CN102614349B - 预防和治疗a型魏氏梭菌病的中药组合物、提取物、制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了预防和治疗A型魏氏梭菌病的中药组合物，按重量份计由以下组分组成，十大功劳10-80份、白头翁5-50份、山药3-50份、车前子3-30份、地榆3-30份、大黄3-30份和铁苋菜5-45份；还公开了由该组合物制得的提取物及其制备方法和由提取物制备的制剂和应用，能够用于预防和治疗A型魏氏梭菌病，具有广泛的临床应用价值。

Description

预防和治疗A型魏氏梭菌病的中药组合物、提取物、制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及中药组合物，特别涉及防治兔A型魏氏梭菌病的中药组合物，还涉及这种中药组合物的提取物和制备方法，还涉及由提取物制得的制剂及其应用。

背景技术

A型魏氏梭菌病，又称产气荚膜梭菌病，是常见的一种急性致死性腹泻病，其发病率和死亡率均高，对养殖业的危害极大，一旦感染容易造成巨大的经济损失。祖国医学认为此病是外邪入里而出现的里热症，其致病机制是热炽盛，犯及气血、致瘀、致热，外窜经络，内伤脏腑，气阴损伤。而实际上，A型魏氏梭菌是条件致病菌，在正常情况下不会致病，但当卫生条件差，饲养管理不良，饲料突然改变、搭配不当、粗纤维不足，使肠道内环境发生改变，肠道正常菌群破坏，使得A型魏氏梭菌大量繁殖，并产生A型魏氏梭菌外毒素，使感染动物中毒死亡。感染途径为消化道、皮肤和粘膜损伤等，一年四季均可发生，以春、秋、冬3季多发。各日龄动物均可发病，以幼年动物发病率最高。

因此，急需一种中药组合物，能够增强的免疫力，抑制A型魏氏梭菌的生长，中和A型魏氏梭菌产生的外毒素。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供预防和治疗防治A型魏氏梭菌病的中药组合物。具有清热解毒、凉血止血，能够很好的预防和治疗A型魏氏梭菌病，而且毒副作用小。

预防和治疗A型魏氏梭菌病的中药组合物，按重量份计由以下组分组成，十大功劳10-80份、白头翁5-50份、山药3-50份、车前子3-30份、地榆3-30份、大黄3-30份和铁苋菜5-45份。

优选的，按重量份计由以下组分组成：十大功劳20-50份、白头翁6-40份、山药5-40份、车前子4-16份、地榆4-16份、大黄4-16份和铁苋菜6-40份

更优选的，按重量份计由以下组分组成：十大功劳35份、白头翁25份、山药8份、车前子8份、地榆8份、大黄25份和铁苋菜25份。

十大功劳为小檗科阔叶十大功劳（Mahonia bealei（Fort.）Carr.）或狭叶十大功劳（Mahonia fortunei（Lindl）Fedde）的根、茎和叶。性味苦、寒，滋阴、清热、解毒。据研究表明十大功劳主要含有小檗碱，药根碱、木犀草素、5-甲氧基大风子等有效活性成分，其对细菌性痢疾，急性肠胃炎、传染性肝炎、等有良好的治疗效果。

山药，学名为薯蓣，薯蓣植物薯蓣（Dioscorea opposita）的块根，味甘、性平，具有健脾补肺、益胃补肾、固肾益精的功效，山药中还含有淀粉酶、多酚氧化酶等活性物质，有利于脾胃消化吸收功能；同时山药中含有大量的黏液蛋白、维生素及微量元素能够促进动物血管软化，预防细菌性疾病的发病，增强动物体的非特异性免疫力。

白头翁为毛茛科植物白头翁（Pulsatilla chinensis(Bge.)Regel）的干燥根，味苦，性寒；归胃经，具有清热解毒，凉血止痢的功效。据研究表明，白头翁含有白头翁皂甙、白桦脂酸、胡萝卜甙、原白头翁素及白头翁素等多种有效活性成分，原白头翁素和白头翁素有抗多种细菌和病毒的功效，其中对白喉杆菌、葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、结核杆菌、魏氏梭菌等有明显的抑制作用。同时白头翁还具有镇静、镇痛及抗痉挛，对由于细菌引起的肠道出血性痢疾和肠痉挛性痢疾有良好的治疗作用。

