CN105111265A - 一种使用“一锅法”标记修饰生物大分子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了式Ⅰ或式Ⅱ所示化学分子链接修饰的生物大分子的一锅法制备方法：取式A和式B所示化合物溶于溶剂中，在碱和配体存在下，使用叠氮转移试剂和铜催化剂，在pH值为4.0～11.0的缓冲溶液中，直接反应生成式Ⅰ或式Ⅱ所示化合物；其中，R1、R2分别独立选自生物大分子或化学小分子，两者不同时为生物大分子或化学小分子。本发明提供的一种化学修饰生物大分子的新方法，工艺路线简单，反应条件温和，采用咪唑磺酰叠氮盐酸盐或者三甲基硅基叠氮作为叠氮转移试剂，操作安全性好，中间产物无需分离纯化，节省了工序，降低了操作难度，可以制备得到不同化学修饰的生物大分子，非常适合产业上的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种使用“一锅法”标记修饰生物大分子的方法。
背景技术
在新药研究过程中，通过化合物活性筛选而获得具有生物活性的先导化合物是创新药物研究的基础。随着筛选方法和合成DNA编码大规模生物活性化合物库用于高通量新药筛选(HighThroughputScreening，HTS)的新技术的发展，大大加速了先导化合物的寻找和发现。高通量新药筛选需要建立数目庞大、结构多样性的小分子化合物链接到DNA的生物大分子上。因此，对化学小分子和生物大分子的链接反应技术提出了更高的要求。
ADC药物是近年来快速发展的一类综合了治疗性抗体强靶向性和小分子化学药物对癌细胞高度杀伤力的新型药物。ADC药物由抗体蛋白、化学药物及“连接物”(Linker)共同构成。ADC药物的连接物实现抗体蛋白与化学药物的连接，目前使用化学共价键(二硫键、肽键、硫醚键)等来实现。在ADC药物进入靶细胞前，链接键能确保偶联药物的完整性。而一旦ADC药物进入作用靶点，连接物又要确保化学药物的有效释放。可见，构建稳定性合适的“连接物”，是目前ADC药物研发和产业化所面临的一个主要问题。此外，ADC药物中抗体负载的化学药物数量也取决于连接物。早期的ADC药物的研发失败，多是由于连接物技术的落后，其直接影响了ADC药物的安全性和有效性。
一价铜离子Cu(Ⅰ)催化的炔基和叠氮的1,3-偶极环加成反应目前已被大家熟知，称为点击化学(ClickChemistry)反应，其具有反应条件温和、转化率高、官能团耐受性好和区域选择性好等特点(R.Huisgen,1,3-dipolarCycloadditionChemistry,Wiley：NewYork，1984；K.B.Sharpless,etal,Angew.Chem.Int.Ed.2002,41,2596–2599；K.B.Sharpless,etal,Angew.Chem.Int.Ed.2001,40,2004–2021.)。
点击化学反应是生物兼容性的反应，反应底物及产物对生物大分子(蛋白质、核酸及糖类等)以及细胞的活性没有影响，反应条件温和，可以进行体内实验等。因此，在药物化学、分子生物学和生物化学等领域得到了广泛的应用。目前，点击反应已经广泛地在小分子药物合成，生物大分子类如蛋白质、DNA、糖类，以及体内活细胞的修饰标记等领域，得到了很大的发展和应用(C.R.Bertozzi,etal,Science2000,287,2007–2010；C.R.Bertozzi,etal,Proc.Natl.Acad.Sci.USA2002,99,19–24；Srivatsan,etal,Nat.Protoc.2012,7,1097-1112；P.M.Gramlich,etal,Angew.ChemInt.Ed.2008,47,8350–8358；M.D.Best,etal,Biochemistry2009,48,6571–6584；E.Lallana,etal,Angew.Chem.Int.Ed.2011,50,8794–8804.)。
点击化学反应中有一种底物是有机叠氮类化合物。传统的方法都是先将叠氮类底物合成并进行分离纯化后，与另一种含炔基的化合物进行反应。在传统的修饰链接中，生成叠氮化合物的反应，通常是由烷基或芳香基卤代物与叠氮化钠进行复分解反应得到，反应需要较高的温度或者微波加热等剧烈条件(OrganicAzidesSynthesesandApplications，S.Betal,2010,AJohnWiley&Sons,Ltd,Publication)。叠氮化钠属于剧毒易爆试剂，使用时给操作人员带来了较大的安全隐患。另外，生成的叠氮类化合物通常稳定性不好，不能长时间的进行保存，分离纯化过程都有一定的难度。一些叠氮化合物在溶液中是稳定存在的，但是在蒸发溶剂和浓缩的过程中，会导致分解，存在潜在的爆炸的危险。因此，叠氮化合物的这些特性决定了在使用它们作为点击化学的底物时，在结构多样性上受到了很大的限制。
通过以上分析，可以看出化学修饰生物大分子的现有方法存在以下缺点：
(1)反应条件苛刻，需要较高温度或微波加热条件。
(2)安全隐患大，使用的试剂叠氮化钠是剧毒易爆的危险试剂；有些叠氮中间体纯化过程中具有潜在的爆炸危险。
(3)中间体保存条件苛刻，需避光低温密封保存，极易变质，从而影响链接反应的效果。
因此，为了克服现有技术中存在的上述缺陷或不足，需要对化学修饰生物大分子的现有方法进行改进。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有背景技术的不足之处，而提供了一种新颖的基于“一锅法”对生物大分子进行化学修饰的方法。
