CN102690895B - 一种jc病毒的检测试剂盒及应用 - Google Patents
一种jc病毒的检测试剂盒及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102690895B CN102690895B CN 201110211891 CN201110211891A CN102690895B CN 102690895 B CN102690895 B CN 102690895B CN 201110211891 CN201110211891 CN 201110211891 CN 201110211891 A CN201110211891 A CN 201110211891A CN 102690895 B CN102690895 B CN 102690895B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- jcv
- virus
- carboxyl
- test kit
- rhodamine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种病毒的检测方法和试剂盒，具体讲，涉及一种JC病毒的检测方法及其试剂盒。本发明的检测方法包括以下步骤：首先针对JC病毒基因组设计特异性引物JCV-F和JCV-R，Taqman荧光探针JCV-P，Taqman荧光探针JCV-P的5’端标记有荧光基团，在除5’端外的任意一个位置上标记有淬灭基团；然后处理待测样本，进行PCR反应；最后通过荧光定量PCR仪检测反应结果。本发明的检测方法可进行定性、定量检测，具有敏感性高、特异性好、反应快速且成本低的优势。本发明还涉及JC病毒的检测试剂盒及其应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种病毒的检测方法和试剂盒，具体讲，涉及一种JC病毒的检测方法及其试剂盒。
背景技术
JC病毒(JCV)属人类多瘤病毒，是一种小双链DNA病毒。JCV由PADGETT于1971年等首先在进行性多灶性脑白质病(Progressive Multifocal Lukoenphalapathy，PML)患者中发现并分离出。该病毒只有一种血清型，但可分为30多个基因型。
JCV是一种机会感染性病原，正常人群中血清学阳性率高达80％以上。初次感染一般发生在儿童时期，并且多无症状。JCV可通过分娩(胎盘)、哺乳或长期共同生活接触从母亲传播给子女，也可通过呼吸道、消化道传播。初次感染后，JCV以潜伏状态存在于人体组织，但是当宿主免疫力降低时，病毒可以重新激活复制，并且导致宿主病理改变。
JCV具有明显的嗜神经性特点，严重免疫抑制患者感染JCV后可引起进行性多灶性脑白质病(PML)。PML主要发生于淋巴网状内皮细胞恶性肿瘤如慢性淋巴细胞性白血病、淋巴增生障碍(如淋巴瘤)、实质性器官瘤、重度免疫抑制的患者(包括爱滋病、系统性红斑狼疮、韦格肉芽肿病、硬皮病、皮肌炎、多发性肌炎及类风湿性关节炎等)和器官移植后药物治疗所致严重免疫抑制患者。
JCV还能在肾脏组织中复制，并通过尿液排出病毒。器官移植后，免疫抑制剂的使用是诱导多瘤病毒激活复制的重要原因，其中，40％以上的肾移植患者可检测到JCV的复制。与BK病毒(BKV)一样，JCV的感染也可致肾移植患者的多瘤病毒相关性肾病(PVAN)。PVAN被认为是影响肾移植手术成功与否最关键的因素之一。形态学上，比如Decoy细胞检测与肾组织活检均不能区分BKV与JCV感染。
JCV具有致瘤性。近年国外研究结果发现，JCV在体外可使人及动物多种组织类型正常细胞发生恶性转化，在仓鼠及转基因小鼠体内可诱发多种肿瘤形成，但其致瘤机制尚不清楚。
目前没有针对JCV有效的抗病毒药物，早期诊断是JCV感染相关疾病防治的最好手段。确认JCV感染的检测包括检测血清中特异性VP1抗体；对感染者的尿液、脑脊液、血液及病 变组织进行JCV DNA检测；对活组织进行原位杂交及免疫组化检测等。由于JCV在人群中感染率很高，抗体检测并非确证活动性JCV感染的可靠方法。国外研究认为，利用聚合酶链式反应(PCR)对尿液、血液或脑脊液特异性地检测JCV DNA是PVAN或PML早期诊断及预测的最佳方法。PCR技术检测方法的灵敏度为75％，特异度则高达96％，同时可以区分BKV与JCV的感染。荧光定量PCR比常规PCR具有更高的灵敏度、特异性，操作更加快速、方便，是用于JCV DNA检测的理想手段。目前国内对JCV的研究尚属空白，更没有成熟的检测方法或试剂。
综上亟需能够实现快速、有效且准确检测JC病毒的产品，以用于JC病毒载量的检测，JC病毒相关性疾病的预测及治疗监测。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种用于检测JC病毒的方法；
本发明的第二发明目的在于提出检测JC病毒的试剂盒；
本发明的第三发明目的在于提出该检测JC病毒试剂盒的应用。
为了完成本发明的目的，采用的技术方案为：
本发明涉及一种JC病毒的检测方法，包括以下步骤：
(1)针对JC病毒基因组设计特异性引物JCV-F和JCV-R，Taqman荧光探针JCV-P，Taqman荧光探针JCV-P的5’端标记有荧光基团，在除5’端外的任意一个位置上标记有淬灭基团，优选为3’端；
