CN102604130B - 环境响应的基因载体材料及合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明所述环境响应的基因载体材料，由含二硒键的化合物与寡聚乙烯亚胺或寡聚丙烯亚胺或精胺交联而成，制备方法有两种。第一种方法：(1)活性中间体的制备，原料包括含二硒键的二羧酸、N-羟基琥珀酰亚胺或硫代羟基琥珀酰亚胺和缩合剂；(2)配制寡聚乙烯亚胺或寡聚丙烯亚胺或精胺溶液；(3)将活性中间体溶液和步骤(1)配制的溶液加入反应容器，然后抽去溶解活性中间体的溶剂，再充入氮气于20～60℃反应6～72h。第二种方法：(1)配制寡聚乙烯亚胺、寡聚丙烯亚胺或精胺溶液；(2)将含二硒键的二烯溶液和步骤(1)配制的溶液加入反应容器，然后抽去溶解含二硒键的二烯的溶剂，再充入氮气于20～80℃搅拌反应6～72h。
Description
技术领域
本发明属于基因载体材料领域，特别涉及一种环境响应的基因载体材料及合成方法。
背景技术
近年来，基因治疗因在遗传性疾病、传染病和癌症等各种疾病治疗方面具有非常大的潜力而引起了极大的关注。由于游离的核酸带负电荷，不能穿过细胞膜、会很快的被血液中的核酸酶降解，不能达到转染的目的，所以大量研究工作聚焦于开发能有效包装和保护寡聚核苷酸和DNA的基因载体。
病毒载体，例如逆转录病毒、腺病毒等虽然在多种细胞系中运载DNA和RNA时均显示出很高的转染效率，但具有毒性、免疫原性，且只能装载一定尺寸的基因。聚乙烯亚胺(PEI)是一种常用的基因转染载体材料，分子量为25kDa的PEI具有较高的转染效率，但具有较高的细胞毒性，因而限制了它的应用。较低分子量的PEI，如分子量为800Da的PEI，虽然几乎没有细胞毒性，但不能很好压缩DNA，转染效率较低。
发明内容
本发明的目的提供一类具有环境响应的基因载体材料，此类基因载体材料兼具毒性低、转染效率高的特性，本发明的再一目的是提供所述环境响应的基因载体材料的合成方法。
本发明所述环境响应的基因载体材料，由含二硒键的化合物与寡聚乙烯亚胺或寡聚丙烯亚胺或精胺交联而成，结构示意如下：
或
上述结构示意中，n＝1～10，x≥1，y≥1，DT为寡聚乙烯亚胺或寡聚丙烯亚胺或精胺，所述含二硒键的化合物为含二硒键的二羧酸或含二硒键的二烯。
本发明所述环境响应的基因载体材料，所含寡聚乙烯亚胺或寡聚丙烯亚胺或精胺的分子量为200～4000Da。
本发明所述环境响应的基因载体材料，在还原或氧化的条件下会发生降解。
本发明所述环境响应基因载体材料的制备方法有以下两种：
1、第一种制备方法
此种制备方法的工艺步骤如下：
(1)活性中间体的制备
原料包括含二硒键的二羧酸、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或硫代羟基琥珀酰亚胺(S-NHS)和缩合剂，N-羟基琥珀酰亚胺或硫代羟基琥珀酰亚胺与含二硒键的二羧酸的摩尔比2.0～4.0∶1，缩合剂与含二硒键的二羧酸的摩尔比2.0～4.0∶1，
将含二硒键的二羧酸、N-羟基琥珀酰亚胺或含二硒键的二羧酸、硫代羟基琥珀酰亚胺在室温(室内自然温度)、常压下用溶剂溶解形成混合溶液，所述溶剂的量以含二硒键的二羧酸和N-羟基琥珀酰亚胺或含二硒键的二羧酸和硫代羟基琥珀酰亚胺能完全溶解为限，将缩合剂在室温(室内自然温度)、常压下用溶剂溶解，所述溶剂的量以缩合剂能完全溶解为限，溶解含二硒键的二羧酸、N-羟基琥珀酰亚胺或含二硒键的二羧酸、硫代羟基琥珀酰亚胺的溶剂和溶解缩合剂的溶剂为二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、二氧六环、丙酮中的至少一种，
将含二硒键的二羧酸和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液或含二硒键的二羧酸和硫代羟基琥珀酰亚胺的混合溶液加入反应容器并将所述混合溶液的温度控制在0～25℃，在氮气保护和搅拌下将缩合剂溶液滴入含二硒键的二羧酸和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中或含二硒键的二羧酸和硫代羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中，缩合剂溶液滴加完毕后，在搅拌下于室温(室内自然温度)反应4h～48h生成活性中间体，经过滤除杂后，将滤液旋干即得到活性中间体；
(2)配制寡聚乙烯亚胺或寡聚丙烯亚胺或精胺溶液
将寡聚乙烯亚胺或寡聚丙烯亚胺或精胺用去离子水或蒸馏水溶解，去离子水或蒸馏水的 量以寡聚乙烯亚胺或寡聚丙烯亚胺或精胺能完全溶解为限，然后将寡聚乙烯亚胺水溶液或寡聚丙烯亚胺水溶液或精胺水溶液用酸调pH至4～10并冷冻干燥，继后用二甲基亚砜或二甲基甲酰胺将冷冻干燥所获寡聚乙烯亚胺或寡聚丙烯亚胺或精胺溶解，形成质量浓度5～30％的寡聚乙烯亚胺溶液或寡聚丙烯亚胺溶液或精胺溶液；
(3)交联反应
将步骤(1)制备的活性中间体用溶剂溶解形成溶液，所述溶剂的量以活性中间体能完全溶解为限，然后将活性中间体溶液和步骤(2)所配制的寡聚乙烯亚胺溶液或聚丙烯亚胺溶液或精胺溶液加入反应容器，活性中间体溶液与寡聚乙烯亚胺溶液或寡聚丙烯亚胺溶液或精胺溶液的量以混合液中活性中间体与寡聚乙烯亚胺或寡聚丙烯亚胺或精胺的摩尔比达到0.5～3.0∶1为限，继后用真空泵抽去溶解活性中间体的溶剂，再充入氮气在搅拌下于20～60℃反应6h～72h，反应时间届满后，经透析纯化、冷冻干燥得到胶状的环境响应基因载体材料，结构示意如下：
上述结构示意中，n＝1～10，x≥1，y≥1，DT为寡聚乙烯亚胺或寡聚丙烯亚胺或精胺，所述含二硒键的化合物为含二硒键的二羧酸；
溶解活性中间体的溶剂为二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、二氧六环、丙酮中的至少一种。
上述方法中，缩合剂为N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)、苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)中的至少一种。
上述方法中，含二硒键的二羧酸为3，3′-二硒二丙酸、2，2′-二硒二乙酸、4，4′-二硒二丁酸中的一种。
上述方法中，调寡聚乙烯亚胺水溶液或寡聚丙烯亚胺水溶液或精胺水溶液pH至4～10所用酸为有机酸或无机酸，所述有机酸为甲酸、乙酸、枸橼酸中的一种，所述无机酸为盐酸、硫酸、磷酸、硼酸中的一种。
2、第二种制备方法
此种制备方法的工艺步骤如下：
(1)配制寡聚乙烯亚胺、寡聚丙烯亚胺或精胺溶液