本发明提供的式Ⅰ或式Ⅱ所示化学分子链接修饰的生物大分子的一锅法制备方法：
取式A和式B所示化合物溶于溶剂中，在碱和配体存在下，使用叠氮转移试剂和铜催化剂，在pH值为4.0～11.0的缓冲溶液中，直接反应生成式Ⅰ或式Ⅱ所示化合物；
其中，R1、R2分别独立选自生物大分子或化学小分子，两者不同时为生物大分子或化学小分子。
进一步的，所述叠氮转移试剂选自咪唑磺酰叠氮或者三甲基硅基叠氮。
进一步的，所述碱为有机碱；优选为三乙胺。
进一步的，所述铜催化剂为硫酸铜。
进一步的，所述配体为三[(1-苄基-1-氢-1,2,3-三氮唑-4-基)甲基]胺。
进一步的，反应中还需要使用还原试剂；优选为抗坏血酸钠。
进一步的，所述生物大分子是指DNA、RNA、蛋白、糖。
进一步的，所述DNA是指单链DNA或双链DNA。
进一步的，所述单链DNA是指含有20～300个碱基的单链多聚脱氧核苷酸、双链DNA是指含有20～300个碱基对双链脱氧核糖核酸。
进一步的，反应温度为4℃～90℃；较适合的温度为15℃～40℃；更适合的温度为20℃、25℃、37℃或者40℃；最适合的温度为25℃。
进一步的，反应进行时间在60分钟到36小时范围内；较适合的时间段为60分钟到24小时内；更适合的时间点为2小时、4小时、6小时、8小时、12小时，16小时；最适合的反应时间为12小时。
进一步的，反应的试剂的加料顺序为化学小分子、碱试剂、叠氮转移试剂、铜催化剂、配体、还原剂、生物大分子。
进一步的，反应当量为生物大分子为1当量、化学小分子为5～1000当量、叠氮转移试剂为5～1500当量、铜催化剂为5～600当量、配体为5～600当量。
进一步的，反应当量为生物大分子为1当量，还原剂为5～600当量。
本发明中，当量是指摩尔当量，例如：“生物大分子为1当量，还原剂为5～600当量”是指“生物大分子为1摩尔，还原剂为5～600摩尔”。
进一步的，所述溶剂是指常用化学溶剂，包括乙腈、甲醇、乙醇、DMF、DMSO和水。
进一步的，所述的制备方法包括以下步骤：
①、
将式B所示化合物溶于溶剂中，加入叠氮转移试剂、铜催化剂和有机碱，于0℃～100℃下反应0.5h～24h后，得到含有式C所示化合物的反应液；
或者，
将式B所示化合物溶于溶剂中，加入叠氮转移试剂、亚硝酸叔丁酯，于0℃～100℃下反应0.5h～24h后，得到含有式C所示化合物的反应液；
②、
取步骤①所得含有式C所示化合物的反应液，加入铜催化剂、配体、还原试剂和式A所示化合物，于0℃～100℃下反应0.5h～24h后，加入三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、乙二胺四乙酸水溶液、醋酸钠-醋酸缓冲液和醇溶剂，进行分离、纯化，得到式Ⅰ或式Ⅱ所示化合物；
其中，R1、R2分别独立选自生物大分子或化学小分子，两者不同时为生物大分子或化学小分子。
更进一步的，所述的制备方法包括以下步骤：
①、
将式B所示化合物溶于溶剂中，加入叠氮转移试剂、铜催化剂和有机碱，于60℃下反应1h后，得到含有式C所示化合物的反应液；
或者，
将式B所示化合物溶于溶剂中，加入叠氮转移试剂、亚硝酸叔丁酯，于60℃下反应1h后，得到含有式C所示化合物的反应液；
②、
取步骤①所得含有式C所示化合物的反应液，加入铜催化剂、配体、还原试剂和式A所示化合物，于25℃下反应12h后，加入三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、乙二胺四乙酸水溶液、醋酸钠-醋酸缓冲液和醇溶剂，进行分离、纯化，得到式Ⅰ或式Ⅱ所示化合物；
其中，R1、R2分别独立选自生物大分子或化学小分子，两者不同时为生物大分子或化学小分子。
进一步的，步骤①中，式B所示化合物为 步骤②中，式A所示化合物为
进一步的，式A所示化合物按照如下方法制备得到：
将4-炔基戊酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶于二甲基亚砜中，加入化合物1的磷酸缓冲盐溶液，混匀，于0℃～100℃下反应0.5h～24h后，加入三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、醋酸钠-醋酸缓冲液和醇溶剂，进行分离、纯化，得到化合物2；
4-炔基戊酸与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:1～1:5；4-炔基戊酸与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1～1:5；4-炔基戊酸与二甲基亚砜的摩尔体积比为1:1～1:2000μmol/μL；4-炔基戊酸与化合物1的摩尔比为1:0.001～1:1；4-炔基戊酸与三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液的摩尔体积比为1:1～1:2000μmol/μL；4-炔基戊酸与醋酸钠-醋酸缓冲液的摩尔体积比为1:1～1:2000μmol/μL；4-炔基戊酸与醇溶剂的摩尔体积比为1:1～1:2000μmol/μL。
更进一步的，将4-炔基戊酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶于二甲基亚砜中，加入化合物1的磷酸缓冲盐溶液，混匀，于50℃下反应12h～24h后，加入三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、醋酸钠-醋酸缓冲液和醇溶剂，进行分离、纯化，得到化合物2；