车前子又名车前实，为车前科植物车前（Plantago asiatica Linn.）的干燥成熟种子，性甘、寒。车前子含有多种有效活性成分，具有利水通淋，渗湿止泻，清肝明目的功效，此外对急、慢性细菌性痢疾具有良好的治疗效果。

大黄（Rheum palmatum L）是多种蓼科大黄属的多年生植物的根和根茎。性味苦、寒，具有凉血解毒，逐瘀通经，治疗湿热、热结胸痞等功效；能够治疗湿热泻痢、水肿腹满、小便不利、胃热、便血、尿血、蓄血、热毒痈疡、丹毒等疾病。大黄中含有蒽类衍生物、鞣质类、有机酸类、挥发油类等化合物。大黄可减轻毒素性低血压，消除氧自由基，降低在灌注期血浆、肺、小肠等内源性一氧化氮的水平，降低肠、肝、肺毛细血管通透性，减轻毒素引起的肠壁血管通透性增加，防止肠道细菌移位及毒素进入血循环等。

铁苋菜为大戟科（Euphorbiaceae Herba Acalyphae）的植物，性凉，味苦、涩，具有清热解毒，收敛止血的功效，能够用于肠炎、痢疾、便血、尿血、崩漏、痈疖疮疡、皮肤湿疹等病症。铁苋菜具有丰富的营养，增强体质，铁苋菜中富含蛋白质、脂肪、糖类及多种维生素和矿物质，其所含的蛋白质比牛奶更能充分被人体吸收，所含胡萝卜素比茄果类高2倍以上，可为动物体提供丰富的营养物质，能够提高机体的免疫力，预防细菌、病毒性疾病的发生具有良好的效果。

地榆为蔷薇科地榆属植物地榆（Garden Burnet Root）的根。性味苦、酸、寒；具有凉血止血，清热解毒等功效。地榆中含有鞣质，具有收敛作用，能止泻、止血、抗菌、抗炎等作用。研究表明，地榆对伤寒杆菌、脑膜炎双球菌、福氏痢疾杆菌、宋内痢疾杆菌、乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌、白喉杆菌、大肠杆菌、枯草杆菌、魏氏梭菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌、绿脓杆菌及霍乱弧菌均有不同程度的抑制作用。

本发明目的之二在于提供中药组合物的提取物，含有中药组合物的全部有效成分，其纯度高。

为实现上述目的，技术方案为：

所述中药组合物的提取物。

本发明的目的之三在于提供中药组合物的提取物的制备方法，其制备方法简单，不需要特殊设备，技术方案为：

所述提取物的制备方法，具体步骤如下：

（1）按份取各药材，混合，碎粉，加入水，浸泡；

（2）将步骤（1）所得药材及其浸泡液煎煮，然后过滤，收集滤液，得煎煮液；

（3）将步骤（2）所得煎煮液中加入体积分数为95%的乙醇，放置于4℃冰箱中静止过夜，然后过滤，收集滤液，浓缩，得中药组合物的提取物。

本发明目的之四在于提供中药组合物的提取物的制剂，该制剂使用方便，适口性强，能够增强中药组合物的药效，技术方案为：

含所述提取物的制剂。

优选的，所述制剂为颗粒剂或片剂。

更优选的，所述颗粒制剂或片剂按重量份计由以下组分组成：中药组合物的提取物90-150份、填充剂400-1800份、固体分散载体40-500份、湿润剂100-300份、粘合剂100-500份、崩解剂200-500份和香味剂20-70份。

更优选的，所述固体分散剂载体为聚乙二醇、聚维酮、表面活性剂、有机酸、纤维素、聚丙烯酸和树脂中的一种或多种混合；所述的填充剂为淀粉、糊精、乳糖、微晶纤维素和磷酸氢钙中一种或多种混合；所述的湿润剂为水或/和乙醇；所述的粘合剂为淀粉或/和纤维素；所述的香味剂为桂皮油、橙皮油和青草香精中的一种或多种混合。本发明目的之五在于提供中药组合物的应用，技术方案为：

所述中药组合物在制备预防或治疗A型魏氏梭菌病药物的应用。

本发明的有益效果在于：本发明公开了中药组合物，对实验动物给药后，能够增加给药动物的T淋巴细胞和B淋巴细胞的转化率，增加脾脏指数和胸腺指数，提高血液中巨噬细胞的吞噬能力和血液中白细胞、粒细胞和淋巴细胞的含量；因此能够增强给药动物的免疫功能，能够预防和治疗A型魏氏梭菌；本发明还公开了中药组所得提取物中，含有中药组合物中的全部有效成分，为了方便给药，将中药提取物进一步制备成制剂，并在制剂中添加填充剂、粘合剂、崩解剂、香味剂等辅料，使提取物能够处于高度分散状态，增加中药复方的生物利用率，同时制成制剂后还能增加适口性和提高药效，因此可以用于预防和治疗A型魏氏梭菌，具有广泛的应用价值。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

