CN102676464A - 嗜热长链烷醛醛脱氢酶及其晶体结构 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株嗜热脱氮芽孢杆菌的正烷烃末端降解途径中的嗜热长链烷醛醛脱氢酶及其晶体结构。本发明利用分子克隆方法将目的基因克隆到大肠杆菌E.coli中进行异源表达。通过蛋白质纯化方法获得醛脱氢酶的纯品。利用悬滴结晶法得到适宜衍射的醛脱氢酶的结晶。利用X射线衍射方法对醛脱氢酶的晶体结构进行解析。结果表明，该醛脱氢酶中含有一个特征性的ALDH折叠，由三个结构域构成。对酶活性部位的保守残基进行定点突变，通过该酶的野生型及其突变体的酶活性实验证明保守残基对酶活性的影响。这些结果能全方位反应该酶的空间构象，为进一步研究醛脱氢酶的结构与功能之间的关系、提高酶的降解活性提供理论上的指导。
Description
技术领域：
本发明涉及到用X射线晶体衍射方法确定的一种嗜热长链烷醛醛脱氢酶晶体结构，属于分子生物学和应用微生物学领域。
背景技术：
醛脱氢酶（Aldehyde Dehydrogenase,ALDH）在所有的生物体内普遍存在，这一类酶利用NAD+或NADP+作为辅酶因子将醛类物质氧化成羧基酸类物质。在生物体中，醛脱氢酶将细胞代谢过程中产生的对机体有毒的醛类物质进行氧化从而完成解毒过程。此外，在烷烃类物质降解的生物转化过程中也有醛脱氢酶的参与，在这个过程中烷基醛作为反应的中间产物出现，在醛脱氢酶的作用下转变成羧基酸进入到细菌下一步新陈代谢过程中。
很多细菌源的ALDH可以氧化较短链长到中等链长的烷基醛（C1-C14），例如，Ishige等人分离到来源于不动杆菌属的菌株M-1中的Ald1，该酶可以氧化含有4-14个碳原子的烷基醛；Okibe等人分离到一种石油降解菌中的HD-1，其可以降解含有2-12个碳原子的烷基醛；Jaureguibeitia等人分离到的红串红球菌中的ThcA，该酶可以氧化含有1-8个碳原子的烷基醛；Yamanaka等人分离得到的噬细胞菌属的菌株KUC-1同样也只能降解含有1-8个碳原子的烷基醛。据我们所知，到目前为止，没有关于降解长链烷醛（碳链长度大于16个碳原子的烷醛）的醛脱氢酶的报道。
为了更加深入了解嗜热脱氮芽孢杆菌（Geobacillus thermodenitrificans）NG80-2中参与正烷烃末端降解途径中的嗜热长链烷醛醛脱氢酶的结构与功能之间的关系，本发明通过基因克隆、蛋白质表达、纯化和悬滴气相扩散结晶方法获得了该嗜热长链烷醛醛脱氢酶的晶体，并通过X射线衍射方法对醛脱氢酶的晶体结构进行了解析。
经文献检索，未发现与本发明的嗜热长链烷醛醛脱氢酶的晶体结构相同的公开文献报道。
发明内容：
本发明的目的在于通过X射线衍射方法，确定嗜热脱氮芽孢杆菌（Geobacillusthermodenitrificans）NG80-2中参与正烷烃末端降解途径中的嗜热长链烷醛醛脱氢酶的晶体结构。为进一步研究该醛脱氢酶的降解机理、理解其结构与功能之间的关系，及将该酶用于环境石油污染治理中提供理论上的指导。
本发明中涉及的嗜热长链烷醛醛脱氢酶其底物为从甲醛到二十烷醛的直链烷醛以及几种芳香醛包括：苯甲醛、苯乙醛、邻苯二醛和邻氯苯甲醛。系统发育分析表明，该醛脱氢酶属于第14个ALDH家族的脂肪族子群，该家族中包含的醛脱氢酶作用的底物不具有很强的特异性。在石油烃降解途径中，长链烷醛脱氢酶是十分重要的关键酶，它能够耐高温并高效利用长链烷醇脱氢酶的催化产物长链烷醛，使其进一步脱氢，提高烷烃降解途径中的催化效率，对该酶的研究为深入研究嗜热脱氮芽孢杆菌（Geobacillusthermodenitrificans）NG80-2降解长链烷烃代谢途径的机制提供了更有利的证据，也为探索其他烷烃降解菌的代谢途径提供理论基础。同时，该酶的嗜热性及降解长链烷醛的能力具有重要的工业应用价值，可以应用于石油污染物、石油废水的处理过程及提高微生物石油采收率。
为了更加深入了解嗜热脱氮芽孢杆菌（Geobacillus thermodenitrificans）NG80-2中参与正烷烃末端降解途径中的嗜热长链烷醛醛脱氢酶的结构与功能之间的关系，本发明通过基因克隆、蛋白质表达、纯化和悬滴气相扩散结晶方法获得了醛脱氢酶的晶体，并通过X射线衍射方法对醛脱氢酶的晶体结构进行了解析。