4-炔基戊酸与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:2；4-炔基戊酸与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:2；4-炔基戊酸与二甲基亚砜的摩尔体积比为1:40μmol/μL；4-炔基戊酸与化合物1的摩尔比为1:0.1；4-炔基戊酸与三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液的摩尔体积比为1:50μmol/μL；4-炔基戊酸与醋酸钠-醋酸缓冲液的摩尔体积比为1:200μmol/μL；4-炔基戊酸与醇溶剂的摩尔体积比为1:750μmol/μL。
进一步的，化合物1的磷酸缓冲盐溶液的浓度为0.01～10μmol/μL；三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液的浓度为0.01～10μmol/μL；醋酸钠-醋酸缓冲液的浓度为0.01～10μmol/μL。
更进一步的，化合物1的磷酸缓冲盐溶液的浓度为0.5μmol/μL；三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液的浓度为0.1μmol/μL；醋酸钠-醋酸缓冲液的浓度为0.5μmol/μL。
进一步的，步骤①中，所述的叠氮转移试剂为咪唑磺酰叠氮水溶液或三甲基硅基叠氮；所述的铜催化剂为硫酸铜水溶液；所述的有机碱为三乙胺的醇溶液；步骤②中，所述的铜催化剂为硫酸铜或硫酸铜水溶液；所述的配体为三[(1-苄基-1-氢-1,2,3-三氮唑-4-基)甲基]胺的二甲亚砜溶液；所述的还原试剂为抗坏血酸钠水溶液。
进一步的，步骤①中，咪唑磺酰叠氮水溶液的浓度为0.05～50μmol/μL；硫酸铜水溶液的浓度为0.05～50μmol/μL；三乙胺的醇溶液的浓度为0.05～50μmol/μL；步骤②中，硫酸铜水溶液的浓度为0.05～50μmol/μL；三[(1-苄基-1-氢-1,2,3-三氮唑-4-基)甲基]胺的二甲亚砜溶液的浓度为0.01～10μmol/μL；抗坏血酸钠水溶液的浓度为0.05～50μmol/μL；三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液的浓度为0.01～10μmol/μL；乙二胺四乙酸水溶液的浓度为0.01～10μmol/μL；醋酸钠-醋酸缓冲液的浓度为0.01～10μmol/μL。
更进一步的，步骤①中，咪唑磺酰叠氮水溶液的浓度为0.75μmol/μL；硫酸铜水溶液的浓度为1.5μmol/μL；三乙胺的醇溶液的浓度为0.625μmol/μL；步骤②中，硫酸铜水溶液的浓度为0.18～0.2μmol/μL；三[(1-苄基-1-氢-1,2,3-三氮唑-4-基)甲基]胺的二甲亚砜溶液的浓度为0.01～0.1μmol/μL；抗坏血酸钠水溶液的浓度为0.1～0.2μmol/μL；三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液的浓度为0.1μmol/μL；乙二胺四乙酸水溶液的浓度为0.1μmol/μL；醋酸钠-醋酸缓冲液的浓度为0.5μmol/μL。
进一步的，步骤①中，式B所示化合物与溶剂的摩尔体积比为1:1～1:100000μmol/μL；式B所示化合物与咪唑磺酰叠氮的摩尔比为1000:1～1:1；式B所示化合物与硫酸铜的摩尔比为2000:1～1:1；式B所示化合物与三乙胺的摩尔比为1:1～1:2000；式B所示化合物与亚硝酸叔丁酯的摩尔比为1:1～1:2000；式B所示化合物与三甲基硅基叠氮的摩尔比为2000:1～1:1；步骤②中，式C所示化合物与硫酸铜的摩尔比为2000:1～1:1；式C所示化合物与三[(1-苄基-1-氢-1,2,3-三氮唑-4-基)甲基]胺的摩尔比为2000:1～1:1；式C所示化合物与抗坏血酸钠的摩尔比为2000:1～1:1；式C所示化合物与式A所示化合物的摩尔比为2000:1～1:1；式C所示化合物与三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液的摩尔体积比为1:1～1:100000μmol/μL；式C所示化合物与乙二胺四乙酸水溶液的摩尔体积比为1:1～1:100000μmol/μL；式C所示化合物与醋酸钠-醋酸缓冲液的摩尔体积比为1:1～1:100000μmol/μL；式C所示化合物与醇溶剂的摩尔体积比为1:1～1:100000μmol/μL。
更进一步的，步骤①中，式B所示化合物与溶剂的摩尔体积比为1:1～1:2μmol/μL；式B所示化合物与咪唑磺酰叠氮的摩尔比为2:1～1:1；式B所示化合物与硫酸铜的摩尔比为2:1～1:1；式B所示化合物与三乙胺的摩尔比为1:1～1:2；式B所示化合物与亚硝酸叔丁酯的摩尔比为1:1～1:2；式B所示化合物与三甲基硅基叠氮的摩尔比为2:1～1:1；步骤②中，式C所示化合物与硫酸铜的摩尔比为4:1～1:1；式C所示化合物与三[(1-苄基-1-氢-1,2,3-三氮唑-4-基)甲基]胺的摩尔比为120:1～5:1；式C所示化合物与抗坏血酸钠的摩尔比为3:1～1:1；式C所示化合物与式A所示化合物的摩尔比为400:1～500:1；式C所示化合物与三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液的摩尔体积比为1:10～1:20μmol/μL；式C所示化合物与乙二胺四乙酸水溶液的摩尔体积比为1:2～1:10μmol/μL；式C所示化合物与醋酸钠-醋酸缓冲液的摩尔体积比为1:40～1:50μmol/μL；式C所示化合物与醇溶剂的摩尔体积比为1:150～1:200μmol/μL。
