CN102653769B

CN102653769B - 一种菊芋果聚糖外切水解酶基因及其应用

Info

Publication number: CN102653769B
Application number: CN201210141758.8A
Authority: CN
Inventors: 梁明祥; 康健; 隆小华; 刘兆普
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2012-05-09
Filing date: 2012-05-09
Publication date: 2014-09-10
Anticipated expiration: 2032-05-09
Also published as: CN102653769A

Abstract

本发明属于基因工程领域，公开了一种菊芋果聚糖外切水解酶基因及其应用。该菊芋果聚糖1-外切水解酶基因Ht 1-FEH，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，编码具有如SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列的菊芋果聚糖1-外切水解酶。所述的菊芋果聚糖1-外切水解酶基因Ht1-FEH可在水解菊粉生产果糖类物质中应用，也可在培育转基因耐盐植物中应用。

Description

一种菊芋果聚糖外切水解酶基因及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种菊芋果聚糖外切水解酶基因及其应用。

背景技术

植物果聚糖主要是由多个果糖基通过糖苷键连接而成的碳水化合物。虽然15%的被子植物中均能发现果聚糖，但植物体中果聚糖的含量一般较低，只有在菊芋（Helianthustuberosus）的块茎；菊苣（Cichorium intybus）、牛蒡（Arctium lappal）和鸡脚草（Dactylis glomeratus）的根；百合（Lilium brownii）和洋葱（Allium cepa）的球茎；黑麦草（Lolium perenne）、大麦（Hordeum vulgare）和小麦（Triticum aestivum）茎叶等少数几种植物的组织中含量相对较高(Ritsema and Smeekens 2003a;Van Laere andVan Den Ende 2002)。

蔗糖是果聚糖合成的前体(Van Laere and Van Den Ende 2002)。植物体内主要存在两种酶类合成果聚糖：（1）蔗糖：蔗糖1-果糖基转移酶（Sucrose:Sucrose1-Fructosyltransferase，简写为1-SST）(Van den Ende et al.2006;Van Der Meer et al.1998;殷桂香et al.2009)和果聚糖：果聚糖1-果糖基转移酶（Fructan:Fructan1-Fructosyltransferase，简写为1-FFT）(Kawakami and Yoshida 2005;王志敏2000)。两个蔗糖分子通过1-SST作用产生一个三糖（1-kestose）和一个单糖。随后1-FFT聚合三糖或者寡聚糖产生更长聚合度的多糖，在一些植物中聚合度能够达到70之多。其它一些酶，例如果聚糖：果聚糖6G-果糖基转移酶（Fructan:Fructan 6G-Fructosyltransferase，简写为6G-FFT）(Lasseur et al.2006)和蔗糖：果聚糖6-果糖基转移酶（Sucrose:Fructan6-fructosyltransferase，简写为6-SFT）也可参与果聚糖的合成(Gao et al.2010a;Tamuraet al.2009)。

果聚糖合成途径中的1-FFT同时也在果聚糖的降解中发挥功能，因为该酶可以把高聚合度的果聚糖中的果糖基转移到低聚合度的果聚糖上。除了1-FFT，植物中负责果聚糖降解的酶主要有果聚糖1-外切水解酶（Fructan 1-exohydrolases，简写为1-FEH）和果聚糖6-外切水解酶（Fructan 6-exohydrolases，简写为6-FEH）。另外果聚糖6&1-外切水解酶（Fructan6&1-exohydrolases，简写为6&1-FEH）和6-蔗果三糖外切酶（6-kestose exohydrolases，简写为6-KEH）也能水解果聚糖(Kawakami et al.2005;Van den Ende et al.2005)。1-FEH酶能够水解果聚糖的β（2-1）糖苷键，6-FEH负责水解β（2-6）糖苷键，而6&1-FEH能水解上述两种糖苷键，6-KEH仅仅水解最简单的蔗果三糖（6-kestose），但并不是所有这些酶都能在同一个植物中被发现。

目前FEH已经在菊苣、谷类（小麦，大麦等）、甜菜、牛蒡和大蒜等被发现(De Roover etal.1999;Kawakami et al.2005;Ueno et al.2011;Van den Ende et al.2000;Van denEnde et al.2003;Van den Ende et al.2003a;Van Laere and Van Den Ende 2002)，并且所有这些FEH都是外切水解酶，通过水解末端的果糖基生成一个果糖来实现果聚糖的降解。果聚糖的完全降解还需要转化酶（Invertase，简写为INV）的参与，因为FEH酶水解的最终产物部分是蔗糖，而FEH酶活力受蔗糖抑制(Lothier et al.2010;Verhaest et al.2007)，蔗糖需通过转化酶的作用水解生成果糖和葡萄糖(Sturm 1999)。

