CN102648937A

CN102648937A - 远志碱水解产物组合物在制备抗老年性痴呆药物中的应用

Info

Publication number: CN102648937A
Application number: CN2011100441922A
Authority: CN
Inventors: 潘瑞乐; 刘新民; 常琪; 徐淑萍; 王君; 王力为
Original assignee: Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
Priority date: 2011-02-24
Filing date: 2011-02-24
Publication date: 2012-08-29

Abstract

本发明提供中药远志碱水解产物组合物在制备抗老年性痴呆药物中的应用。该组合物的主要成分有：细叶远志皂苷(tenuifolin)、黄花倒水莲皂苷A(fallaxsaponin A)、3，4，5-三甲氧基肉桂酸(3，4，5-trimethoxycinnamic acid，TMCA)、对甲氧基肉桂酸(p-methoxycinnamic acid，PMCA)，它们各自的比例为：细叶远志皂苷(25～38％)，黄花倒水莲皂苷A(10～25％)，3，4，5-三甲氧基肉桂酸(12～25％)，肉桂酸(5～15％)。该组合物明显改善Aβ25-35海马注射所致C57小鼠学习记忆障碍；明显改善东莨菪碱所致C57小鼠学习记忆障碍模型的空间学习记忆能力，且作用优于阳性药；明显改善快速老化模型小鼠学习记忆障碍模型的空间学习记忆能力和被动逃避能力。

Description

远志碱水解产物组合物在制备抗老年性痴呆药物中的应用

技术领域

本发明属于中药领域，主要涉及中药远志及其同属植物提取物的碱水解产物在抗老年性痴呆药物中的应用。

技术背景

阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s Disease，AD)多发生于老年和老年前期，又称早老性痴呆症，是以进行性认知功能障碍为主要特征的神经退行性病变。随着人口老龄化，AD已经成为继心血管疾病和肿瘤之后严重威胁老年人生命健康的主要疾病之一。目前，AD的发病机制尚不明确，其中胆碱能神经元丢失和自由基氧化损伤可能是其主要发病机制。胆碱能损伤学说表明AD患者脑内神经递质乙酰胆碱水平明显降低，临床多采用乙酰胆碱酯酶抑制剂，美国FDA批准的5种临床治疗AD的药物中4种为乙酰胆碱酯酶抑制剂，表明抑制乙酰胆碱酯酶活性仍不失为一种有效的AD治疗途径。自由基假说表明，AD患者的脑内还出现氧含量偏高，氧化应激损伤较显著的现象，可通过使用抗氧化剂辅助治疗，改善患者脑内自由基消除系统的缺陷。已有体外实验显示维生素E可保护培养的神经元抵抗β一淀粉样蛋白的侵害作用，能延缓AD的进程，同时建议将抗氧化剂与胆碱酯酶抑制剂合用，通过清除自由基以及抑制乙酰胆碱酯酶的活性来达到协同治疗AD的目的。

远志为远志科植物远志Polygala tenuifolia Wulld．或卵叶远志P.sibirica L.的干燥根，始载于《(神农本草经)》，列为上品。本品性温，味苦、辛，归心、肾、肺经，具有安神益智、交通心。肾、祛痰消肿之功效，临床上常用于治疗心肾不交引起的失眠多梦、健忘惊悸、神志恍惚、咳痰不爽、疮疡肿毒、乳房肿痛等症。现代研究表明远志主要成分为皂苷、寡糖酯、Xanthone以及少量生物碱等，且皂苷类成分是远志的主要活性成分。文献报道远志皂苷具有较强的毒性，我们的动物实验也表明当大鼠口服远志总皂苷200mg/(kg·d)时即可导致死亡，对死亡大鼠解剖发现体内有大量充血，推测可能是远志皂苷的溶血毒性所致。通过对公开发表的90多个远志皂苷类成分的结构分析，发现远志皂苷类成分为齐墩果烷型五环三萜，3位羟基与葡萄糖成苷键，28位羧基与糖成酯键，这种类型的皂苷一般具有溶血作用，但当28位酯键被碱水解后，溶血作用则消失。因此，我们将远志提取物进行碱水解后，再进行动物毒性实验，结果发现毒性大大降低。我们还对远志碱水解产物进行了抗老年性痴呆的活性研究，采用Aβ25-35海马注射模型及东莨菪碱所致小鼠学习记忆障碍模型，进行了Morris水迷宫、跳台和避暗等实验，结果表明远志碱水解产物对模型小鼠的空间参考记忆、再学习及工作记忆能力均有明显的改善作用。为了搞清远志皂苷碱水解产物抗老年性痴呆的物质基础，本文对远志碱水解产物的化学成分进行了详细的研究，从中分离并鉴定出四个主要成分，并采用HPLC法对这四个成分的含量进行了测定，为远志碱水解产物的开发抗老年性痴呆药物提供了科学依据。