实施例1

防治兔A型魏氏梭菌病的中药组合物，按重量份计，由表1所述组分组成：

表1防治兔A型魏氏梭菌病的中药组合物配方

配方	处方1	处方2	处方3	处方4	处方5	处方6	处方7	处方8
									十大功劳（份）	20	25	35	40	45	50	10	80
山药（份）	5	15	25	30	35	40	5	50
									大黄（份）	4	6	8	12	14	16	3	30
车前子（份）	4	6	8	12	14	16	3	30
									地榆（份）	4	6	8	12	14	16	3	30
铁苋菜（份）	6	15	25	30	35	40	5	45
									白头翁（份）	6	15	25	30	35	40	5	50

实施例2

制备中药组合物的提取物，具体步骤为：

（1）按份取各药材，混合，碎粉，加入相当于药材重量10倍的水，浸泡1小时；

（2）将步骤（1）所得药材煎煮2次，第一次煎煮2小时，第二次煎煮1.5小时，然后用纱布过滤，收集滤液得煎煮液；

（3）将步骤（2）所得煎煮液中加入与煎煮液等体积的体积分数为95%的乙醇，放置于4℃冰箱中静止过夜，然后用滤纸过滤，收集滤液，并将滤液用旋转蒸发器抽气加压浓缩，至生药浓度为1g/ml（生药浓度指药材质量比浓缩液体积），得中药组合物提取物。

然后将药液在115℃、20min高压锅中灭菌，冷却后放在4℃冰箱中，避光保存。

实施例3

将实施例2制备的中药组合物的提取物用于制备防治兔A型魏氏梭菌病的中药组合物的颗粒剂：

按重量份计，由表2所述组份制成：

表2中药组合物的颗粒剂的组份

配方	配方1	配方2	配方3
				提取物（份）	47	88	134
固体分散剂（份）	聚乙二醇400	纤维素800	表面活性剂1000
				粘合剂（份）	淀粉1200	淀粉1600	纤维素1800
填充剂（份）	磷酸氢钙300	蔗糖500	乳糖600
				湿润剂（份）	乙醇140	乙醇180	蒸馏水200
香味剂（份）	青草香精40	橙皮油60	桂皮油75

中药组合物颗粒剂的制备方法，包括如下制备步骤：

（1）按配方称取固体分散剂，置90℃水浴40分钟，至熔融完全，得固体分散熔融液；

（2）向步骤（1）所得固体分散熔融液中加入配方量的中药组合物提取液，迅速搅拌至混合均匀；

（3）将步骤（2）所得混合均匀的液体分散体置-20℃冰箱中，得冰冻分散体；

（4）将步骤（3）所得冰冻分散体，置60℃真空干燥箱中，干燥6-7小时，得干燥的分散体；

（5）将步骤（4）所得干燥的分散体用玻璃棒捣成粉状，然后过80目筛，干燥，备用；

（6）取配方量2/5的粘合剂，加入相当于粘合剂重量5倍的水，制成粘合剂浆；

（7）将余下粘合剂和配方量的填充剂加入步骤（6）所得淀粉浆中，搅拌均匀，转到制粒机上制粒，然后置烘箱中，60℃烘8小时；

（8）将烘干的粒子置整粒机内制成大小均匀的颗粒，然后置搅拌机内，喷入处方量的香味剂和湿润剂混合物，然后按等量递加法加入步骤（5）所得干燥的分散体，搅拌混合，即得中药组合物的颗粒剂。

制备防治兔A型魏氏梭菌病的中药组合物的片剂：将上述中药组合物的颗粒剂加入压片机，压制成片重为0.5g/片的片子，即得中药组合物的片剂。

本实施例中使用的粘合剂具有崩解剂的功效，能够使有效成分迅速溶解，并被组织吸收，从而发挥治疗作用。固体分散剂除了可以为聚乙二醇、纤维素和表面活性剂外，还可以根据常规药剂学的方法使用有机酸、聚维酮、聚丙烯酸或树脂，也可以是其组合。另外填充剂除了可以为磷酸氢钙、蔗糖和乳糖，也可以为糊精或微晶纤维素，还可以是常用填充剂的组合物。