除了植物体内的FEH酶外，微生物产生的菊粉酶（Inulinase）也能水解菊芋等植物的果聚糖。菊粉酶一般同时具有水解酶和转化酶的活力，也就是可以水解蔗糖，而植物的FEH一般没有转化酶的功能；同时微生物来源的菊粉酶同时具有外切酶和内切酶的活力，而植物来源的FEH一般只有外切酶的能力；最后一个差别是微生物来源的菊粉酶主要水解β（2-1）糖苷键而较少能够水解β（2-6）糖苷键(董英et al.2006;王静and金征宇2002)。目前对于菊粉酶研究较多，而对植物源的FEH酶研究相对较少。

转果聚糖合成酶基因的植物除了获得合成果聚糖的功能以外，植物的抗逆性（冷、干旱）也有所增强，表明果聚糖与植物的抗逆有关(Livingston et al.2009;杨晓红and陈晓阳2006)。最新研究发现果聚糖提高植物的抗逆性主要是通过提高细胞内果聚糖的积累，保护质膜不被冷害和渗透胁迫损伤，如低温胁迫可诱导合成高聚合度的果聚糖，果聚糖可以插入细胞脂质膜中而防止其渗漏(Livingston III and Henson 1998;Livingston et al.2009)。但是，果聚糖与抗逆的相关研究主要集中在耐冷与耐旱方面(Kawakami et al.2008;Park et al.1999;张小芸et al.2011)，而果聚糖与盐胁迫相关的研究报道较少(Livingston et al.2009;杨晓红and陈晓阳2006)。

菊芋中的1-SST基因和1-FFT基因已经被克隆出，初步发现可能是单拷贝基因，其蛋白也被提纯(Lüscher et al.1996;Van Der Meer et al.1998)。体外生化反应证实菊芋在1-SST和1-FFT共同作用下可以促进果聚糖的合成(Koops and Jonker 1994;1996)。在矮牵牛花植物体内中过表达菊芋的1-SST基因能导致三糖化合物的堆积；而在同样的植物中单独过表达1-FFT的基因却并没有增加果聚糖，但提取转基因植物中的1-FFT酶，可在体外促进以三糖为底物的多糖合成。这说明，植物体单独过表达1-FFT，由于缺少合适的作用底物而并不能直接表现出酶的作用。研究者通过杂交将这两个基因转到牵牛花体中，发现老叶片中果聚糖的含量增加，这就说明菊芋中的1-SST和1-FFT具有果聚糖合成的功能，也说明菊芋和其它植物一样存在类似的果聚糖合成途径。至于菊芋中果聚糖的水解途径，Stefan P.Marx在1997通过初步的蛋白提纯已经发现菊芋中几个水解果聚糖的蛋白组分，一个蛋白组分能够水解β（2-1）糖苷键，而对β（2-6）糖苷键的果聚糖或者蔗糖几乎没有水解能力，说明这个蛋白确实是1-FEH酶，对于其余组分该文作者并没有研究(Marx et al.1997)，亦没有公开该蛋白的氨基酸或核苷酸序列。菊芋的1-FEH的核苷酸序列或者肽段信息迄今也未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种菊芋果聚糖1-外切水解酶（1-FEH酶）基因。

本发明的另一目的是提供该基因的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种菊芋果聚糖1-外切水解酶基因Ht 1-FEH，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

所述的菊芋果聚糖1-外切水解酶基因Ht 1-FEH编码的蛋白质，具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

一种重组载体，将菊芋果聚糖1-外切水解酶基因Ht 1-FEH插入表达载体pPICZαC的XhoI和XbaI酶切位点之间。

所述的菊芋果聚糖1-外切水解酶基因Ht 1-FEH优选以菊芋品种“南芋1号”叶片cDNA为模板，以picFEH-F和picFEH-R为引物，通过PCR扩增得到。

一种含有所述的菊芋果聚糖1-外切水解酶基因Ht 1-FEH的毕赤酵母。

所述的毕赤酵母优选将上述的重组载体经限制性内切酶PmeI酶切线性化，将该线性化的重组载体DNA电转化Pichiapastoris X-33酵母，使线性化的重组载体DNA与宿主基因组DNA进行同源重组整合而得到的。

所述的菊芋果聚糖1-外切水解酶基因Ht 1-FEH在水解菊粉生产果糖类物质中的应用。

所述的菊芋果聚糖1-外切水解酶基因Ht 1-FEH在培育转基因耐盐植物中的应用。

有益效果：

本发明设计特异引物，在菊芋中成功克隆了一个果聚糖外切水解酶基因，命名为Ht 1-FEH，该基因的CDS全长为1683bp，编码560个氨基酸，等电点为6.24。通过对该基因的序列分析表明，Ht 1-FFH是一个果聚糖外切水解酶，具有糖苷水解酶32（GH32）家族相同的三个保守基序（NDPN、RDP和EC）。氨基酸序列的信号肽和糖基化位点预测结果表明，Ht 1-FEH可能有一条包括25个氨基酸残基的信号肽序列和7个糖基化位点。基因表达模式分析结果表明，Ht1-FEH主要在发芽的块茎中表达，参与菊芋块茎萌发过程中果聚糖降解代谢的转录调控。