本发明提供的一种化学修饰生物大分子的新方法，工艺路线简单，反应条件温和，采用咪唑磺酰叠氮盐酸盐或者三甲基硅基叠氮作为叠氮转移试剂，操作安全性好，中间产物无需分离纯化，节省了工序，降低了操作难度，可以制备得到不同化学修饰的生物大分子，非常适合产业上的应用。
本发明的优点在于：实现了链接在生物大分子的化学分子上进行由有机胺作为起始原料的点击化学反应；与传统的点击化学反应相比，用有机胺类化合物作为原料种类丰富、廉价易得；原位生成的叠氮中间体不需分离，弥补了某些胺类对应叠氮物不易纯化以及稳定存在时间较短而导致相应点击化学反应不能进行的缺点，能得到一些在溶液中稳定存在的叠氮中间体，进行下一步的点击化学反应，大大增加了化学修饰的生物大分子结构多样性；本发明采用的“一锅法”进行生物大分子化学修饰的中间体叠氮化物不用进行分离纯化，极大地简化了生物大分子化学修饰的步骤和难度，节约了人力资源。
本方法提供的修饰生物大分子的路线简单，条件温和，操作方便，收率高。使用的叠氮转移试剂是咪唑磺酰叠氮盐酸盐或者三甲基硅基叠氮，它们的稳定性好，毒性小，能够有效避免发生爆炸、中毒等安全事故，本发明方法的操作安全性好。
另外，本发明“一锅法”对生物大分子的化学修饰，为生物大分子的化学修饰提供了新的选择；也为高通量新药筛选提供了强大的支持。例如，本发明方法增加了DNA结构上化学小分子的多样性；本发明为ADC技术药的链接技术提供了新的选择，希望改善ADC技术药中链接物使用二硫键不稳定的弊端和严重的副作用；本发明同时也为细胞和糖的荧光标签技术提供了新的耦联方法选择，对追踪带有荧光标记的生物分子在生命系统的动态过程用以研究和诊疗疾病方面同样提供了新的选择。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
1、原料与试剂：
5’端氨基修饰的寡聚脱氧核苷酸：购买自Invitrogen英杰生命科技有限公司。
4-炔基戊酸、(吡啶-2-基)甲基胺、2-(噻吩-2-基)乙基胺、(2-苯基-恶唑-4-基)甲基胺：购买自TCI梯希爱(上海)化成工业发展有限公司。
2-(4-羟基苯-1-基)乙基胺、4-溴苯胺、2-甲基苯胺、4-羟基苯胺、4-氯苯胺、三羟甲基氨基甲烷：购买自AlfaAesar阿法埃莎中国化学有限公司。
硫酸铜、抗坏血酸钠、亚硝酸叔丁酯、咪唑磺酰叠氮、三甲基硅基叠氮：购买自J&K百灵威科技有限公司。
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐：购买自阿达玛斯试剂有限公司。
N-羟基琥珀酰亚胺：购买自南京爱里凯德化工有限公司。
醋酸钠、醋酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、盐酸：购买自成都市科龙化工试剂厂。
二甲基亚砜、乙醇、甲醇：购买自成都市联合化工试剂研究所。
2、分析条件：
HPLC：ShimadzuLC-6AD(日本岛津公司)。
HPLC分离条件：反相色谱柱:ShimadzuODS-3150*4.6mm，5μm；流动相:A:100mM，三乙胺-醋酸缓冲溶液pH＝7.0，B:乙腈；淋洗梯度：B在10分钟内从5％到40％,随后在5分钟内从40％到95％，最后保持95％5分钟；流速:1.0mL/mins；柱温:40℃。
MS型号：ThermoLCQ-DecaXP(美国赛默飞公司)。
ESI质谱条件：分为自动进样器(CTC)，流动相，离子阱(LCQ)。流动相所用试剂分为A液、B液、C液、D液，制备试剂的比例见表1。
表1、A液、B液、C液、D液的配置比例
HFIPA：六氟异丙醇苯胺；ACN：乙腈；DIEA：二异丙基乙胺；MeOH：甲醇；EDTA：乙二胺四乙酸；H2O：水。
实施例1合成炔基修饰的寡聚脱氧核苷酸
将5’端氨基修饰的寡聚脱氧核苷酸1(分子量为7743.0Da，100.0nmol)溶于20.0μL的磷酸缓冲盐溶液(pH＝7.4，0.5M)，得到寡聚脱氧核苷酸溶液。将4-炔基戊酸(0.1mg，1.0μmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.38mg，2.0μmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(0.23mg，2.0μmol)溶于40.0μL二甲基亚砜后，加入上述寡聚脱氧核苷酸溶液，混匀后在50℃下反应过夜，然后依次加入50μL的0.1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH＝9.0)、200μL的0.5M醋酸钠-醋酸缓冲液(pH＝4.7)和750μL的无水乙醇，放置在-20℃冷冻两小时静置沉降后，在4℃下14000g离心15分钟沉降分离，寡聚脱氧核苷酸沉淀再用85％的乙醇洗涤一次，再在4℃下14000g离心15分钟沉降分离，所得寡聚脱氧核苷酸沉淀加100μL水冻干得目标产品2：炔基修饰的寡聚脱氧核苷酸产物2。
HPLC：保留时间＝10.7mins；
MS(ESI)m/z868.6[M+9]9+，977.2[M+8]8+，1116.7[M+7]7+。