(2)处理待测样本，进行PCR反应；
(3)通过荧光定量PCR仪检测反应结果；
其中，JCV-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，或由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；
JCV-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，或由SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；
JCV-P的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，或由SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列。
其中，SEQ ID NO：1的核苷酸序列为GGTATACACAGCAAAAGAAGCAACA，
SEQ ID NO：2的核苷酸序列为CAGTGATGATGAAAACACAGGATCC，
SEQ ID NO：3的核苷酸序列为GCATGCAGATCTACAGGAAAGTCTTTAGGGT。
本发明的第一优选技术方案为，所述的Taqman荧光探针的荧光报告基团选自由6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁5或花菁5.5中的至少一种；所述荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬灭剂1、黑洞淬灭剂2或黑洞淬灭剂3中的至少一种。
本发明的第二优选技术方案为：
当荧光淬灭基团选自4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸时，荧光报告基团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、六氯-6-甲基荧光素、花菁3中的至少一种；
当荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明时，荧光报告基团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯或六氯-6-甲基荧光素中的至少一种；
当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂1时，荧光报告基团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、六氯-6-甲基荧光素或花菁3中的至少一种；
当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂2时，荧光报告基团选自6-羧基四甲基罗丹明、花菁3、羧基-X-罗丹明或磺酰罗丹明中的至少一种；
当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂3时，荧光报告基团选自花菁5或花菁5.5中的一种。
最优选地，所述荧光报告基团为6-FAM；所述荧光淬灭基团为BHQ1。
本发明的第三优选技术方案为，步骤(2)中PCR反应的反应体系包括：PCR反应液19.8μl、DNA聚合酶0.2μl、待检模板5.0μl；
其中，PCR反应液的组成为：10×反应缓冲液2.5μl，JCV-F(10μM)0.6μl，JCV-R(10μM)0.3μl，JCV-P(10μM)0.7μl，dNTP 3.0μl，最后用无菌超纯水将反应体系补至19.8μl。
本发明的第四优选技术方案为：步骤(2)中PCR反应的反应条件为：92～95℃条件下反应3～5分钟；然后92～95℃，10～15秒，55～65℃，10～35秒，共35～45个循环；优选：94℃条件下反应4分钟；然后94℃，15秒，60℃，35秒，共40个循 环。
本发明的第五优选技术方案为：所述的PCR反应均设置阴性质控组和JC病毒定量标准品I～IV组，其中阴性质控组的待测模板为纯水，JC病毒定量标准品I-IV的待测模板分别为JCV定量标准品I、JCV定量标准品II、JCV定量标准品III、JCV定量标准品IV。
本发明的第六优选技术方案为：JCV定量标准品I～IV的构建方法包括以下步骤：
(1)配制PCR反应体系，加入提纯的病毒基因组，进行PCR反应；
(2)将扩增产物插入T载体构建重组质粒，经基因测序确认正确后将重组质粒转化细菌扩增；
(3)提纯重组质粒后利用紫外分析法测定吸光度，计算质粒浓度，最后将重组质粒稀释成4个梯度5×105～5×108copies/ml，分别作为试剂盒的JCV定量标准品I、JCV定量标准品II、JCV定量标准品III、JCV定量标准品IV。
本发明的第七优选技术方案为：所述的待测样本的处理方法包括：磁珠提取法、柱提法、煮沸裂解法和十六烷基三甲基溴化铵法。
本发明的第八优选技术方案为：荧光定量PCR仪检测反应结果；如果检测通道没有出现S型扩增曲线，判为JC病毒阴性；如果检测通道出现S型扩增曲线，则判定为阳性，并利用JCV定量标准品检测所生成的标准曲线计算待测样本的浓度(copies/ml)。
本发明的第九优选技术方案为：荧光定量PCR仪检测反应结果，采用荧光定量PCR仪，荧光信号收集时设定为FAM荧光素，荧光信号收集设在60℃。