Stefan P.Marx在1997年通过蛋白纯化的手段，初步提纯了一个菊芋1-FEH酶（Marx SP,J,Frehner M(1997)Seasonal variation of fructan‐β‐fructosidase(FEH)activity and characterization of a β‐(2‐1)‐linkage specific FEH from tubers of Jerusalem artichoke(Helianthus tuberosus).New Phytol 135:267-277），但该研究存在一下三个问题：1.该研究并没有获得该1-FEH的蛋白或者核苷酸序列，缺少关键的核苷酸序列将不可能将该基因运用到农业生产实践和工业化中。2.根据Stefan P.Marx和申请者本人的推测，目前菊芋中应该有2~3个1-FEH基因家族成员，各成员间核苷酸序列和蛋白基本性质不尽相同。虽然目前缺少Stefan P.Marx研究中1-FEH的酶的核苷酸序列，但申请者推断Stefan P.Marx提纯的1-FEH酶不是本研究中发现的Ht 1-FEH酶，因为被Stefan P.Marx提纯的1-FEH酶的分子量为79kDa，但本研究中所发现该酶的分子量在100~130kDa之间。3.该作者并没有对提纯的1-FEH在植物盐分反应中的功能进行探讨。

本发明利用巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris X-33）表达系统对菊芋果聚糖外切水解酶基因Ht 1-FEH进行异源表达和功能的初步验证。Ht 1-FEH表达产物重组蛋白具有果聚糖水解酶活性，而对蔗糖没有水解活性。因此，初步推断Ht 1-FEH为果聚糖外切水解酶基因，与预测的结果相符。

本发明研究盐逆境下果聚糖代谢相关基因的表达调控机制，结果表明在地上部快速生长期（50-90d），盐胁迫诱导Ht 1-FEH在茎和叶中的表达量上升，叶片中总糖和还原糖含量明显高于对照，茎中的非还原糖含量高于对照，由此说明，盐胁迫下果聚糖水解酶Ht 1-FEH基因在地上部快速生长期的转录正调控可以增加叶片和茎中的单糖或非还原糖含量，而这些渗透调节物质的增加则有利于菊芋在盐胁迫下的生理防卫。因此，该基因可用于培育转基因耐盐植物。

附图说明

图1、菊芋果聚糖外切水解酶基因的CDS全长扩增结果；1：PCR结果，M：Marker。

图2、Ht 1-FEH氨基酸序列的信号肽预测。

图3、Ht 1-FEH基因在菊芋不同器官中的时空表达模式。

图4、菊芋果聚糖外切水解酶基因表达载体的构建

A：1-picFEH高保真扩增片段，2-pEASY-B-picFEH双酶切，3-pPICZαC双酶切，M-Marker

B：表达载体pPICZαC-picFEH双酶切验证，1～5：pPICZαC-picFEH，M-Marker。

图5、pPICZαC-picFEH质粒的线性化（A）和阳性转化子的PCR验证（B）

A：M-Marker，1-pPICZαC-picFEH线性化前，2-pPICZαC-picFEH线性化后;

B：M-Marker，CK1-未转化对照，CK2-转空载对照，CK3-阳性对照，1～4：转化子。

图6、Ht 1-FEH重组蛋白的SDS-PAGE分析

胶中CK1代表：培养的空白毕赤酵母X-33的上清液;CK2：培养的带有pPICZαC质粒的毕赤酵母X-33的上清液（无1-FEH）；A和B：浓缩的酶液；1-4：培养的带有菊芋1-FEH的毕赤酵母X-33的上清液；M：蛋白分子量标记。

图7盐胁迫下菊芋果聚糖代谢关键酶基因的时空表达调控

DAP表示种植时间。

图8盐胁迫对叶片可溶性总糖（A）和还原糖（B）含量的影响，

CK：代表正常生长的南芋一号，T：代表经盐胁迫处理的南芋一号。

图9盐胁迫对茎基部可溶性总糖（A）、还原糖（B）含量的影响

具体实施方式

实施例1 Ht1-FEH基因的克隆

取菊芋品种“南芋1号”4叶期幼嫩的叶片，参照OMEGA plant RNA提取试剂盒说明书提取植物总RNA，用TaKaRa反转录试剂盒两步法反转录得到cDNA模板。

利用其它物种已有的1-FEH基因编码序列（coding sequence，CDS）序列到菊芋（NCBI）和向日葵EST数据库（http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/plant.html）中Blast，筛选相似性高的EST序列用DNAstar软件进行拼接，得到一条全长为1792bp的EST序列（TC4077），将该EST序列与已有的1-FEH基因CDS序列比对发现，该EST序列与菊苣的Ci1-FEH I（AJ242538）CDS序列相似性达78.3%，而且还有起始密码子ATG和终止密码子TGA。于是，以TC4077 EST序列为模板，用Primer Premier 5.0设计特异引物用于扩增Ht 1-FEH CDS全长序列，引物序列如下：