将寡聚乙烯亚胺或寡聚丙烯亚胺或精胺用去离子水或蒸馏水溶解，去离子水或蒸馏水的量以寡聚乙烯亚胺或寡聚丙烯亚胺或精胺能完全溶解为限，然后将寡聚乙烯亚胺水溶液或寡聚丙烯亚胺水溶液或精胺水溶液用酸调pH至4～10并冷冻干燥，继后用二甲基亚砜或二甲基甲酰胺将冷冻干燥所获寡聚乙烯亚胺、寡聚丙烯亚胺或精胺溶解，形成质量浓度5～30％的寡聚乙烯亚胺溶液或寡聚丙烯亚胺溶液或精胺溶液；
(2)交联反应
将含二硒键的二烯在室温(室内自然温度)、常压下用溶剂溶解形成溶液，所述溶剂的量以含二硒键的二烯能完全溶解为限，然后将含二硒键的二烯溶液和步骤(1)所配制的寡聚乙烯亚胺溶液或寡聚丙烯亚胺溶液或精胺溶液加入反应容器，含二硒键的二烯溶液与寡聚乙烯亚胺溶液或寡聚丙烯亚胺溶液或精胺溶液的量以混合液中含二硒键的二烯与寡聚乙烯亚胺或寡聚丙烯亚胺或精胺的摩尔比达到0.5～3.0∶1为限，继后用真空泵抽去溶解含二硒键的二烯的溶剂，再充入氮气在搅拌下于20～80℃搅拌反应6～72h，反应时间届满后，经透析纯化、冷冻干燥得到胶状的环境响应基因载体材料，结构示意如下：
上述结构示意中，n＝1～10，x≥1，y≥1，DT为寡聚乙烯亚胺或寡聚丙烯亚胺或精胺，所述含二硒键的化合物为含二硒键的二烯；
溶解含二硒键的二烯的溶剂为二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、二氧六环、丙酮中的至少一种。
上述方法中，含二硒键的二烯为4，4′-二硒二(1-丁烯)、5，5′-二硒二(1-戊烯)、3，3′-二硒二(1-丙烯)中的一种。
上述方法中，调寡聚乙烯亚胺水溶液或寡聚丙烯亚胺水溶液或精胺水溶液pH至4～10所用酸为有机酸或无机酸，所述有机酸为甲酸、乙酸、枸橼酸中的一种，所述无机酸为盐酸、硫酸、磷酸、硼酸中的一种。
上述两种方法中，含二硒键的二羧酸、含二硒键的二烯的制备方法参考下述论文：
1、“羧酸硒醚、二硒醚及相应硒多糖的合成”(林晓芝，黎永铭，唐渝，化学世界， 50(1)(2009)40-43.)；
2、“Synthesis of novel diselenide-linked porphyrin dimers under phase-transfer catalysiscondition and their interactions with DNA”(Z.Xue，D.W.J.Kwong，L.W.Xue，Q.Liu，A.X.Hou，W.K.Wong，Chem.Biodiversity，6(2009)1131-1143.)；
3、“The oxidative cleavability of protein cross-linking reagents containing organoseleniumbridges”(T.Koch，E.Suenson，U.Henriksen，O.Buchardt，Bioconjugate Chem.，1(1990)296-304.)。
本发明所述环境响应的基因载体材料及其合成方法具有以下特点及有益技术效果：
(1)本发明所述环境响应的基因载体材料，其敏感键为二硒键，在血液中可保持稳定，不被降解，当进入细胞后，在细胞内的还原条件下二硒键断裂，或在放射治疗所用γ射线照射下产生的氧化环境中二硒键断裂，降解为低分子量的片断，从而降低细胞毒性，提高转染效率。
(2)实验表明，本发明所述环境响应的基因载体材料细胞毒性低，转染效率高(见实施例15)。
(3)本发明所述环境响应的基因载体材料的制备方法，通过含二硒键的二羧酸或含二硒键的二烯将寡聚乙烯亚胺或寡聚丙烯亚胺或精胺交联起来，因而可以控制含二硒键的二羧酸或含二硒键的二烯与寡聚乙烯亚胺或寡聚丙烯亚胺或精胺的比例，透析袋截留分子量及反应时寡聚乙烯亚胺或寡聚丙烯亚胺或精胺的浓度得到不同分子量的基因载体材料。
(4))本发明所述环境响应的基因载体材料的制备方法，操作简单，对环境不会产生污染，有利于工业化生产。
附图说明
图1是采用GPC测定的色谱图，其中，PEI800是分子量为800Da的寡聚乙烯亚胺的色谱图，PEI25k是分子量为25KDa的聚乙烯亚胺的色谱图，PEI800-SeSex是实施例1所制备的3，3′-二硒二丙酸与PEI800交联而成的基因载体材料的色谱图。
图2.是采用MTT法评价材料在B16F10细胞中的毒性示意图，图中，PEI800是分子量为800Da的寡聚乙烯亚胺，PEI25k是分子量为25KDa的聚乙烯亚胺，PEI800-SeSex是实施例1所制备的3，3′-二硒二丙酸与PEI800交联而成的基因载体材料。
图3是采用pEGFP法定性评价材料在B16F10细胞中的转染效率图，其中，位于左侧的图片为分子量25KDa的聚乙烯亚胺(PEI25k)在B16F10细胞中的转染效率图，位于中部的图片为分子量800Da的寡聚乙烯亚胺(PEI800)在B16F10细胞中的转染效率图，位于右侧 的图片为实施例1所制备的3，3′-二硒二丙酸与PEI800交联而成的基因载体材料(PEI800-SeSex)在B16F10细胞中的转染效率图。
图4是采用pGL3法定量评价材料在B16F10细胞中的转染效率示意图，其中，位于左侧的图为分子量25KDa的聚乙烯亚胺(PEI25k)在B16F10细胞中的转染效率示意图，位于中部的图为分子量800Da的寡聚乙烯亚胺(PEI800)在B16F10细胞中的转染效率示意图，位于右侧的图为实施例1所制备的3，3′-二硒二丙酸与PEI800交联而成的基因载体材料(PEI800-SeSex)在B16F10细胞中的转染效率示意图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明所述环境响应的基因载体材料及其合成方法作进一步说明，以助于理解本发明的内容。
下述实施例中，所用试剂和材料均为分析纯，可通过市场购买。
实施例1：合成3，3′-二硒二丙酸与PEI800(PEI800为分子量800Da的寡聚乙烯亚胺)交联而成的基因载体材料
3，3′-二硒二丙酸的制备方法如下：
将两口烧瓶放入冰浴，在两口烧瓶中加入0.05mol硒粉并通入氮气，在氮气保护和磁力搅拌下将20ml去离子水加入两口烧瓶，将硼氢化钠水溶液滴入两口烧瓶，所述硼氢化钠水溶液由0.1mol硼氢化钠和20ml去离子水配制而成，当硼氢化钠水溶液滴加完后且两口烧瓶中的液体变成无色时，向两口烧瓶中加入0.05mol硒粉，并将两口烧瓶移入105℃的油浴中在氮气保护和磁力搅拌下保温20分钟，然后将两口烧瓶从油浴中取出，将pH值为8.0的3-氯丙酸0.1mol滴入两口烧瓶(3-氯丙酸用饱和碳酸钠调pH值)，在氮气保护和磁力搅拌下于室温(20℃)反应24h，反应时间届满后，用浓度1mol/L的盐酸将两口烧瓶中反应液的pH值调到3～4，继后将所述反应液用乙酸乙酯萃取，将萃取液旋转蒸发后用乙酸乙酯重结晶，即得到黄色的3，3′-二硒二丙酸。