本发明还涉及一种JC病毒的检测试剂盒，所述的试剂盒包括：PCR反应液、耐热DNA聚合酶、待检模板、阴性质控组和JC病毒定量标准品I～IV组。
其中，其中，JCV-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，或由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；
JCV-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，或由SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；
JCV-P的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，或由SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列。
本发明还涉及所述的JC病毒的检测试剂盒在检测和/或诊断JC病毒相关性疾病中的应用。JC病毒的感染与多瘤病毒相关性肾病、骨髓移植患者的出血性膀胱炎、进行性多灶性脑 白质病、肺部疾病、肿瘤、自身免疫性疾病等有关。
下面对本发明的技术方案做进一步的解释和说明：
本发明的首要目的是解决目前缺乏JC病毒检测产品的问题，提供一种检测JC病毒的方法，使用该方法可以实现对JC病毒的快速、有效且准确的定量或定性检测，来保证及时的JC病毒载量的检测，JC病毒相关性疾病的预测及治疗监测。
本发明涉及一种用于检测JC病毒的试剂盒，该试剂盒具有敏感性高、特异性好、反应快速且成本低的优势，适合于大规模临床开展；可以实现对JC病毒的快速、有效且准确的定量检测，因而能保证及时的病例诊治及治疗效果监测。
本发明针对JC病毒基因组设计特异性引物JCV-F和JCV-R，Taqman荧光探针JCV-P，Taqman荧光探针JCV-P的5’端标记有荧光基团，在除5’端外的任意一个位置上标记有淬灭基团，优选为3’端；本发明在PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
所述荧光报告基团和所述荧光淬灭基团选自由6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein，FAM)、四氯-6-羧基荧光素(tetrachloro-6-carboxyfluorescein，TET)、六氯-6-甲基荧光素(Hexachloro-6-methylfluorescein，HEX)、6-羧基四甲基罗丹明(6-carboxytetramethylrhodamine，TAMRA)、磺酰罗丹明(Sulforhodamine 101，Texas Red)、羧基-X-罗丹明(Carboxy-x-rhodamine，ROX)、花菁3(cyanine3，Cy3)、花菁3.5(cyanine3.5，Cy3.5)、花菁5(cyanine5，Cy5)、花菁5.5(cyanine5.5，Cy5.5)、生物搜索技术公司(Biosearch Technologies，Inc)的黑洞淬灭剂1(Black Hole Quencher 1，BHQ1)、黑洞淬灭剂2(Black Hole Quencher 2，BHQ2)、黑洞淬灭剂3(Black Hole Quencher 3，BHQ3)、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸(4-(4’-dimethylaminophenylazo)benzoic acid，DABCYL)、6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯(6-Carboxy-4’，5’-dichloro-2’，7’-dimethoxyfluorescein，JOE)和美国应用生物系统公司的VIC荧光染料所组成的组中。优选地，所述荧光报告基团选自由6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花 菁3、花菁5和花菁5.5所组成的组中；所述荧光淬灭基团选自由6-羧基四甲基罗丹明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸DABCYL、BHQ1、BHQ2和BHQ3所组成的组中。更优选地，按照下表1所示来选择荧光报告基团和荧光淬灭基团。
表1：
| 荧光淬灭基团 | 荧光报告基团 |
| DABCYL | 6-FAM、TET、JOE、HEX、Cy3中的至少一种 |
| TAMRA | 6-FAM、TET、JOE、HEX中的至少一种 |
| BHQ1 | 6-FAM、TET、JOE、HEX、Cy3中的至少一种 |
| BHQ2 | TAMRA、Cy3、ROX、Texas Red中的至少一种 |
| BHQ3 | Cy5或Cy5.5 |
最优选地，所述荧光报告基团为6-FAM；所述荧光淬灭基团为BHQ1。
然后处理待测样品，待测样品的处理可采用现有的DNA处理试剂盒。可以采用的病毒核酸提取方法为：磁珠提取法、柱提法、煮沸裂解法和CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法，并优选煮沸裂解法处理样本与提取核酸。