FEH-F:5’-CGTTGATGGTAAAGGAGATG-3’（SEQ ID NO.3）

FEH-R:5’-CCATAGTTTCTCAATCCATAGG-3’（SEQ ID NO.4）

以上步得到的“南芋1号”cDNA为模板，FEH-F和FEH-R为引物PCR扩增目的基因片段，反应体系如下：10×PCR Buffer 2μL，10mM dNTP 0.4μL，FEH-F（10μM）1μL，FEH-R（10μM）1μL，cDNA模板1μL，Taq酶0.2μL，ddH₂O 14.4μL，总体积20μL。

反应程序：

取2μL扩增产物跑1%的琼脂糖凝胶电泳，检测扩增结果。

得到约1700bp左右的特异条带，如图1所示。将扩增片段回收，TA克隆后测序结果显示，得到长度为1698bp的DNA序列，序列分析发现其中有一个SEQ ID No.1所示的1683bp的开放阅读框（ORF），ORF编码560个氨基酸，序列如SEQ ID No.2所示。因此，该ORF序列即为预测的CDS全长序列，将该基因命名为Ht 1-FEH。

将获得的cDNA序列利用DNAstar软件翻译成氨基酸序列，利用NCBI GenBank数据库进行Blast同源性比较，调出相关同源基因的CDS序列和氨基酸序列，用DNAstar软件中MegAlign进行序列比对并构建系统发育进化树。

蛋白质序列性质分析：

信号肽预测：http://www.cbs.dtu.dk/serics/SignalP/

糖基化位点分析：http://cbs.dtu.dk/servies/NetGlyc

分子量及等电点预测：http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html

用Ht 1-FEHCDS核酸序列在NCBI Blast比对分析结果显示，Ht FEH与向日葵细胞壁转化酶基因（Helianthus annuus cwINV1，DQ012383）同源性最高，相似性（Identities）达97%，但NCBI数据库中仅有该基因序列，对该基因序列的功能研究目前还没有；其次与菊苣果聚糖外切水解酶基因（Cichorium intybus 1-FEH I，AJ242538）相似性为81%，但通过菊苣的核苷酸的序列不能够获得菊芋的1-FEH核苷酸序列，主要由于虽然菊芋和菊苣是同一个科的植物，但属于不同的属的植物，基因序列差别较大。氨基酸序列Blast比对分析显示，Ht 1-FEH与向日葵细胞壁转化酶（Ha cwINV1，AAY85659）相似性达96%，与菊苣果聚糖外切水解酶（Ci1-FEH I，CAC19366）相似性为75%。实际上，核苷酸的相似性高低仅仅作为植物FEH功能的一个参考，因为在FEH的研究中发现，仅仅通过改变一个核苷酸，也能将拟南芥的INV转变为FEH，而这两个酶是功能几乎完全不同的酶（Le Roy,K.Lammens,W.Verhaest,M.De Coninck,B.Rabijns,A.Van Laere,A.Van den Ende,W(2007).Unraveling the difference between invertases and fructan exohydrolases:Asingle amino acid(Asp-239)substitution transforms Arabidopsis cell wall invertase 1into a fructan 1-exohydrolase.PlantPhysiology 145(3):616-625）。

用Ht 1-FEH氨基酸序列到NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure）保守结构域数据库（Conserved Domain Database，CDD）中进行保守结构域预测，结果显示，从N端的45～225个氨基酸序列中，有3个活性位点，5个底物结合区，Ht 1-FEH与糖苷水解酶32（Glycosyl hydrolase family 32，GH32）家族匹配性最高。GH32家族成员包括水解酶（cellwall invertases、fructan exohydrolases、vacuolar invertases）和果糖基转移酶（fructosyltransferases），这些酶在分子结构上非常相似但功能各异，该家族的显著特征是有NDPN、RDP和EC三个高度保守的基序（motif）。另外，转化酶（INV）还有一个特异的SLD保守基序，而果聚糖外切水解酶（FEH）一般没有这个保守基序，SLD是区分FEH和INV的主要特征(Lammens et al.2009;Van den Ende et al.2009)。将Ht 1-FEH与相关基因的氨基酸序列多重比对发现，Ht 1-FEH有NDPN、RDP和EC三个保守基序，而没有SLD这个保守基序。由以上结果表明，我们推测Ht 1-FEH可能为果聚糖外切水解酶。

