약물 방출 속도에 이어 7주 내에 파클리탁셀 함량 30%의 총 누적 방출을 제공하는 느린 방출을 나타내는 폴리(락타이드-코-글리콜라이드) 미립자 내에 제제화된 파클리탁셀인 조성물.
  16. 제2항에 있어서, 상기 종양 세포자멸사 유도제가 50:50 중량비로 락트산:글리콜산을 포함하고, 3 내지 5㎛의 평균 입자 직경, 체온 미만의 유리전이온도를 갖으며, 5 중량% 이하의 파클리탁셀을 함유하고, 1일 내에 파클리탁셀 함량 70% 이하의 약물 방출 속도를 나타내는 폴리(락타이드-코-글리콜라이드) 미립자 내에 제제화된 파클리탁셀인 조성물.
  17. 제2항에 있어서, 상기 종양 세포자멸사 유도제가 50:50 중량비로 락트산:글리콜산을 포함하고, 3 내지 5㎛의 평균 입자 직경, 체온 미만의 유리전이온도를 갖으며, 5 중량% 이하의 파클리탁셀을 함유하고, 1일 내에 파클리탁셀 함량 10% 이상의 약물 방출 속도를 나타내는 폴리(락타이드-코-글리콜라이드) 미립자 내에 제제화된 조성물.
  18. 제14항에 있어서, 상기 종양 세포자멸사 유도제가 50:50 중량비로 락트산:글리콜산을 포함하고, 3 내지 5㎛의 평균 입자 직경, 체온 미만의 유리전이온도를 갖으며, 5 중량% 이하의 파클리탁셀을 함유하고, 1일 내에 파클리탁셀 함량 70% 이하의 약물 방출 속도를 나타내는 폴리(락타이드-코-글리콜라이드) 미립자 내에 제제화된 파클리탁셀인 조성물.
  19. 제15항에 있어서, 상기 종양 세포자멸사 유도제가 50:50 중량비로 락트산:글리콜산을 포함하고, 3 내지 5㎛의 평균 입자 직경, 체온 미만의 유리전이온도를 갖으며, 5 중량% 이하의 파클리탁셀을 함유하고, 1일 내에 파클리탁셀 함량 70% 이하의 약물 방출 속도를 나타내는 폴리(락타이드-코-글리콜라이드) 미립자 내에 제제화된 파클리탁셀인 조성물.
  20. 제13항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 트윈(Tween) 20, 트윈 80, 이소프로필 미리스테이트, β-락토즈 또는 디에틸프탈레이트중 하나 이상인 방출 향상제를 추가로 포함하는 조성물.
  21. 제13항에 있어서, 상기 종양 세포자멸사 유도제가 파클리탁셀을 포함하는 조성물.
  22. 제13항에 있어서, 상기 종양 세포자멸사 유도제가 독소루비신을 포함하는 조성물.
  23. 제1항에 있어서, 상기 서방성 제제가 아데노바이러스 유전자 구조물로 대체되고, 종양 세포자멸사 유도제의 신속-방출성 제제 투여 후 그 사이에 투여되는 조성물.
  24. 제1항에 있어서, 상기 서방성 제제가 양이온성 리포좀 내에 제제화된 유전자 구조물로 대체되고, 종양 세포자멸사 유도제의 신속-방출성 제제 투여 후 그 사이에 투여되는 조성물.
  25. 제1항에 있어서, 상기 서방성 제제가 치료제로 독소루비신을 함유하는 나노입자 리포좀 제제로 대체되고, 종양 세포자멸사 유도제의 신속-방출성 제제 투여 후 그 사이에 투여되는 조성물.
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