所述的煮沸裂解法处理样本与提取核酸的方法包括：
血液样本：取100μl血清或血浆样本与50μl浓缩液混匀，13000rpm/min离心10min后去除上清，加入25μl裂解液混匀沉淀，100℃煮沸10min，离心10min，上清即为纯化的病毒核酸。
尿液样本：取1000μl尿液样本，13000rpm/min离心10min后去除上清，加入50μl裂解液混匀沉淀，100℃煮沸10min，离心10min，上清即为纯化的病毒核酸。
本发明采用PCR方法进行检测，其中PCR反应的反应体系包括：PCR反应液19.8μl、DNA聚合酶0.2μl、待检模板5.0μl；其中，PCR反应液的组成为：10×反应缓冲液2.5μl，JCV-F(10μM)0.60μl，JCV-R(10μM)0.30μl，JCV-P(10μM)0.70μl，dNTP3.0μl，最后用无菌超纯水将反应体系补至19.8μl。
PCR反应的反应条件为：94℃，4分钟；94℃，15秒；60℃，35秒，40个循环。
在PCR反应过程中，均设置阴性质控组和JC病毒定量标准品I～IV组，其中阴性质控组的待测模板为纯水，JC病毒定量标准品I-IV的待测模板分别为JCV定量标准品I、JCV定量标准品II、JCV定量标准品III、JCV定量标准品IV。
JCV定量标准品I～IV的构建方法包括以下步骤：
(1)配制检测反应体系：PCR反应液19.8μl、DNA聚合酶0.2μl、提纯的病毒基因组5.0μl，进行PCR反应，PCR反应的反应条件为：94℃，4分钟；94℃，15秒；60℃，35秒，40个循环；
(2)将扩增产物插入T载体构建重组质粒，经基因测序确认正确后将重组质粒转化细菌扩增；
(3)提纯重组质粒后利用紫外分析法测定吸光度，计算质粒浓度，最后将重组质粒稀释成4个梯度5×105～5×108copies/ml，分别作为试剂盒的JCV定量标准品I、JCV定量标准品II、JCV定量标准品III、JCV定量标准品IV。
本发明采用荧光定量PCR仪检测反应结果：采用荧光定量PCR仪，荧光信号收集时设定为FAM荧光素，荧光信号收集设在60℃；如果检测通道没有出现S型扩增曲线，判为JC病毒阴性；如果检测通道出现S型扩增曲线，利用JCV定量标准品检测所生成的标准曲线计算待测样本的浓度(copies/ml)。
本发明还涉及一种JC病毒的检测试剂盒，所述的试剂盒包括：PCR反应液、DNA聚合酶、待检模板、阴性质控组和JC病毒定量标准品I～IV组；其中，所述的PCR反应液中含有JCV-F、JCV-R和JCV-P。
本发明的JC病毒检测试剂盒中还可以包括DNA提取试剂盒，DNA提取试剂盒可采用现有的DNA提取技术。
本发明的技术优势为：
1.利用本发明的试剂盒可以快速、简便的对JC病毒相关性肾病进行筛查，改变了现有技术中需要进行组织活检的现状。
2.本发明的检测方法敏感性高，最低检出可达到2×103copies/ml；同时，本发明的检测方法的特异性很好，不和其他的病毒发生交叉反应，例如乙肝病毒(HBV)，丙肝病毒(HCV)，EB病毒(EBV)，人巨细胞病毒(HCMV)，人类细小病毒B19(HPVB19)和BK病毒(BKV)；
3.本发明的检测方法反应快速，一般1.5到2小时即可得到反应结果，并且成本低、无假阳性，适合于大规模临床开展。从而实现对JC病毒的快速、有效且准确的定量检测，因而能保证及时的病例诊治及治疗效果监测。
附图说明
图1为采用荧光定量PCR仪检测待测样本得到的曲线；
图2为采用荧光定量PCR仪检测JC病毒标准品得到的曲线。
本发明的具体实施方式仅限于进一步的解释和说明本发明，并不对本发明的内容构成限制。本发明所采用的试剂均为市售，所用仪器均为试验室常规仪器。
具体实施方式
实施例1
1.引物与探针的设计：针对JC病毒基因组设计特异性引物JCV-F和JCV-R，与Taqman荧光探针JCV-P。Taqman荧光探针JCV-P的5’端标记的荧光基团是6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein，FAM)，3’端标记的淬灭基团是黑洞淬灭剂1(Black Hole Quencher 1，BHQ1)。
JCV-F：GGTATACACAGCAAAAGAAGCAACA；
JCV-R：CAGTGATGATGAAAACACAGGATCC；
JCV-P：GCATGCAGATCTACAGGAAAGTCTTTAGGGT；
(序列方向5’-3’)
2.JC病毒DNA聚合酶链式反应液的配制：将各成分(引物、探针和反应缓冲液)按一定比例混合在一起。单个反应聚合酶链式反应液包括：10×反应缓冲液2.5μl，JCV-F(10μM)0.60μl，JCV-R(10μM)0.30μl，JCV-P(10μM)0.70μl，dNTP3.0μl，最后用无菌超纯水将反应体系补至19.8μl。
3.检测反应：取聚合酶链式反应液19.8μl和DNA聚合酶0.2μl(1个单位)配制成反应体系，然后加入5.0μl待检模板。
每批次反应均设置阴性质控(H2O)和JC病毒定量标准品I-IV。
反应条件：94℃，4分钟；94℃，15秒；60℃，35秒，40个循环。
采用Stratagene Mx 3000p荧光定量PCR仪，荧光信号收集时设定为FAM荧光素，荧光信号收集设在60℃。
