JP2011512160A - ポリオーマウイルスの検出 - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、2008年2月20日に出願された、米国仮特許出願第61/064,166号(この開示は、その全体が参考として本明細書に援用される)の優先日の利益を主張する。
本明細書で用いられる生物学的配列は、以下に説明される。
TCAGGAGAGTTTATAGAAAAAACTATTGCCCCAGGAGGTGCTAATCAAAGAACTGCTCCTCAATGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGGGACTGTAACACCTGCTCTTGAAGCATATGAAGATGGCCCCAACCAAAAGAAAAGGAGAGTG
さらに、1437位〜1605位のNCBI受入番号NC_001538の別の部分を、標的配列として用いることができる。
本発明は、全般的に、試料中のポリオーマウイルス、特にBKVの検出に関する。ある態様において、BKVは、定量され、および/またはJCVから区別される。
Tm=16.6×log[Na30]+0.41×%G:C+81.5−0.72×(%)(w/v)ホルムアミド
この式は、種々の塩およびホルムアミドの濃度を有する溶液中での種々のDNAについての非ストリンジェントおよびストリンジェントなハイブリッド形成条件を決定するための参照点を、それぞれのハイブリッド形成条件でそれぞれ個別のDNAについてのTmを実験的に測定する必要なく設定するための簡便な手段を提供する。
試料中の1種または複数種のポリオーマウイルスの存在について試験するためのキットが提供される。ある実施形態において、キットは、ハイブリッド形成プローブ:配列番号5および配列番号23と、配列番号2および配列番号3を含むプライマー対とを含む。ある例において、配列番号5および配列番号23は、5’端に受容体フルオロフォアと、3’端にC3ブロッカーまたはホスフェートとを含む。その他の実施形態において、キットは、ハイブリッド形成プローブ:配列番号9および配列番号13と、配列番号4および配列番号6を含むプライマー対とを含む。ある例において、配列番号9および配列番号13は、独特で識別可能な発光波長で蛍光を発する2つの別々のフルオロフォアで標識される。別の実施形態において、キットは、ハイブリッド形成プローブ:配列番号14および配列番号15と、配列番号4および配列番号6を含むプライマー対とを含む。
ポリオーマウイルスの検出
配列番号2および配列番号3のプライマーと、配列番号4および配列番号5のプローブを用いて、リアルタイム増幅アッセイを行った。アッセイは、ストリンジェントな条件下でBKVのDNAと特異的にハイブリッド形成するように設計された配列番号4のフルオレセイン標識供与体プローブと配列番号5のLC610標識受容体プローブとを用いるリアルタイム検出を用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によるDNA増幅を含んだ。種々の濃度のBKVのDNAおよびJCVのDNAを、DNA試料を含まない陰性対照とともに試験した。
BKVおよびJCVを含む試料の評価
BKVおよびJCVの両方を含む試料を、実施例1に記載される一般的な条件を用いて評価した。ウェルD1は、ウイルスDNAを含まない陰性対照である。ウェルD2〜D6は、BKV DNAをそれぞれ8×105コピー、8×104コピー、8×103コピー、8×102コピーおよび8×101コピーで含む。ウェルD7〜D12は、それぞれウェルD1〜D6の重複である。ウェルE1はウイルスDNAを含まない陰性対照である。ウェルE2〜E6は、BKV DNA:JCV DNAの両方を1:1の比率で、それぞれE2:105のBKV DNAコピーおよび105のJCV DNAコピー;E3:104のBKV DNAコピーおよび104のJCV DNAコピー;E4:103のBKV DNAコピーおよび103のJCV DNAコピー;E5:102のBKV DNAコピーおよび102のJCV DNAコピー;E6:101のBKV DNAコピーおよび101のJCV DNAコピーの濃度で含む。ウェルE7〜E12は、それぞれウェルE1〜E6の重複である。
臨床試験
臨床試料の日常的な試験を、以下のプライマー/プローブの組合せを用いて行った:配列番号6および配列番号4のプライマーと配列番号14のプローブ配列とからなる組合せ1;配列番号6および配列番号2のプライマーと配列番号14のプローブ配列とからなる組合せ2;BKV_5.2および配列番号4のプライマーと配列番号14のプローブ配列とからなる組合せ3;BKV_5.2および配列番号2のプライマーと配列番号14のプローブ配列とからなる組合せ4。