本发明通过对含有嗜热脱氮芽孢杆菌（Geobacillus thermodenitrificans）NG80-2正烷烃降解途径中的醛脱氢酶基因的重组质粒的大肠杆菌E.coli甘油菌液，其载体为pET-28a(+)，接种到5ml经过灭菌且添加了100mg/l kanamycin抗生素的LB液体培养基中，在37℃摇床中培养12个小时后，转接到1L经过灭菌且添加100mg/l kanamycin抗生素的LB液体培养基中，在37℃摇床中培养5-6个小时后，利用0.1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行目的蛋白质的诱导表达，45℃下诱导2.5个小时后利用离心机收集菌体，收集到的菌体在缓冲液50mM Tris-HCl，300mM NaCl，pH8.0中重新溶解；利用超声波破碎菌体的细胞壁并利用高速离心机进行离心，离心后的上清液利用镍离子金属螯合亲和层析柱进行初步纯化，洗脱下的蛋白质浓缩后利用AKTA蛋白质纯化仪的阴离子交换柱Resource Q和分子排阻凝胶色谱柱Superdex200 10/300GL进行纯化。通过SDS-PAGE检测蛋白酶的纯度。在获得电泳纯（>95%）的蛋白酶后用Amicon超滤浓缩管（Millipore,USA）将其浓缩到较高浓度，然后使用悬滴气相扩散法进行晶体培养。结晶条件的筛选使用Hampton（USA）公司的结晶条件筛选试剂盒。在获得好的筛选条件后，即在该条件下进行蛋白质晶体的优化培养。获得的晶体在X光机上衍射。使用HKL2000，CCP4等软件进行处理，最终获得该蛋白酶的三维结构。对结构活性部位的保守残基进行定点突变，通过分子克隆一系列手段得到突变体菌株，并利用前述相同的步骤进行突变体蛋白的纯化，得到电泳纯蛋白之后将醛脱氢酶的野生型蛋白和突变体蛋白同时进行酶活性测定，测定结果显示突变体蛋白没有酶活性。
本发明所涉及的菌株为嗜热脱氮芽孢杆菌（Geobacillus thermodenitrificans）NG80-2，该菌株已于2004年10月09日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏号为CGMCC No.1228，已申请国内发明专利并获得授权（发明名称为《嗜热脱氮芽孢杆菌及其筛选和应用》，专利号：ZL200410072759.7）。
本发明提供的嗜热脱氮芽孢杆菌内的嗜热长链烷醛醛脱氢酶，其晶体结构如下：分辨率为
晶体的空间群为C2221，晶体为四聚体，在每个不对称单元中含有两个分子。在A链中能够看见1-477个残基，在B链中能够看到6-477个残基；每个亚单位含有24个β片层和13个α螺旋；该单体的结构含有一个特征性的ALDH折叠，由三个结构域构成：一个辅酶结合域，包括残基1-119,141-247和439-462，构成一个罗斯曼折叠，用于结合辅酶NAD+；一个催化域，包括残基248-43；一个寡聚化域，包括残基120-140和463-477，用于二聚化。
所述的醛脱氢酶的活性中心结构特征为：三个结构域的交界面处构成一个长度为
的漏斗形的通道，该通道有一个
的开口通向催化口袋；该通道的核心部分排列着疏水残基，这些疏水残基允许底物进入催化部位；起催化作用的残基Cys281位于底物结合通道的最底部，这个残基具有极性，这样可以满足去质子化、亲核攻击并形成一个氧离子的催化需求；辅酶NAD+的结合位点处于一个由罗斯曼折叠形成的伸长的口袋状的辅酶结合域，该辅酶结合域处在催化域的对面。
本发明所述的嗜热长链烷醛醛脱氢酶的晶体结构，经如下步骤得到：
1、嗜热脱氮芽孢杆菌（Geobacillus thermodenitrificans）NG80-2基因组DNA的提取利用酚抽提法从（Geobacillus thermodenitrificans）NG80-2菌体中提取其基因组DNA。
2、含有嗜热长链烷醛醛脱氢酶基因的重组质粒的大肠杆菌E.coli的构建
1）以NG80-2的基因组DNA作为模板，利用聚合酶链式反应PCR扩增NG80-2的aldh基因（GT3117），扩增引物分别为：
FP1:GTAGAATTCATGATTTACGCACAACCAGGCC和
RP1:AGGCTCGAGTTAGAACAAGCCGAGTTTTTTC。
2）PCR扩增产物利用EcoRI（Takara）和XhoI（Takara）进行双酶切，同时质粒pET-28a(+)(Novagen)也利用相同的酶进行双酶切，以使目的基因的PCR产物和质粒形成相同的黏性末端。在连接酶的作用下，将酶切后的目的基因片段连接到pET-28a(+)的质粒中，形成重组质粒。
