CN102660604B - 一种生物催化制备百合多糖酯化衍生物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物催化与生物转化领域，公开了一种生物催化制备百合多糖酯化衍生物的方法。该方法是以离子液体为溶剂，以C2～C18碳链长度的脂肪酸乙烯酯为酰基供体，在反应温度35～55℃下，利用脂肪酶催化百合多糖进行转酯化反应，合成得到百合多糖酯化衍生物。本发明具有反应条件温和、对环境友好、反应具有可控性、过程简单及产物易从反应混合体系中分离等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物催化与生物转化领域，涉及一种生物催化制备百合多糖酯化衍生物的方法。
背景技术
百合是国家卫生部审批通过的首批药食两用品之一，不仅在临床上有着广泛的应用，而且还具有很好的保健作用。百合多糖是百合的主要功能因子之一，百合多糖主要是由D-葡萄糖、D-甘露糖及半乳糖等通过吡喃糖苷键结合而成的多糖。研究发现：百合多糖具有抗肿瘤、降血脂、抗病毒、抗突变和增强免疫力等多种生物医药功能。因此，过对百合多糖化合物结构进行改造，寻找活性更强的百合多糖衍生物的研究工作倍受关注。
目前百合多糖酯化衍生物的合成国内外都是采用传统化学方法。化学方法合成百合多糖酯化衍生物，能耗大、选择性差、易产生副产物且产物难分离；并且由于反应过程中使用大量有机溶剂和催化剂，一方面会带来较严重的环境污染问题，另一方面产物中常残留一些有毒的化学物质而存在安全隐患。因此，研究开发百合多糖酯化衍生物合成新工艺具有重要的实践意义。
由于百合多糖为高分子化合物（Mw 350.0kDa），主要由葡萄糖甘露糖及半乳糖等组成，结构较复杂。我们采用测定取代度（DS）方法来判断反应，这也是国际上高分子化合物常用的方法[Biomacromolecules，2001，2(3)：824-826）]。聚多糖大分子链的每个糖单元上被取代的羟基的平均数。取代度能真实地反映酯化或酰化反应的程度。产物的取代度可用皂化法测定。其测定原理是：氢氧化钾与样品发生皂化反应，使样品中酰基(RCO－)脱出，生成脂肪酸(RCOOH)并与氢氧化钾溶液发生中和反应，之后用盐酸返滴定过量的氢氧化钾。于是，可以准确测出生成的脂肪酸的量，通过计算便可得到样品的取代度。
离子液体（ionic liquids，ILs）是由有机阳离子和无机或有机阴离子构成的低熔点盐类，在室温或较低温(＜100℃)下呈液态，通常称为室温离子液体。离子液体替代有机溶剂作为绿色反应介质用于生物催化与生物转化，已引起人们的重视。与传统的有机溶剂相比，离子液体通常被认为是一种极性较强的溶剂，其极性相当于短链的醇类（如甲醇或乙醇）或N-甲基甲酰胺，远大于一般的有机介质。当用甲醇或N-甲基甲酰胺为反应介质时，生物催化剂通常会失活；而用与之有相似极性的离子液体作为反应介质时，生物催化剂通常表现出较高活力和选择性。
离子液体与传统的有机溶剂相比，除具有可忽略的蒸汽压、高（热、化学）稳定性及对环境友好等特点外，另一个突出的优点是对极性强的底物（如碳水化合物）易溶解。由于离子液体对碳水化合物有着较强的溶解性能，并且对酶活性影响较小，因而为该类化合物的生物转化提供了一个良好的反应介质。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术工艺存在的问题，提供一种生物催化制备百合多糖酯化衍生物的方法。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种生物催化制备百合多糖酯化衍生物的方法，以离子液体为溶剂，以C2～C18碳链长度的脂肪酸乙烯酯为酰基供体，在反应温度35～55℃下，利用脂肪酶催化百合多糖进行转酯化反应，合成得到百合多糖酯化衍生物。
其中，所述的离子液体溶剂为1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体（C4MIm·BF4）。
