JP2011050363A - ネオケストースの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】フルクタン含有組成物に所定の活性を有するフルクタン加水分解酵素(1−FEH(fructan 1−exohydrolase)など)を作用させ、ネオケストース以外のフルクタンを選択的に分解してグルコース、フルクトース、スクロース、ネオケストースのみを残存させ、この酵素処理液をクロマト分離して高純度のネオケストースを効率的に製造する。
【選択図】なし
Description
また、レバン型フルクタンとは、スクロースのフルクトース残基の6位にもう一つのフルクトースの2位が結合し、このFru−(β2→6)−Fru結合によりさらにフルクトース鎖が伸長した構造を有するフルクトース重合体(6−ケストース型)である。
(1)フルクタン含有組成物を、フルクタンのFru−(β2→1)−Fru結合を分解し、フルクタンのFru−(β2→6)−Glc結合及びスクロースを分解しないフルクタン加水分解酵素で処理し、その酵素処理液をクロマト分離することを特徴とするネオケストースの製造方法。
(2)フルクタン加水分解酵素が、ゴボウ由来であることを特徴とする(1)に記載の方法。
(3)フルクタン加水分解酵素が、1−FEH(fructan 1−exohydrolase)であることを特徴とする(1)又は(2)に記載の方法。
(4)フルクタン加水分解酵素が、配列番号1(図3)に記載のアミノ酸配列からなる1−FEH(fructan 1−exohydrolase)であることを特徴とする(3)に記載の方法。
(5)フルクタン加水分解酵素が、配列番号1(図3)に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、1−FEH(fructan 1−exohydrolase)の活性を有するものであることを特徴とする(3)に記載の方法。
(6)フルクタン加水分解酵素が、配列番号2(図4)に記載の塩基配列からなる遺伝子がコードする、1−FEH(fructan 1−exohydrolase)の活性を有するタンパク質であることを特徴とする(3)に記載の方法。
(7)フルクタン加水分解酵素が、配列番号2(図4)に記載の塩基配列からなるDNAをプローブとして用いるストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションによって得られる遺伝子がコードする、1−FEH(fructan 1−exohydrolase)の活性を有するタンパク質であることを特徴とする(3)に記載の方法。
(8)フルクタン含有組成物が、農産物及び/又は農産副産物であることを特徴とする(1)〜(7)のいずれか1つに記載の方法。
(9)農産物及び/又は農産副産物が、ユリ科植物及び/又はキク科植物由来であることを特徴とする(8)に記載の方法。
(10)農産物及び/又は農産副産物が、アスパラガス(例えばアスパラガスの更新廃棄株)、タマネギ(例えば余剰生産タマネギ)、ゴボウから選ばれる少なくともひとつの由来であることを特徴とする(9)に記載の方法。
(12)フルクタン含有組成物中のネオケストース以外のフルクタンを選択的に分解し、グルコース、フルクトース、スクロース及びフルクタンとしてネオケストースを残存させることを特徴とする、(4)〜(7)のいずれか1つに記載のフルクタン加水分解酵素1−FEH(fructan 1−exohydrolase)。
クロマト分離によって得られたネオケストースは、そのまま液状の高純度ネオケストースとして用いることもできるが、定法によって濃縮物、ペースト化物、乾燥物(粉末、顆粒)などとすることもできる。
ゴボウtotalRNAからPCR法及びRACE法(Rapid Amplification of cDNA end)を用いて、ゴボウ由来の新規1−FEH遺伝子(aleh1;完全長cDNA)をクローニングし、その塩基配列をSanger−dideoxy法により決定した(配列番号2、図4)。この新規1−FEH遺伝子は、塩基配列が2,063bpからなり、1,746bpからなるオープンリーディングフレームを有していた。また、そのオープンリーディングフレームの塩基配列(コドン)から、コードするタンパク質のアミノ酸配列も決定した(配列番号1、図3)。そのアミノ酸配列は、581残基からなり、チコリー由来の1−FEHと81%という高い相同性を示した。
定法に従い、アスパラガス根およびタマネギ鱗茎から熱エタノール抽出により抽出糖(フルクタン含有組成物)を調製した。まず、アスパラガス根およびたまねぎ鱗茎を熱エタノールで抽出し、その抽出物を凍結乾燥し、その凍結乾燥粉末を320mg/mlとなるよう水で溶解した。
結果として、アスパラガスより抽出したフルクタン含有組成物に組換え1−FEHを作用させ、フルクタンを分解することによりネオケストース濃度が約5倍となり、フルクトース、スクロース、ネオケストースの3種の糖を主成分とする分離に適した糖組成へと変換することができた。
結果として、タマネギより抽出したフルクタン含有組成物に組換え1−FEHを作用させ、フルクタンを分解することによりネオケストース濃度が約1.5倍となり、フルクトース、スクロース、ネオケストースの3種の糖を主成分とする分離に適した糖組成へと変換することができた。
基質としてアスパラガスより抽出したフルクタン含有組成物(アスパラガス根抽出糖)を用い、ネオケストースの大量調製に最も有効な条件と考えられる、35U/mlの酵素溶液で8時間の反応条件でネオケストースの大量調製を実施した。具体的には、320mg/mlのアスパラガスのフルクタン含有液20ml、McIlvaine緩衝液(pH5.5)10ml、35U/mlの酵素溶液10mlを混合し、30℃で8時間酵素反応させ、10分間煮沸して反応を停止した。反応生成物を実施例2に記載のHPAEC分析で定量した。
Claims (12)
- フルクタン含有組成物を、フルクタンのFru−(β2→1)−Fru結合を分解し、フルクタンのFru−(β2→6)−Glc結合及びスクロースを分解しないフルクタン加水分解酵素で処理し、その酵素処理液をクロマト分離することを特徴とするネオケストースの製造方法。
- フルクタン加水分解酵素が、ゴボウ由来であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- フルクタン加水分解酵素が、1−FEH(fructan 1−exohydrolase)であることを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
- フルクタン加水分解酵素が、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなる1−FEH(fructan 1−exohydrolase)であることを特徴とする請求項3に記載の方法。
- フルクタン加水分解酵素が、配列番号1に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、1−FEH(fructan 1−exohydrolase)の活性を有するものであることを特徴とする請求項3に記載の方法。
- フルクタン加水分解酵素が、配列番号2に記載の塩基配列からなる遺伝子がコードする、1−FEH(fructan 1−exohydrolase)の活性を有するタンパク質であることを特徴とする請求項3に記載の方法。
- フルクタン加水分解酵素が、配列番号2に記載の塩基配列からなるDNAをプローブとして用いるストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションによって得られる遺伝子がコードする、1−FEH(fructan 1−exohydrolase)の活性を有するタンパク質であることを特徴とする請求項3に記載の方法。
- フルクタン含有組成物が、農産物及び/又は農産副産物であることを特徴とする請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 農産物及び/又は農産副産物が、ユリ科植物及び/又はキク科植物由来であることを特徴とする請求項8に記載の方法。
- 農産物及び/又は農産副産物が、アスパラガス、タマネギ、ゴボウから選ばれる少なくともひとつの由来であることを特徴とする請求項9に記載の方法。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のフルクタン加水分解酵素でフルクタン含有組成物を処理することにより、当該組成物中のネオケストース以外のフルクタンを選択的に分解し、ネオケストースを残存させる方法。
- フルクタン含有組成物中のネオケストース以外のフルクタンを選択的に分解し、ネオケストースを残存させることを特徴とする、請求項4〜7のいずれか1項に記載のフルクタン加水分解酵素1−FEH(fructan 1−exohydrolase)。
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