发明内容

本发明首次公开远志碱水解产物组合物在制备抗老年性痴呆药物中的应用。

本发明所提到的组合物应该是远志提取物通过碱水解，并脱除糖及其它杂质成分而保留了全部的水解产物。

本发明所提到的组合物应该是细叶远志皂苷(tenuifolin)和fallaxsaponin A)、3，4，5-三甲氧基肉桂酸(3，4，5-trimethoxycinnamic acid，TMCA)、对甲氧基肉桂酸(p-methoxycinnamic acid，PMCA)的组合物，它们的比例为：细叶远志皂苷(25-38％)；黄花倒水莲皂苷A(10-25％)，3，4，5-三甲氧基肉桂酸(12-25％)肉桂酸(5-15％)。

本发明所提到的组合物应该是远志及其同属任何一种植物通过碱水解得到的组合物。

本发明所提到的碱水解是指：PH为8-14，水解温度为70-100℃，水解时间为2-10小时条件下对远志提取物进行水解，并对水解产物再进行相关处理所得到的组合物。

本发明所提到碱水解产物的处理是指：采用盐酸调节碱水解产物PH为4-5，然后再用大孔树脂(如D101，AB8等)进行吸附，先用蒸馏水洗去杂质，再用不同浓度的乙醇进行洗脱，得到组合物。

本发明所提到的提取物是指远志药材采用水、乙醇、甲醇中任意一种或任意两种以上溶剂以任意比例所组成的混合溶剂采用常规方法提取而得到。

本发明所提到的远志属提取物的提取方法包括室温下浸渍法或超声波震荡提取，或回流提取等。

本发明所提到的组合物主要成分的含量测定采用目前公认的HPLC方法测得。

发明人通过药效学试验表明该组合物具有明显改善Aβ25-35海马注射所致C57小鼠学习记忆障碍；能明显改善东莨菪碱所致C57小鼠学习记忆障碍模型的空间学习记忆能力，且作用优于阳性药；能明显改善快速老化模型小鼠学习记忆障碍模型的空间学习记忆能力和被动逃避能力。

基于上述药效实验结果，本发明提出了该组合物在在制备治疗老年性痴呆药物中应用，尤其对老年性痴呆引起的学习记忆障碍的改善作用。

具体实施方案

1组合物的制备

方法一：称取远志药材1kg，切段，8倍体积70％乙醇回流提取3次，每次4h，过滤，合并，减压回收溶剂，蒸干得远志浸膏380g。将远志浸膏用蒸馏水溶解后，以D101大孔树脂进行柱层析，先用40％乙醇洗脱至流出液无色，洗脱液弃去；再用95％：乙醇洗脱至流出液无色，减压回收溶剂，蒸干得远志总皂苷160g。将远志总皂苷置于pH＝10的NaOH溶液3000mL中，于80℃加热8h，放冷，用盐酸调节pH值至4～5。将酸化后的碱水解溶液再以D101大孔树脂进行柱层析，先用蒸馏水洗脱至流出液基本无色，洗脱液弃去；再用95％乙醇洗脱至流出液无色，减压回收溶剂，蒸干得远志皂苷碱水解产物60g。

方法二：称取远志药材1kg，切段，8倍体积70％乙醇回流提取3次，每次4h，过滤，合并，减压回收溶剂，蒸干得远志浸膏380g。将远志浸膏用蒸馏水溶解后，以D101大孔树脂进行柱层析，先用40％乙醇洗脱至流出液无色，洗脱液弃去；再用95％：乙醇洗脱至流出液无色，减压回收溶剂，蒸干得远志总皂苷160g。将远志总皂苷置于pH＝14的NaOH溶液3000mL中，加热回流4h，放冷，用盐酸调节pH值至4～5。将酸化后的碱水解溶液再以D101大孔树脂进行柱层析，先用蒸馏水洗脱至流出液基本无色，洗脱液弃去；再用95％乙醇洗脱至流出液无色，减压回收溶剂，蒸干得远志皂苷碱水解产物50g。

