CN102936586A

CN102936586A - 嗜热长链烷醇醇脱氢酶及其晶体结构

Info

Publication number: CN102936586A
Application number: CN2012105370434A
Authority: CN
Inventors: 马克·巴特兰姆; 王莹莹; 纪玉蕊
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2012-12-10
Filing date: 2012-12-10
Publication date: 2013-02-20

Abstract

本发明涉及一株嗜热脱氮芽孢杆菌正烷烃末端降解途径中的嗜热长链烷醇醇脱氢酶的晶体结构。本发明利用大肠杆菌E.coli异源表达该醇脱氢酶。通过蛋白质纯化方法获得该酶的纯品。利用悬滴结晶法得到该酶适宜衍射的晶体。利用X射线衍射方法对该酶的晶体结构进行解析。结果表明，一个亚基中含有两个结构域，其被一个裂缝隔开。N-端结构域含有一对类似于罗斯曼折叠的α/β折叠。该结构域含有一个NAD⁺辅酶结合位点。C-端结构域含有一个脱氢奎尼酸盐合成酶类似的α结构域布局。一个金属铁离子结合到C-端结构域，并暴露于中间裂缝。这些结果能全方位反应该酶的空间构象，为进一步研究醇脱氢酶的结构与功能之间的关系、提高酶的降解活性提供理论上的指导。

Description

嗜热长链烷醇醇脱氢酶及其晶体结构

技术领域：

本发明涉及到用X射线晶体衍射方法确定的一种嗜热长链烷醇醇脱氢酶晶体结构，属于分子生物学和应用微生物学领域。

背景技术：

醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase,ADHs,EC 1.1.1.1）是生物体内重要的氧化还原剂之一，很多醇类代谢都是通过醇脱氢酶催化完成的。在动物、植物、微生物、真核生物以及原核细菌中都已发现醇脱氢酶，至少有25个EC编号的酶被称为醇脱氢酶。

醇脱氢酶能够催化醇类物质到醛类物质的可逆氧化。ADHs的底物范围很广，其所起到的生理学作用也是多种多样的。在微生物烷烃类物质的末端降解途径中，ADHs催化反应中的第二步，末端降解途径如图3所示。

在正烷烃类物质末端降解途径中，由烷烃加氧酶将烷烃氧化为长链烷醇，再由醇脱氢酶进一步脱氢为长链烷醛，生成的长链烷醛在醛脱氢酶的作用下脱氢生成长链脂肪酸。在长链脂肪酸辅酶A连接酶作用下生成长链烷酸辅酶A后进入三羧酸循环，最终完全氧化为二氧化碳和水。

醇脱氢酶来源广泛，种类繁多。依赖NAD(P)H的醇脱氢酶，根据它们的分子性质和金属含量，能够分为三类。I型：Zn²⁺依赖的长链醇脱氢酶（每个亚基含有约350个氨基酸残基），如来自于大肠杆菌Escherichia coli的菌株K-12中的YqhD。II型：不含有金属的短链醇脱氢酶（每个亚基中含有约250个氨基酸残基），如来自于栖热菌属的Thermusthermophilus HB27中的醇脱氢酶即属于该型脱氢酶。III型：含铁的/由铁激活的长链醇脱氢酶（每个亚基中含有385-900个氨基酸残基），如来自于发酵单胞菌属的Zymomonasmobilis ZM4中的醇脱氢酶，该醇脱氢酶需要铁离子存在才能活化发挥功能，以及来自于大肠杆菌E.coli的菌株ECL1中的含铁的醇脱氢酶。

不动杆菌属中菌株HO1N对于十六烷醇具有降解活性。从一些已知的烷烃降解细菌，如假单胞菌属Pseudomonas fluorescens NRRL B-1244、假单胞菌属Pseudomonas butanovoraATCC 43655、不动杆菌属Acinetobacter M-1，以及一些尚未了解具有降解烃类物质功能的细菌，如土壤芽孢杆菌属Geobacillus stearothermophilus LLD-R、热球菌属Pyrococcusfuriosus DSM 3638，以及黄杆菌属Flavobacterium frigidimaris KUC-1，等菌株都表现出了对于短链长到中等链长（C2-C14）烷基醇的降解活性。然而，具有降解较长链长（C15及以上）烷基醇的醇脱氢酶到目前还没有报道。目前研究最为清楚的是酵母菌中的醇脱氢酶，其为四聚体，单个亚基肽链含有347个氨基酸残基，亚基分子量为35000。酵母醇脱氢酶对底物专一性强，对乙醇及其他直链伯醇活性较高，只对少数仲醇和侧链烷醇具有活性。