实施例2
将(吡啶-2-基)甲基胺(2.7mg，25.0μmol)溶于40.0μL甲醇，然后加入20.0μL咪唑磺酰叠氮水溶液(3.8mg，15.0μmol)，10.0μL硫酸铜水溶液(2.4mg，15.0μmol)和40μL三乙胺(2.5mg，25μmol)的甲醇溶液，在60℃反应1小时得反应液。
取上述反应液10μL(其中含有2.3μmol的(吡啶-2-基)甲基叠氮)，加入硫酸铜(0.1mg，0.63μmol)，2.0μL的0.01M的三[(1-苄基-1-氢-1,2,3-三氮唑-4-基)甲基]胺的二甲亚砜溶液和10μL抗坏血酸钠水溶液(0.2mg,1.0μmol)和30μL炔基修饰的寡聚脱氧核苷酸产物2的水溶液(5.0nmol)。在25℃反应12小时后，加入25.0μL三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH＝9.0,0.1M)，10.0μL0.1M的乙二胺四乙酸水溶液，100μL的醋酸钠-醋酸缓冲液(pH＝4.7，0.5M)和400μL的无水乙醇。放置在-20℃冷冻两小时静置沉降。在4℃、14000g下离心15分钟沉降分离，生物大分子沉淀再用85％的乙醇洗涤一次，在4℃、14000g离心15分钟沉降分离，所得沉淀加100μL水冻干，得到目标产物3。
HPLC：保留时间＝10.2mins；
MS(ESI)m/z883.1[M+9]9+，993.6[M+8]8+，1135.7[M+7]7+。
实施例3
将2-(噻吩-2-基)乙基胺(3.2mg，25.0μmol)溶于40.0μL甲醇，然后向其中加入20.0μL咪唑磺酰叠氮水溶液(3.8mg，15.0μmol)，10.0μL硫酸铜水溶液(2.4mg，15.0μmol)和40.0μL三乙胺(2.5mg，25.0μmol)的甲醇溶液，在60℃反应1小时得反应液。
取上述反应液10.0μL(其中含有2.3μmol的2-(噻吩-2-基)乙基叠氮)，加入硫酸铜(0.1mg，0.63μmol)，2.0μL、0.01M的三[(1-苄基-1-氢-1,2,3-三氮唑-4-基)甲基]胺的二甲亚砜溶液和10.0μL抗坏血酸钠水溶液(0.2mg，1.0μmol)和30μL炔基修饰的寡聚脱氧核苷酸产物2的水溶液(5.0nmol)，25℃下反应过夜后，加入25.0μL三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH＝9.0,0.1M)，10.0μL、0.1M的乙二胺四乙酸水溶液，100μL的醋酸钠-醋酸缓冲液(pH＝4.7，0.5M)和400μL的无水乙醇，放置在-20℃冷冻两小时静置沉降，在4℃下14000g离心15分钟沉降分离，沉淀再用85％的乙醇洗涤一次，在4℃下14000g离心15分钟沉降分离，所得沉淀加100μL水冻干，得到目标产物4。
HPLC:保留时间＝11.2mins；
MS(ESI)m/z885.2[M+9]9+，996.0[M+8]8+，1138.4[M+7]7+。
实施例4
将(2-苯基-恶唑-4-基)甲基胺(4.4mg,25.0μmol)溶于40.0μL甲醇，然后加入20.0μL咪唑磺酰叠氮水溶液(3.8mg,15.0μmol)，10.0μL硫酸铜水溶液(2.4mg,15.0μmol)和40.0μL三乙胺(2.5mg,25.0μmol)的甲醇溶液，在60℃反应1小时得反应液。
取上述反应液10.0μL(其中含有2.3μmol的(2-苯基-恶唑-4-基)甲基叠氮)，加入硫酸铜(0.1mg,0.63μmol)，2.0μL、0.01M的三[(1-苄基-1-氢-1,2,3-三氮唑-4-基)甲基]胺的二甲亚砜溶液和10.0μL抗坏血酸钠水溶液(0.2mg,1.0μmol)和30μL炔基修饰的寡聚脱氧核苷酸产物2的水溶液(5.0nmol)，25℃下反应过夜后，加入25.0μL三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH＝9.0,0.1M)，10.0μL的0.1M的乙二胺四乙酸水溶液，100μL的醋酸钠-醋酸缓冲液(pH＝4.7，0.5M)和400μL的无水乙醇，放置在-20℃冷冻两小时静置沉降，在4℃下14000g离心15分钟沉降分离，沉淀再用85％的乙醇洗涤一次，在4℃下14000g离心15分钟沉降分离，所得寡聚脱氧核苷酸沉淀加100μL水冻干，得到目标产物5。
HPLC：保留时间＝11.6mins；
MS(ESI)m/z890.9[M+9]9+，1002.3[M+8]8+，1145.6[M+7]7+。
实施例5
将2-(4-羟基苯-1-基)乙基胺(3.4mg，25.0μmol)溶于40.0μL甲醇，然后加入20.0μL咪唑磺酰叠氮水溶液(3.8mg，15.0μmol)，10.0μL硫酸铜水溶液(2.4mg，15.0μmol)和40.0μL三乙胺(2.5mg，25.0μmol)的甲醇溶液，在60℃反应1小时得反应液。
取上述反应液10.0μL(其中含有2.3μmol的2-(4-羟基苯-1-基)乙基叠氮)，加入硫酸铜(0.2mg，1.26μmol)，2.0μL的0.01M的三[(1-苄基-1-氢-1,2,3-三氮唑-4-基)甲基]胺的二甲亚砜溶液和10.0μL抗坏血酸钠水溶液(0.2mg,1.0μmol)和30μL炔基修饰的寡聚脱氧核苷酸产物2水溶液(5.0nmol)，25℃下反应过夜后，加入25.0μL三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH＝9.0,0.1M)，10.0μL的0.1M的乙二胺四乙酸水溶液，100μL的醋酸钠-醋酸缓冲液(pH＝4.7，0.5M)和400μL的无水乙醇，放置在-20℃冷冻两小时静置沉降，在4℃下14000g离心15分钟沉降分离，沉淀再用85％的乙醇洗涤一次，在4℃下14000g离心15分钟沉降分离，所得寡聚脱氧核苷酸沉淀加100μL水冻干，得到目标产物6。