BKVウイルス量についての米国病理学会(CAP)調査
2つの試料を、2つの別々のcap調査において検査して、BKVウイルス量について試験した。実施例3に詳細に記載した上記のアッセイプロトコルを用いて、全てのBKV陽性試料は、例えばBKV検出について商業的に入手可能なキットを含む多様な一連の技術を用いる全ての43の調査参加者と一致することが同定された。図7に例示するように、CAP精度管理試験の結果は、本出願の方法が、それぞれの陽性CAP試料についての中央値またはその近傍であったことを示す。重要なことに、本出願の方法はそれぞれの試料についての中央値またはその近傍であったが、異なる方法を用いた他の参加者により得られた定量値は非常に変動していた。
外部検査室との比較研究
本出願の方法を、外部の独立実験室との比較研究によりさらに検証した。合計で74個の臨床試料を試験した。ポリオーマウイルス陽性またはポリオーマウイルス陰性のようなそれぞれの試料の臨床状態は、試験のときには未知であった。合計で74個の未知試料は、30個の尿試料と44個の血漿試料との試料の組を含んだ。30個の尿試料のうち、10個はBKV陽性であり、20個は陰性であった。44個の血漿試料のうち、24個はBKV陽性であり、20個は陰性であった。本出願の方法を用いて、100%の感度が達成された。感度および特異性は、以下の式を用いて算出された:
尿試料感度(%)=(真の陽性/(真の陽性+偽陽性))×100=(34/(34+0))×100=100%
血漿試料特異性(%)=(真の陰性/(真の陰性+偽陽性))×100=(40/(40+0)×100=100% 。
Claims (34)
- 試料中のポリオーマウイルスの存在または不在を試験する方法であって、配列番号1の配列を有する核酸、その逆相補物または配列番号1と90%以上の配列相同性を有する配列の存在または不在について前記試料を試験するステップを含む、方法。
- 配列番号1の核酸もしくはその逆相補物またはそれらのいずれかの一部を増幅するステップ、次いで、得られるアプリコンの存在または不在について試験するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記試験するステップが、前記試料を、ストリンジェントな条件下で配列番号1の核酸またはその逆相補物とハイブリッド形成可能な少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブと接触させることを含む請求項2に記載の方法。
- 前記試験するステップが、融解曲線分析を行うことをさらに含む請求項3に記載の方法。
- 前記増幅ステップが、少なくとも配列番号2(BK_F_1.1)および配列番号3(BK_R_1.2)の増幅プライマーの使用を含み、前記試験するステップが、少なくとも配列番号4(BK_P_1.3)および配列番号5(BK_P_1.4)のオリゴヌクレオチドプローブの使用を含む請求項3に記載の方法。
- 前記増幅ステップが、少なくとも配列番号2(BK_F_1.1)および配列番号6(BK_R_1.5)の増幅プライマーの使用を含み、前記試験するステップが、少なくとも配列番号4(BK_P_1.3)および配列番号5(BK_P_1.4)のオリゴヌクレオチドプローブの使用を含む請求項3に記載の方法。
- 前記増幅ステップが、少なくとも配列番号2(BK_F_1.1)および配列番号3(BK_R_1.2)の増幅プライマーの使用を含み、前記試験するステップが、少なくとも配列番号4(BK_P_1.3)および配列番号23(JC_P_1.5)のオリゴヌクレオチドプローブの使用を含む請求項3に記載の方法。
- 前記増幅ステップが、少なくとも配列番号2(BK_F_1.1)および配列番号3(BK_R_1.2)の増幅プライマーの使用を含み、前記試験するステップが、少なくとも配列番号5(BK_P_1.4)および配列番号23(JC_P_1.5)のオリゴヌクレオチドプローブの使用を含む請求項3に記載の方法。
- 前記増幅ステップが、少なくとも配列番号8(BK_F_2.1)および配列番号9(BK_R_2.2)の増幅プライマーの使用を含む請求項1に記載の方法。
- 前記試験するステップが、2本鎖DNAと結合するシアニン色素の使用を含む請求項9に記載の方法。
- 前記増幅ステップが、少なくとも配列番号4(ポリオーマウイルス_F_3.1)および配列番号6(ポリオーマウイルス_R_3.2)の増幅プライマーの使用を含み、前記試験するステップが、少なくとも配列番号9(BK_P_3.3)および配列番号13(JCV_P_3.4)のオリゴヌクレオチドプローブの使用を含む請求項3に記載の方法。