在石油烃降解途径中，嗜热脱氮芽孢杆菌（Geobacillus thermodenitrificans）NG80-2中的长链烷醇醇脱氢酶是十分重要的关键酶，其能够耐高温并高效利用烷烃单加氧酶的催化产物长链烷醇，使其进一步脱氢，提高烷烃降解途径中的催化效率；另一方面，它有着比长链烷烃单加氧酶更广泛的底物范围，不仅能够催化长链烷醇，还对短链醇有很高的催化能力。因此，对长链烷醇醇脱氢酶的研究不仅有利于深入了解嗜热脱氮芽孢杆菌（Geobacillus thermodenitrificans）NG80-2降解长链烷烃途径的机制，为探索其它烷烃降解菌的代谢途径提供理论基础，对该酶构建高效表达工程菌株及大量纯化更具有广阔的工业应用前景和经济价值。

经文献检索，未发现与本发明的嗜热长链烷醇醇脱氢酶的晶体结构相同的公开文献报道。

发明内容：

本发明目的是为了更加深入了解嗜热脱氮芽孢杆菌（Geobacillus thermodenitrificans）NG80-2中参与正烷烃末端降解途径中的嗜热长链烷醇醇脱氢酶的结构与功能之间的关系，提供嗜热长链烷醇醇脱氢酶的晶体结构；本发明通过蛋白质表达、纯化和悬滴气相扩散结晶方法获得了该嗜热长链烷醇醇脱氢酶的晶体，并通过X射线衍射方法对醇脱氢酶的晶体结构进行了解析。

本发明中涉及的嗜热长链烷醇醇脱氢酶，其可以广泛作用于C₁₂-C₃₀之间的长链烷醇，其底物范围为：碳链长度大于16个碳原子的烷基醇、1,3-丙二醇、乙醛、异丙醇、异戊醇、丙酮、辛醛和癸醛。其中，该醇脱氢酶的最适底物为1-辛醇。该醇脱氢酶可以利用NAD⁺/NADP⁺作为辅因子。序列分析该醇脱氢酶属于III型醇脱氢酶。

在石油烃降解途径中，长链烷醇醇脱氢酶是十分重要的关键酶，对该酶的研究为深入研究嗜热脱氮芽孢杆菌（Geobacillus thermodenitrificans）NG80-2降解长链烷烃代谢途径的机制提供了更有利的证据，也为探索其它烷烃降解菌的代谢途径提供理论基础。同时，该酶的嗜热性及降解长链烷醇的能力具有重要的工业应用价值，可以应用于石油污染物和石油废水的处理过程及用于提高微生物石油采收率。

本发明通过X射线衍射方法，确定嗜热脱氮芽孢杆菌（Geobacillus thermodenitrificans）NG80-2中参与正烷烃末端降解途径中的嗜热长链烷醇醇脱氢酶的晶体结构。为进一步研究该醇脱氢酶的降解机理、理解其结构与功能之间的关系，及将该酶用于环境石油污染治理中提供理论上的指导。

本发明所涉及的菌株为嗜热脱氮芽孢杆菌（Geobacillus thermodenitrificans）NG80-2，该菌株于2004年10月09日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.1228，该菌株已公开在专利号为ZL200410072759.7、发明名称为《嗜热脱氮芽孢杆菌及其筛选和应用》的中国发明专利中。