HPLC：保留时间＝11.0mins；
MS(ESI)m/z886.7[M+9]9+，997.7[M+8]8+，1140.2[M+7]7+。
实施例6
将4-溴苯胺(10.0mg,60.0μmol)溶于170μL乙腈，向其中加入10μL亚硝酸叔丁酯(60.0μmol)和10μL三甲基硅基叠氮(40μmol)，在60℃反应1小时得反应液。
取上述反应液8μL(其中含有2.5μmol的4-溴苯基叠氮)，加入10.0μL硫酸铜水溶液(0.3mg，1.89μmol)，4.0μL的0.1M的三[(1-苄基氢-1,2,3-三唑-4基)甲基]胺的二甲亚砜溶液和10.0μL抗坏血酸钠水溶液(0.4mg，2.0μmol)和30μL炔基修饰的寡聚脱氧核苷酸2水溶液(5.0nmol)，25℃下反应过夜后，加入25.0μL三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH＝9.0,0.1M)，10.0μL的0.1M的乙二胺四乙酸水溶液，100μL的醋酸钠-醋酸缓冲液(pH＝4.7,0.5M)和400μL的无水乙醇，放置在-20℃冷冻两小时静置沉降，在4℃下14000g离心15分钟沉降分离，沉淀再用85％的乙醇洗涤一次，在4℃下14000g离心15分钟沉降分离，所得寡聚脱氧核苷酸沉淀加100μL水冻干，得到目标产物7。
MS(ESI)m/z890.3[M+9]9+，1001.8[M+8]8+，1145.0[M+7]7+。
实施例7
将2-甲基苯胺(6.2mg，60.0μmol)溶于170μL乙腈，向其中加入10μL亚硝酸叔丁酯(60.0μmol)和10μL三甲基硅基叠氮(40μmol)，在60℃反应1小时得反应液。
取上述反应液8μL(其中含有2.5μmol的2-甲基苯基叠氮)，加入10.0μL硫酸铜水溶液(0.3mg，1.89μmol)，4μL的0.1M的三[(1-苄基氢-1,2,3-三唑-4基)甲基]胺的二甲亚砜溶液和10.0μL抗坏血酸钠水溶液(0.4mg，2.0μmol)和30μL炔基修饰的寡聚脱氧核苷酸2水溶液(5.0nmol)，25℃下反应过夜后，加入25.0μL三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH＝9.0,0.1M)，10.0μL的0.1M的乙二胺四乙酸水溶液，100μL的醋酸钠-醋酸缓冲液(pH＝4.7，0.5M)和400μL的无水乙醇，放置在-20℃冷冻两小时静置沉降，在4℃下14000g离心15分钟沉降分离，沉淀再用85％的乙醇洗涤一次，在4℃下14000g离心15分钟沉降分离，所得寡聚脱氧核苷酸沉淀加100μL水冻干，得到目标产物8。
MS(ESI)m/z883.2[M+9]9+，993.6[M+8]8+，1135.8[M+7]7+。
实施例8
将4-羟基苯胺(60.0μmol，6.6mg)溶于170μL乙腈，向其中加入10μL亚硝酸叔丁酯(60.0μmol)和10μL三甲基硅基叠氮(40μmol)，在60℃反应1小时得反应液。
取上述反应液8μL(其中含有2.5μmol的4-羟基苯基叠氮)，加入10.0μL硫酸铜水溶液(0.3mg，1.89μmol)，4μL的0.1M的三[(1-苄基氢-1,2,3-三唑-4基)甲基]胺的二甲亚砜溶液和10.0μL抗坏血酸钠水溶液(0.4mg，2.0μmol)和30μL炔基修饰的寡聚脱氧核苷酸2水溶液(5.0nmol)，25℃下反应过夜后，加入25.0μL三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH＝9.0,0.1M)，10.0μL的0.1M的乙二胺四乙酸水溶液，100μL的醋酸钠-醋酸缓冲液(pH＝4.7，0.5M)和400μL的无水乙醇，放置在-20℃冷冻两小时静置沉降。在4℃下14000g离心15分钟沉降分离，沉淀再用85％的乙醇洗涤一次，在4℃下14000g离心15分钟沉降分离，所得寡聚脱氧核苷酸沉淀加100μL水冻干，得到目标产物9。
MS(ESI)m/z883.4[M+9]9+，993.9[M+8]8+，1136.0[M+7]7+。
实施例9
将4-氯苯胺(7.7mg，60.0μmol)溶于170μL乙腈，向其中加入10μL亚硝酸叔丁酯(60.0μmol)和10μL三甲基硅基叠氮(40μmol)，在60℃反应1小时得反应液。
取上述反应液8μL(其中含有2.5μmol的4-氯苯基叠氮)，加入10.0μL硫酸铜水溶液(0.3mg，1.89μmol)，4μL的0.1M的三[(1-苄基氢-1,2,3-三唑-4基)甲基]胺的二甲亚砜溶液和10.0μL抗坏血酸钠水溶液(0.4mg，2.0μmol)和30μL炔基修饰的寡聚脱氧核苷酸2水溶液(5.0nmol)，25℃下反应过夜后，加入25.0μL三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH＝9.0,0.1M)，10.0μL的0.1M的乙二胺四乙酸水溶液，100μL的醋酸钠-醋酸缓冲液(pH＝4.7，0.5M)和400μL的无水乙醇，放置在-20℃冷冻两小时静置沉降，在4℃下14000g离心15分钟沉降分离，沉淀再用85％的乙醇洗涤一次，在4℃下14000g离心15分钟沉降分离，所得寡聚脱氧核苷酸沉淀加100μL水冻干，得到目标产物10。