4.JC病毒样本(尿液与血液)的处理与DNA提取：采用煮沸裂解法处理样本与提取核酸。
血液样本：取100μl血清或血浆样本与50μl浓缩液混匀，13000rpm/min离心10min后去除上清，加入25μl裂解液混匀沉淀，100℃煮沸10min，离心10min，上清即为纯化的病毒核酸。
尿液样本：取1000μl尿液样本，13000rpm/min离心10min后去除上清，加入50μl裂解液混匀沉淀，100℃煮沸10min，离心10min，上清即为纯化的病毒核酸。
5.构建JCV定量标准品I-IV。
6.结果判断：检测通道没有出现S型扩增曲线，判定为JC病毒阴性。
检测通道出现S型扩增曲线，判定为阳性，并利用JCV定量标准品检测所生成的标准曲线计算待测样本的浓度(copies/ml)。检测反应时，JCV定量标准品I-IV(浓度分别是5×105～5×108copies/ml)与样品同时检测，JCV定量标准品I-IV的靶基因浓度已知。根据定量标准品浓度与检测结果CT值，系统自动生成一条标准曲线。根据待测样品的检测CT值，可计算出样品中靶基因的浓度。
利用上述方法对2例JC病毒血液样本、2例JC病毒尿液样本、5例健康人尿液样本，5例健康人血液样本、乙肝病毒(HBV)血液样本、丙肝病毒(HCV)血液样本、EB病毒(EBV)血液样本、人巨细胞病毒(HCMV)血液样本、人类细小病毒B19(HPV B19)血液样本和BK病毒(BKV)血液样本，共计20份样本进行检测，结果如图1所示：
其中，2例JC病毒血液样本及2例JC病毒尿液样本检测均为阳性，有S型扩增曲线；健康人尿液样本(10例)，血液样本(10例)，及临床常见的其他病原体，包括乙肝病毒(HBV)，丙肝病毒(HCV)，EB病毒(EBV)，人巨细胞病毒(HCMV)，人类细小病毒B19(HPVB19)和BK病毒(BKV)检测均为阴性，无S型扩增曲线。
通过计算机生成的标准曲线，从左至右，计算4个阳性样本的浓度分别为：血液样本分别8.2×107copies/ml和7.6×107copies/ml，尿液样本分别8.4×106copies/ml和7.9×106copies/ml。
从而证实了本发明检测方法的特异性。
7.结果验证：将检测阳性的扩增产物进行基因测序，测序结果经BLAST比对后证实为JC病毒基因序列。
实施例2JCV定量标准品I-IV的构建：
(1)配制检测反应体系：PCR反应液19.8μl、DNA聚合酶0.2μl、提纯的病毒基因组5.0μl，进行PCR反应，PCR反应的反应条件为：94℃，4分钟；94℃，15秒；60℃，35秒，40个循环；
PCR反应液包括：10×反应缓冲液2.5μl，JCV-F(10μM)0.60μl，JCV-R(10μM)0.30μl，JCV-P(10μM)0.70μl，dNTP3.0μl，最后用无菌超纯水将反应体系补至19.8μl。
(2)将扩增产物插入T载体构建重组质粒，经基因测序确认正确后将重组质粒转化细菌扩增。
将所得的DNA序列通过T4噬菌体DNA连接酶直接连接到pSTV28DNA载体上，pSTV28DNA载体购自宝生物(Takara)公司。然后将重组质粒载体转化大肠杆菌(使用北京全式金生物技术有限公司的Trans5α Chemically Competent Cell)，筛选阳性克隆后提取质粒(使用天根生化科技(北京)有限公司的高纯度质粒小提试剂盒，TIANpure Mini Plasmid Kit)。对所得质粒DNA的一部分扩增产物进行测序，证明所述扩增得到的DNA片段具有目的序列。将带有重组质粒载体转化大肠杆菌大量培养，提取质粒，紫外分光光度法测量并计算靶基因的浓度。
(3)提纯重组质粒后利用紫外分析法测定吸光度，计算质粒浓度(copies/ml)。
将重组质粒稀释成9个梯度：5×109copies/ml，5×108copies/ml，5×107copies/ml，5×106copies/ml，5×105copies/ml，5×104copies/ml，5×103copies/ml，1×103copies/ml，1×102copies/ml，然后采用Stratagene Mx 3000p荧光定量PCR仪进行检测。
结果如图2所示：从左至右分别是5×109copies/ml，5×108copies/ml，5×107copies/ml，5×106copies/ml，5×105copies/ml，5×104copies/ml，5×103copies/ml，1×103copies/ml，1×102copies/ml，的扩增曲线；最低检出限为1×103copies/ml，相当于每个反应体系5个靶基因分子；1×102copies/ml检测阴性，无S型扩增曲线；线性范围：5×109copies/ml-5×103copies/ml。
将JCV定量标准品稀释成5×105copies/ml、5×106copies/ml、5×107copies/ml、5×108copies/ml，分别作为试剂盒的JCV定量标准品I、JCV定量标准品II、JCV定量标准品III、JCV定量标准品IV。
Claims (7)
1.一种JC病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：检测组、阴性质控组和JC病毒定量标准品I～IV组，其中，检测组包括PCR反应液和耐热DNA聚合酶，所述的PCR反应液中含有特异性引物JCV-F、特异性引物JCV-R和Taqman荧光探针JCV-P；Taqman荧光探针JCV-P的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；