本发明提供的嗜热脱氮芽孢杆菌内的嗜热长链烷醇醇脱氢酶，其晶体结构如下：一个亚基中含有两个结构域，这两个结构域被一个裂缝隔开。N-端结构域含有一对类似于罗斯曼折叠的α/β折叠，其中包含β折叠1-5和β折叠8，α螺旋1-4位于侧面；该结构域含有一个NAD⁺辅酶结合位点。C-端结构域含有一个脱氢奎尼酸盐合成酶类似的α结构域布局，其中9个α螺旋排成了一个螺旋束。一个金属铁离子结合到C-端结构域，并暴露于中间裂缝。该金属铁离子处于由四个严格保守的残基Asp194，His198，His261和His267所构成的金字塔形式的氢键网络之中。

上述的醇脱氢酶的活性中心结构特征为：在N-端结构域和C-端结构域中间有一条裂缝，有一个通道通往该裂缝。这个裂缝为底物提供了一个入口，并且使其能够接触到NAD⁺辅酶和金属结合位点。

然而，该长链烷醇醇脱氢酶在之前的功能研究中并未表明其需要铁来使其发挥活性(Liu et al.,2009,Microbiology 155:2078-85)。

本发明所述的嗜热长链烷醇醇脱氢酶的晶体结构，经如下步骤得到：

1、蛋白酶的表达

将含有该醇脱氢酶基因的重组质粒的大肠杆菌E.coli的菌液，接种到5ml经过灭菌且添加100mg/l kanamycin抗生素的LB液体培养基中，在37℃摇床中过夜培养12个小时后，转接到1L经过灭菌且添加100mg/l kanamycin抗生素的LB液体培养基中，培养5-6个小时后，经高温条件及低浓度IPTG诱导后，E.coli BL21大量表达有活性的醇脱氢酶。诱导结束后，利用离心机收集菌体，收集到的菌体在适当的缓冲液中重新溶解。

2、蛋白酶的纯化

利用超声波细胞破碎仪破碎菌体细胞壁并利用低温高速离心机进行离心，离心后的上清液利用镍离子金属螯合亲和层析柱进行初步纯化，洗脱下的蛋白质浓缩后利用AKTA蛋白质纯化仪的阴离子交换柱Resource Q和分子排阻凝胶色谱柱Superdex200 10/300 GL进行纯化。通过SDS-PAGE检测蛋白酶的纯度。

3、蛋白酶的结晶

1）通过以上纯化步骤获得电泳纯的蛋白酶样品，将此蛋白酶溶液加入Amicon（Millipore,USA）超滤浓缩管中于4000rpm的转速下离心浓缩，浓缩过程中将蛋白酶溶液中的300mM NaCl利用不含NaCl但其他组分相同的缓冲液进行稀释，降低蛋白酶溶液中的离子浓度，使NaCl浓度低于10mM。利用紫外吸收法测定蛋白质的浓度。

2）将测定浓度后的蛋白酶溶液利用缓冲液稀释至20mg/ml后，利用悬滴结晶法于100mM phosphate-citrate,pH6.0、12.5%(w/v)PEG8000、200mM NaCl的结晶条件下获得醇脱氢酶的晶体。

4、晶体的X射线衍射和结构解析

蛋白酶晶体的X射线衍射数据收集步骤如下：首先使用Hampton Research公司的尼龙晶体环，从晶体浸泡液中获取适宜X射线衍射的晶体，并迅速使用Oxford Cryosystem公司的冷却系统产生的低温氮气流中冷冻至零下150-180℃；使X射线通过晶体，利用旋进法收集X射线衍射数据。

收集到晶体的X射线衍射数据后，按照下述步骤进行相应的数据处理：

首先使用HKL2000等软件对上一步骤中收集得到的衍射数据进行处理，获得完整的数据文件；其次，使用CCP4程序包中的Phaser、Molrep等软件，利用分子置换（MR，Molecular Replacement）方法，以海栖热袍菌（Thermotoga maritima）中的NADH依赖的丁醇脱氢酶A（TM0820）（PDB code：1VLJ）为搜索模型，得到嗜热烷醇醇脱氢酶的精细三维结构。

