CN102603880A - 降低芸豆凝集素血凝活性且提高其促α-淀粉酶抑制活性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及降低芸豆凝集素血凝活性且提高其促α-淀粉酶抑制活性的方法，包括步骤：芸豆粗提物的制备；硫酸铵沉淀；60MPa~150MPa下微射流均质处理一次或两次；200MPa-500MPa超高压处理10min~15min；将处理后的芸豆粗提物取出，经冷冻干燥得到芸豆粗提物粉末。经本发明处理以后，芸豆粗提物中的凝集素血凝活性降低同时促α-淀粉酶抑制活性提高，即一方面有效的降低了芸豆的抗营养性，另一方面提高了其有益的促α-淀粉酶抑制活性。

Description

降低芸豆凝集素血凝活性且提高其促α-淀粉酶抑制活性的方法

技术领域

本发明涉及食品生物化学领域，具体涉及一种能够有效降低芸豆中凝集素血凝活性同时使其促α-淀粉酶抑制活性提高的加工方法。

背景技术

芸豆凝集素 (Phytohemagglutinin)是芸豆种子中的一类糖蛋白，研究发现其具有双重特性：一方面，凝集素属于一类抗营养因子，能够通过抑制肠道表面目标糖蛋白的消化和肠道刷状缘膜的活性，从而妨碍了营养物质的吸收；但另一方面，它还具有许多有益的生理活性功能，如促α-淀粉酶抑制活性。因为芸豆中的α-淀粉酶抑制剂与凝集素都属于植物自身防御糖蛋白，其基因序列在染色体上排列成簇，根据M. Santimone et al.的研究(Biochimica et Biophysica Acta,1696,181-190,2004)表明部分伸展的芸豆凝集素四聚体蛋白能够促进α-淀粉酶抑制剂的抑制活性，阻碍食物中碳水化合物的水解和消化，进而减少糖分的摄取，降低人体内血糖和血脂含量水平，因此在生物医学领域有广泛的应用前景。

随着生活水平提高和饮食结构的不合理，肥胖症的发病率逐年攀升，而常常与肥胖伴发的糖尿病亦成为一种严重危害人类健康的常见病，据FDA最新数据表明，2010年全世界糖尿病患者约为4.5亿。芸豆糖蛋白提取物，由于富含α-淀粉酶抑制剂，作为一种纯天然物质，口服后经胃肠道排出体外，不进入血液循环系统，符合世界卫生组织倡导的健康安全标准，目前在日本及欧美等国都有相关的保健食品在世界各地销售作为肥胖和糖尿病防治的药物和保健品。

然而为了破坏芸豆中凝集素的抗营养作用，在传统的加工工艺中，芸豆糖蛋白提取往往集中于应用热处理或酸碱处理破坏凝集素的血凝活性，同时也破坏了其促α-淀粉酶抑制活性，降低了芸豆糖蛋白提取物降糖减肥的药用效果。因此，寻找一种既能有效的降低芸豆中凝集素血凝活性又能保持其有益的促α-淀粉酶抑制活性的加工方法十分迫切。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的上述不足，提供降低芸豆凝集素血凝活性且提高其促α-淀粉酶抑制活性的方法，以解决目前加工方法中单纯的采用热处理破坏芸豆凝集素使其抗营养性和有益生理活性同时消失的问题，具体技术方案如下。

一种降低芸豆凝集素血凝活性且提高其促α-淀粉酶抑制活性的方法，包括下列步骤：

（1）芸豆提取物的制备：将芸豆或芸豆粉与生理盐水混合搅拌4 ~ 8 h，0 ~ 4℃静置过夜提取，过滤后离心，得上清液；

（2）硫酸铵沉淀：向上清液中加入固体(NH₄)₂SO₄，使上清液中(NH₄)₂SO₄的质量浓度达到30%~90%，0 ~4℃静置过夜，离心取沉淀；将沉淀溶于蒸馏水，透析3~5h除盐，冷冻干燥得芸豆凝集素粗品；

（3）动态微射流均质处理：将芸豆凝集素粗品用磷酸盐缓冲液配制成蛋白质量浓度为0.5% ~ 2.5% （w/w）的溶液，在压力60 MPa ~150 MPa条件下微射流均质一次或二次；