其中，JCV-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，JCV-R的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示，JCV-P的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.根据权利要求1所述的JC病毒的检测试剂盒，其特征在于，
所述的Taqman荧光探针的荧光基团选自由6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁5或花菁5.5中的至少一种；
所述淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬灭剂1、黑洞淬灭剂2或黑洞淬灭剂3中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的JC病毒的检测试剂盒，其特征在于，
当淬灭基团选自4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸时，荧光基团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、六氯-6-甲基荧光素、花菁3中的至少一种；
当淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明时，荧光基团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯或六氯-6-甲基荧光素中的至少一种；
当淬灭基团选自黑洞淬灭剂1时，荧光基团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、六氯-6-甲基荧光素或花菁3中的至少一种；
当淬灭基团选自黑洞淬灭剂2时，荧光基团选自6-羧基四甲基罗丹明、花菁3、羧基-X-罗丹明或磺酰罗丹明中的至少一种；
当淬灭基团选自黑洞淬灭剂3时，荧光基团选自花菁5或花菁5.5中的一种。
4.根据权利要求2所述的JC病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述荧光报告基团为6-羧基荧光素；所述荧光淬灭基团为黑洞淬灭剂1。
5.根据权利要求1所述的JC病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液、耐热DNA聚合酶的含量分别为：PCR反应液19.8μl、DNA聚合酶0.2μl；
其中，PCR反应液的组成为：10×反应缓冲液2.5μl，10μM的JCV-F0.60μl，10μM的JCV-R0.30μl，10μM的JCV-P0.70μl，dNTP3.0μl，最后用无菌超纯水将反应体系补至19.8μl。
6.根据权利要求1所述的JC病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述的JCV定量标准品I～IV的构建方法包括以下步骤：
（1）配制PCR反应体系，加入提纯的JC病毒基因组，进行PCR反应；
（2）将扩增产物插入T载体构建重组质粒，经基因测序确认正确后，将重组质粒转化细菌扩增；
（3）提纯重组质粒后利用紫外分析法测定吸光度，计算质粒浓度，最后将重组质粒稀释成4个梯度5×105、5×106、5×107、5×108拷贝/ml，分别作为试剂盒的JCV定量标准品I、II、III、Ⅳ。
7.根据权利要求1～6任一权利要求所述的JC病毒的检测试剂盒，其特征在于，对所述的检测试剂盒采用荧光定量PCR仪检测反应结果时，当检测通道出现S型扩增曲线，判定为阳性，并利用JCV定量标准品检测所生成的标准曲线计算待测样本的浓度；当检测通道没有出现S型扩增曲线，判定为JC病毒阴性。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201110211891 CN102690895B (zh) | 2011-07-27 | 2011-07-27 | 一种jc病毒的检测试剂盒及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201110211891 CN102690895B (zh) | 2011-07-27 | 2011-07-27 | 一种jc病毒的检测试剂盒及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102690895A CN102690895A (zh) | 2012-09-26 |
| CN102690895B true CN102690895B (zh) | 2013-05-01 |
Family
ID=46856632