实施例4

中药组合物的提取物对A型魏氏梭菌的最低抑菌浓度（MIC）。实验药物为将实施例1中的各处方按实施例2制备的中药组合物的提取物。

取1mL OD值为0.1的A型魏氏梭菌的菌液分别装入9只试管中，然后排成一列，分别编上1-9的管号，在第1管内加入1mL处方3中药组合物的提取物，混匀后吸取1mL到第二管，混匀，然后再取1mL到第三管，依次类推到第8管，第9管加入1mL无菌水，做空白对照，具体方法见下表3。

表3.二倍稀释法测中药组合物的提取物最低抑菌浓度

结果判定：以能抑制细菌生长的中药组合物提取物的最高稀释度作为中药组合物提取物的最低以菌浓度

牛津杯法测中药组合物的提取物最低抑菌浓度：配置含质量分数为10%的琼脂的固体培养基，培养基成分为牛肉膏10g/L、蛋白胨10g/L和NaCl5g/L，培养基中还含有体积分数5%的健康兔血液。培养基使用前在37℃的生化培养箱中，培养24小时，观察培养皿是否有污染。取无污染的培养基平均分成9组，每组至少3个重复，在培养基表面用棉签将OD值为0.1的A型魏氏梭菌菌液均匀的涂抹在培养基的表面，在培养基表面直接垂直放上牛津杯（牛津杯为内径6mm、外径8mm、高10mm的圆形小管），轻轻加压，使其与培养基无空隙接触，在牛津杯中分别加入试管1-8号的药物和试管9号的无菌水，牛津杯一般可以装240微升。加满后置37℃培养16-18小时，重复此实验4次，根据抑菌圈计算中药组合物提取物的最低抑菌浓度，结果如表4所示。

表4.中药组合物的提取物最低抑菌浓度

由表4可知，中药组合物提取物有抑制A型魏氏梭菌的功效，最低抑菌浓度为0.1093g/mL。用其他处方按上述方法测定中药组合物的最低抑菌浓度，结果表明：处方1的最低抑菌浓度为0.1252g/mL，处方2的最低抑菌浓度为0.1184g/mL，处方4的最低抑菌浓度为0.1175g/mL，处方5的最低抑菌浓度为0.1259，处方6的最低抑菌浓度为0.1233g/mL，处方7的最低抑菌浓度为0.1574g/mL，处方8的抑菌浓度为0.1463g/mL。

实施例5

中药组合物对小鼠A型魏氏梭菌外毒素免疫功能的影响：选取健康小鼠66只，体重在20±2g，随机分为5组，分别为空白对照组，阴性对照组、给药高剂量组、给药中剂量组，给药低剂量组，每组各11只小鼠。对阴性对照组、给药高剂量组、给药中剂量组和给药低剂量组感染A型魏氏梭菌外毒素，每只小鼠注射0.26mlA型魏氏梭菌外毒素，连续注射3天，获得A型魏氏梭菌外毒素感染模型。造模成功后，给药高剂量组、给药中剂量组和给药低剂量组分别灌胃处方3中药组合物的提取物，每只灌胃至生药浓度为0.5g/ml、0.25g/ml和0.125g/ml的药液0.4mL，连续灌胃15天，每天1次；空白对照组和阴性对照组灌胃等量的蒸馏水。在第16天取样，各组取5只小鼠眼眶采血，用于碳粒轮廓血清指数测定和小鼠血象的测定；剩余小鼠用于测定脾脏指数、胸腺指数及T、B淋巴细胞转化实验。

（1）测定小鼠脾脏指数和胸腺指数的影响

给药15天后，将供试小鼠称重，断颈处死，取脾脏和胸腺用预冷生理盐水漂洗，用滤纸吸干水分，称重（精确到0.0001）根据下列公式计算：脾脏指数=脾脏质量（mg）/体质量；胸腺指数=胸腺质量（mg）/体质量，计算结果如表5所示：

表5、中药组合物对小鼠脾脏指数和胸腺指数的影响

注：△示与空白对照组比较P<0.05，呈差异显著；△△示与空白对照组比较P<0.01，呈差异极显著；＊示与模型组比较P<0.05，呈差异显著；＊＊示与模型组比较P<0.01，呈差异极显著