3）将构建好的重组质粒转化入感受态细胞E.coli BL21(DE3)(Novagen)中；将菌液送到测序公司进行测序，以确定连接片段的正确性。将含有该醛脱氢酶基因的重组质粒的大肠杆菌E.coli的菌液，接种到5ml经过灭菌且添加100mg/l kanamycin抗生素的LB液体培养基中，在37℃摇床中过夜培养12个小时后，转到1L经过灭菌且添加100mg/lkanamycin抗生素的LB液体培养基中，培养5-6个小时后，经高温条件及低浓度IPTG诱导后，E.coli BL21大量表达有活性的醛脱氢酶。诱导结束后，利用离心机收集菌体，收集到的菌体在适当的缓冲液中重新溶解。
3、蛋白酶的纯化
利用超声波细胞破碎仪破碎菌体细胞壁并利用低温高速离心机进行离心，离心后的上清液利用镍离子金属螯合亲和层析柱进行初步纯化，洗脱下的蛋白质浓缩后利用AKTA蛋白质纯化仪的阴离子交换柱Resource Q和分子排阻凝胶色谱柱Superdex20010/300 GL进行纯化。通过SDS-PAGE检测蛋白酶的纯度。
4、蛋白酶的结晶
1）通过以上纯化步骤获得电泳纯的蛋白酶样品，将此蛋白酶溶液加入Amicon（Millipore,USA）超滤浓缩管中于4000rpm的转速下离心浓缩，浓缩过程中将蛋白酶溶液中的300mM NaCl利用不含NaCl但其他组分相同的缓冲液进行稀释，降低蛋白酶溶液中的离子浓度，使NaCl浓度低于10mM。利用紫外吸收法测定蛋白质的浓度。
2）将测定浓度后的蛋白酶溶液利用缓冲液稀释至15mg/ml后，利用悬滴结晶法于pH6.5(0.1M MES)、19%(w/v)PEG3350的结晶条件下获得醛脱氢酶的晶体。
5、晶体的X射线衍射和结构解析
蛋白酶晶体的X射线衍射数据收集步骤如下：首先使用Hampton Research公司的尼龙晶体环，从晶体浸泡液中获取适宜X射线衍射的晶体，并迅速使用Oxford Cyrosystem公司的冷却系统产生的低温氮气流中冷冻至零下150-180℃；使X射线通过晶体，利用旋进法收集X射线衍射数据。
收集到晶体的X射线衍射数据后，按照下述步骤进行相应的数据处理：
首先使用HKL2000等软件对上一步骤中收集得到的衍射数据进行处理，获得完整的数据文件；其次，使用CCP4程序包中的Phaser、Molrep等软件，利用分子置换（MR，Molecular Replacement）方法，以人体肝脏中线粒体内的醛脱氢酶（PDB code：1CW3）为搜索模型，得到蛋白酶ALDH的精细三维结构。
本发明解析得到的醛脱氢酶的总体结构特征如上所述。
6、ALDH活性部位关键残基进行定点突变，利用分子生物学手段进行重新构建，利用上述步骤2和3进行突变体蛋白的纯化。
将ALDH的301位的半胱氨酸突变为丙氨酸（Cys301Ala），采用重叠延伸法进行该定点突变。
1）根据ALDH的核苷酸序列及欲突变位点，设计两对引物，分别为：
F:CGGGATCCATGATTTACGCACAACCAGG，
R:CCGCTCGAGTTAGAACAAGCCGAGTTTTTTC及
FM301:CGAAGTGGCCACATGC，
RM301:GCATGTGGCCACTTCG。
以ALDH的核苷酸序列为模板，分别利用两对引物进行PCR反应，扩增突变位点前端片段和后端片段，两个PCR反应中使用的引物分别为：F/RM301，R/FM301。通过两个PCR反应，已经将突变位点前后的核苷酸序列分别克隆完成。利用F/R一对引物，以前面反应得到的产物作为模板进行PCR，得到目的位点突变的ALDH的全长核苷酸序列。
2）将上步反应中得到的定点突变的PCR产物利用BamHI(Takara)和XhoI(Takara)进行双酶切反应，同时载体质粒pET-28a(+)(Novagen)也利用相同的酶进行双酶切反应，以使PCR产物和质粒形成相同的黏性末端。在连接酶的作用下，将酶切后的目的基因片段连接到pET-28a(+)的质粒中。
3）将构建好的表达载体转化入感受态细胞E.coli BL21(DE3)(Novagen)中；将菌液送到测序公司进行测序，以确定连接片段的正确性。经高温条件及低浓度IPTG诱导后，E.coli BL21大量表达突变体C301A醛脱氢酶。
4）利用超声波细胞破碎仪破碎菌体细胞壁并利用高速离心机进行离心，离心后的上清液利用镍离子金属螯合亲和层析柱进行初步纯化，洗脱下的蛋白质浓缩后利用AKTA蛋白质纯化仪的阴离子交换柱Resource Q和分子排阻凝胶色谱柱Superdex20010/300GL进行纯化。通过SDS-PAGE检测蛋白酶的纯度。