合成基因载体材料的工艺步骤如下：
(1)活性中间体的制备
原料包括1.2mmol 3，3′-二硒二丙酸、2.4mmol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、2.4mmol1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)；将3，3′-二硒二丙酸和NHS在室温(20℃)、常压下用5mL四氢呋喃溶解后加入两口烧瓶，向两口烧瓶中通入氮气并将其置于冰浴(0℃)上，将EDC在室温(20℃)、常压下用5mL四氢呋喃溶解形成溶液，在氮气保护和搅拌下将EDC溶液滴入两口烧瓶，EDC溶液滴加完毕后，将两口烧瓶从冰浴中取出，在搅拌下于 室温(20℃)反应24h生成活性中间体，经过滤除杂后，将滤液旋干即得到活性中间体；
(2)配制寡聚乙烯亚胺溶液
将1mmol分子量800Da的寡聚乙烯亚胺(PEI800)用10mL去离子水溶解，然后将PEI800水溶液用盐酸调pH至8.4并冷冻干燥，继后用二甲基亚砜(DMSO)将冷冻干燥所获PEI800溶解，形成质量浓度为25％的PEI800溶液；
(3)交联反应
将步骤(1)制备的活性中间体1.2mmol用2mL二氯甲烷溶解形成溶液，然后将活性中间体溶液和步骤(2)所配制的PEI800溶液加入两口烧瓶，继后用真空泵抽去溶解活性中间体的二氯甲烷，再充入氮气在搅拌下于25℃反应48h，反应时间届满后，经透析纯化(透析袋截留分子量7000Da)、冷冻干燥得到黄色胶状物，即为3，3′-二硒二丙酸与PEI800交联而成的基因载体材料，简写为PEI800-SeSex。
将所制备的PEI800-SeSex用凝胶渗透色谱法(GPC法)测其分子量(GPC设备：Waters2690D HPLC，ultrahydrogel 1000及ultrahydrogel 120柱串联，折射率检测器；流动相：0.1mol/LNaCl水溶液，甲酸调pH至2.8，流速1.0mL/min，柱温35℃；以普鲁兰为标准物质计算分子量)，色谱图见图1，测量结果为：重均分子量(MW)18kDa，数均分子量(Mn)5.3kDa，多分散系数(PDI)3.4。
实施例2：合成2，2′-二硒二乙酸与PEI1800(PEI1800为分子量1800Da的寡聚乙烯亚胺)交联而成的基因载体材料
2，2′-二硒二乙酸的制备方法如下：
将两口烧瓶放入冰浴，在两口烧瓶中加入0.05mol硒粉并通入氮气，在氮气保护和磁力搅拌下将20ml去离子水加入两口烧瓶，将硼氢化钠水溶液滴入两口烧瓶，所述硼氢化钠水溶液由0.1mol硼氢化钠和20ml去离子水配制而成，当硼氢化钠水溶液滴加完后且两口烧瓶中的液体变成无色时，向两口烧瓶中加入0.05mol硒粉，并将两口烧瓶移入105℃的油浴中在氮气保护和磁力搅拌下保温20分钟，然后将两口烧瓶从油浴中取出，将pH值为8.0的氯乙酸0.1mol滴入两口烧瓶(氯乙酸用饱和碳酸钠调pH值)，在氮气保护和磁力搅拌下于室温(20℃)反应24h，反应时间届满后，用浓度1mol/L的盐酸将两口烧瓶中反应液的pH值调到3～4，继后将所述反应液用乙酸乙酯萃取，将萃取液旋转蒸发后用乙酸乙酯重结晶，即得到黄色的2，2′-二硒二乙酸。
合成基因载体材料的工艺步骤如下：
(1)活性中间体的制备
原料包括0.5mmol 2，2′-二硒二乙酸、2.0mmol硫代羟基琥珀酰亚胺(S-NHS)、2.0mmolN，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)；将2，2′-二硒二乙酸和S-NHS在室温(20℃)、常压下用5mL丙酮溶解后加入两口烧瓶，向两口烧瓶中通入氮气，将DIC在室温(20℃)、常压下用5mL丙酮溶解形成溶液，在氮气保护和搅拌下于室温(20℃)将DIC溶液滴入两口烧瓶，DIC溶液滴加完毕后，在搅拌下于室温(20℃)反应4h生成活性中间体，经过滤除杂后，将滤液旋干即得到活性中间体；
(2)配制寡聚乙烯亚胺溶液
将1mmol分子量1800Da的寡聚乙烯亚胺(PEI1800)用10mL去离子水溶解，然后将PEI1800水溶液用硫酸调pH至7.0并冷冻干燥，继后用二甲基甲酰胺(DMF)将冷冻干燥所获PEI1800溶解，形成质量浓度为25％的PEI1800溶液；
(3)交联反应
将步骤(1)制备的活性中间体0.5mmol用2mL丙酮溶解形成溶液，然后将活性中间体溶液和步骤(2)所配制的PEI1800溶液加入两口烧瓶，继后用真空泵抽去溶解活性中间体的丙酮，再充入氮气在搅拌下于25℃反应24h，反应时间届满后，经透析纯化(透析袋截留分子量7000Da)、冷冻干燥得到黄色胶状物，即为2，2′-二硒二乙酸与PEI1800交联而成的基因载体材料，简写为PEI1800-SeSex。
将所制备的PEI1800-SeSex用凝胶渗透色谱法(GPC法)测其分子量，所用设备和测试方法与实施例1相同，测量结果为：重均分子量(MW)11kDa，数均分子量(Mn)4.3kDa，多分散系数(PDI)2.6。
实施例3：合成4，4′-二硒二丁酸与PEI423(PEI423为分子量423Da的寡聚乙烯亚胺)交联而成的基因载体材料
4，4′-二硒二丁酸的制备方法如下：
将两口烧瓶放入冰浴，在两口烧瓶中加入0.05mol硒粉并通入氮气，在氮气保护和磁力搅拌下将20ml去离子水加入两口烧瓶，将硼氢化钠水溶液滴入两口烧瓶，所述硼氢化钠水溶液由0.1mol硼氢化钠和20ml去离子水配制而成，当硼氢化钠水溶液滴加完后且两口烧瓶中的液体变成无色时，向两口烧瓶中加入0.05mol硒粉，并将两口烧瓶移入105℃的油浴中在氮气保护和磁力搅拌下保温20分钟，然后将两口烧瓶从油浴中取出，将pH值为8.0的4-氯丁酸0.1mol滴入两口烧瓶(4-氯丁酸用饱和碳酸钠调pH值)，在氮气保护和磁力搅拌下于室温(25℃)反应24h，反应时间届满后，用浓度1mol/L的盐酸将两口烧瓶中反应液的pH值调到3～4，继后将所述反应液用乙酸乙酯萃取，将萃取液旋转蒸发后用乙酸乙酯重结晶， 即得到黄色的4，4′-二硒二丁酸。
合成基因载体材料的工艺步骤如下：
(1)活性中间体的制备
原料包括3.0mmol 4，4′-二硒二丁酸、9.0mmol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、9.0mmol1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)；将4，4′-二硒二丁酸和NHS在室温(25℃)、常压下用5mL二氯甲烷溶解后加入两口烧瓶，向两口烧瓶中通入氮气，将EDCI在室温(25℃)、常压下用4mL二氯甲烷溶解形成溶液，在氮气保护和搅拌下于室温(25℃)将EDCI溶液滴入两口烧瓶，EDCI溶液滴加完毕后，在搅拌下于室温(25℃)反应48h生成活性中间体，经过滤除杂后，将滤液旋干即得到活性中间体；
