CN102604862B - 一种酵母培养物在促进乳酸利用菌增殖中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种酵母培养物在促进乳酸利用菌增殖中的应用。所述酵母培养物是按照包括如下步骤的方法制备得到的：将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No.2.1882)进行液体发酵后，收集发酵液，除去所述发酵液中的所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No.2.1882)细胞得到的无菌液体即为所述酵母培养物。实验证明，使用所述酵母培养物分别培养乳酸利用菌反刍兽月形单胞菌(Selenomonas ruminantium subsp.ruminantium Bryant ATCC NO.12561)和埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii(Gutierrez et al.)Rogosa ATCC NO.17752)可使其生物量分别提高2.6-3.5倍和2.3-3.8倍。本发明为提高反刍动物生产力水平、优化饲料组成提供了一个重要途径。

Description

一种酵母培养物在促进乳酸利用菌增殖中的应用
技术领域
本发明涉及一种酵母培养物在促进乳酸利用菌增殖中的应用。
背景技术
通过调控瘤胃微生物菌群结构来加强反刍动物对粗饲料的利用近年来成为研究的热点。目前存在许多方法用以调控瘤胃微生物菌群结构，如应用离子载体和抗生素。但对于饲料工业中应用抗生素所引起的问题和寻求安全饲料的广泛关注，促使研究者致力于发展一种新型非抗生素或“天然”的饲料添加剂。微生物饲料添加剂，即直接饲喂微生物(DFM)，完全满足发展需求，因此被推到了历史前台。DFM包括细菌、酵母等，许多研究证明DFM使用效果良好，尤其是酵母培养物。
酵母培养物(Yeast culture，YC)是指由酵母菌在特定工艺条件下经充分发酵后所形成的微生态制品，主要包括酵母细胞代谢产物、经发酵后变异的培养基以及少量已无活性的酵母细胞。酵母培养物的复杂成分主要包括酵母细胞内的营养物质和酵母细胞的发酵代谢产物。作为集营养、保健于一体的新型饲料添加剂，酵母培养物通过调控瘤胃微生物区系有效提高反刍动物对饲料的利用率，这也是近年来反刍动物学和营养学研究的热点。酵母培养物中含有氨基酸、葡萄糖、维生素和有机酸(乳酸、苹果酸、甲酸、琥珀酸等)等，而某些瘤胃微生物如乳酸利用菌的生长代谢也需要这些物质。所以在一定程度上可以通过乳酸利用菌的生长情况判断酵母培养物对反刍动物的营养情况。
酵母培养物的质量又受到菌种、发酵生产工艺以及检测手段等因素的影响。酵母菌在不同的培养环境下，如：不同的温度、湿度或酸碱环境尤其是底物成分，会产生不同的发酵产物，而这其中又包含大量的未知生长因子。生产酵母培养物时所使用的培养基和发酵工艺控制参数对其终端产品中代谢产物的组成、浓度及其生物利用率的稳定性有着至关重要的影响。即便在使用相同酵母菌种的情况下，不同培养基组成或不同的发酵生产控制工艺会导致酵母培养物产品中代谢产物组成和浓度出现明显的差异。
发明内容
本发明的目的是提供一种酵母培养物在制备促乳酸利用菌增殖制剂中的用途。
所述酵母培养物是按照包括如下步骤的方法制备得到的：将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No.2.1882)进行液体发酵后，收集发酵液，除去所述发酵液中的所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No.2.1882)细胞得到的无菌液体即为所述酵母培养物。
所述液体发酵在如下条件下进行：20-40℃、100-200转/分钟振荡培养10-30小时后再静置培养10-60小时；该振荡培养是在有氧条件下进行的，该静置培养是在厌氧条件下进行的。
所述液体发酵所使用的发酵培养基的溶剂为水，溶质由如下1)-3)的物质组成：
1)碳源，所述碳源为如下A)-C)中的任一种：
A)葡萄糖、蔗糖和糖蜜；
B)葡萄糖、蔗糖和糖蜜中的任两种；
C)葡萄糖、蔗糖和糖蜜中的任一种；
2)氮源，所述氮源为如下D)-F)中的任一种：
D)酵母膏、蛋白胨和硫酸铵；
E)酵母膏、蛋白胨和硫酸铵中的任两种；