MS(ESI)m/z885.4[M+9]9+，996.1[M+8]8+，1138.6[M+7]7+。
本发明实现了链接在生物大分子的化学分子上进行由有机胺作为起始原料的点击化学反应；与传统的点击化学反应相比，用有机胺类化合物作为原料种类丰富、廉价易得；原位生成的叠氮中间体不需分离，弥补了某些胺类对应叠氮物不易纯化以及稳定存在时间较短而导致相应点击化学反应不能进行的缺点，能得到一些在溶液中稳定存在的叠氮中间体，进行下一步的点击化学反应，大大增加了化学修饰的生物大分子结构多样性；本发明采用的“一锅法”进行生物大分子化学修饰的中间体叠氮化物不用进行分离纯化，极大地简化了生物大分子化学修饰的步骤和难度，节约了人力资源。
本方法提供的修饰生物大分子的路线简单，条件温和，操作方便，收率高。使用的叠氮转移试剂是咪唑磺酰叠氮盐酸盐或者三甲基硅基叠氮，它们的稳定性好，毒性小，能够有效避免发生爆炸、中毒等安全事故，本发明方法的操作安全性好。
另外，本发明“一锅法”对生物大分子的化学修饰，为生物大分子的化学修饰提供了新的选择；也为高通量新药筛选提供了强大的支持。例如，此方法增加了DNA结构上化学小分子的多样性；本发明为ADC技术药的链接技术提供了新的选择，希望改善ADC技术药中链接物使用二硫键不稳定的弊端和严重的副作用；本发明同时也为细胞和糖的荧光标签技术提供了新的耦联方法选择，对追踪带有荧光标记的生物分子在生命系统的动态过程用以研究和诊疗疾病方面同样提供了新的选择。
Claims (22)
1.式Ⅰ或式Ⅱ所示化学分子链接修饰的生物大分子的一锅法制备方法，其特征在于：
取式A和式B所示化合物溶于溶剂中，在碱和配体存在下，使用叠氮转移试剂和铜催化剂，在pH值为4.0～11.0的缓冲溶液中，直接反应生成式Ⅰ或式Ⅱ所示化合物；
其中，R1、R2分别独立选自生物大分子或化学小分子，两者不同时为生物大分子或化学小分子。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述叠氮转移试剂选自咪唑磺酰叠氮或者三甲基硅基叠氮。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述碱为有机碱；优选为三乙胺。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述铜催化剂为硫酸铜。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述配体为三[(1-苄基-1-氢-1,2,3-三氮唑-4-基)甲基]胺。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：反应中还需要使用还原试剂；优选为抗坏血酸钠。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述生物大分子是指DNA、RNA、蛋白、糖。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述DNA是指单链DNA或双链DNA。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述单链DNA是指含有20～300个碱基的单链多聚脱氧核苷酸、双链DNA是指含有20～300个碱基对双链脱氧核糖核酸。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：反应温度为4℃～90℃；较适合的温度为15℃～40℃；更适合的温度为20℃、25℃、37℃或者40℃；最适合的温度为25℃。
11.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：反应进行时间在60分钟到36小时范围内；较适合的时间段为60分钟到24小时内；更适合的时间点为2小时、4小时、6小时、8小时、12小时，16小时；最适合的反应时间为12小时。
12.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：反应的试剂的加料顺序为化学小分子、碱试剂、叠氮转移试剂、铜催化剂、配体、还原剂、生物大分子。
13.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：反应当量为生物大分子为1当量、化学小分子为5～1000当量、叠氮转移试剂为5～1500当量、铜催化剂为5～600当量、配体为5～600当量。
14.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：反应当量为生物大分子为1当量，还原剂为5～600当量。
15.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述溶剂是指常用化学溶剂，包括乙腈、甲醇、乙醇、DMF、DMSO和水。
16.根据权利要求1～15任意一项所述的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包括以下步骤：
将式B所示化合物溶于溶剂中，加入叠氮转移试剂、铜催化剂和有机碱，于0℃～100℃下反应0.5h～24h后，得到含有式C所示化合物的反应液；