本发明解析得到的醇脱氢酶的总体结构特征如上所述。

本发明的优点和有益效果：

本发明涉及到一株嗜热脱氮芽孢杆菌（Geobacillus thermodenitrificans）NG80-2中参与正烷烃末端降解途径中的醇脱氢酶及其晶体结构。该醇脱氢酶的特点在于其能够氧化碳链长度大于十六的直链烷基醇，此外还能够氧化几种醇和醛类物质。且该醇脱氢酶还具有热稳定性，能够在温度高达70℃时发挥降解功能。其较强的降解能力及自身的热稳定性使其在工业上及在石油类物质的环境污染修复和治理上有很强应用的潜力。此外，通过对其三维结构分析，揭示其结构与功能之间的关系，为进一步提高醇脱氢酶的降解活性提供理论上的指导。

附图说明

图1为醇脱氢酶晶体结构的飘带模型。

由图可知该醇脱氢酶为二聚体，一个亚基中含有两个结构域，这两个结构域被一个裂缝隔开。N-端结构域含有一对类似于罗斯曼折叠的α/β折叠，其中包含β折叠1-5和β折叠8，α螺旋1-4位于侧面。该结构域含有一个NAD⁺辅酶结合位点。C-端结构域含有一个脱氢奎尼酸盐合成酶类似的α结构域布局，其由9个α螺旋排成了一个螺旋束。一个金属（铁）离子结合到C-端结构域，并暴露于中间裂缝。图2为醇脱氢酶的辅酶结合位点的表面电势图。由该图可以看出，ADH2是一个二聚体，图中显示出推测的底物结合位点邻近于NAD(P)⁺结合位。

图3为微生物正烷烃类物质的末端降解途径流程。

为了更加详细的解释本发明，下面将结合附图给出本发明的具体实施例。下述实施例仅仅是用于解释本发明，而不应当理解为以任何方式限制本发明范围。

具体实施方式

实施例1、嗜热长链烷醇醇脱氢酶的蛋白质表达及纯化

1、嗜热长链烷醇醇脱氢酶的诱导表达

1）含有该嗜热长链烷醇醇脱氢酶基因的菌液由我们的合作研究组提供。取15μL该菌液接种于5ml的经高温灭菌、添加了100mg/l kanamycin抗生素的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养过夜；

2）按1%接种量转接到添加了100mg/l kanamycin抗生素的1L液体LB培养基中，37℃、200rpm培养5-6h，加入100μL终浓度为0.1mM IPTG后于45℃诱导2.5h。

2、嗜热长链烷醇醇脱氢酶的纯化

1）菌体收集

a.将1中的液体培养液于5000rpm离心15min收集菌体，用ddH2O冲洗两次；

b.按1L培养液用25ml的50mM Tris-HCl，300mM NaCl（pH8.0）缓冲液的比例将菌体重悬；

2）超声波破碎获得粗酶液

将1）中得到的菌体重悬液放置于冰上，以40%的频率，超声4s后停6s的条件进行超声破碎，一个循环为10分钟，超声破碎三个循环，直到重悬液完全清亮为止；破碎之后的菌液在4℃离心机中于18000rpm离心40min，离心结束之后弃去沉淀；

3）粗酶液过亲和层析柱

a.选择镍离子金属螯合亲和层析柱；

b.用50mM Tris-HCl,300mM NaCl（pH8.0）缓冲液将柱子平衡；

c.将2）中得到的粗酶液加入到镍柱中使目的蛋白与镍介质结合；粗酶液与镍柱重复结合3次；

d.用50mM Tris-HCl,300mM NaCl（pH8.0）缓冲液冲洗镍柱，将未与镍介质结合的杂质洗去；

e.用100ml含有20mM咪唑的50mM Tris-HCl,300mM NaCl（pH8.0）缓冲液冲洗柱子，将一些结合较弱的杂蛋白洗去；

f.用含有250mM咪唑的50mM Tris-HCl,300mM NaCl缓冲液（pH8.0）洗脱目的蛋白，收集洗脱液；

4）洗脱的酶液中盐离子的稀释及酶液的浓缩

将收集的蛋白质洗脱液加入到30kD浓缩管中，4℃条件下于离心机中4000rpm浓缩，同时利用50mM Tris-HCl（pH8.0）缓冲液稀释蛋白质溶液中的NaCl浓度，使其浓度低于10mM；