5）进行野生型蛋白酶ALDH和突变体蛋白酶ALDHM的酶活性检测，检测方法冯露等人2010年在《Microbiological Research》上发表的文章《Characterization of abroad-range aldehyde dehydrogenase involved in alkane degradation in Geobacillusthermodenitrificans NG80-2》中所述的ALDH的酶活实验中的方法并稍加改进后进行。
具体实验步骤如下：反应的标准混合物组成如下：50mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液，1mM NAD+，1mM甲醛和0.1mM酶。不添加底物甲醛的上述混合物作为空白。将上述混合物混匀之后60℃水浴反应15分钟。反应结束后，野生型ALDH由于具有催化活性催化甲醛反应，产物中的NADH在340nm波长处具有吸收，光吸收值利用GeneQuant 1300型紫外/可见分光光度计测定。
酶活实验结果表明，空白对照组有一定的光吸收值是因为NAD+在340nm处也有一定的吸收值，只不过比NADH要弱，野生型的光吸收值很高，显示出醛脱氢酶催化甲醛反应产生了较多的NADH，而突变体的光吸收值与空白对照组的光吸收值相当，表明其反应体系中并未产生NADH，也即突变体不具有活性，没有催化底物甲醛进行反应。由此确定了决定醛脱氢酶的反应活性的关键残基，使我们对于醛脱氢酶的三维结构及功能行使有了更加深入的了解。
本发明的优点和有益效果：
本发明涉及到一株嗜热脱氮芽孢杆菌（Geobacillus thermodenitrificans）NG80-2中参与正烷烃末端降解途径中的醛脱氢酶及其晶体结构。该醛脱氢酶的特点在于其能够氧化碳链长度大于十六的直链烷基醛，此外还能够氧化几种芳香醛。且该醛脱氢酶还具有热稳定性，能够在温度高达70℃时发挥降解功能。其较强的降解能力及自身的热稳定性使其在工业上及在石油类物质的环境污染修复和治理上有很强应用的潜力。此外，通过对其三维结构分析，揭示其结构与功能之间的关系，为进一步提高醛脱氢酶的降解活性提供理论上的指导。
附图说明
图1为醛脱氢酶晶体结构的飘带模型。
由图可知该醛脱氢酶为四聚体，一个亚基含有24个β片层和13个α螺旋。该亚基的结构含有一个特征性的ALDH折叠，由三个结构域构成：一个辅酶结合域，包括残基1-119,141-247和439-462，含有一个罗斯曼折叠，用于结合辅酶NAD+；一个催化域，包括残基248-438；一个寡聚化域包括残基120-140和463-477，用于单体二聚化。
图2为醛脱氢酶的底物结合位点的示意图。
为了更加详细的解释本发明，下面将结合附图给出本发明的具体实施例。下述实施例仅仅是用于解释本发明，而不应当理解为以任何方式限制本发明范围。
具体实施方式
实施例1、嗜热长链烷醛醛脱氢酶的分子构建及蛋白纯化
1．Geobacillus thermodenitrificans NG80-2基因组DNA的提取
1）将嗜热脱氮芽孢杆菌Geobacillus thermodenitrificans NG80-2接种于LB液体培养基，37℃、200rpm培养12小时；
2）取其过夜培养的新鲜培养物3ml，离心收集菌体；
3）菌体悬于250μL 50mM Tris（pH8.0）缓冲液中，加入10μL 0.4M EDTA（pH8.0），混匀后37℃保温20min；
4）之后加入30μL 20mg/ml溶菌酶，混匀后37℃再保温20min；
5）再加入5μL 20mg/ml蛋白酶K，温柔混匀后，再加入20μL 10%SDS，50℃保温至溶液澄清；
6）分别用等体积酚∶氯仿∶异戊醇抽提两次，氯仿∶异戊醇抽提一次，最后一次的上清液，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，回收DNA，用70%乙醇洗，沉淀溶于100μL TE缓冲液（pH8.0,10mM Tris,1mM EDTA）；
7）加入10mg/ml RNase 2μL，65℃保温30min，分别用酚∶氯仿∶异戊醇、氯仿∶异戊醇各抽提一次，上清液加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，回收DNA，用70%乙醇洗，真空干燥，沉淀溶于50μL TE缓冲液。
2．Geobacillus thermodenitrificans NG80-2醛脱氢酶基因序列的获得
1）PCR扩增体系
2)PCR反应程序