（4）静态超高压处理：将微射流均质后的芸豆提取物浓缩至蛋白质量浓度为3% ~ 5% （w/w），控制处理过程中样品处理中温度为15~40℃，压力在200MPa~500MPa，保压时间10min~15min，得具有降低芸豆凝集素血凝活性且提高其促α-淀粉酶抑制活性的芸豆凝集素。

作为上述方法进一步优化的技术方案：步骤（1）中所述离心参数为5000g ~ 10000g下离心15 min ~ 30min。

作为上述方法进一步优化的技术方案：在步骤（1）中提取料液重量比为1:10-20，静置时间为12~24 h。

作为上述方法进一步优化的技术方案：在步骤（2）中所述离心为4000g ~ 6000g下离心30 min ~ 40 min。

上述方法在步骤（3）中通过动态微射流均质处理过程中产生的高频振荡、高速撞击、强烈剪切、空穴爆炸的综合作用改变芸豆凝集素的聚集状态。

本发明与现有技术相比具有以下优点和技术效果：

1、传统的芸豆粗提物采用热处理或酸碱处理方法后能够使凝集素血凝活性丧失，同时其有益的生理活性也完全消失。相比之下，本发明公开的降低芸豆凝集素的血凝活性且提高其促α-淀粉酶抑制活性的加工方法，不仅能够在有效的降低芸豆抗营养性而且还可以提高其有益生理活性。

2、本发明发现动态微射流均质处理结合静态超高压处理能够改变芸豆中凝集素四聚体的解离和聚合形式进而抑制其血凝活性，同时暴露了更多同源的α-淀粉酶抑制剂片段，使其促α-淀粉酶抑制活性提高。

3、本发明公开的降低芸豆凝集素的血凝活性且提高其促α-淀粉酶抑制活性的加工方法，操作简单，产品安全，可规模化生产。

具体实施方式

本实施方式中凝集素血凝活性的测定方式为：用胰蛋白酶溶液处理红细胞，增强红细胞的敏感性。以红细胞发生50%凝集作为判定终点，计算凝集效价。凝集效价以2ⁿ（n为血凝板上样品产生凝集现象的最大稀释倍数）表示。

α-淀粉酶抑制活性的测定方式为：利用淀粉溶液在I-KI作用下显蓝色，在660nm处的吸光值和淀粉的量呈线性关系的特点，再根据加入抑制剂前后α-淀粉酶分解淀粉量的差值可计算出抑制剂的活性。测定过程在试管中进行，取α-淀粉酶溶液0.25ml（50mmol/l的磷酸盐缓冲液配制，pH 6.9），加入5mg/ml的α-淀粉酶抑制剂与芸豆粗提物的混合溶液0.25ml（50mmol/l的磷酸盐缓冲液配制，pH 6.9），蒸馏水做空白对照，相同浓度的α-淀粉酶抑制剂做比较对照。37℃结合15 min -30min，加入可溶性淀粉溶液0.5ml，37℃恒温反应10min-15min，用盐酸终止反应后加入碘液显色。加水稀释适当倍数后用分光光度计测定吸光度。根据吸光度的差异计算抑制剂的相对活度。

下面结合具体实施例对本发明的实施做进一步的说明，但本发明的实施不限于此。

对照1

（1）芸豆粗提物的制备：将芸豆与生理盐水混合匀浆，料液比为1:15，4℃静置24h， 6000g离心20min，取上清液；

（2）硫酸铵沉淀：向上清液中加入固体(NH₄)₂SO₄，使上清液中(NH₄)₂SO₄的质量浓度达到60%， 4℃静置过夜，5000g离心30min，取沉淀。将沉淀溶于蒸馏水，透析3h除盐，冷冻干燥得芸豆凝集素粗品；