(2)配制寡聚乙烯亚胺溶液
将1mmol分子量423Da的寡聚乙烯亚胺(PEI423)用10mL蒸馏水溶解，然后将PEI423水溶液用磷酸调pH至10.0并冷冻干燥，继后用二甲基甲酰胺(DMF)将冷冻干燥所获PEI423溶解，形成质量浓度为30％的PEI423溶液；
(3)交联反应
将步骤(1)制备的活性中间体3.0mmol用2mL二氧六环溶解形成溶液，然后将活性中间体溶液和步骤(2)所配制的PEI423溶液加入两口烧瓶，继后用真空泵抽去溶解活性中间体的二氧六环，再充入氮气在搅拌下于60℃反应72h，反应时间届满后，经透析纯化(透析袋截留分子量7000Da)、冷冻干燥得到黄色胶状物，即为4，4′-二硒二丁酸与PEI423交联而成的基因载体材料，简写为PEI423-SeSex。
将所制备的PEI423-SeSex用凝胶渗透色谱法(GPC法)测其分子量，所用设备和测试方法与实施例1相同，测量结果为：重均分子量(MW)7.2kDa，数均分子量(Mn)2.9kDa，多分散系数(PDI)2.4。
实施例4：合成3，3′-二硒二丙酸与PPI 800(PPI 800为分子量800Da的寡聚丙烯亚胺)交联而成的基因载体材料
3，3′-二硒二丙酸的制备方法与实施例1相同。
合成基因载体材料的工艺步骤如下：
(1)活性中间体的制备
原料包括1.0mmol 3，3′-二硒二丙酸、2.4mmol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、2.0mmolN，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)；将3，3′-二硒二丙酸和NHS在室温(18℃)、常压下用5mL氯仿溶解后加入两口烧瓶，向两口烧瓶中通入氮气并将其置于冰浴(0℃)上，将DCC在室温 (18℃)、常压下用5mL氯仿溶解形成溶液，在氮气保护和搅拌下将DCC溶液滴入两口烧瓶，DCC溶液滴加完毕后，将两口烧瓶从冰浴中取出，在搅拌下于室温(18℃)反应24h生成活性中间体，经过滤除杂后，将滤液旋干即得到活性中间体；
(2)配制寡聚丙烯亚胺溶液
将0.7mmol分子量800Da的寡聚丙烯亚胺(PPI 800)用10mL去离子水溶解，然后将PPI 800水溶液用硼酸调pH至9.0并冷冻干燥，继后用二甲基亚砜(DMSO)将冷冻干燥所获PPI 800溶解，形成质量浓度为25％的PPI 800溶液；
(3)交联反应
将步骤(1)制备的活性中间体1.0mmol用2mL氯仿溶解形成溶液，然后将活性中间体溶液和步骤(2)所配制的PPI 800溶液加入两口烧瓶，继后用真空泵抽去溶解活性中间体的氯仿，再充入氮气在搅拌下于20℃反应48h，反应时间届满后，经透析纯化(透析袋截留分子量7000Da)、冷冻干燥得到黄色胶状物，即为3，3′-二硒二丙酸与PPI 800交联而成的基因载体材料，简写为PPI 800-SeSex。
将所制备的PPI 800-SeSex用凝胶渗透色谱法(GPC法)测其分子量，所用设备和测试方法与实施例1相同，测量结果为：重均分子量(MW)17kDa，数均分子量(Mn)5.8kDa，多分散系数(PDI)2.9。
实施例5：合成2，2′-二硒二乙酸与PPI4000(PPI4000为分子量4000Da的寡聚丙烯亚胺)交联而成的基因载体材料
2，2′-二硒二乙酸的制备方法与实施例2相同。
合成基因载体材料的工艺步骤如下：
(1)活性中间体的制备
原料包括1mmol 2，2′-二硒二乙酸、2.2mmol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、2mmol 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、2mmol苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)；将2，2′-二硒二乙酸和NHS在室温(25℃)、常压下用5mL二氧六环溶解后加入两口烧瓶，向两口烧瓶中通入氮气，将EDC和HBTU在室温(25℃)、常压下用5mL二氧六环溶解形成溶液，在氮气保护和搅拌下于室温(25℃)将EDC和HBTU混合溶液滴入两口烧瓶，EDC和HBTU混合溶液滴加完毕后，在搅拌下于室温(25℃)反应4h生成活性中间体，经过滤除杂后，将滤液旋干即得到活性中间体；
(2)配制寡聚丙烯亚胺溶液
将1.0mmol分子量4000Da的寡聚丙烯亚胺(PPI4000)用10mL蒸馏水溶解，然后将 PPI4000水溶液用甲酸调pH至4.0并冷冻干燥，继后用二甲基亚砜(DMSO)将冷冻干燥所获PPI4000溶解，形成质量浓度为25％的PPI4000溶液；
(3)交联反应
将步骤(1)制备的活性中间体1.0mmol用2mL四氢呋喃溶解形成溶液，然后将活性中间体溶液和步骤(2)所配制的PPI4000溶液加入两口烧瓶，继后用真空泵抽去溶解活性中间体的四氢呋喃，再充入氮气在搅拌下于40℃反应6h，反应时间届满后，经透析纯化(透析袋截留分子量7000Da)、冷冻干燥得到黄色胶状物，即为2，2′-二硒二乙酸与PPI4000交联而成的基因载体材料，简写为PPI4000-SeSex。
将所制备的PPI4000-SeSex用凝胶渗透色谱法(GPC法)测其分子量，所用设备和测试方法与实施例1相同，测量结果为：重均分子量(MW)36kDa，数均分子量(Mn)8.3kDa，多分散系数(PDI)为4.3。
实施例6：合成3，3′-二硒二丙酸与SP202(分子量为202Da的精胺)交联而成的基因载体材料
3，3′-二硒二丙酸的制备方法与实施例1相同。
合成基因载体材料的工艺步骤如下：
(1)活性中间体的制备
原料包括0.9mmol 3，3′-二硒二丙酸、2.5mmol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、2.5mmol N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)；将3，3′-二硒二丙酸和NHS在室温(18℃)、常压下用3mL四氢呋喃和2mL氯仿溶解后加入两口烧瓶，向两口烧瓶中通入氮气并将其置于冰浴(0℃)上，将DIC在室温(18℃)、常压下用5mL氯仿溶解形成溶液，在氮气保护和搅拌下将DIC溶液滴入两口烧瓶，DIC溶液滴加完毕后，将两口烧瓶从冰浴中取出，在搅拌下于室温(18℃)反应24h生成活性中间体，经过滤除杂后，将滤液旋干即得到活性中间体；
(2)配制SP202溶液