- 前記増幅ステップが、少なくとも配列番号4(ポリオーマウイルス_F_3.1)および配列番号6(ポリオーマウイルス_R_3.2)の増幅プライマーの使用を含み、前記試験するステップが、少なくとも配列番号9(BK_P_3.3)のオリゴヌクレオチドプローブの使用を含む請求項3に記載の方法。
- 前記増幅ステップが、少なくとも配列番号4(ポリオーマウイルス_F_4.1)および配列番号6(ポリオーマウイルス_R_4.2)の増幅プライマーの使用を含み、前記試験するステップが、少なくとも配列番号14(BK_P_4.3)および配列番号15(JCV_P_4.4)のオリゴヌクレオチドプローブの使用を含む請求項3に記載の方法。
- 配列番号1の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成可能な少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブを含むキット。
- 配列番号1の核酸、相補物もしくは転写産物またはその一部を増幅するための増幅プライマーをさらに含む請求項14に記載のキット。
- 配列番号2(BK_F_1.1)および配列番号3(BK_R_1.2)の増幅プライマーと、配列番号4(BK_P_1.3)および配列番号5(BK_P_1.4)のオリゴヌクレオチドプローブとを含む請求項15に記載のキット。
- 配列番号2(BK_F_1.1)および配列番号6(BK_R_1.5)の増幅プライマーと、配列番号4(BK_P_1.3)および配列番号5(BK_P_1.4)のオリゴヌクレオチドプローブとを含む請求項15に記載のキット。
- 配列番号2(BK_F_1.1)および配列番号3(BK_R_1.2)の増幅プライマーと、配列番号4(BK_P_1.3)および配列番号23(JC_P_1.5)のオリゴヌクレオチドプローブとを含む請求項15に記載のキット。
- 配列番号2(BK_F_1.1)および配列番号3(BK_R_1.2)の増幅プライマーと、配列番号5(BK_P_1.4)および配列番号23(JC_P_1.5)のオリゴヌクレオチドプローブとを含む請求項15に記載のキット。
- 配列番号4(ポリオーマウイルス_F_3.1)および配列番号6(ポリオーマウイルス_R_3.2)の増幅プライマーと、配列番号9(BK_P_3.3)および配列番号13(JCV_P_3.4)のオリゴヌクレオチドプローブとを含む請求項15に記載のキット。
- 配列番号4(ポリオーマウイルス_F_3.1)および配列番号6(ポリオーマウイルス_R_3.2)の増幅プライマーと、配列番号9(BK_P_3.3)のオリゴヌクレオチドプローブとを含む請求項15に記載のキット。
- 配列番号4(ポリオーマウイルス_F_4.1)および配列番号6(ポリオーマウイルス_R_4.2)の増幅プライマーと、配列番号14(BK_P_4.3)および配列番号15(JCV_P_4.4)のオリゴヌクレオチドプローブとを含む請求項15に記載のキット。
- 配列番号8(BK_F_2.1)および配列番号9(BK_R_2.2)の増幅プライマーを含むキット。
- 請求項1から13のいずれかに記載の方法を含む、ポリオーマウイルスの存在について臓器提供者からの血液試料を試験する方法。
- 提供が検討される前記臓器が、腎臓、肝臓および心臓からなる群より選択される請求項24に記載の方法。
- ポリオーマウイルスについて陽性であることが見出された臓器提供者からの臓器を拒否するステップをさらに含む請求項24に記載の方法。
- ポリオーマウイルスを有する患者の治療を監視する方法であって、請求項1から13のいずれかに記載の方法を用いて前記患者におけるポリオーマウイルスのウイルス量を測定するステップを含む、方法。
- 前記ウイルス量が、前記治療の前または治療中に測定される請求項27に記載の方法。
- 前記治療が、抗ウイルス剤の投与を含む請求項27に記載の方法。
- 前記抗ウイルス剤が、シドフォビル、レフルノミド、キノロン抗生物質および静脈内免疫グロブリンからなる群より選択される請求項29に記載の方法。
- 前記増幅ステップが、少なくとも配列番号2および配列番号6の増幅プライマーと、配列番号14のプローブとの使用を含む請求項1に記載の方法。
- 前記増幅ステップが、少なくとも配列番号4および配列番号6の増幅プライマーと、配列番号14のプローブとの使用を含む請求項1に記載の方法。
- 前記増幅ステップが、少なくとも配列番号2およびプライマーBKV_5.2の増幅プライマーと、配列番号14のプローブとの使用を含む請求項1に記載の方法。
- 前記増幅ステップが、少なくとも配列番号4およびプライマーBKV_5.2の増幅プライマーと、配列番号14のプローブとの使用を含む請求項1に記載の方法。
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