F)酵母膏、蛋白胨和硫酸铵中的任一种；
3)无机盐，所述无机盐为KH2PO4、MgSO4、MnSO4、CaCl2、CuSO4、ZnSO4和FeSO4；
所述碳源在所述发酵培养基中的总浓度为30-300g/L；所述碳源具体可由10g/L-100g/L葡萄糖、10g/L-100g/L蔗糖和10g/L-100g/L糖蜜组成；
所述氮源在所述发酵培养基中的总浓度为25-640g/L；所述氮源具体可由10g/L-300g/L酵母膏、10g/L-300g/L蛋白胨和5g/L-40g/L硫酸铵组成；
所述无机盐中的各组分在所述发酵培养基中的浓度分别为：KH2PO4 0.1g/L-10.0g/L、MgSO4 0.0488g/L-4.88g/L、MnSO4 0.089g/L-3.56g/L、FeSO4 0.068g/L-2.714g/L、CaCl2 0.1g/L-4.0g/L、CuSO4 0.0639g/L-2.556g/L、ZnSO4 0.0561g/L-2.244g/L；
所述发酵培养基的pH值为4.0-6.5。
所述液体发酵按照包括如下步骤的方法进行：将所述酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae CGMCC No.2.1882)接种于种子培养基中，20-40℃、100-200转/分钟振荡培养18-40小时，获得种子液；再将所述种子液按照(1-30)∶100的体积比接种于所述发酵培养基中进行所述液体发酵；所述种子液中所述酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae CGMCC No.2.1882)的浓度为106-108cfu/L。
所述种子培养基的溶剂为水，溶质为葡萄糖、酵母粉、蛋白胨和MnSO4，在所述种子培养基中各溶质的浓度分别为：葡萄糖10g/L-40g/L、酵母粉5.0g/L-40g/L、蛋白胨5.0g/L-40g/L、MnSO40.089g/L-3.56g/L。
本发明还提供一种乳酸利用菌的培养方法，该方法包括将所述乳酸利用菌接种于含有所述酵母培养物的培养基中进行培养的步骤。
在上述应用或方法中，所述乳酸利用菌为反刍兽月形单胞菌(Selenomonasruminantium subsp.ruminantium Bryant)或埃氏巨型球菌(Megasphaeraelsdenii(Gutierrez et al.)Rogosa)。
在上述应用或方法中，所述反刍兽月形单胞菌(Selenomonas ruminantium subsp.ruminantium Bryant)具体可为反刍兽月形单胞菌(Selenomonas ruminantium subsp.ruminantium Bryant ATCC NO.12561)；所述埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii(Gutierrez et al.)Rogosa)具体可为埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii(Gutierrez et al.)Rogosa ATCC NO.17752)。
实验证明，使用上述工艺制备得到的酵母培养物分别培养乳酸利用菌反刍兽月形单胞菌(Selenomonas ruminantium subsp.ruminantium Bryant ATCC NO.12561)和埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii(Gutierrez et al.)Rogosa ATCC NO.17752)可使其生物量分别提高2.6-3.5倍和2.4-3.8倍。本发明为提高反刍动物生产力水平、优化饲料组成提供了一个重要途径。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例所用的培养基、菌株的详细信息如下：
CDC培养基：青岛海博生物技术有限公司。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)：CGMCC编号为2.1882。
反刍兽月形单胞菌(Selenomonas ruminantium subsp.ruminantium Bryant)：ATCC编号为12561。
埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii(Gutierrez et al.)Rogosa)：ATCC编号为17752。
实施例1、酵母培养物及其制备方法与应用
一、酵母培养物的制备
1、培养基的配制
液体种子培养基：称取10g葡萄糖、5g酵母粉、5g蛋白胨和0.1g MnSO4·H2O，用1L蒸馏水加热溶解后，121℃、0.1Mpa高温灭菌15min，备用。
液体发酵培养基：称取10g葡萄糖，10g蔗糖，10g糖蜜，10g蛋白胨，10g酵母膏，5g硫酸铵，0.1g KH2PO4，0.1g MgSO4·7H2O，0.1g MnSO4·H2O，0.1g CaCl2，0.1gCuSO4·5H2O，0.1g ZnSO4·7H2O和0.1g FeSO4·4H2O，蒸馏水溶解后，用0.1mol/L HCl溶液调节pH值至4.0，定容至1L，121℃、0.1Mpa高温灭菌15min，备用。
2、种子液的获得
将冻干保藏的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No.2.1882)活化三代后接入上述液体种子培养基中，20℃、100转/分钟振摇培养18h，获得种子液，经检测，该种子液经15倍稀释后的OD600值为0.491，酿酒酵母的活细胞数为1.1×109cfu/L。
3、发酵液的获得
将步骤2获得的种子液按1∶100的体积比接种于液体发酵培养基中，20℃、100转/分钟条件下发酵培养10h后转入20℃恒温箱中静置培养10h，获得发酵液。
4、酵母培养物的获得
将步骤3获得的发酵液于4000转/分钟条件下离心5min除去菌体，将获得的上清液用细菌过滤器(0.22μm)过滤，经平板检验无菌长出，得到的无细胞滤液即为无菌酵母培养物。
二、利用酵母培养物对乳酸利用菌进行增殖培养
将冻干保藏的两种乳酸利用菌反刍兽月形单胞菌和埃氏巨型球菌分别进行如下步骤1-4的实验：
1、活化后分别接入CDC培养基，20℃严格厌氧培养20h，获得菌悬液；
2、制备如下培养基：乳酸钠15ml、硫酸铵0.6g、NaCl 0.5g、KH2PO4 0.1g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO4·H2O 0.2g/L、CaCl2 2g/L、CuSO4·5H2O 2g/L、ZnSO4·7H2O1g/L、FeSO4·4H2O 0.3g/L，pH值为4.5。
3、设置如下两组处理，每种处理3次重复：
处理1(实验组)：取5ml步骤2制备的培养基、0.025ml步骤一制备的酵母培养物和0.005ml的乳酸利用菌菌悬液(约1×107cfu/ml)在10ml无菌离心管中混合后密封，37℃恒温培养24h，得到乳酸利用菌培养液。
处理2(对照组)：取5ml步骤2制备的培养基、0.025ml无菌水和0.005ml的乳酸利用菌菌悬液(约1×107cfu/ml)在10ml无菌离心管中混合后密封，37℃恒温培养24h，得到乳酸利用菌培养液。
4、培养液中乳酸利用菌的生物量测定
以乳酸利用菌培养基(即步骤2制备的培养基)为调零空白对照，将步骤3培养的乳酸利用菌培养液直接用TU-1901紫外可见分光光度计测定其在600nm波长条件下的吸光值即OD600值，结果如表1所示。
表1.培养液中乳酸利用菌生物量的测定结果
  实验组的OD600结果   对照组的OD600结果
  反刍兽月单胞菌   1.992±0.01   0.498±0.02
  埃氏巨型球菌   1.843±0.03   0.483±0.03
与对照组相比，实验组获得的培养液中反刍兽月形单胞菌生物量提高3.0倍，埃氏巨型球菌生物量提高2.82倍。
实施例2、酵母培养物及其制备方法与应用
一、酵母培养物的制备
1、培养基的配制
液体种子培养基：称取40g葡萄糖、40g酵母粉、40g蛋白胨和4.0g MnSO4·H2O，用1L蒸馏水加热溶解后，121℃、0.1Mpa高温灭菌15min，备用。
液体发酵培养基：100g葡萄糖，100g蔗糖，100g糖蜜，300g蛋白胨，300g酵母膏，40g硫酸铵，10g KH2PO4，10g MgSO4·7H2O，4.0g MnSO4·H2O，4.0g CaCl2，4.0gCuSO4·5H2O，4.0g ZnSO4·7H2O和4.0g FeSO4·4H2O，蒸馏水溶解后，用0.1mol/L NaOH溶液调节pH值至6.5，定容至1L，121℃、0.1Mpa高温灭菌15min，备用。