5）阴离子交换层析Resource Q

a.用50mM Tris-HCl（pH8.0）缓冲液平衡阴离子交换柱，直到电导率、UV值不再变化为止；

b.浓缩好的样品转移到1.5ml EP管中，于4℃离心机中13300rpm离心10min，以除去蛋白质溶液中可能存在的固体颗粒杂质和气泡；

c.通过六通阀进行上样，然后用50mM Tris-HCl缓冲液（pH8.0）以1ml/min的流速平衡柱子2个柱体积；

d.待冲洗完层析柱，开始梯度洗脱。洗脱条件为0-100%洗脱缓冲液（50mM Tris-HCl，1M NaCl，pH8.0），流速为1ml/min，同时根据A280的变化收集各洗脱峰；

e.使用SDS-PAGE电泳检测d中收集得到的蛋白纯度，收集纯度较高的部分浓缩；

6）分子筛凝胶色谱柱Superdex 200 10/300GL

a.用50mM Tris-HCl,300mM NaCl（pH8.0）缓冲液平衡Superdex 200 10/300GL分子筛凝胶色谱柱至电导率保持不变；

c.通过六通阀进行上样，然后在50mM Tris-HCl,300mM NaCl（pH8.0）缓冲液条件下以流速0.5ml/min洗脱。根据A280的变化收集各洗脱峰；

d.使用SDS-PAGE电泳检测c中收集得到的蛋白纯度，收集纯度较高的部分浓缩；浓缩过程中同时对NaCl进行稀释，使其浓度低于10mM；

e.蛋白样品稀释好后，利用紫外吸收法测定蛋白质浓度。

实施例2、嗜热长链烷醇醇脱氢酶蛋白的结晶及数据收集、解析

1．纯化后的醇脱氢酶的结晶及结构分析

1）醇脱氢酶结晶

a．将纯化后的醇脱氢酶浓度稀释到10mg/ml和20mg/ml；

b．利用Emerald BioSystems公司的结晶试剂盒进行晶体初筛，晶体板置于16℃；经过一段时间观察，发现在WizardI 31号中有晶体生长，且生长较好；以此条件为基础条件，进行醇脱氢酶结晶条件的优化实验；

c．在注射器中填入高真空硅脂，在24孔悬滴晶体板上，每个培养孔边上画一个2mm宽的硅脂圈；

d．将结晶条件中的pH缓冲液条件和沉淀剂PEG8000的浓度分别拉一个浓度梯度进行池液的配比，池液中的NaCl浓度保持不变；

e．将经过硅化的玻璃片放在干净的滤纸上，利用微量移液枪吸取1μL蛋白质溶液，再吸取1μL池液加到蛋白质溶液上；

f．用手指捏住盖玻片边缘，将其翻转，使液滴悬垂在盖玻片下，将盖玻片置于晶体板相应的孔上，保证盖玻片边缘将孔密闭；

g．用手指将盖玻片均匀而有力的压合在孔上；

h．将晶体板的盖子盖上，置于16℃生长。

2）醇脱氢酶晶体结构数据的收集及结构解析

通过悬滴扩散法获得醇脱氢酶的晶体，该晶体数据在100K的低温条件下利用RAXIS-IV探测器收集数据。衍射数据利用HKL2000软件包进行处理，醇脱氢酶的晶体结构以以海栖热袍菌（Thermotoga maritima）中的NADH依赖的丁醇脱氢酶A（TM0820）（PDB code：1VLJ）作为搜索模型，应用PHASER程序通过分子置换来获得初始相位。醇脱氢酶的晶体属于C222₁。晶体结构的衍射数据参见表1。

表1晶体衍射数据的收集和修正

^a圆括号中的值表示相应的最高分辨率的数值

^bR_merge＝∑_h∑₁|I_ih-<I_h>|/∑_h∑_I<I_h>，<I_h>是观测值的平均值I_ih的参照h

cR_work＝∑(||F_p(obs)|-|F_p(calc)||)/∑|F_p(obs)|；R_free指没有包括在优先细化的衍射点抽取子集（5%）后的R因子。