（3）动态微射流均质处理：将芸豆凝集素粗品用磷酸盐缓冲液配制成蛋白质量浓度1.0%的溶液，在设定压力100 MPa条件下微射流均质一次；

（4）将处理后的芸豆凝集素粗品浓缩，经冷冻干燥得到芸豆粗提物粉末1。

对照2

（1）芸豆粗提物的制备：芸豆粉碎后与生理盐水混合搅拌8h，料液比为1:15，4℃静置16h，6000g离心20min，得上清液；

（2）硫酸铵沉淀：向上清液中加入固体(NH₄)₂SO₄，使上清液中(NH₄)₂SO₄的质量浓度达到60%，4℃静置过夜，5000g离心30min，取沉淀。将沉淀溶于蒸馏水，透析3h除盐，冷冻干燥得芸豆凝集素粗品；

（3）静态超高压处理：将微射流均质后的芸豆提取物浓缩至蛋白质量浓度为3% （w/w），控制处理过程中样品处理中温度为40℃，压力在500MPa，保压时间15min，得芸豆提取物粉末2。 

实施例1

芸豆提取物的制备：将芸豆与生理盐水混合匀浆，料液比为1:15，4℃静置24h，8000g离心20min，取上清液，得芸豆提取物；

硫酸铵沉淀：向上清液中加入固体(NH₄)₂SO₄，使上清液中(NH₄)₂SO₄的质量浓度达到70%，4℃静置过夜，5000g离心30min，取沉淀。将沉淀溶于蒸馏水，透析5h除盐，冷冻干燥得芸豆凝集素粗品；

动态微射流均质处理：将芸豆凝集素粗品用磷酸盐缓冲液配制成蛋白浓度1.0%的溶液，在设定压力60 MPa条件下微射流均质一次；

静态超高压处理：将芸豆凝集素粗品用磷酸盐缓冲液配制成蛋白浓度3.0%的溶液，用包装袋密封后置于聚四氟乙烯传压套筒内，控制处理过程中样品处理中温度30℃，压力控制在300MPa，保压时间10min；     （5）将装有芸豆提取物的包装袋从聚四氟乙烯传压套筒中取出，经冷冻干燥得到芸豆提取物粉末3。 

实施例2

芸豆提取物的制备：芸豆粉碎后与生理盐水混合搅拌8小时，料液比为1:15，4℃静置16 h，四层纱布过滤后离心（8000g，20min），取上清液，得芸豆提取物；

硫酸铵沉淀：向上清液中加入固体(NH₄)₂SO₄至65%饱和，0 ~4℃静置过夜，离心（5000g，30min）取沉淀。将沉淀溶于蒸馏水，透析3h，除盐，冷冻干燥得芸豆凝集素粗品；

动态微射流均质处理：将芸豆凝集素粗品用磷酸盐缓冲液配制成蛋白浓度1.0%的溶液，在设定压力100 MPa条件下微射流均质二次；

静态超高压处理：将芸豆凝集素粗品用磷酸盐缓冲液配制成蛋白浓度3.0%的溶液，用包装袋密封后置于聚四氟乙烯传压套筒内，控制处理过程中样品处理中温度35℃，压力控制在400MPa，保压时间15min；

将装有芸豆提取物的包装袋从聚四氟乙烯传压套筒中取出，经冷冻干燥得到芸豆提取物粉末4。

实施例3

芸豆提取物的制备：将芸豆与生理盐水混合匀浆，料液比为1:15，4℃静置24 h，四层纱布过滤后离心（8000g，20min），取上清液，得芸豆提取物；

硫酸铵沉淀：向上清液中加入固体(NH₄)₂SO₄至70%饱和，0 ~4℃静置过夜，离心（8000g，30min）取沉淀。将沉淀溶于蒸馏水，透析4h，除盐，冷冻干燥得芸豆凝集素粗品；

动态微射流均质处理：将芸豆凝集素粗品用磷酸盐缓冲液配制成蛋白浓度1.5%的溶液，在设定压力150 MPa条件下微射流均质一次；

静态超高压处理：将芸豆凝集素粗品用磷酸盐缓冲液配制成蛋白浓度3.0%的溶液，用包装袋密封后置于聚四氟乙烯传压套筒内，控制处理过程中样品处理中温度15℃，压力控制在450MPa，保压时间10min；