信号肽是分泌蛋白新生肽链N端的一段20～30氨基酸残基组成的肽段，信号肽序列可使正在翻译的核糖体附着到粗面内质网（RER）膜上并合成分泌蛋白，带有信号肽的蛋白可通过分泌途径分泌到胞外，因此，信号肽对蛋白质的正确合成与转运起重要作用，并使功能蛋白能分泌到特定的部位行使具体的功能(朱玉贤et al.2007)。通过信号肽分析软件预测显示（图2），Ht 1-FEH的氨基酸序列在N端第25和26个氨基酸之间有一个较大可能的切割位点（VHA-SE），那么可以推测在Ht 1-FEH氨基酸序列的N端有一条包括25个氨基酸残基的信号肽序列，因此该基因所编码的蛋白有可能是分泌蛋白。

实施例2

根据克隆得到的Ht 1-FEH CDS序列，用Primer Premier 5.0设计半定量表达引物qFEH，以18S核糖体编码基因作为内参，分析Ht 1-FEH在菊芋中的表达模式。PCR反应体系和程序同实施例1，循环数为25。引物序列如下：

qFEH-F:5’-TGCGTCAAAGTCATTCTA-3’（SEQ ID NO.5）

qFEH-R:5’-CCATAACTCCCACTCGTA-3’（SEQ ID NO.6）

18S-F:5’-TACCGTCCTAGTCTCAACCA-3’（SEQ ID NO.7）

18S-R:5’-AACATCTAAGGGCATCACAG-3’（SEQ ID NO.8）

通过半定量RT-PCR检测了Ht 1-FEH在菊芋不同器官和以及块茎发育、萌发过程中的转录水平（图3）。Ht 1-FEH在发芽块茎中表达量最高，块茎发芽后，随着时间的延长，表达量呈增加趋势；Ht 1-FEH在成熟叶片中表达，但弱于发芽后的块茎。Ht 1-FEH在根和茎中只有少量表达，在块茎发育膨大过程中，Ht 1-FEH的表达水平很低。以上结果表明，Ht 1-FEH主要在块茎萌发过程中提高转录水平的表达量。基因序列同源性和保守功能域分析结果表明Ht1-FEH可能是果聚糖外切水解酶的编码基因，Ht 1-FEH在转录水平的时空表达调控可能与果聚糖外切水解酶在菊芋生长发育中所起的作用有关。

实施例3表达载体的构建

根据果聚糖外切水解酶基因Ht 1-FEH的序列分析结果，上游引物去除预测的N端信号肽序列：MVKEMAGWVLSFCILLVVNGVGVHA，共25个氨基酸，从第26个氨基酸开始设计上游引物，并加上Xho I酶切位点：C｜TCGAG，加上Kex2 signal cleavage序列：AAGAGA，加上保护碱基：CCG，将载体中自带的酵母α因子前导肽序列作为信号肽，构建分泌型表达载体，以使重组的果聚糖外切水解酶能分泌到毕赤酵母的细胞外。下游引物去除序列自身的终止密码子，在表达框后加入融合6×His标签，使重组蛋白为融合蛋白，方便蛋白表达后的纯化和检测，再加上Xba I酶切位点：T｜CTAGA，加上保护碱基：GCCG。设计引物如下，酶切位点如下划线所示：

picFEH-F：5'-CCGCTCGAGAAGAGATCAGAAGATTTGCAGCCTT-3'（SEQ ID NO.9）

picFEH-R：5’-GCCGTCTAGA ATCCATAGGAACTATTTGAG-3’（SEQ ID NO.10）

以实施例1中的cDNA为模板，用高保真酶进行PCR扩增，由于以cDNA为模板进行高保真扩增效率低，本实验中进行了两次PCR，第一次以cDNA为模板先扩增一次，然后以第一次PCR产物为模板，再扩增一次。

反应体系：5×PrimerSTARTM Buffer(Mg²⁺plus)10μL，dNTP Mixture（2.5mM）4μL，picFEH-F（10μM）1μL，picFEH-R（10μM）1μL，DNA模板2μL，HS DNA polymerase（2.5U/μL）0.5μL，ddH₂O 31.5μL，总体积50μL。

反应程序：

取5μL扩增产物跑1%的琼脂糖凝胶电泳，检测扩增结果。结果如图4所示，得到长度为1.6kb左右的单一条带，与预期的大小相同（1630bp）。将该基因片段克隆至pEASY-Blunt平末端载体上（具体操作参照pEASY-Blunt Cloning Kit说明书进行），即得到克隆载体pEASY-B-picFEH。

pEASY-B-picFEH酶切后得到一条3.9kb和一条1.6kb左右的条带（图4A-2泳道），pPICZαC（INVITROGEN公司）酶切后得到3.6kb左右的单一条带（图4A-3泳道），与预期大小相符。将酶切后的pPICZαC单一片段和pEASY-B-picFEH中的picFEH片段回收，然后用连接酶将二者酶连，即得到表达载体pPICZαC-picFEH，表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α(TAKARA D9057S)中，并在低盐LB+Zeocin^TM（25μg/mL）的平板上37℃过夜培养，挑选阳性克隆，提取质粒（方法按试剂盒说明书进行），将提取的质粒用XhoI和XbaI进行双酶切验证，结果如图4B所示，得到了3.6kb和1.6kb的两条带，说明目的基因片段picFEH已成功连入pPICZαC中，表达载体pPICZαC-picFEH构建成功。