将0.9mmol分子量为202Da的精胺(SP202)用10mL去离子水溶解，然后将SP202水溶液用乙酸调pH至8.0并冷冻干燥，继后用二甲基亚砜(DMSO)将冷冻干燥所获SP202溶解，形成质量浓度为5％的SP202溶液；
(3)交联反应
将步骤(1)制备的活性中间体0.9mmol用1mL二氯甲烷溶解形成溶液，然后将活性中间体溶液和步骤(2)所配制的SP202溶液加入两口烧瓶，继后用真空泵抽去溶解活性中间体的二氯甲烷，再充入氮气在搅拌下于30℃反应36h，反应时间届满后，经透析纯化(透析袋 截留分子量7000Da)、冷冻干燥得到黄色胶状物，即为3，3′-二硒二丙酸与SP202交联而成的基因载体材料，简写为SP202-SeSex。
将所制备的SP202-SeSex用凝胶渗透色谱法(GPC法)测其分子量，所用设备和测试方法与实施例1相同，测量结果为：重均分子量(MW)7.4kDa，数均分子量(Mn)3.0kDa，多分散系数(PDI)2.5。
实施例7：合成3，3′-二硒二丙酸与SP202(分子量为202Da的精胺)交联而成的基因载体材料
3，3′-二硒二丙酸的制备方法与实施例1相同。
合成基因载体材料的工艺步骤如下：
(1)活性中间体的制备
原料包括0.9mmol 3，3′-二硒二丙酸、2.5mmol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、2.5mmol N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)；将3，3′-二硒二丙酸和NHS在室温(18℃)、常压下用5mL四氢呋喃溶解后加入两口烧瓶，向两口烧瓶中通入氮气并将其置于冰浴(0℃)上，将DIC在室温(18℃)、常压下用3mL四氢呋喃和2mL二氯甲烷溶解形成溶液，在氮气保护和搅拌下将DIC溶液滴入两口烧瓶，DIC溶液滴加完毕后，将两口烧瓶从冰浴中取出，在搅拌下于室温(18℃)反应24h生成活性中间体，经过滤除杂后，将滤液旋干即得到活性中间体；
(2)配制SP202溶液
将0.45mmol分子量为202Da的精胺(SP202)用10mL去离子水溶解，然后将SP202水溶液用枸橼酸调pH至8.0并冷冻干燥，继后用二甲基亚砜(DMSO)将冷冻干燥所获SP202溶解，形成质量浓度为15％的SP202溶液；
(3)交联反应
将步骤(1)制备的活性中间体0.9mmol用1mL四氢呋喃和1mL二氯甲烷溶解形成溶液，然后将活性中间体溶液和步骤(2)所配制的SP202溶液加入两口烧瓶，继后用真空泵抽去溶解活性中间体的四氢呋喃和二氯甲烷，再充入氮气在搅拌下于30℃反应36h，反应时间届满后，经透析纯化(透析袋截留分子量7000Da)、冷冻干燥得到黄色胶状物，即为3，3′-二硒二丙酸与SP202交联而成的基因载体材料，简写为SP202-SeSex。
将所制备的SP202-SeSex用凝胶渗透色谱法(GPC法)测其分子量，所用设备和测试方法与实施例1相同，测量结果为：重均分子量(MW)7.5kDa，数均分子量(Mn)3.1kDa，多分散系数(PDI)2.4。
实施例8：合成4，4′-二硒二(1-丁烯)与PEI800(PEI800为分子量800Da的寡聚乙烯亚 胺)交联而成的基因载体材料
4，4′-二硒二(1-丁烯)的制备方法如下：
将两口烧瓶放入冰浴，在两口烧瓶中加入0.05mol硒粉并通入氮气，在氮气保护和磁力搅拌下将20ml去离子水加入两口烧瓶，将硼氢化钠水溶液滴入两口烧瓶，所述硼氢化钠水溶液由0.1mol硼氢化钠和20ml去离子水配制而成，当硼氢化钠水溶液滴加完后且两口烧瓶中的液体变成无色时，向两口烧瓶中加入0.05mol硒粉，并将两口烧瓶移入105℃的油浴中在氮气保护和磁力搅拌下保温20分钟，然后将两口烧瓶从油浴中取出，将4-氯-1-丁烯0.1mol加入两口烧瓶，在氮气保护和磁力搅拌下于室温(22℃)反应24h，反应时间届满后，将所述反应液用乙酸乙酯萃取，将萃取液旋转蒸发后用乙酸乙酯重结晶，即得到黄色的4，4′-二硒二(1-丁烯)。
合成基因载体材料的工艺步骤如下：
(1)配制寡聚乙烯亚胺溶液
将1.0mmol分子量800Da的寡聚乙烯亚胺(PEI800)用10mL去离子水溶解，然后将PEI800水溶液用甲酸调pH至8.5并冷冻干燥，继后用二甲基亚砜(DMSO)将冷冻干燥所获PEI800溶解，形成质量浓度为25％的PEI800溶液；
(2)交联反应
将1.2mmol 4，4′-二硒二(1-丁烯)在室温(22℃)、常压下用3mL四氢呋喃溶解形成溶液，然后将4，4′-二硒二(1-丁烯)溶液和步骤(1)所配制的PEI800溶液加入两口烧瓶，继后用真空泵抽去溶解4，4′-二硒二(1-丁烯)的四氢呋喃，再充入氮气在搅拌下于40℃反应72h，反应时间届满后，经透析纯化(透析袋截留分子量7000Da)、冷冻干燥得到黄色胶状物，即为4，4′-二硒二(1-丁烯)与PEI800交联而成的基因载体材料。
将本实施例所制备的基因载体材料用凝胶渗透色谱法(GPC法)测其分子量，所用设备和测试方法与实施例1相同，测量结果为：重均分子量(MW)15kDa，数均分子量(Mn)7.9kDa，多分散系数(PDI)1.9。
实施例9：合成5，5′-二硒二(1-戊烯)与PPI4000(PPI4000为分子量4000Da的寡聚丙烯亚胺)交联而成的基因载体材料
5，5′-二硒二(1-戊烯)的制备方法如下：
将两口烧瓶放入冰浴，在两口烧瓶中加入0.05mol硒粉并通入氮气，在氮气保护和磁力搅拌下将20ml去离子水加入两口烧瓶，将硼氢化钠水溶液滴入两口烧瓶，所述硼氢化钠水溶液由0.1mol硼氢化钠和20ml去离子水配制而成，当硼氢化钠水溶液滴加完后且两口烧瓶中 的液体变成无色时，向两口烧瓶中加入0.05mol硒粉，并将两口烧瓶移入105℃的油浴中在氮气保护和磁力搅拌下保温20分钟，然后将两口烧瓶从油浴中取出，将5-氯-1-戊烯0.1mol加入两口烧瓶，在氮气保护和磁力搅拌下于室温(22℃)反应24h，反应时间届满后，将所述反应液用乙酸乙酯萃取，将萃取液旋转蒸发后用乙酸乙酯重结晶，即得到黄色的5，5′-二硒二(1-戊烯)。
合成基因载体材料的工艺步骤如下：
(1)配制寡聚丙烯亚胺溶液
将1.0mmol分子量4000Da的寡聚丙烯亚胺(PPI4000)用10mL蒸馏水溶解，然后将PPI4000水溶液用乙酸调pH至4.0并冷冻干燥，继后用二甲基亚砜(DMSO)将冷冻干燥所获PPI4000溶解，形成质量浓度为5％的PPI4000溶液；
(2)交联反应
将3.0mmol 5，5′-二硒二(1-戊烯)在室温(20℃)、常压下用3mL氯仿溶解形成溶液，然后将5，5′-二硒二(1-戊烯)溶液和步骤(1)所配制的PPI4000溶液加入两口烧瓶，继后用真空泵抽去溶解5，5′-二硒二(1-戊烯)的氯仿，再充入氮气在搅拌下于20℃反应24h，反应时间届满后，经透析纯化(透析袋截留分子量7000Da)、冷冻干燥得到黄色胶状物，即为5，5′-二硒二(1-戊烯)与PPI4000交联而成的基因载体材料。