3.Geobacillus thermodenitrificans NG80-2醛脱氢酶基因序列PCR产物的回收PCR结束后，产物利用1％的琼脂糖凝胶电泳切胶回收1.5kb的目的片段。
具体步骤如下：
1)琼脂糖凝胶电泳结束后，在紫外灯下观察跑胶结果，切取目的片段放入1.5ml灭菌的EP管中；
2)在EP管中加入650μL溶胶液，将EP管放入65℃水浴锅中加热，使胶块溶解；
3)将溶胶液分两次加入树脂柱中，冰上静置2min，室温下于离心机中12000rpm离心1min。将管中液体倒回树脂柱中重新结合一次，冰上静置2min，室温下于离心机中12000rpm离心1min，弃去收集管中的液体；
4)树脂柱中加入600μL洗涤液，室温放置2min后，于离心机中12000rpm离心1min，弃去收集管中液体；重复此步骤一次；
5)室温下于离心机中12000rpm离心3min，使树脂柱中酒精尽量减少；将树脂柱转移到1.5ml灭菌的EP管中；
6)在树脂柱上加入20μL65℃预热的TE溶液，室温静置3min，于离心机中12000rpm离心2min；重复此步骤一次。
得到40μL醛脱氢酶基因。
4.Geobacillus thermodenitrificans NG80-2醛脱氢酶基因序列PCR产物与载体的双酶切
将3中回收的目的片段PCR产物与载体质粒pET-28a(+)同时进行双酶切，酶切体系如下：
目的片段酶切体系与载体质粒酶切体系相同，不同之处在于体系中添加的目的片段量为600ng。
将反应物全部加入灭菌后的EP管中，柔和混匀，于37℃水浴中进行酶切，反应18个小时以上。
5.Geobacillus thermodenitrificans NG80-2醛脱氢酶基因序列PCR产物与载体的酶切产物的回收、连接
酶切后的目的片段和载体质粒进行切胶回收，回收步骤同3。回收结束后，进行目的片段与载体质粒的连接。连接反应体系如下：
Solution I： 5μL
载体质粒： 0.6μL
目的基因片段： 4.5μL
反应于16℃条件下进行6小时。
6.连接产物转化E.coli trans5α
a.从-80℃冰箱中取出100μL感受态细胞悬液放在冰上解冻；
b.将感受态细胞50μL加入到5中的连接产物中，冰浴30min；
c.冰浴结束后，将b中的反应体系放入42℃水浴中热激90s，热激结束后，迅速转入冰中冰浴2min；
d.冰浴结束后，在反应体系中加入800μL LB培养基，于37℃摇床中振荡培养90min；
e.振荡培养结束后，将培养物取出，于离心机中4500rpm离心7min；
f.离心后，用移液枪将大部分上清吸去，剩余液体量50μL-100μL，再用移液枪将管底的菌体吹吸悬浮起来之后，转移到含有100 mg/l kanamycin抗生素的LB平板上，用推子推匀，37℃培养十几个小时。
7.重组质粒的酶切鉴定
1)6中平板培养十几个小时之后，平板表面会长出许多菌落，挑取单克隆菌落于5ml经高温灭菌且添加了100 mg/l kanamycin抗生素的LB液体培养基中，一共挑6个，于37℃振荡培养12小时；
2)取3ml菌液提取质粒，进行质粒的酶切鉴定。质粒提取步骤按照博大泰克试剂盒说明书进行操作。质粒酶切体系如下：
37℃水浴反应一个小时后利用琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳中含有两段DNA片段，大小分别为1.5kb和5.0kb左右，表明目的片段连接到了载体质粒中，将质粒送往测序公司进行测序。
8.重组质粒在E.coli BL21中的诱导表达
1)将带有醛脱氢酶基因的重组质粒转化E.coli BL21
转化步骤与6中连接产物转化入E.coli trans5α步骤相同，只不过在体系中加入LB培养基后37℃振荡培养时间为1h。菌液涂布在含有100mg/l kanamycin抗生素的平板上，于37℃倒置培养12h。
2）IPTG诱导醛脱氢酶的异源表达
a.挑取平板上含有重组质粒的单菌落接种于5ml的经高温灭菌、添加了100mg/lkanamycin抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；
b.按1%接种量转接添加了100mg/l kanamycin抗生素的液体LB培养基，37℃、200rpm培养5-6h，加入0.1mM IPTG后于45℃诱导2.5h。
9．醛脱氢酶ALDH的纯化
1）菌体收集
a.将8中的液体培养液于5000rpm离心15min收集菌体，用ddH2O冲洗两次；