2组合物的药效学研究结果

2.1组合物对Aβ_25-35海马注射拟AD模型小鼠学习记忆的影响

(1)动物分组及给药方案

雄性C57BL/6小鼠，25-30g，造模后将动物随机分为6组：正常对照组、假手术组、模型组、阳性对照组(加兰他敏，3mg/kg)、远志碱水解组合物组(50、100mg/kg)，每组12-15只小鼠，于造模后24小时开始给药，正常对照组、假手术组、模型组以等量蒸馏水灌胃。

(2)实验药品配制

分别称取远志碱水解组合物50、25mg，各加入蒸馏水10ml，超声助溶，得药液浓度为5、2.5mg/ml，按0.2ml/10g灌胃，即给药剂量分别为100、50mg/kg。称取阳性药氢溴酸加兰他敏3mg，加入蒸馏水20ml，得药液浓度为0.15mg/ml，按0.2ml/10g灌胃，即给药剂量分别为3mg/kg。造模药品配制：临用前用无菌生理盐水将淀粉样蛋白Aβ_25-35配成1mg/ml工作液，置37℃CO2恒温箱孵育7天，使其老化为聚集态的Aβ_25-35，-20℃保存备用。

(3)小鼠Aβ_25-35海马注射模型的制备

0.4％戊巴比妥钠(0.2ml/10g)麻醉小鼠后，立体定位仪固定头部，颅顶区备皮，常规消毒手术区皮肤，做1cm斜切口(端点分别为前囱和海马的位置)，分离骨膜暴露颅骨，参照海马CA1区图谱及预实验结果，确定定位坐标为：以前囟为0点，AP-2.46mm，ML 2.2mm，DV 2.1mm。10μl微量进样器垂直进针，将5μl聚集态Aβ_25-35溶液缓慢注入(注射速度设置为1μl/min)，注射时间为5min，留针3min，以保证溶液充分弥散，缓慢撤针。青霉素粉消毒，缝合切口皮肤，将小鼠放在棉花上保温。假手术组注射等量生理盐水，正常对照组不处理。

(4)行为学检测方法

Morris水迷宫检测：于造模第10天开始Morris水迷宫检测，以测定小鼠的空间学习记忆能力，历时10d(定位航行3天+空间探索1天+再学习3天+工作记忆3天)。每天给药30min后开始检测。

跳台实验：水迷宫实验结束后，动物休息1天，于造模后21天开始跳台实验，测试分为两个阶段，即记忆获得和记忆巩固实验，给药30min后开始检测。

避暗实验：采用另一批实验动物，于造模后第10天开始避暗正式实验。正式实验前3天，对小鼠进行3次适应性训练，每天1次，每次训练3min，即将动物头部背向电动门自明室放入，任其在明暗室内自由活动以熟悉环境。

(5)结果

使用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，结果表明组合物(50、25mg/kg)能明显改善Aβ25-35海马注射所致C57小鼠学习记忆障碍模型的空间学习记忆能力和被动逃避能力

2.2组合物对东莨菪碱拟AD模型小鼠学习记忆的影响

(1)动物分组及给药方案

雄性C57BL/6J小鼠，8周龄，适应性饲养3d，将小鼠完全随机分为5组，分别为正常组、模型组、阳性药组、组合物组(50、100mg/kg)，每天灌胃给药一次，给药后第10天开始行为学检测，每天检测前30min灌胃给药并腹腔注射东莨菪碱(1mg/kg)造模。

(2)实验药品配制

称取东莨菪碱(scopolamine，SCOP)2.5mg，加入无菌生理盐水50ml，混匀，得药液浓度为0.05mg/ml，按0.2ml/10g腹腔注射，即给药剂量为1mg/kg，此为造模药物。分别称取远志碱水解组合物50、25mg，各加入蒸馏水10ml，超声助溶，得药液浓度为5、2.5mg/ml，按0.2ml/10g灌胃，即给药剂量分别为100、50mg/kg。称取阳性药氢溴酸加兰他敏3mg，加入蒸馏水20ml，得药液浓度为0.15mg/ml，按0.2ml/10g灌胃，即给药剂量分别为3mg/kg。