将本实施例所制备的基因载体材料用凝胶渗透色谱法(GPC法)测其分子量，所用设备和测试方法与实施例1相同，测量结果为：重均分子量(MW)32kDa，数均分子量(Mn)11kDa，多分散系数(PDI)3.0。
实施例10：合成3，3′-二硒二(1-丙烯)与PEI1800(PEI1800为分子量1800Da的寡聚乙烯亚胺)交联而成的基因载体材料
3，3′-二硒二(1-丙烯)的制备方法如下：
将两口烧瓶放入冰浴，在两口烧瓶中加入0.05mol硒粉并通入氮气，在氮气保护和磁力搅拌下将20ml去离子水加入两口烧瓶，将硼氢化钠水溶液滴入两口烧瓶，所述硼氢化钠水溶液由0.1mol硼氢化钠和20ml去离子水配制而成，当硼氢化钠水溶液滴加完后且两口烧瓶中的液体变成无色时，向两口烧瓶中加入0.05mol硒粉，并将两口烧瓶移入105℃的油浴中在氮气保护和磁力搅拌下保温20分钟，然后将两口烧瓶从油浴中取出，将3-氯-1-丙烯0.1mol加入两口烧瓶，在氮气保护和磁力搅拌下于室温(22℃)反应24h，反应时间届满后，将所述反应液用乙酸乙酯萃取，将萃取液旋转蒸发后用乙酸乙酯重结晶，即得到黄色的3，3′-二硒二(1-丙烯)。
合成基因载体材料的工艺步骤如下：
(1)配制寡聚乙烯亚胺溶液
将1.0mmol分子量1800Da的寡聚乙烯亚胺(PEI1800)用10mL去离子水溶解，然后将PEI1800水溶液用用枸橼酸调pH至10.0并冷冻干燥，继后用二甲基甲酰胺(DMF)将冷冻干燥所获PEI1800溶解，形成质量浓度为30％的PEI1800溶液；
(2)交联反应
将0.5mmol 3，3′-二硒二(1-丙烯)在室温(22℃)、常压下用3mL二氯甲烷溶解形成溶液，然后将3，3′-二硒二(1-丙烯)溶液和步骤(1)所配制的PEI1800溶液加入两口烧瓶，继后用真空泵抽去溶解3，3′-二硒二(1-丙烯的二氯甲烷，再充入氮气在搅拌下于80℃反应6h，反应时间届满后，经透析纯化(透析袋截留分子量7000Da)、冷冻干燥得到黄色胶状物，即为3，3′-二硒二(1-丙烯)与PEI1800交联而成的基因载体材料。
将本实施例所制备的基因载体材料用凝胶渗透色谱法(GPC法)测其分子量，所用设备和测试方法与实施例1相同，测量结果为：重均分子量(MW)12kDa，数均分子量(Mn)5.2kDa，多分散系数(PDI)2.3。
实施例11：合成4，4′-二硒二(1-丁烯)与PPI 800(PPI 800为分子量800Da的寡聚丙烯亚胺)交联而成的基因载体材料
4，4′-二硒二(1-丁烯)的制备方法同实施例7。
合成基因载体材料的工艺步骤如下：
(1)配制精胺溶液
将1.0mmol分子量800Da的寡聚丙烯亚胺(PPI 800)用10mL去离子水溶解，然后将PPI 800水溶液用盐酸调pH至8.5并冷冻干燥，继后用二甲基亚砜(DMSO)将冷冻干燥所获PPI 800溶解，形成质量浓度为25％的PPI 800溶液；
(2)交联反应
将1.2mmol 4，4′-二硒二(1-丁烯)在室温(22℃)、常压下用3mL丙酮溶解形成溶液，然后将4，4′-二硒二(1-丁烯)溶液和步骤(1)所配制的PPI 800溶液加入两口烧瓶，继后用真空泵抽去溶解4，4′-二硒二(1-丁烯)的丙酮，再充入氮气在搅拌下于60℃反应72h，反应时间届满后，经透析纯化(透析袋截留分子量7000Da)、冷冻干燥得到黄色胶状物，即为4，4′-二硒二(1-丁烯)与PPI 800交联而成的基因载体材料。
将本实施例所制备的基因载体材料用凝胶渗透色谱法(GPC法)测其分子量，所用设备和测试方法与实施例1相同，测量结果为：重均分子量(MW)6.2kDa，数均分子量(Mn) 2.9kDa，多分散系数(PDI)2.1。
实施例12：合成4，4′-二硒二(1-丁烯)与SP202(SP202为分子量202Da的精胺)交联而成的基因载体材料
4，4′-二硒二(1-丁烯)的制备方法同实施例7。
合成基因载体材料的工艺步骤如下：
(1)配制精胺溶液
将1.0mmol分子量202Da的精胺(SP202)用10mL去离子水溶解，然后将SP202水溶液用硫酸调pH至9.0并冷冻干燥，继后用二甲基亚砜(DMSO)将冷冻干燥所获SP202溶解，形成质量浓度为5％的SP202溶液；
(2)交联反应
将1.2mmol 4，4′-二硒二(1-丁烯)在室温(22℃)、常压下用3mL二氧六环溶解形成溶液，然后将4，4′-二硒二(1-丁烯)溶液和步骤(1)所配制的SP202溶液加入两口烧瓶，继后用真空泵抽去溶解4，4′-二硒二(1-丁烯)的二氧六环，再充入氮气在搅拌下于60℃反应72h，反应时间届满后，经透析纯化(透析袋截留分子量7000Da)、冷冻干燥得到黄色胶状物，即为4，4′-二硒二(1-丁烯)与SP202交联而成的基因载体材料。
将本实施例所制备的基因载体材料用凝胶渗透色谱法(GPC法)测其分子量，所用设备和测试方法与实施例1相同，测量结果为：重均分子量(MW)5.4kDa，数均分子量(Mn)2.7kDa，多分散系数(PDI)2.0。
实施例13：合成4，4′-二硒二(1-丁烯)与SP202(SP202为分子量202Da的精胺)交联而成的基因载体材料
4，4′-二硒二(1-丁烯)的制备方法同实施例7。
合成基因载体材料的工艺步骤如下：
(1)配制精胺溶液
将1.0mmol分子量202Da的精胺(SP202)用10mL蒸馏水溶解，然后将SP202水溶液用磷酸调pH至9.0并冷冻干燥，继后用二甲基亚砜(DMSO)将冷冻干燥所获SP202溶解，形成质量浓度为30％的SP202溶液；
(2)交联反应
将1.2mmol 4，4′-二硒二(1-丁烯)在室温(22℃)、常压下用2mL四氢呋喃和2mL二氯甲烷的混合溶剂溶解形成溶液，然后将4，4′-二硒二(1-丁烯)溶液和步骤(1)所配制的SP202溶液加入两口烧瓶，继后用真空泵抽去溶解4，4′-二硒二(1-丁烯)的四氢呋喃和二氯甲烷，再 充入氮气在搅拌下于60℃反应72h，反应时间届满后，经透析纯化(透析袋截留分子量7000Da)、冷冻干燥得到黄色胶状物，即为4，4′-二硒二(1-丁烯)与SP202交联而成的基因载体材料。
将本实施例所制备的基因载体材料用凝胶渗透色谱法(GPC法)测其分子量，所用设备和测试方法与实施例1相同，测量结果为：重均分子量(MW)4.7kDa，数均分子量(Mn)2.1kDa，多分散系数(PDI)2.2。
实施例14：合成4，4′-二硒二(1-丁烯)与SP202(SP202为分子量202Da的精胺)交联而成的基因载体材料
4，4′-二硒二(1-丁烯)的制备方法同实施例7。