b.按1L发酵液用25ml的50mM Tris-HCl，300mM NaCl（pH8.0）缓冲液的比例将菌体重悬；
2）超声波破碎获得粗酶液
将细胞重悬液放置于冰上，以40%的频率，超声4s后停6s的条件超声，一个循环为10分钟，超声破碎约三个循环，直到重悬液完全清亮为止；破碎之后的菌液在4℃离心机中于18000rpm离心40min，离心结束之后弃去沉淀；
3）粗酶液过亲和层析柱
a．选择镍离子金属螯合亲和层析柱；
b．用50mM Tris-HCl,300mM NaCl（pH8.0）缓冲液将柱子平衡；
c．将2）中得到的粗酶液加入到镍柱中使目的蛋白与镍介质结合；粗酶液一共过3遍镍柱；
d．用50mM Tris-HCl,300mM NaCl（pH8.0）缓冲液冲洗柱子，将未与镍介质结合的杂质洗去；
e．用100ml含有40mM咪唑的50mM Tris-HCl,300mM NaCl（pH8.0）缓冲液冲洗柱子，将一些结合较弱的杂蛋白洗去；
f．用含有300mM咪唑的50mM Tris-HCl,300mM NaCl缓冲液（pH8.0）洗脱目的蛋白，收集洗脱液；
4）洗脱的酶液中盐离子的稀释及酶液的浓缩
将收集的蛋白质洗脱液加入到30kD浓缩管中，4℃条件下于离心机中4000rpm浓缩，同时利用50mM Tris-HCl（pH8.0）缓冲液稀释蛋白质溶液中的NaCl浓度，使其浓度低于10mM；
5）阴离子交换层析Resource Q
a.用50mM Tris-HCl（pH8.0）缓冲液平衡阴离子交换柱，直到电导率、UV值不再变化为止；
b.浓缩好的样品转移到1.5ml EP管中，于4℃离心机中13300rpm离心10min，以除去蛋白质溶液中可能存在的固体颗粒杂质和气泡；
c.通过六通阀进行上样，然后用50mM Tris-HCl缓冲液（pH8.0）以1ml/min的流速平衡柱子2个柱体积；
d.待冲洗完层析柱，开始梯度洗脱。洗脱条件为0-100%洗脱缓冲液（50mM Tris-HCl，1M NaCl，pH8.0），流速为1ml/min，同时根据A280的变化收集各洗脱峰；
e.使用SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度，收集纯度较高的部分浓缩；
6）分子筛凝胶色谱柱Superdex 20010/300 GL
a.用50mM Tris-HCl,300mM NaCl（pH8.0）缓冲液平衡Superdex 20010/300GL分子筛凝胶色谱柱至电导率保持不变；
b.浓缩好的样品转移到1.5ml EP管中，于4℃离心机中13300rpm离心10min，以除去蛋白质溶液中可能存在的固体颗粒杂质和气泡；
c.通过六通阀进行上样，然后在50mM Tris-HCl,300mM NaCl（pH8.0）缓冲液条件下以流速0.5ml/min洗脱。根据A280的变化收集各洗脱峰；
d.使用SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度，收集纯度较高的部分浓缩；浓缩过程中同时对NaCl进行稀释，使其浓度低于10mM；
e.蛋白样品稀释好后，利用紫外吸收法测定蛋白质浓度。
实施例2、嗜热长链烷醛醛脱氢酶蛋白的结晶及数据收集、解析
1．纯化后的醛脱氢酶的结晶及结构分析
1）醛脱氢酶结晶
a．将纯化后的醛脱氢酶浓度稀释到10mg/ml和20mg/ml；
b．利用Hampton Research公司的结晶试剂盒进行晶体初筛，晶体板置于16℃；
经过一段时间观察，发现在Index 43号中有晶体生长，且生长较好；以此条件为基础条件，进行醛脱氢酶结晶条件的优化实验；
c．在注射器中填入高真空硅脂，在24孔悬滴晶体板上，每个培养孔边上画一个2mm宽的硅脂圈；
d．将结晶条件中的pH缓冲液条件和沉淀剂PEG3350的浓度分别拉一个浓度梯度进行池液的配比；
e．将经过硅化的玻璃片放在干净的滤纸上，利用微量移液枪吸取1μL蛋白质溶液，再吸取1μL池液加到蛋白质溶液上；
f．用手指捏住盖玻片边缘，将其翻转，使液滴悬垂在盖玻片下，将盖玻片置于晶体板相应的孔上，保证盖玻片边缘将孔密闭；
g．用手指将盖玻片均匀而有力的压合在孔上；
h．将晶体板的盖子盖上，置于16℃生长。
2）醛脱氢酶晶体结构数据的收集及结构解析通过悬滴扩散法获得醛脱氢酶的晶体，该晶体数据在100K的低温条件下利用RAXIS-IV探测器收集数据。衍射数据利用HKL2000软件包进行处理，醛脱氢酶的晶体结构以人体肝脏线粒体中的醛脱氢酶（PDB code:1CW3）作为搜索模型，应用PHASER程序通过分子置换来获得初始相位。醛脱氢酶的晶体属于C2221空间群。晶体结构的衍射数据参见表1。