2、种子液的获得
将冻干保藏的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No.2.1882)活化三代后接入上述液体种子培养基中，40℃、200转/分钟振摇培养40h，获得种子液，经检测，该种子液经10倍稀释后的OD600值为0.591，酿酒酵母的活细胞数为8.9×108cfu/L
3、发酵液的获得
将步骤2获得的种子液按30∶100的体积比接种于液体发酵培养基中，40℃、200转/分钟条件下发酵培养30h后转入40℃恒温箱中静置培养60h，获得发酵液。
4、酵母培养物的获得
将步骤3获得的发酵液于4000转/分钟条件下离心5min除去菌体，将获得的上清液用细菌过滤器(0.22μm)过滤，经平板检验无菌长出，得到的无细胞滤液即为无菌酵母培养物。
二、利用酵母培养物对乳酸利用菌进行体外增殖培养
方法同实施例1中的步骤二，结果如表2所示。
表2.培养液中乳酸利用菌生物量的测定结果
  实验组的OD600结果   对照组的OD600结果
  反刍兽月单胞菌   1.724±0.04   0.479±0.01
  埃氏巨型球菌   1.581±0.03   0.462±0.02
与对照组相比，实验组获得的培养液中反刍兽月形单胞菌生物量提高2.6倍，埃氏巨型球菌生物量提高2.4倍。
实施例3、酵母培养物及其制备方法与应用
一、酵母培养物的制备
1、培养基的配制
液体种子培养基：20g葡萄糖、20g酵母粉、20g蛋白胨和2.0g MnSO4·H2O。
液体发酵培养基：50g葡萄糖，50g蔗糖，50g糖蜜，50g蛋白胨，50g酵母膏，20g硫酸铵，5.0g KH2PO4，5.0g MgSO4·7H2O，2.0g MnSO4·H2O，2.0g CaCl2，2.0gCuSO4·5H2O，2.0g ZnSO4·7H2O和2.0g FeSO4·4H2O，蒸馏水溶解后，用0.1mol/L NaOH溶液调节pH值至5.5，定容至1L，121℃、0.1Mpa高温灭菌15min，备用。
2、种子液的获得
将冻干保藏的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No.2.1882)活化三代后接入上述液体种子培养基中，30℃、150转/分钟振摇培养20h，获得种子液，经检测，该种子液经13倍稀释后的OD600值为0.572，酿酒酵母的活细胞数为1.1×109cfu/L
3、发酵液的获得
将步骤2获得的种子液按15∶100的体积比接种于液体发酵培养基中，30℃、150转/分钟条件下发酵培养24h后转入30℃恒温箱中静置培养40h，获得发酵液。
4、酵母培养物的获得
将步骤3获得的发酵液于4000转/分钟条件下离心5min除去菌体，将获得的上清液用细菌过滤器(0.22μm)过滤，经平板检验无菌长出，得到的无细胞滤液即为无菌酵母培养物。
二、利用酵母培养物对乳酸利用菌进行体外增殖培养
方法同实施例1中的步骤二，结果如表3所示。
表3.培养液中乳酸利用菌生物量的测定结果
  实验组的OD600结果   对照组的OD600结果
  反刍兽月单胞菌   2.210±0.04   0.491±0.03
  埃氏巨型球菌   2.455±0.05   0.512±0.02
与对照组相比，实验组获得的培养液中反刍兽月形单胞菌生物量提高3.5倍，埃氏巨型球菌生物量提高3.8倍。

Claims (4)

1.一种酵母培养物在制备促乳酸利用菌增殖制剂中的应用；
所述酵母培养物是按照包括如下步骤的方法制备得到的：将保藏号为CGMCC No.2.1882的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)进行液体发酵后，收集发酵液，除去所述发酵液中的所述保藏号为CGMCC No.2.1882的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)细胞得到的无菌液体即为所述酵母培养物；
所述液体发酵在如下条件下进行：20—40℃、100—200转/分钟振荡培养10—30小时后再静置培养10—60小时；
所述液体发酵所使用的发酵培养基的溶剂为水，溶质由碳源、氮源和无机盐组成；