合成基因载体材料的工艺步骤如下：
(1)配制精胺溶液
将1.0mmol分子量202Da的精胺(SP202)用10mL蒸馏水溶解，然后将SP202水溶液用硼酸调pH至9.0并冷冻干燥，继后用二甲基亚砜(DMSO)将冷冻干燥所获SP202溶解，形成质量浓度为30％的SP202溶液；
(2)交联反应
将1.2mmol 4，4′-二硒二(1-丁烯)在室温(22℃)、常压下用2mL二氯甲烷溶解形成溶液，然后将4，4′-二硒二(1-丁烯)溶液和步骤(1)所配制的SP202溶液加入两口烧瓶，继后用真空泵抽去溶解4，4′-二硒二(1-丁烯)的二氯甲烷，再充入氮气在搅拌下于60℃反应72h，反应时间届满后，经透析纯化(透析袋截留分子量7000Da)、冷冻干燥得到黄色胶状物，即为4，4′-二硒二(1-丁烯)与SP202交联而成的基因载体材料。
将本实施例所制备的基因载体材料用凝胶渗透色谱法(GPC法)测其分子量，所用设备和测试方法与实施例1相同，测量结果为：重均分子量(MW)4.7kDa，数均分子量(Mn)2.1kDa，多分散系数(PDI)2.2。
实施例15：对实施例1所合成的基因载体材料PEI800-SeSex进行生物学性能实验
本实施例中，B16F10细胞购自上海细胞所，质粒DNA：pEGFP购自金维克(中国)生命科学技术中心，质粒DNA：pGL3购自金维克(中国)生命科学技术中心。
(1)体外细胞毒性实验。用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法评价PEI800-SeSex的细胞毒性，PEI800(分子量为800Da的聚乙烯亚胺)和PEI25k(分子量为25KDa的聚乙烯亚胺)用作对照样品，组成三个实验组，浓度为10mmol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液用于阴性对照。将PEI800-SeSex、PEI800和PEI25k用浓度为10mmol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液分 别配制成浓度50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml的除菌溶液。
B16F10细胞在96孔培养板中以8×103个细胞/孔接种细胞，用100μL含10％血清DMEM培养基，在5％CO2培养箱中37℃培养过夜。96孔培养板中培养基弃去，加入90μL的含10％血清DMEM培养基，然后将10μL四种不同浓度的PEI800-SeSex除菌溶液分别加入含B16F10细胞的孔中，每一种浓度的PEI800-SeSex除菌溶液均加四个孔，使孔中PEI800-SeSex的浓度最终分别为5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml；将10μL四种不同浓度的PEI800除菌溶液分别加入含B16F10细胞的孔中，每一种浓度的PEI800除菌溶液均加四个孔，使孔中PEI800的浓度最终分别为5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml；将10μL四种不同浓度的PEI25k除菌溶液分别加入含B16F10细胞的孔中，每一种浓度的PEI25k除菌溶液均加四个孔，使孔中PEI25k的浓度最终分别为5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml；将10μL浓度为10mmol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液分别加入含B16F10细胞的四个孔中。继续培养24h后，更换各孔中的DMEM培养基，并在每孔中加入10μL MTT(浓度5mg/mL)，于37℃培养4h，然后吸去各孔中的培养基，并在各孔中加入200μL二甲基亚砜(DMSO)，室温(25℃)下振荡后用酶标仪(550BIO-RAD)测570nm处吸光度。根据吸光度得到细胞存活率。细胞存活率＝实验组吸光度/阴性对照组吸光度×100％。实验结果见附图2。从图中可以看出，在浓度为10μg/ml、20μg/ml时，PEI800-SeSex组的细胞毒性与PEI800组的细胞毒性基本相同，它们的细胞毒性均低于PEI25k组，在浓度为50μg/ml时，PEI800-SeSex组的细胞存活率达80％左右，只比PEI800组略低，而PEI25k(分子量较高的聚乙烯亚胺)组的细胞毒性较高，细胞存活率不到40％，因此，PEI800-SeSex细胞毒性明显低于PEI25k。
(2)体外转染效率实验
①定性转染效率评价：pEGFP法
PEI800-SeSex用HBG溶液[0.02mol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液，用NaOH调pH值至7.4，加入5％(w/w)葡萄糖]溶解，与质粒DNA：pEGFP以质量比为6∶1混合形成复合物，室温(25℃)孵育30分钟后用于转染实验。PEI800(分子量为800Da的聚乙烯亚胺)和PEI25k(分子量为25KDa的聚乙烯亚胺)用作对照样品。PEI25k与pEGFP的质量比为1.2∶1，PEI800与pEGFP的质量比为6∶1.
B16F10细胞在48孔培养板中以2×104个细胞/孔接种细胞，用300μL含10％血清DMEM培养基，在5％CO2培养箱中37℃培养过夜，然后更换为无血清培养基，向每孔细胞中加入过滤除菌的PEI25k、PEI800或PEI800-SeSex与质粒DNA：pEGFP的复合物(每孔加入量为复合物中含400ng质粒DNA：pEGFP)，37℃培养4h后，更换为含10％血清DMEM 培养基，再培养48h后，用倒置荧光显微镜观察拍照，所拍照片见图3，从图3中可以看出，PEI800-SeSex组和PEI25k组对应的照片中都可以看到大量的绿色荧光，而PEI800组对应的照片中无荧光，由此说明：PEI800-SeSex具有与PEI25k高的转染效率，而PEI800几乎无法转染。
②定量转染效率评价：pGL3法
PEI800-SeSex用HBG溶液[0.02mol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液，用NaOH调pH值至7.4，加入5％(w/w)葡萄糖]溶解，与质粒DNA：pGL3以质量比为6∶1混合形成复合物，室温(25℃)孵育30分钟后用于转染实验。PEI800(分子量为800Da的聚乙烯亚胺)和PEI25k(分子量为25KDa的聚乙烯亚胺)用作对照样品。PEI25k与pGL3的质量比为1.2∶1，PEI800与pGL3的质量比为6∶1.