或者，
将式B所示化合物溶于溶剂中，加入叠氮转移试剂、亚硝酸叔丁酯，于0℃～100℃下反应0.5h～24h后，得到含有式C所示化合物的反应液；
取步骤①所得含有式C所示化合物的反应液，加入铜催化剂、配体、还原试剂和式A所示化合物，于0℃～100℃下反应0.5h～24h后，加入三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、乙二胺四乙酸水溶液、醋酸钠-醋酸缓冲液和醇溶剂，进行分离、纯化，得到式Ⅰ或式Ⅱ所示化合物；
其中，R1、R2分别独立选自生物大分子或化学小分子，两者不同时为生物大分子或化学小分子。
17.根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于：步骤①中，式B所示化合物为步骤②中，式A所示化合物为
18.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于：式A所示化合物按照如下方法制备得到：
将4-炔基戊酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶于二甲基亚砜中，加入化合物1的磷酸缓冲盐溶液，混匀，于0℃～100℃下反应0.5h～24h后，加入三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、醋酸钠-醋酸缓冲液和醇溶剂，进行分离、纯化，得到化合物2；
4-炔基戊酸与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:1～1:5；4-炔基戊酸与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1～1:5；4-炔基戊酸与二甲基亚砜的摩尔体积比为1:1～1:2000μmol/μL；4-炔基戊酸与化合物1的摩尔比为1:0.001～1:1；4-炔基戊酸与三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液的摩尔体积比为1:1～1:2000μmol/μL；4-炔基戊酸与醋酸钠-醋酸缓冲液的摩尔体积比为1:1～1:2000μmol/μL；4-炔基戊酸与醇溶剂的摩尔体积比为1:1～1:2000μmol/μL。
19.根据权利要求18所述的制备方法，其特征在于：化合物1的磷酸缓冲盐溶液的浓度为0.01～10μmol/μL；三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液的浓度为0.01～10μmol/μL；醋酸钠-醋酸缓冲液的浓度为0.01～10μmol/μL。
20.根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于：步骤①中，所述的叠氮转移试剂为咪唑磺酰叠氮水溶液或三甲基硅基叠氮；所述的铜催化剂为硫酸铜水溶液；所述的有机碱为三乙胺的醇溶液；步骤②中，所述的铜催化剂为硫酸铜或硫酸铜水溶液；所述的配体为三[(1-苄基-1-氢-1,2,3-三氮唑-4-基)甲基]胺的二甲亚砜溶液；所述的还原试剂为抗坏血酸钠水溶液。
21.根据权利要求20所述的制备方法，其特征在于：步骤①中，咪唑磺酰叠氮水溶液的浓度为0.05～50μmol/μL；硫酸铜水溶液的浓度为0.05～50μmol/μL；三乙胺的醇溶液的浓度为0.05～50μmol/μL；步骤②中，硫酸铜水溶液的浓度为0.05～50μmol/μL；三[(1-苄基-1-氢-1,2,3-三氮唑-4-基)甲基]胺的二甲亚砜溶液的浓度为0.01～10μmol/μL；抗坏血酸钠水溶液的浓度为0.05～50μmol/μL；三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液的浓度为0.01～10μmol/μL；乙二胺四乙酸水溶液的浓度为0.01～10μmol/μL；醋酸钠-醋酸缓冲液的浓度为0.01～10μmol/μL。
22.根据权利要求20所述的制备方法，其特征在于：步骤①中，式B所示化合物与溶剂的摩尔体积比为1:1～1:100000μmol/μL；式B所示化合物与咪唑磺酰叠氮的摩尔比为1000:1～1:1；式B所示化合物与硫酸铜的摩尔比为2000:1～1:1；式B所示化合物与三乙胺的摩尔比为1:1～1:2000；式B所示化合物与亚硝酸叔丁酯的摩尔比为1:1～1:2000；式B所示化合物与三甲基硅基叠氮的摩尔比为2000:1～1:1；步骤②中，式C所示化合物与硫酸铜的摩尔比为2000:1～1:1；式C所示化合物与三[(1-苄基-1-氢-1,2,3-三氮唑-4-基)甲基]胺的摩尔比为2000:1～1:1；式C所示化合物与抗坏血酸钠的摩尔比为2000:1～1:1；式C所示化合物与式A所示化合物的摩尔比为2000:1～1:1；式C所示化合物与三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液的摩尔体积比为1:1～1:100000μmol/μL；式C所示化合物与乙二胺四乙酸水溶液的摩尔体积比为1:1～1:100000μmol/μL；式C所示化合物与醋酸钠-醋酸缓冲液的摩尔体积比为1:1～1:100000μmol/μL；式C所示化合物与醇溶剂的摩尔体积比为1:1～1:100000μmol/μL。
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