实施例4表达载体转化毕赤酵母

⑴质粒的线性化

使用限制性内切酶PmeI将载体pPICZαC-picFEH酶切线性化，从而可以使线性化的质粒DNA与宿主基因组DNA进行同源重组整合。

酶切体系如下：10×NEB Buffer 4 15μL，DNA≤6μg 50μL，100×BSA 1.5μL，Pme I3μL，ddH₂O 80.5μL，总体积150μL。

37℃酶切过夜，1%琼脂糖凝胶电泳检测线性化效果，使用核酸回收试剂盒（PCR cleanKit）回收线性化产物，如图5A所示。

⑵制备毕赤酵母Pichia pastoris X-33（INVITROGEN公司）感受态细胞

⑶利用步骤（1）制备的线性化产物电转化毕赤酵母Pichia pastoris X-33，经YPDS+ZeocinTM（100μg/mL）抗性平板筛选得到阳性转化子。

⑷阳性克隆的检测

提取经划线纯化的单克隆的基因组DNA，将AOX1-F（SEQ ID NO.15,pPICZαC载体自身位于插入基因上游的序列）作为上游引物和picFEH-R（SEQ ID NO.10）作为下游引物进行PCR检测，将PCR产物送测序检测是否有移码和错配。PCR验证，结果（图5B）显示，用AOX1-F和picFEH-R引物可以从阳性转化子的基因组DNA中扩增到1.6kb左右的目的条带，而未转基因和转空载的对照中则没有扩得任何片段，和说明目的基因片段picFEH成功转入受体菌中，并成功整合到宿主基因组DNA中。

实施例5Mut+和MutS表型鉴定

1）用灭菌牙签挑取阳性单克隆，在MM及MD平板上以一定的方式划线，每板划10个；

2）保先在MM平板上划线；

3）每个克隆换一次牙签；

4）30℃培养两天；

5）两天后，计数平板，在MD平板正常生长而在MM平板上生长很小或不长的菌株为Mut^S型，其余为Mut⁺类型。实验中Mut⁺和Mut^S表型鉴定结果表明，转化子在MD和MM培养基上都能正常生长，所以获得的转化子为Mut⁺型，即甲醇利用正常型。

实施例6菊芋果聚糖外切水解酶基因在毕赤酵母中的表达

⑴重组酵母的诱导表达及SDS-PAGE分析

重组酵母的诱导表达方法参照Kawakami(Kawakami and Yoshida 2002)的方法进行，稍有改动，具体步骤如下：

1）挑重组子的单克隆至装有100mL BMGY液体培养基的1L的摇瓶中，200rpm，30℃培养至OD₆₀₀值为2-6。

2）1500×g，离心5min，弃上清，收集细胞用20mL BMMY液体培养基将菌体重悬，转移到200mL的摇瓶中，四层纱布封口，保证一定的通气量，200rpm，28℃培养。

3）每隔24h在培养基中加入100%甲醇至终浓度为2%。

4）每隔24h取一次样，取1mL样品于1.5mL离心管中，用于检测蛋白表达水平。

5）诱导表达4d后离心（5000×g，10min）收集上清液，液氮速冻后保存于-70℃直至分析。

同时以未转基因的受体菌和转化空质粒pPICZαC的重组子X-33/pPICZαC作为对照。

将诱导表达4d的发酵液上清采用SDS-PAGE垂直板电泳法(汪家政and范明2002)进行析，其中浓缩胶浓度5%，分离胶浓度10%，考马斯亮蓝R-250染色。结果如图6所示，在70～130kDa范围内，未转化的对照没有条带，转空载的对照则有一条较暗的带。携带Ht 1-FEH基因的重组子则有两条较明亮的带，其中一条较单一，而另一条较弥散，且随着诱导表达时间的延长，蛋白条带颜色越来越深。与对照相比，转Ht 1-FEH的重组子在100kDa左右有一条弥散的带，而对照中没有，因此可以推断这条100kDa左右的条带是Ht 1-FEH在毕赤酵母中重组表达的蛋白。重组蛋白较弥散且SDS-PAGE中蛋白的大小（100kDa）大于软件预测的（62.7kDa），前人用毕赤酵母异源表达外源基因也出现过类似的结果，其原因可能是重组蛋白在毕赤酵母糖基化修饰的结果(Ueno et al.2011;Wang et al.2011)。