B16F10细胞在96孔培养板中以8×103个细胞/孔接种细胞，用100μL含10％血清DMEM培养基，在5％C02培养箱中37℃培养过夜，然后更换为无血清培养基，向每孔细胞中加入过滤除菌的PEI25k、PEI800或PEI800-SeSex与DNA的复合物(每孔加入量为复合物中含200ng质粒DNA：pGL3)，37℃培养4h后，更换为含10％血清DMEM培养基，再培养24h后，测定每孔中荧光素酶的表达[荧光素酶测定试剂盒，Promega，美国]，测定结果见图4。从图4中可以看出，PEI800-SeSex组和PEI25k组中，荧光素酶表达量均大于1.0×109相对发光量/毫克蛋白，比PEI800组的相对发光量/毫克蛋白高了4个数量级。由此表明，PEI800-SeSex具有高的转染效率，其转染效率可以达到PEI25k的水平，与定性转染实验数据相符。
Claims (7)
1.环境响应的基因载体材料，其特征在于所述基因载体材料由含二硒键的化合物与寡聚乙烯亚胺或寡聚丙烯亚胺或精胺交联而成，结构示意图如下：
上述结构示意图中，n=1～10，x≥1,y≥1，DT为寡聚乙烯亚胺或寡聚丙烯亚胺或精胺，所述含二硒键的化合物为含二硒键的二羧酸或含二硒键的二烯，含二硒键的二羧酸为3，3'-二硒二丙酸、2，2'-二硒二乙酸、4，4'-二硒二丁酸中的一种，含二硒键的二烯为4，4'-二硒二(1-丁烯)、5，5'-二硒二(1-戊烯)、3，3'-二硒二(1-丙烯)中的一种。
2.根据权利要求1环境响应的基因载体材料，其特征在于所述寡聚乙烯亚胺或寡聚丙烯亚胺或精胺的分子量为200～4000Da。
3.根据权利要求1或2的环境响应的基因载体材料，其特征在于该基因载体材料在还原或氧化的条件下会发生降解。
4.一种环境响应基因载体材料的制备方法，其特征在于工艺步骤如下：
（1）活性中间体的制备
原料包括缩合剂、含二硒键的二羧酸、N-羟基琥珀酰亚胺或硫代羟基琥珀酰亚胺，N-羟基琥珀酰亚胺或硫代羟基琥珀酰亚胺与含二硒键的二羧酸的摩尔比2.0～4.0:1，缩合剂与含二硒键的二羧酸的摩尔比2.0～4.0:1，
将含二硒键的二羧酸、N-羟基琥珀酰亚胺或含二硒键的二羧酸、硫代羟基琥珀酰亚胺在室温、常压下用溶剂溶解形成混合溶液，所述溶剂的量以含二硒键的二羧酸和N-羟基琥珀酰亚胺或含二硒键的二羧酸和硫代羟基琥珀酰亚胺能完全溶解为限，将缩合剂在室温、常压下用溶剂溶解，所述溶剂的量以缩合剂能完全溶解为限，溶解含二硒键的二羧酸、N-羟基琥珀酰亚胺或含二硒键的二羧酸、硫代羟基琥珀酰亚胺的溶剂和溶解缩合剂的溶剂为二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、二氧六环、丙酮中的至少一种，所述缩合剂为N,N'-二环己基碳二亚胺、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N,N'-二异丙基碳二亚胺、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯中的至少一种，
将含二硒键的二羧酸和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液或含二硒键的二羧酸和硫代羟基琥珀酰亚胺的混合溶液加入反应容器并将所述混合溶液的温度控制在0～25℃，在氮气保护和搅拌下将缩合剂溶液滴入含二硒键的二羧酸和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中或含二硒键的二羧酸和硫代羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中，缩合剂溶液滴加完毕后，在搅拌下于室温反应4h～48h生成活性中间体，经过滤除杂后，将滤液旋干即得到活性中间体；
所述含二硒键的二羧酸为3，3'-二硒二丙酸、2，2'-二硒二乙酸、4，4'-二硒二丁酸中的一种；
（2）配制寡聚乙烯亚胺或寡聚丙烯亚胺或精胺溶液
将寡聚乙烯亚胺或寡聚丙烯亚胺或精胺用去离子水或蒸馏水溶解，去离子水或蒸馏水的量以寡聚乙烯亚胺或寡聚丙烯亚胺或精胺能完全溶解为限，然后将寡聚乙烯亚胺水溶液或寡聚丙烯亚胺水溶液或精胺水溶液用酸调pH至4～10并冷冻干燥，继后用二甲基亚砜或二甲基甲酰胺将冷冻干燥所获寡聚乙烯亚胺或寡聚丙烯亚胺或精胺溶解，形成质量浓度5～30%的寡聚乙烯亚胺溶液或寡聚丙烯亚胺溶液或精胺溶液；
（3）交联反应
将步骤（1）制备的活性中间体用溶剂溶解形成溶液，所述溶剂的量以活性中间体能完全溶解为限，然后将活性中间体溶液和步骤（2）所配制的寡聚乙烯亚胺溶液或聚丙烯亚胺溶液或精胺溶液加入反应容器，活性中间体溶液与寡聚乙烯亚胺溶液或寡聚丙烯亚胺溶液或精胺溶液的量以混合液中活性中间体与寡聚乙烯亚胺或寡聚丙烯亚胺或精胺的摩尔比达到0.5～3.0:1为限，继后用真空泵抽去溶解活性中间体的溶剂，再充入氮气在搅拌下于20～60℃反应6h～72h，反应时间届满后，经透析纯化、冷冻干燥得到胶状的环境响应基因载体材料；
溶解活性中间体的溶剂为二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、二氧六环、丙酮中的至少一种。
5.根据权利要求4所述环境响应基因载体材料的制备方法，其特征在于调寡聚乙烯亚胺水溶液或寡聚丙烯亚胺水溶液或精胺水溶液pH至4～10所用酸为有机酸或无机酸，所述有机酸为甲酸、乙酸、枸橼酸中的一种，所述无机酸为盐酸、硫酸、磷酸、硼酸中的一种。
6.一种环境响应基因载体材料的制备方法，其特征在于工艺步骤如下：
（1）配制寡聚乙烯亚胺、寡聚丙烯亚胺或精胺溶液
将寡聚乙烯亚胺或寡聚丙烯亚胺或精胺用去离子水或蒸馏水溶解，去离子水或蒸馏水的量以寡聚乙烯亚胺或寡聚丙烯亚胺或精胺能完全溶解为限，然后将寡聚乙烯亚胺水溶液或寡聚丙烯亚胺水溶液或精胺水溶液用酸调pH至4～10并冷冻干燥，继后用二甲基亚砜或二甲基甲酰胺将冷冻干燥所获寡聚乙烯亚胺、寡聚丙烯亚胺或精胺溶解，形成质量浓度5～30%的寡聚乙烯亚胺溶液或寡聚丙烯亚胺溶液或精胺溶液；
（2）交联反应
将含二硒键的二烯在室温、常压下用溶剂溶解形成溶液，所述溶剂的量以含二硒键的二烯能完全溶解为限，然后将含二硒键的二烯溶液和步骤（1）所配制的寡聚乙烯亚胺溶液或寡聚丙烯亚胺溶液或精胺溶液加入反应容器，含二硒键的二烯溶液与寡聚乙烯亚胺溶液或寡聚丙烯亚胺溶液或精胺溶液的量以混合液中含二硒键的二烯与寡聚乙烯亚胺或寡聚丙烯亚胺或精胺的摩尔比达到0.5～3.0:1为限，继后用真空泵抽去溶解含二硒键的二烯的溶剂，再充入氮气在搅拌下于20～80℃搅拌反应6～72h，反应时间届满后，经透析纯化、冷冻干燥得到胶状的环境响应基因载体材料；溶解含二硒键的二烯的溶剂为二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、二氧六环、丙酮中的至少一种；
所述含二硒键的二烯为4，4'-二硒二(1-丁烯)、5，5'-二硒二(1-戊烯)、3，3'-二硒二(1-丙烯)中的一种。
7.根据权利要求6所述环境响应基因载体材料的制备方法，其特征在于调寡聚乙烯亚胺水溶液或寡聚丙烯亚胺水溶液或精胺水溶液pH至4～10所用酸为有机酸或无机酸，所述有机酸为甲酸、乙酸、枸橼酸中的一种，所述无机酸为盐酸、硫酸、磷酸、硼酸中的一种。
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