所述的生物催化制备百合多糖酯化衍生物的方法优选把百合多糖、脂肪酸乙烯酯和溶剂按质量/体积/体积比例1:5～12:30～70混合，按脂肪酶与百合多糖的用量之比为100～500U/g的比例加入脂肪酶，而后加热至35～55℃，反应12～24小时后，分离得到百合多糖酯化衍生物。
百合多糖、脂肪酸酯和溶剂优选按质量/体积/体积比例1:7:50混合。
所述的转酯化反应在振荡速度为180~220rpm的条件下进行。
所述脂肪酶优选来源于洋葱假单胞菌(Burkholderia cepacia)。
所述的分离方法如下：转酯化反应混合物经过滤或5500~6000rpm离心除去脂肪酶，然后加入乙醇产生白色的沉淀物，过滤，用乙醇充分洗涤，真空干燥，所得白色粉末即是百合多糖酯化衍生物。
本发明与现有的技术相比具有如下的有益效果：
1、本发明针对百合多糖的具体理化性质，通过大量的实验筛选确定了能够生物催化合成百合多糖酯化衍生物的反应体系。对于本发明所采用的溶剂体系，发明人在实验过程中筛选了很多，当以常规的有机溶剂（例如正己烷、异丙醚、叔丁醇、叔戊醇、吡啶、四氢呋喃、乙腈、DMF及DMSO等）为溶剂，也使用了一系列的蛋白酶及脂肪酶，均不能有效进行反应。主要是因为不同于小分子，百合多糖难溶于有机溶剂；在极性较小的有机介质中，酶虽然能保持一定的活性，但百合多糖却极难溶于该类介质，因而反应不能进行；当采用对多糖有较好溶解性的DMF及DMSO等强极性溶剂时，酶通常在该类介质中失活，反应也不能进行。对于离子液体，我们也筛选了一系列包括咪唑类、吡啶类及季胺盐类离子液体，最后发现在咪唑类的四氟硼酸盐离子液体中，源于洋葱假单胞菌(Burkholderia cepacia)的脂肪酶能有效的进行百合多糖的转酯化反应。
2、采用绿色溶剂离子液体为反应介质，克服了传统有机溶剂作为介质时易蒸发、不稳定等缺点。同时离子液体可以循环利用，降低了生产成本。
3、采用高效的生物催化剂来催化百合多糖酯化衍生物合成，克服了传统化学方法的效率低的缺点；
4、酶催化反应具有高度选择性，因而产物百合多糖酯化衍生物纯度高；而传统的化学方法合成百合多糖酯化衍生物，由于选择性较差，副产物较多，产物纯度低；
5、由于采用生物酶作为催化剂，克服了传统化学方法使用大量有毒有害的金属盐作为催化剂的缺点，且产品不会引起健康方面的忧虑。
6、本发明反应条件温和、环境友好、反应过程简单易控、产物易分离。
具体实施方式
实施例1
把1.0g百合多糖、30ml C4MIm·BF4离子液体、50mg来源于洋葱假单胞菌(Burkholderiacepacia)的脂肪酶(2000U/g，日本Amano酶制剂公司)和5ml乙酸乙烯酯放入具塞三角瓶中，置于35℃、200rpm的水浴恒温振荡器内振荡，反应12h后，过滤除去脂肪酶，然后加入乙醇产生白色的沉淀物，过滤，用乙醇充分洗涤，真空干燥（30℃、0.05MPa），即得取代度为0.23的百合多糖乙酸酯衍生物。
实施例2
把1.0g百合多糖、70ml C4MIm·BF4离子液体、250mg来源于洋葱假单胞菌(Burkholderiacepacia)的脂肪酶(2000U/g，日本Amano酶制剂公司)和12ml乙酸乙烯酯放入具塞三角瓶中，置于55℃、200rpm的水浴恒温振荡器内振荡，反应24h后，过滤除去脂肪酶，然后加入乙醇产生白色的沉淀物，过滤，用乙醇充分洗涤，真空干燥（30℃、0.05MPa），即得取代度为0.71的百合多糖乙酸酯衍生物。
实施例3
把1.0g百合多糖、50ml C4MIm·BF4离子液体、150mg来源于洋葱假单胞菌(Burkholderiacepacia)的脂肪酶(2000U/g，日本Amano酶制剂公司)和7ml丁酸乙烯酯放入具塞三角瓶中，置于45℃、200rpm的水浴恒温振荡器内振荡，反应18h后，过滤除去脂肪酶，然后加入乙醇产生白色的沉淀物，过滤，用乙醇充分洗涤，真空干燥（30℃、0.05MPa），即得取代度为0.42的百合多糖丁酸酯化衍生物。