由表5可知，本发明的中药组合物连续灌胃15天后，小鼠没有出现死亡，也没有任何的异常反应，表明该剂量组对小鼠没有任何的毒副作用。并且阴性对照组小鼠脾脏指数和胸腺指数降低，与空白对照组比较差异显著（P<0.05），给药低剂量组、给药中剂量组能够提高小鼠的脾脏指数和胸腺指数，但差异不明著（P>0.05）；给药高剂量组能促进小鼠胸腺指数和促进小鼠脾脏指数，并且差异显著（P<0.05）。因此，使用浓度为0.5g/mL的中药组合物的提取物，每天灌胃0.4ml，具有促进小鼠胸腺指数和促进小鼠脾脏指数的效果。

（2）小鼠淋巴细胞增值试验

将上述取的脾脏，用PBS缓冲液冲洗2遍。用无菌的研磨器研磨后取其浆液，在转速为1000转/分钟、离心5分钟，弃上清；加入pH为7.2的Tris-NH₄Cl5mL，轻轻吹打，使红细胞完全破裂，在转速为1000转/分钟，离心5分钟，弃上清；用PBS缓冲液冲洗1次，再以1000转/分钟，离心5分钟，弃上清；细胞浮于1mL的RPMI-1640完全培养液中（含10％FBS，20mmol/L谷氨酰胺，100U/mL青霉素和100ug/L链霉素），用台酚蓝染色计数活细胞数在95％以上，然后调整细胞浓度在5×10⁶个/ml。将细胞悬浮接种在96孔培养板。每孔加入200μL脾淋巴细胞，刀豆蛋白15μL，8复孔，后置37℃，体积分数为5％的CO₂孵箱中培养72小时，培养结束前4小时吸取培养液，补充不含胎牛血清的RPMI-1604培养液，每孔补充200μL，同时每孔加入浓度为5mg/mL的氯丁胶新型交联剂(MTT)15μL，后继续培养4小时后，弃上清，每孔再加入200μL的二甲基亚枫，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解，用酶标仪在波长630nm测定光密值（OD），结果如表6所示。

表6、中药组合物的提取物对小鼠T、B淋巴细胞增值的影响

注：^△示与空白对照组比较P<0.05，呈差异显著；^△△示与空白对照组比较P<0.01，呈差异极显著；^*示与模型组比较P<0.05，呈差异显著；^**示与模型组比较P<0.01，呈差异极显著

由表6可知，中药组合物的提取物可促进小鼠T淋巴细胞转化率，随着中药组合物的提取物浓度升高，淋巴细胞的增殖显示一定的上升的趋势，但是给药低剂量组和给药高剂量组与阴性对照组比较的增高趋势不显著（P>0.05），而给药高剂量组与阴性对照组比较差异显著（P<0.05）。同时中药组合物提取物还能促进B淋巴细胞的转化率，随着中药组合物提取物浓度的升高B淋巴细胞的转化率增加，但与阴性对照组相比差异并不显著（P>0.05）。

（3）中药组合物的提取物对给药小鼠巨噬细胞吞噬能力的测定

将处理后的实验小鼠，腹腔注射质量分数为5％的可溶性淀粉0.5mL，3天后，小鼠脱颈椎处死，用体积分数为75％酒精浸泡后，用注射器腹腔注射10ml无菌预冷的PBS缓冲液，轻柔腹部3分钟后吸取腹腔液于离心管中，在1000转/分钟条件下，离心8分钟，弃去上清，沉淀用质量分数为10％的FBS-RPMI1640培养液洗涤2次，重悬、调整细胞浓度至2×10⁶个/ml。将细胞悬液按每孔200μL接种到96孔板，置于37℃、体积分数为5％的CO₂的培养箱中贴壁3小时后弃上清，用PBS冲洗3次，得纯化的巨噬细胞。再置于37℃，体积分数为5％的CO₂的培养箱中，培养24小时，弃上清，每孔加质量分数为0.1％的中性红生理盐水200μL，继续培养4小时，取出，弃中性红，用37℃预温的PBS清洗96孔板3次。弃上清，加入细胞裂解液200μL，静止过夜，在酶标仪上测定490nm的吸光度，结果如表7所示。

表7、中药组合物提取物对给药小鼠碳粒血清的影响

注：^△示与空白对照组比较P<0.05，呈差异显著；^△△示与空白对照组比较P<0.01，呈差异极显著；^＊示与模型组比较P<0.05，呈差异显著；^＊＊示与模型组比较P<0.01，呈差异极显著