表1晶体衍射数据的收集和修正
a圆括号中的值表示相应的最高分辨率的数值
b Rmerge＝∑h∑l|Iih-<Ih>|/∑h∑l<Ih>，<Ih>是观测值的平均值Iih的参照h
cRwork＝∑(||Fp(obs)|-|Fp(calc)||)/∑|Fp(obs)|；Rfree指没有包括在优先细化的衍射点抽取子集（5%）后的R因子。
实施例3、嗜热长链烷醛醛脱氢酶突变体的分子构建、蛋白纯化
1、醛脱氢酶突变体（Cys301Ala）的重组质粒的构建与蛋白纯化
醛脱氢酶突变体的重组质粒的构建过程同醛脱氢酶野生型的重组质粒的构建，只不过在目的片段的PCR部分不同，利用重叠延伸法进行，具体步骤如下：
1）以ALDH的核苷酸序列为模板，分别利用F/RM301，R/FM301这两对引物进行PCR反应，扩增突变位点前端片段和后端片段。反应体系如下：
PCR程序同ALDH野生型的重组质粒构建过程。PCR产物切胶回收之后并跑胶鉴定。鉴定其大小正确之后，分别以两次PCR反应的产物作为模板，进行定点突变的第三步反应，反应体系如下：
PCR反应程序除了延伸温度为72℃下2min外，其它程序都相同。通过此步PCR反应得到ALDH的突变体的基因序列。
下面进行的质粒重组、蛋白纯化实验同实施例1中的步骤4-9，只不过在4中双酶切所用的酶为BamHI(Takara)和XhoI(Takara)，通过这样一系列步骤得到ALDH突变体的电泳纯蛋白酶。
实施例4、嗜热长链烷醛醛脱氢酶野生型及突变体酶活实验
1、醛脱氢酶野生型与突变体的酶活实验
酶活实验的方法冯露等人2010年在《Microbiological Research》上发表的文章《Characterization of a broad-range aldehyde dehydrogenase involved in alkanedegradation in Geobacillus thermodenitrificans NG80-2》中所述的ALDH的酶活实验中的方法并稍加改进后进行。
具体实验步骤如下：反应的标准混合物组成如下：50mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液，1mM NAD+，1mM甲醛和0.1mM酶。不添加底物甲醛的上述混合物作为空白。将上述混合物混匀之后60℃水浴反应15分钟。反应结束后，野生型ALDH由于具有催化活性催化甲醛反应，产物中的NADH在340nm波长处具有吸收，光吸收值利用GeneQuant 1300型紫外/可见分光光度计测定。实验结果如下表2所示。
从表2实验结果中可以看出，空白对照组有一定的光吸收值是因为NAD+在340nm处也有一定的吸收值，只不过比NADH要弱，野生型的光吸收值很高，显示出醛脱氢酶催化甲醛反应产生了较多的NADH，而突变体的光吸收值与空白对照组的光吸收值相当，表明其反应体系中并未产生NADH，也即突变体不具有活性，没有催化底物甲醛进行反应。
醛脱氢酶的应用
冯露等人2010年在《Microbiological Research》上发表的文章《Characterization of abroad-range aldehyde dehydrogenase involved in alkane degradation in Geobacillusthermodenitrificans NG80-2》中谈到该嗜热长链烷醛醛脱氢酶其底物为从甲醛到二十烷醛的直链烷醛以及几种芳香醛包括：苯甲醛、苯乙醛、邻苯二醛和邻氯苯甲醛，其中其对于甲醛的降解活性最高。在石油烃降解途径中，长链烷醛脱氢酶是十分重要的关键酶，它能够耐高温并高效利用长链烷醇脱氢酶的催化产物长链烷醛，使其进一步脱氢，提高烷烃降解途径中的催化效率，对该酶的研究为深入研究嗜热脱氮芽孢杆菌（Geobacillusthermodenitrificans）NG80-2降解长链烷烃代谢途径的机制提供了更有利的证据，也为探索其他烷烃降解菌的代谢途径提供理论基础。同时，该酶的嗜热性及降解长链烷醛的能力具有重要的工业应用价值，可以应用于石油污染物和我石油废水的处理过程和提高微生物石油采收率。
ALDH降解苯甲醛的活性很高，而苯甲醛是甲苯降解途径中的中间产物，芳香族烃类包含甲苯，它们与烷烃一样，也是石油的组分。因此，ALDH不仅在正烷烃降解途径中起作用，还参与了芳香烃的降解。该酶对于NG80-2在油田环境中生存起到了很关键的作用。