⑵酶活性的测定

酶活测定的底物有两种：2%（w/v）的菊粉、100mM的蔗糖，底物都用0.1M的醋酸-醋酸钠缓冲液配制（pH4.6）。取0.1mL粗酶液（菌液上清作适当稀释），加入0.9mL底物，30℃保温2h，沸水浴5min终止反应，快速冷却后，用DNS(Miller 1959)法测定产物中还原糖含量。在相同的条件下，用100℃灭活的酶液作为对照。每1个单位（U）的酶活定义为：在以上反应条件下，1mL粗酶液中每分钟生成1μg还原糖的酶量。

结果发现（表1），重组酶只对菊粉有水解活性，而对蔗糖几乎没有水解活性，由此说明，重组酶为果聚糖水解酶，而不是转化酶（invertase）。菊粉为β2-1型果聚糖，是菊芋中天然的果聚糖，因此，可以初步推断，从菊芋中克隆得到的Ht 1-FEH基因具有1-FEH活性，但对其他类型果聚糖是否有水解活性，还需用其他类型果聚糖为底物进一步验证。

表1 Ht 1-FEH重组酶的底物特异性

⑶粗酶液中可溶性蛋白含量的测定

将诱导表达4d的发酵液上清采用考马斯亮蓝G-250比色法(Marion M 1976)进行酶活测定。取适当稀释的粗酶液20μL，加入200μL的考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，放置5min左右，用酶标仪测定595nm的吸光值。以BSA为蛋白标准品作标准曲线，根据标准曲线计算粗酶液中可溶性蛋白的含量。从表2可知，转空载的对照没有果聚糖水解酶活性，重组子具有果聚糖水解酶活性，随着发酵时间的延长，粗酶液中的可溶性蛋白含量不断增加，单位体积粗酶液（1mL）中的酶活力呈增加趋势，比活力也不断增加，由此说明，菊芋果聚糖水解酶基因Ht 1-FEH在毕赤酵母中成功分泌表达，且具有生物活性。

表2 Ht1-FEH重组酶的酶活力分析

实施例7

在菊芋品种“南芋1号”移栽后的50d、90d和130d取幼嫩的倒数第一片完全叶、倒一茎节，移栽后90d、130d、180d和210d取块茎，用锡箔纸将样品包裹装入5mL离心管中，于液氮中速冻后-70℃保存，用于提取RNA。按照实施例1中的方法提取总RNA，并合成cDNA。

根据果聚糖合成酶基因1-SST（AJ009757）和1-FFT（AJ009756）及本发明Ht 1-FEH基因的CDS序列，用Primer Premier 5.0设计半定量表达引物qSST、qFFT和qFEH，以18S核糖体编码基因作为内参，分析盐胁迫下3个果聚糖代谢关键酶基因的表达情况，引物序列见表3。PCR反应体系和程序同实施例1，循环数为25。

表3半定量表达分析引物序列

菊芋果聚糖代谢关键酶基因半定量表达分析结果如图7所示，1-SST和1-FFT主要在块茎中表达，在180d和210d表达量较高，在茎和叶中表达量较低。盐处理下，1-SST在块茎发育初期（90d）表达量最高，明显高于对照，随着块茎的发育，其表达量减少，表达量明显低于对照；1-FFT在块茎发育初期（90d）和块茎成熟期（210d）表达量较高，在90d和130d的表达量高于对照，180d的表达量低于对照，210d的表达量与对照无显著差异。以上结果表明，盐胁迫使果聚糖合成酶基因1-SST和1-FFT在块茎发育初期表达量上升，而在块茎膨大中后期，1-SST和1-FFT表达量下降，说明盐胁迫使块茎中果聚糖的合成提前。果聚糖外切水解酶1-FEH在茎和叶中有表达，而在块茎发育中没有表达或表达量很低。盐处理下，在50d和90d，茎中的1-FEH表达量明显高于对照；在50d，叶片中的1-FEH表达量高于对照，其他时期与对照无明显差异。说明在地上部快速生长期（50-90d），盐胁迫诱导1-FEH的表达量上升，叶片中总糖和还原糖含量明显高于对照，茎中的非还原糖含量高于对照，由此说明，盐胁迫下果聚糖水解酶1-FEH基因在地上部快速生长期的转录正调控可以增加叶片和茎中的单糖或非还原糖含量，而这些渗透调节物质的增加则有利于菊芋在盐胁迫下的生理防卫。可见本发明Ht 1-FEH基因可应用于培育转基因耐盐植物。