该嗜热脱氮芽孢杆菌内的嗜热长链烷醇醇脱氢酶，其晶体结构如下：一个亚基中含有两个结构域，这两个结构域被一个裂缝隔开。N-端结构域含有一对类似于罗斯曼折叠的α/β折叠，其中包含β折叠1-5和β折叠8，α螺旋1-4位于侧面；该结构域含有一个NAD⁺辅酶结合位点。C-端结构域含有一个脱氢奎尼酸盐合成酶类似的α结构域布局，其中9个α螺旋排成了一个螺旋束。一个金属（铁）离子结合到C-端结构域，并暴露于中间裂缝。该金属离子处于由四个严格保守的残基Asp194，His198，His261和His267所构成的金字塔形式的氢键网络之中。

在N-端结构域和C-端结构域中间的裂缝为底物提供了一个入口，并且使其能够接触到NAD⁺辅酶和金属结合位点；有一个通道通往该裂缝，为反应提供了条件。

醇脱氢酶的应用

冯露等人2009年在《Microbiology》上发表的文章《Two novel metal-independentlong-chain alkyl alcohol dehydrogenases from Geobacillus thermodenitrificans NG80-2》中谈到该嗜热长链烷醇醇脱氢酶其底物为：碳链长度至少达到30个碳原子的烷基醇、1,3-丙二醇、乙醛、异丙醇、异戊醇、丙酮、辛醛和癸醛。其中，该醇脱氢酶的最适底物为1-辛醇。在石油烃降解途径中，长链烷醇醇脱氢酶是十分重要的关键酶，它能够耐高温并高效利用长链烷醇脱氢酶的催化产物长链烷醇，使其进一步脱氢，提高烷烃降解途径中的催化效率，提高轻质烷烃与重质烷烃的比例、改善原油流动性等特性，有利于原油的开采，提高石油采收率；对该酶的研究为深入研究嗜热脱氮芽孢杆菌（Geobacillus thermodenitrificans）NG80-2降解长链烷烃代谢途径的机制提供了更有利的证据，也为探索其他烷烃降解菌的代谢途径提供理论基础。另一方面，该酶的嗜热性及降解长链烷醛的能力具有重要的工业应用价值，该酶在高温下对长链烷醇的降解特性，对由油田开采、输油作业的跑漏、溢流所引起的环境石油污染物以及石油化工带来的高温石油废水的处理也具有良好的应用前景。

本发明通过X-射线衍射方法解析了醇脱氢酶的三维结构，这些数据能够全方位的反映该酶的氨基酸空间构象，为改造该醇脱氢酶，提高其降解能力，使嗜热脱氮芽孢杆菌（Geobacillus thermodenitrificans）NG80-2降解石油能力有所提高，用于石油污染土壤的治理和修复中，具有很好的应用前景。

本发明中所涉及的各种实验用品（包括但不限于：化学试剂、生物制品、细胞、生物体、仪器等）之中，对于那些特殊的或不易获得的，文中均已注明了制造商、参考文献或详细的制备方法；未经特别说明的，均为常规实验用品，可以通过各种方式（例如购买、自行制备等）很方便的获得。

Claims

1.一株嗜热脱氮芽孢杆菌内的嗜热长链烷醇醇脱氢酶，其特征在于该嗜热长链烷醇醇脱氢酶的晶体结构如下：其空间群为C222₁，晶胞参数为

α=β=γ=90°；其为二聚体，一个亚基中含有两个结构域，这两个结构域被一个裂缝隔开；N-端结构域含有一对罗斯曼折叠类似的α/β折叠，其中包含β折叠1-5和β折叠8，α螺旋1-4位于侧面，N-端结构域含有一个NAD⁺辅酶结合位点；C-端结构域含有一个脱氢奎尼酸盐合成酶类似的α结构域布局，其由9个α螺旋排成了一个螺旋束，一个金属铁离子结合到C-端结构域，并暴露于中间裂缝，该金属离子处于由四个严格保守的残基Asp194、His198、His261和His267所构成的金字塔形式的氢键网络之中。

2.根据权利要求1所述的嗜热长链烷醇醇脱氢酶，其特征在于所述的醇脱氢酶的活性中心结构特征为：有一个通道通往N-端结构域和C-端结构域中间的裂缝，这个裂缝为底物提供了一个入口，使底物能够接触到NAD⁺辅酶和金属结合位点。