本发明通过X-射线衍射方法解析了醛脱氢酶的三维结构，并且通过对醛脱氢酶起催化作用的关键残基进行突变，通过野生型和突变体的醛脱氢酶的酶活实验确定了该酶的底物结合位点和活性中心，这些数据能够全方位的反映该酶的氨基酸空间构象，为改造该醛脱氢酶，提高其降解能力，使NG80-2降解石油能力有所提高，用于石油污染土壤的治理和修复中，具有很好的应用前景。
本发明中所涉及的各种实验用品（包括但不限于：化学试剂、生物制品、细胞、生物体、仪器等）之中，对于那些特殊的或不易获得的，文中均已注明了制造商、参考文献或详细的制备方法；未经特别说明的，均为常规实验用品，可以通过各种方式（例如购买、自行制备等）很方便的获得。
Claims (3)
1.一种嗜热脱氮芽孢杆菌内的嗜热长链烷醛醛脱氢酶，其特征在于该嗜热长链烷醛醛脱氢酶的晶体结构如下：分辨率为晶体的空间群为C2221，晶体为四聚体，在每个不对称单元中含有两个分子。在A链中能够看见1-477个残基，在B链中能够看到6-477个残基；每个亚单位含有24个β片层和13个α螺旋；该单体的结构含有一个特征性的ALDH折叠，由三个结构域构成：一个辅酶结合域，包括残基1-119,141-247和439-462，构成一个罗斯曼折叠，用于结合辅酶NAD+；一个催化域，包括残基248-43；一个寡聚化域，包括残基120-140和463-477，用于二聚化。
2.根据权利要求1所述的嗜热长链烷醛醛脱氢酶，其特征在于所述的醛脱氢酶的活性中心结构特征为：三个结构域的交界面处构成一个长度为
的漏斗形的通道，该通道有一个
的开口通向催化口袋；该通道的核心部分排列着疏水残基，这些疏水残基允许底物进入催化部位；起催化作用的残基Cys281位于底物结合通道的最底部，这个残基具有极性，这样可以满足去质子化、亲核攻击并形成一个氧离子的催化需求；辅酶NAD+的结合位点处于一个由罗斯曼折叠形成的伸长的口袋状的辅酶结合域，该辅酶结合域处在催化域的对面。
3.一种权利要求1所述的嗜热长链烷醛醛脱氢酶的晶体结构的确定方法，其特征在于经如下步骤得到：
a.利用酚抽提法从嗜热脱氮芽孢杆菌（Geobacillus thermodenitrifcans）NG80-2菌体中提取其基因组DNA；利用聚合酶链式反应PCR扩增该嗜热长链烷醛醛脱氢酶基因，利用分子生物学方法将该基因克隆到大肠杆菌E.coli中；
b.将含有该嗜热长链烷醛醛脱氢酶基因的重组质粒的大肠杆菌E.coli的菌液，载体为pET-28a(+)，接种到5ml经过灭菌且添加100mg/l kanamycin抗生素的LB液体培养基中，在37℃摇床中过夜培养12个小时后，转到1L经过灭菌且添加100mg/l kanamycin抗生素的LB液体培养基中，在37℃摇床中培养5-6个小时后，利用终浓度为0.1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行目的蛋白质的诱导表达，45℃下诱导2.5个小时后利用离心机收集菌体，收集到的菌体在pH8.0的缓冲液50mM Tris-HCl,300mM NaCl中重新溶解；
c.利用超声波破碎步骤b中得到的菌体的细胞壁并利用高速离心机进行离心，离心后的上清液利用镍离子金属螯合亲和层析柱进行初步纯化，洗脱下的蛋白质浓缩后利用AKTA蛋白质纯化仪的阴离子交换柱Resource Q和分子筛凝胶色谱柱Superdex20010/300GL进行纯化，得到电泳纯的蛋白酶；
d.将电泳纯蛋白酶样品通过悬滴气相扩散法进行结晶，得到适宜X射线衍射的醛脱氢酶的蛋白质晶体；
e.利用X射线衍射法对步骤d中得到的醛脱氢酶的蛋白质晶体进行数据收集，在收集到醛脱氢酶的X射线衍射数据后，首先使用HKL2000对收集得到的衍射数据进行处理，获得完整的数据文件；再使用CCP4程序包中的Phaser软件，利用分子置换（MR，Molecular Replacement）方法得到如权利要求1所述的嗜热脱氮芽孢杆菌中的醛脱氢酶的三维结构；
f.通过对步骤e中得到的结构进行分析，对其活性部位的保守残基进行定点突变，利用重叠延伸法得到保守位点突变的该醛脱氢酶基因，利用a中的步骤得到突变体菌株，并利用b、c中的步骤进行突变体蛋白的纯化，得到电泳纯蛋白之后将c中得到的蛋白和本步骤中得到的突变体蛋白同时进行酶活性测定，测定结果显示突变体蛋白没有酶活性，显示出突变位点残基对于酶功能的发挥具有重要作用。
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