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201110211891 Expired - Fee Related CN102690895B (zh) | 2011-07-27 | 2011-07-27 | 一种jc病毒的检测试剂盒及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102690895B (zh) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104745724A (zh) * | 2015-01-30 | 2015-07-01 | 湖北永邦医疗科技有限公司 | 一种用于检测jc病毒的引物、探针和试剂盒 |
| CN106048093A (zh) * | 2016-08-02 | 2016-10-26 | 北京思尔成生物技术有限公司 | Jc病毒的检测方法、试剂盒及其应用 |
| CN107586883A (zh) * | 2017-09-27 | 2018-01-16 | 湖北朗德医疗科技有限公司 | 一种用于检测jc病毒的引物、探针和试剂盒 |
| CN110607400B (zh) * | 2019-10-08 | 2022-12-27 | 上海市公共卫生临床中心 | 一种用于bkv的组织原位杂交诊断和检测体系及其应用 |
| CN111560473A (zh) * | 2020-05-06 | 2020-08-21 | 南京实践医学检验有限公司 | 一种用于检测尿液jc病毒的试剂盒和方法 |
| CN112442553A (zh) * | 2020-10-27 | 2021-03-05 | 深圳市罗湖区人民医院 | 一种用于JCPyV检测与分型的试剂盒及方法 |
| CN112522440A (zh) * | 2020-11-13 | 2021-03-19 | 苏州奥根诊断科技有限公司 | 同时检测bk病毒和jc病毒的引物组和探针组及用途 |
| CN113186356B (zh) * | 2021-06-02 | 2022-05-20 | 浙江省淡水水产研究所 | 检测黄颡鱼杯状病毒-1的特异性引物、探针及快速检测试剂盒 |
| CN113913554A (zh) * | 2021-11-08 | 2022-01-11 | 苏州药明检测检验有限责任公司 | 一种实时荧光定量pcr检测jc多瘤病毒的方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102166580A (zh) * | 2010-12-16 | 2011-08-31 | 广东奥美特集团有限公司 | 一种废冰箱破碎分选资源再利用方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011512160A (ja) * | 2008-02-20 | 2011-04-21 | アイエム テクノロジーズ， インコーポレイテッド | ポリオーマウイルスの検出 |
-
2011
- 2011-07-27 CN CN 201110211891 patent/CN102690895B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102166580A (zh) * | 2010-12-16 | 2011-08-31 | 广东奥美特集团有限公司 | 一种废冰箱破碎分选资源再利用方法 |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| Caroline Ryschkewitsch et al..Comparison of PCR-southern hybridization and quantitative real-time PCR for the detection of JC and BK viral nucleotide sequences in urine and cerebrospinal fluid.《Journal of Virological Methods》.2004,第121卷(第2期),第218页右栏第1行至第220页左栏第20行，图1，表1. |
| Comparison of PCR-southern hybridization and quantitative real-time PCR for the detection of JC and BK viral nucleotide sequences in urine and cerebrospinal fluid;Caroline Ryschkewitsch et al.;《Journal of Virological Methods》;20041130;第121卷(第2期);第218页右栏第1行至第220页左栏第20行，图1，表1 * |
| Huatao Huang et al..Identification in Human Brain Tumors of DNA Sequences Specific for SV40 Large T Antigen.《Brain Pathology》.1999,第9卷(第1期),33-44. |
| Identification in Human Brain Tumors of DNA Sequences Specific for SV40 Large T Antigen;Huatao Huang et al.;《Brain Pathology》;19990131;第9卷(第1期);33-44 * |