所述碳源由10g/L—100g/L葡萄糖、10g/L—100g/L蔗糖和10g/L—100g/L糖蜜组成；所述碳源在所述发酵培养基中的总浓度为30-300g/L；
所述氮源由10g/L—300g/L酵母膏、10g/L—300g/L蛋白胨和5g/L—40g/L硫酸铵组成；所述氮源在所述发酵培养基中的总浓度为25-640g/L；
所述无机盐为KH2PO4、MgSO4、MnSO4、CaCl2、CuSO4、ZnSO4和FeSO4；
所述无机盐中的各组分在所述发酵培养基中的浓度分别为：KH2PO40.1g/L—10.0g/L、MgSO40.0488g/L—4.88g/L、MnSO40.089g/L—3.56g/L、FeSO40.068g/L—2.714g/L、CaCl20.1g/L—4.0g/L、CuSO40.0639g/L—2.556g/L、ZnSO40.0561g/L—2.244g/L；
所述发酵培养基的pH值为4.0—6.5；
所述乳酸利用菌为保藏号为ATCC NO.12561的反刍兽月形单胞菌（Selenomonasruminantium subsp.）或保藏号为ATCC NO.17752的埃氏巨型球菌（Megasphaeraelsdenii）。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述液体发酵按照包括如下步骤的方法进行：将所述保藏号为CGMCC No.2.1882的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)接种于种子培养基中，20—40℃、100—200转/分钟振荡培养18-40小时,获得种子液；再将所述种子液按照（1—30）:100的体积比接种于所述发酵培养基中进行所述液体发酵。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述种子培养基的溶剂为水，溶质为葡萄糖、酵母粉、蛋白胨和MnSO4，在所述种子培养基中各溶质的浓度分别为：葡萄糖10g/L—40g/L、酵母粉5.0g/L—40g/L、蛋白胨5.0g/L—40g/L、MnSO40.089g/L—3.56g/L。
4.一种乳酸利用菌的培养方法，包括将乳酸利用菌接种于含有酵母培养物的培养基中进行培养的步骤；
所述乳酸利用菌为保藏号为ATCC NO.12561的反刍兽月形单胞菌（Selenomonasruminantium subsp.）或保藏号为ATCC NO.17752的埃氏巨型球菌（Megasphaeraelsdenii）；
所述酵母培养物是按照包括如下步骤的方法制备得到的：将保藏号为CGMCC No.2.1882的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)进行液体发酵后，收集发酵液，除去所述发酵液中的所述保藏号为CGMCC No.2.1882的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)细胞得到的无菌液体即为所述酵母培养物；
所述液体发酵在如下条件下进行：20—40℃、100—200转/分钟振荡培养10—30小时后再静置培养10—60小时；
所述液体发酵所使用的发酵培养基的溶剂为水，溶质由碳源、氮源和无机盐组成；
所述碳源由10g/L—100g/L葡萄糖、10g/L—100g/L蔗糖和10g/L—100g/L糖蜜组成；所述碳源在所述发酵培养基中的总浓度为30-300g/L；
所述氮源由10g/L—300g/L酵母膏、10g/L—300g/L蛋白胨和5g/L—40g/L硫酸铵组成；所述氮源在所述发酵培养基中的总浓度为25-640g/L；
所述无机盐为KH2PO4、MgSO4、MnSO4、CaCl2、CuSO4、ZnSO4和FeSO4；
所述无机盐中的各组分在所述发酵培养基中的浓度分别为：KH2PO40.1g/L—10.0g/L、MgSO40.0488g/L—4.88g/L、MnSO40.089g/L—3.56g/L、FeSO40.068g/L—2.714g/L、CaCl20.1g/L—4.0g/L、CuSO40.0639g/L—2.556g/L、ZnSO40.0561g/L—2.244g/L；
所述发酵培养基的pH值为4.0—6.5。
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