实施例8盐胁迫下菊芋中总糖和还原糖的变化

选用菊芋品种“南芋1号”（NY-1）为试材，NY-1为本室培育。试验于2011年在南京农业大学牌楼温室试验基地进行。试验采用土培盆栽方式，盆栽用土为耕层0～20cm砂壤，土壤盐含量为0.21g·kg^-1。选用底端有孔、透气性良好的塑料桶（直径30cm、深30cm）进行盆栽，底端垫塑料托盘。每盆装干土10kg，施10g复合肥作为底肥，复合肥总养分为45％，不含氯，N∶P∶K=15∶15∶15。试验用菊芋块茎种子预先在室内进行发芽，切取大小一致的块茎芽眼播于装有石英砂的塑料周转箱中，芽眼朝上，于光照培养箱中培养，昼夜温度分别为30℃和20℃，光暗周期为16h∶8h，保持砂质的湿润。待块茎萌发后，选取长势一致的幼苗进行移栽，每盆3株，待幼苗长势稳定后定苗，每盆1留取1株进行盐处理。

试验设2个处理水平，分别为空白对照（CK）和2％盐处理（T），处理方式为：盐处理，向土壤中浇灌NaCl稀溶液，使土壤含盐量达到2g·kg^-1，土壤含盐量（g·kg^-1）=（加入盐量+原始土盐量）/土壤质量×1000。充分供水，使土壤含水量达到最大持水量的60％，同时清洗托盘，将水浇入盆中，以保证盐分不流失。处理重复3次。

在移栽后的50d、90d、130d、180d、210d（Days after planting，DAP）分别取样一次，每个处理每次取3株作为重复样。取功能叶片（倒三、四、五）、茎基部（5-10cm）和块茎（匍匐茎）烘干用于糖分测定；采样发现，在移栽后的90d地下块茎起始形成，

将烘干的植物样磨细过80目筛用于糖含量的测定。

可溶性总糖的提取：准确称取植物干样0.1g左右于10mL离心管中，加5mL去离子水，80℃提取40min，冷却，4000rpm离心5min，收集上清，残渣加水重复提取2次，合并上清液定容，在上清液中加10mg活性炭，80℃脱色30min，过滤后取滤液稀释一定倍数后进行糖的测定。

可溶性总糖含量的测定：采用苯酚-硫酸法(李合生2000)。取待测液2.0mL于20mL刻度试管中（待测液浓度范围0.05～0.1mg/mL），加入6％苯酚1.0mL，98％浓硫酸5.0mL，摇匀，室温下放置30min，490nm下测吸光度，以果糖为标准物作标准曲线并计算糖的含量（结果乘以校正系数0.9得总糖含量）。

总还原糖（TRS）含量的测定采用DNS法(Miller 1959)。

正常生长的南芋一号（NY-1）叶片中可溶性总糖（图8-A CK）和还原糖（图8-B CK）含量的变化总趋势相同。NY-1叶片中可溶性总糖和还原糖含量都呈先上升后下降趋势，在130d达到高峰。土壤盐处理未改变叶片中可溶性总糖和还原糖含量的变化趋势（图8-A T和图8-B T），但在50d-90d生育期，提高了可溶性总糖和还原糖含量，而这还原糖含量的提高也是和叶片中的FEH的转录水平正相关的。

南芋一号茎基部的可溶性总糖（图9-A CK）和还原糖（图9-B CK）含量均呈单峰曲线变化，在90～130d可溶性总糖含量上升，至130d达到峰值，其后下降。盐处理没有改变茎基部中糖组分含量的变化趋势（图9-A T和图9-B T），但降低了茎基部的可溶性总糖和还原糖含量，同一品种盐处理与对照同期相比，茎基部还原糖含量的下降幅度显著大于可溶性总糖，尤其在90d-130d之间，而在这段时间茎中FEH的转录水平较高。在该段时间内FEH的转录水平较高，但茎中还原糖含量却升高不多，其主要原因之一是茎中的还原糖被转移到了块茎中，这从盐处理下块茎中SST和FFT的转录水平均比较高可以看出（图7）。

Claims

1.一种菊芋果聚糖1-外切水解酶基因Ht 1-FEH，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的菊芋果聚糖1-外切水解酶基因Ht 1-FEH编码的蛋白质，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组载体，其特征在于将菊芋果聚糖1-外切水解酶基因Ht 1-FEH插入表达载体pPICZαC的XhoI和XbaI酶切位点之间。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于所述的菊芋果聚糖1-外切水解酶基因Ht 1-FEH是以菊芋品种“南芋1号” 叶片cDNA为模板，以SEQ ID NO.9和 SEQ ID NO.10为引物，通过PCR扩增得到。

5.一种含有权利要求1所述的菊芋果聚糖1-外切水解酶基因Ht 1-FEH的毕赤酵母。

6.根据权利要求5所述的毕赤酵母，其特征在于所述的毕赤酵母是将权利要求3所述的重组载体经限制性内切酶PmeI酶切线性化，再将该线性化的重组载体DNA电转化Pichia pastoris X-33酵母，使线性化的重组载体DNA与宿主基因组DNA进行同源重组整合而得到的。

7.权利要求1所述的菊芋果聚糖1-外切水解酶基因Ht 1-FEH在水解菊粉生产果糖类物质中的应用。