由表7可知，连续灌胃15天后，随着中药组合物的提取物浓度升高巨噬细胞的吞噬能力加强，其中给药高剂量组与阴性对照组比较差异显著（P<0.05），而给药中剂量组和给药低剂量组与阴性对照组差异不显著（P>0.05）。

实施例6、中药组合物提取物对小鼠白细胞、淋巴细胞和粒细胞的影响

将处理后的实验小鼠眼球采血后，放入加有EDTA抗凝剂的容器中。在24小时内用血象分析仪检测小鼠血液中红细胞、白细胞总数、粒细胞总数及血小板的含量，结果如表8所示。

表8.中药组合物对小鼠白细胞、淋巴细胞和粒细胞的影响（个/ml）

注：^△示与空白对照组比较P<0.05，呈差异显著；^△△示与空白对照组比较P<0.01，呈差异极显著；^＊示与模型组比较P<0.05，呈差异显著；^＊＊示与模型组比较P<0.01，呈差异极显著

由表8可知，阴性对照组与空白组比较，阴性对照的白细胞总数呈明显的上升趋势，其中给药高剂量组与阴性对照组相比差异显著（P<0.05），阴性对照组淋巴细胞总数和粒细胞总数的数量与空白对照组相比差异极显著（P<0.01），其中给药中剂量组的淋巴细胞总数与阴性对照组比较差异极显著（P<0.01），给中剂量组的粒细胞总数与阴性对照组比较差异显著（P<0.01）。

实施例7、中药组合物提取物对家兔胃肠功能的影响

中药组合物对家兔胃肠功能的功能的影响：选取健康家兔16只，体重1.5kg±0.2kg，随机分为4组，分别为空白对照组，给药高剂量组、给药中剂量组，给药低剂量组，每组各4只家兔。对给药高剂量组、给药中剂量组和给药低剂量组饲喂中药组合物颗粒剂，给药高剂量组、给药中剂量组和给药低剂量组分别饲喂生药浓度为0.5g/ml、0.25g/ml和0.125g/ml的中药组合物的提取液2mL，连续灌胃7天，每天1次；第8天心脏采血放入加有草酸抗凝剂的容器中。

（1）测定家兔胆碱酯酶活性

将上述加有抗凝剂的血液按表9方法加样，使用的溶液按以下方法配制：

盐酸：ρ₂₀＝1.19g/mL；盐酸溶液：盐酸：水体积比为1:2混合；碱性羟胺溶液：使用前将139g/L的酸羟胺溶液和浓度为140g/L的氢氧化钠溶液等体积混合；磷酸盐缓冲液(pH＝7.20)：准确称取8.36g的十二水磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)和1.36g的磷酸二氢钾(KH₂PO₄)，用水溶解并稀释到500mL，保存在4℃冰箱内。三氯化铁溶液：称取10g六水三氯化铁(FeCl₃·6H₂O)，加0.84mL盐酸，然后加水定容至100mL，贮存于棕色瓶中。氯化胆碱酯酶标准液：精确称取胆碱酯酶1.2716g，用磷酸盐缓冲液(pH＝4.5)溶解，并稀释到100mL，此溶液1mL相当于70μmol胆碱酯酶，为贮备液。使用前，取此溶液用磷酸盐缓冲液(pH=4.5)稀释10倍，此溶液1mL相当于7μmol胆碱酯酶，为胆碱酯酶工作液。

表9、测定家兔胆碱酯酶活性

加样完成后，置于37℃水浴中反应30分钟，每管分别加入4.0ml的碱性羟胺溶液，充分震荡2分钟；再加入2.0ml盐酸溶液，充分振荡2分钟；然后加入2ml三氯化铁溶液，充分振荡，用滤纸滤过后，在波长520nm处测吸光度，以未加入全血的试剂为参比，然后按下式计算胆碱酯酶活性：