| Pasquale Ferrante et al..PCR Detection of JC Virus DNA in Brain Tissue From Patients With and Without Progressive Multifocal Leukoencephalopathy.《Journal of Medical Virology》.1995,第47卷(第3期),219-225. |
| PCR Detection of JC Virus DNA in Brain Tissue From Patients With and Without Progressive Multifocal Leukoencephalopathy;Pasquale Ferrante et al.;《Journal of Medical Virology》;19951130;第47卷(第3期);219-225 * |
| 卢育洪等.造血干细胞移植后检出人类多瘤病毒尿的临床分析.《肿瘤防治研究》.2007,第34卷(第5期),372-374. |
| 造血干细胞移植后检出人类多瘤病毒尿的临床分析;卢育洪等;《肿瘤防治研究》;20070531;第34卷(第5期);372-374 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102690895A (zh) | 2012-09-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102690895B (zh) | 一种jc病毒的检测试剂盒及应用 | |
| US9745638B2 (en) | Methods and compositions for detecting BK virus | |
| KR20070105992A (ko) | 생물학적 시료에서 사람 유두종 바이러스를 검출하기 위한시스템, 방법 및 조성물 | |
| CN105506173A (zh) | 人乳头瘤病毒的核酸检测试剂盒及其使用方法和应用 | |
| WO2020199441A1 (zh) | 引物探针组合及其试剂盒在hbv检测中的应用 | |
| CN103642945A (zh) | 一种含内参照的高灵敏Epstein-Barr病毒荧光定量PCR试剂盒 | |
| CN102690894B (zh) | 一种bk病毒的检测方法、其试剂盒及应用 | |
| CN115058543B (zh) | 一组鉴别Delta变异毒株和Omicron变异毒株的引物组和试剂盒 | |
| CN113508182B (zh) | 用于检测人乳头状瘤病毒(hpv)的测定 | |
| CN104561384B (zh) | 一种hpv检测试剂盒 | |
| CN110484625A (zh) | 用于检测prky基因甲基化的引物探针组合物、试剂盒及检测方法 | |
| CN107723384A (zh) | 一种检测人乳头状瘤病毒的pcr试剂盒及其制备方法 | |
| CN113046484A (zh) | 用于检测非洲猪瘟病毒p72基因的引物探针、试剂盒及方法 | |
| CN104911277A (zh) | 一种检测干血斑标本中人类免疫缺陷病毒1型的试剂盒及其检测方法 | |
| EP3417077A1 (en) | Quantitative measurement of hepatitis b virus cccdna | |
| CN104450954B (zh) | 检测人乳头状瘤病毒13种亚型的荧光pcr试剂盒及其方法 | |
| CN112391495A (zh) | 一种高危人乳头瘤病毒分型检测方法与试剂盒 | |
| CN102108423A (zh) | 快速检测16、18型人乳头瘤病毒的荧光定量pcr试剂盒 | |
| CN115976286A (zh) | 一种通用型猪蓝耳病毒检测引物组合物、试剂盒及检测方法 | |
| CN111334613B (zh) | 用于检测犬腺病毒的rpa引物对、探针、试剂盒及检测方法 | |
| AU2021103861A4 (en) | Method and kit for differentially detecting porcine pseudorabies vaccine virus and wild virus | |
| CN106929601B (zh) | 一种高灵敏人乳头瘤病毒6,11型核酸检测试剂盒 | |
| CN104745724A (zh) | 一种用于检测jc病毒的引物、探针和试剂盒 | |
| CN106566894A (zh) | 用于人乳头瘤病毒高危型感染筛查的引物、探针及其用途 | |
| CN112522440A (zh) | 同时检测bk病毒和jc病毒的引物组和探针组及用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130501 Termination date: 20150727 |
|
| EXPY | Termination of patent right or utility model |