实施例4
把1.0g百合多糖、70ml C4MIm·BF4离子液体、200mg来源于洋葱假单胞菌(Burkholderiacepacia)的脂肪酶(2000U/g，日本Amano酶制剂公司)和8ml辛酸乙烯酯放入具塞三角瓶中，置于50℃、200rpm的水浴恒温振荡器内振荡，反应14h后，过滤除去脂肪酶，然后加入乙醇产生白色的沉淀物，过滤，用乙醇充分洗涤，真空干燥（30℃、0.05MPa），即得取代度为0.55的百合多糖辛酸酯化衍生物。
实施例5
把1.0g百合多糖、50ml C4MIm·BF4离子液体、100mg来源于洋葱假单胞菌(Burkholderiacepacia)的脂肪酶(2000U/g，日本Amano酶制剂公司)和10ml月桂酸乙烯酯放入具塞三角瓶中，置于55℃、200rpm的水浴恒温振荡器内振荡，反应24h后，过滤除去脂肪酶，然后加入乙醇产生白色的沉淀物，过滤，用乙醇充分洗涤，真空干燥（30℃、0.05MPa），即得取代度为0.63的百合多糖月桂酸酯化衍生物。
实施例6
把1.0g百合多糖、30ml C4MIm·BF4离子液体、50mg来源于洋葱假单胞菌(Burkholderiacepacia)的脂肪酶(2000U/g，日本Amano酶制剂公司)和5ml硬脂酸乙烯酯放入具塞三角瓶中，置于40℃、200rpm的水浴恒温振荡器内振荡，反应12h后，过滤除去脂肪酶，然后加入乙醇产生白色的沉淀物，过滤，用乙醇充分洗涤，真空干燥（30℃、0.05MPa），即得取代度为0.25的百合多糖月桂酸酯化衍生物。
实施例7
把1.0g百合多糖、70ml C4MIm·BF4离子液体、250mg来源于洋葱假单胞菌(Burkholderiacepacia)的脂肪酶(2000U/g，日本Amano酶制剂公司)和12ml硬脂酸乙烯酯放入具塞三角瓶中，置于55℃、200rpm的水浴恒温振荡器内振荡，反应24h后，过滤除去脂肪酶，然后加入乙醇产生白色的沉淀物，过滤，用乙醇充分洗涤，真空干燥（30℃、0.05MPa），即得取代度为0.58的百合多糖硬脂酸酯化衍生物。
Claims (5)
1.一种生物催化制备百合多糖酯化衍生物的方法，其特征在于以离子液体为溶剂，以C2～C18碳链长度的脂肪酸乙烯酯为酰基供体，在反应温度35～55 ℃下，利用脂肪酶催化百合多糖进行转酯化反应，合成得到百合多糖酯化衍生物，其中所述的离子液体溶剂为1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体，所述脂肪酶来源于洋葱假单胞菌(Burkholderia cepacia)。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于把百合多糖、脂肪酸乙烯酯和溶剂按质量/体积/体积比例1: 5～12: 30～70混合，按脂肪酶与百合多糖的用量之比为100～500 U/g的比例加入脂肪酶，而后加热至35～55 ℃，反应12～24小时后，分离得到百合多糖酯化衍生物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于百合多糖、脂肪酸酯和溶剂优选按质量/体积/体积比例1: 7: 50混合。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的转酯化反应在振荡速度为180~220 rpm的条件下进行。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的分离方法如下：反应混合物经过滤或5500~6000 rpm离心除去脂肪酶，然后加入乙醇产生白色的沉淀物，过滤，用乙醇充分洗涤，真空干燥，所得白色粉末即是百合多糖酯化衍生物。
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