(3)动物行为学检测方法

避暗检测：历时6天(适应3天、检测3天)。给药后第10-12天，每天于给药后将小鼠背朝电动门放入明室适应避暗测试箱环境1次，每次适应3min；第13天开始正式避暗实验，包括获得、巩固实验。均在灌胃给药及ip SCOP 30min后开始实验。

跳台检测：避暗实验结束后，动物休息一天，即给药第16-17天进行跳台测试。测试分为两个阶段，即记忆获得和记忆巩固实验，于灌胃给药及ip SCOP 30min后开始检测。

水迷宫检测：跳台实验结束后，动物休息1天，再进行水迷宫检测(即给药后第18d)，历时9d，分为定位航行5d、空间探索1d及工作记忆实验3d。

(4)结果

使用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，组合物(50、100mg/kg)能明显改善东莨菪碱所致C57小鼠学习记忆障碍模型的空间学习记忆能力，其中50mg/kg组明显强于阳性药加兰他敏；组合物(50、100mg/kg)能明显改善模型小鼠的被动回避能力，能显著缩短逃避潜伏期和错误区时间，作用优于阳性药；组合物(50、100mg/kg)能明显减少模型小鼠的错误次数；减少明室停留时间2.3组合物对快速老化模型小鼠学习记忆的影响

(1)动物分组及给药方案

雄性8月龄SAMP8快速老化小鼠48只，随机分为4组，每组12只，雄性8月龄SAMR1对照小鼠12只，共5组，分别为SAMR1对照组，SAMP8模型组、阳性药多奈哌齐组、远志次级总皂苷组(25、50mg/kg)，单笼饲养，每天灌胃给药一次，给药后第10天开始行为学检测。

(2)实验药品配制

分别称取远志碱水解组合物25、12.5mg，各加入蒸馏水10ml，超声助溶，得药液浓度为2.5、1.25mg/ml，按0.2ml/10g灌胃，即给药剂量分别为25、12.5mg/kg。取阳性药安理申(多奈哌齐片剂5mg/片)1片，加入蒸馏水20ml，超声助溶，得药液浓度为0.25mg/ml，按0.2ml/10g灌胃，即给药剂量分别为5mg/kg。

(3)动物行为学检测

Morris水迷宫检测：于给药第10天开始Morris水迷宫检测，历时11d(可视平台2天+定位航行5天+空间探索1天)。每天给药30min后开始检测。

避暗实验：水迷宫实验结束后，动物休息1天，开始避暗实验。实验分为记忆获得和巩固两个阶段，均于给药30min后开始检测，

(4)结果

使用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，组合物(12.50、25mg/kg)能明显改善快速老化模型小鼠学习记忆障碍模型的空间学习记忆能力和被动逃避能力。

Claims

1.远志碱水解组合物在制备抗老年性痴呆药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其中所指老年性痴呆是指各种原因引起的痴呆。

3.根据权利要求1所述的组合物是指远志及其同属植物的提取物在PH 8-14，温度在70-100℃的条件下，水解2-10小时得到水解产物，再经大孔树脂等吸附剂处理后得到的混合物。

4.根据权利要求1所述的组合物，其主要成分为：细叶远志皂苷(tenuifolin)、黄花倒水莲皂苷A(fallaxsaponin A)、3，4，5-三甲氧基肉桂酸(3，4，5-trimethoxycinnamic acid，TMCA)、对甲氧基肉桂酸(p-methoxycinnamic acid，PMCA)，它们的比例为：细叶远志皂苷(25～38％)，黄花倒水莲皂苷A(8～15％)，3，4，5-三甲氧基肉桂酸(12～25％)，肉桂酸(5～15％)

5.根据权利要求1的应用，所述的药物是指远志碱水解产物加入常规的赋形剂、调味剂、崩解剂、防腐剂等药物辅料，制成的任何一种适合于临床上使用的剂型，包括片剂、胶囊剂、颗粒剂等口服剂型，也包括注射液等非经口服剂型。

6.根据权利要求1所述的应用，是指治疗抗老年性痴呆的药品、保健食品及其它类似产品。