$X=\frac{C+B-A}{C}\&times;7$

式中：X—水解胆碱酯酶的浓度，μmol(0.02mL·37℃·30min)；

A—以试剂空白为参比的在波长520nm处样品管的吸光度值；

B—以试剂空白为参比的在波长520nm处对照管的吸光度值；

C—以试剂空白为参比的在波长520nm处标准管的吸光度值。

计算结果如表10所示。

（2）D-木糖含量的测定

取三支试管，分别为测定管、标准管和空白管，向测定管中加入家兔血清0.5mL，标准管中加入标准液0.5ml，空白管中加入双蒸馏水0.5mL；然后各管加入0.05mL显色剂，混匀，在100℃水浴中水浴10分钟，然后用流水冷却至25℃，在波长为550nm条件下测定吸光度A（显色剂：D-木糖0.5g加入100mL冰乙酸及6mL浓盐酸；D一木糖标准液（2.0mmol/L））：称取30.1mg木糖用蒸馏水溶解并稀释至100ml，以空白管调零，分别测定测定管和标准管的吸光度A，并用如下公式计算：

D-木糖浓度(mmol／L)=Au÷As×2，其中Au为测定管的吸光值，As为标准管的测定值，计算结果如表10所示。

表10、中药复方对家兔胃肠功能的影响

注：^△示与空白对照组比较P<0.05，呈差异显著；^△△示与空白对照组比较P<0.01。

由表10可知，连续灌胃7天后，给药中剂量组的胆碱酯酶的含量明显高于空白对照组，差异极显著（P<0.01），给药低剂量组与空白组相比胆碱酯酶含量增加，差异显著（P<0.05），因此本发明公开的中药组合物提取物。但是随着药物浓度的增加，D-木糖含量逐渐的减少，中剂量组效果最佳，与空白对照组相比差异极显著（P<0.01）。

按照上述方法对处方1、处方2、处方4、处方5、处方6、处方7和处方8进行测定，具有与处方3同样的效果。

本发明中将中药组合物制成制剂后，能够方便给药，增加适口性，并能提高中药的药效。由结果可知，本发明制得的中药组合物提取物能够提高A型魏氏梭菌外毒素所致的小鼠免疫功能，减少死亡率，还能增加小鼠T、B淋巴细胞增殖；增加小鼠脾脏和胸腺指数；增加小鼠血液中巨噬细胞的吞噬能力；显著的提高小鼠血液中白细胞、粒细胞和红细胞的含量，并且对家兔的肠胃功能影响小。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims (10)

1.预防和治疗A型魏氏梭菌病的中药组合物，其特征在于：按重量份计由以下组分组成，十大功劳10-80份、白头翁5-50份、山药3-50份、车前子3-30份、地榆3-30份、大黄3-30份和铁苋菜5-45份。

2.根据权利要求1所述的预防和治疗A型魏氏梭菌病的中药组合物，其特征在于：按重量份计由以下组分组成：十大功劳20-50份、白头翁6-40份、山药5-40份、车前子4-16份、地榆4-16份、大黄4-16份和铁苋菜6-40份。

3.根据权利要求2所述的预防和治疗A型魏氏梭菌病的中药组合物，其特征在于：按重量份计由以下组分组成：十大功劳35份、白头翁25份、山药8份、车前子8份、地榆8份、大黄25份和铁苋菜25份。

4.权利要求1-3任一项所述中药组合物的提取物。

5.权利要求4所述提取物的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)按份取各药材，混合，碎粉，加入水，浸泡；

(2)将步骤(1)所得药材及其浸泡液煎煮，然后过滤，收集滤液，得煎煮液；

(3)将步骤(2)所得煎煮液中加入体积分数为95％的乙醇，放置于4℃冰箱中静止过夜，然后过滤，收集滤液，浓缩，得中药组合物的提取物。

6.含权利要求4所述提取物的制剂。

7.根据权利要求6所述的制剂，其特征在于：所述制剂为颗粒剂或片剂。

8.根据权利要求7所述制剂，其特征在于，所述颗粒制剂或片剂按重量份计由以下组分组成：中药组合物的提取物47-134份、填充剂300-600份、固体分散载体400-1000份、湿润剂140-200份、粘合剂1200-1800和香味剂40-75份。

9.根据权利要求8所述的制剂，其特征在于：所述固体分散剂载体为聚乙二醇、聚维酮、表面活性剂、有机酸、纤维素、聚丙烯酸和树脂中的一种或多种混合；所述的填充剂为淀粉、糊精、乳糖、微晶纤维素和磷酸氢钙中一种或多种混合；所述的湿润剂为水或/和乙醇；所述的粘合剂为淀粉或/和纤维素；所述的香味剂为桂皮油、橙皮油和青草香精中的一种或多种混合。

10.权利要求1所述中药组合物在制备预防或治疗A型魏氏梭菌病药物的应用。