将装有芸豆提取物的包装袋从聚四氟乙烯传压套筒中取出，经冷冻干燥得到芸豆提取物粉末5。 

实施例4

芸豆提取物的制备：芸豆粉碎后与生理盐水混合搅拌8h，料液比为1:15，4℃静置16 h，四层纱布过滤后离心（8000g，20min），取上清液，得芸豆提取物；

硫酸铵沉淀：向上清液中加入固体(NH₄)₂SO₄至70%饱和，0 ~4℃静置过夜，离心（8000g，30min）取沉淀。将沉淀溶于蒸馏水，透析3.5h，除盐，冷冻干燥得芸豆凝集素粗品；

动态微射流均质处理：将芸豆凝集素粗品用磷酸盐缓冲液配制成蛋白浓度1.5%的溶液，在设定压力150 MPa条件下微射流均质一次；

静态超高压处理：将芸豆凝集素粗品用磷酸盐缓冲液配制成蛋白浓度2.5%的溶液，用包装袋密封后置于聚四氟乙烯传压套筒内，控制处理过程中样品处理中温度为20℃，压力控制在500MPa，保压时间10min；

将装有芸豆提取物的包装袋从聚四氟乙烯传压套筒中取出，经冷冻干燥得到芸豆提取物粉末6。 

由表1可见，对比未经超高压处理的芸豆粗提物粉末，采用本发明的加工方法所制备的芸豆粗提物粉末的凝集素血凝活性均有降低（凝集效价可由2⁴降低为2¹），并且随着动态微射流均质及静态高压处理压力的增大，血凝活性降低得越多，表明本发明所采用的加工方法能够有效的降低芸豆粗提物的抗营养性。

由表2可见，单独微射流均质处理或单独超高压处理的芸豆提取物也可促进α-淀粉酶抑制剂的抑制活性，但效果不明显；在微射流均质处理的基础上再加以超高压处理，则可显著提高芸豆凝集素促进α-淀粉酶抑制剂的抑制活性。采用本发明的加工方法所制备的芸豆粗提物粉末的促α-淀粉酶抑制活性均有所提高（相对抑制率可由53.86%提高至69.41%）。

表1

芸豆粗提物粉末	凝集效价	芸豆粗提物粉末	凝集效价
				对照1	24	对照2	24
实例1	23	实例2	22
				实例3	22	实例4	21

表2

芸豆粗提物粉末	相对抑制率	芸豆粗提物粉末	相对抑制率
				对照1	53.86%	对照2	54.53%
实例1	59.34%	实例2	62.22%
				实例3	69.06%	实例4	68.40%

Claims (5)

1.降低芸豆凝集素血凝活性且提高其促α-淀粉酶抑制活性的方法，其特征在于包括下列步骤：

（1）芸豆提取物的制备：将芸豆或芸豆粉与生理盐水混合搅拌4 ~ 8 h，0 ~ 4℃静置过夜提取，过滤后离心，得上清液；

（2）硫酸铵沉淀：向上清液中加入固体(NH₄)₂SO₄，使上清液中(NH₄)₂SO₄的质量浓度达到30%~90%，0 ~4℃静置过夜，离心取沉淀；将沉淀溶于蒸馏水，透析3~5h除盐，冷冻干燥得芸豆凝集素粗品；

（3）动态微射流均质处理：将芸豆凝集素粗品用磷酸盐缓冲液配制成蛋白质量浓度为0.5% ~ 2.5% （w/w）的溶液，在压力60 MPa ~150 MPa条件下微射流均质一次或二次；

（4）静态超高压处理：将微射流均质后的芸豆提取物浓缩至蛋白质量浓度为3% ~ 5% （w/w），控制处理过程中样品处理中温度为15~40℃，压力在200MPa~500MPa，保压时间10min~15min，得具有降低芸豆凝集素血凝活性且提高其促α-淀粉酶抑制活性的芸豆凝集素。

2.根据权利要求1所述的降低芸豆凝集素血凝活性且提高其促α-淀粉酶抑制活性的方法，其特征在于步骤（1）中所述离心参数为5000g ~ 10000g下离心15 min ~ 30min。

3.根据权利要求1所述的降低芸豆凝集素血凝活性且提高其促α-淀粉酶抑制活性的方法，其特征在于：在步骤（1）中提取料液重量比为1:10-20，静置时间为12~24 h。

4.根据权利要求1所述的处理方法，其特征在于：在步骤（2）中所述离心为4000g ~ 6000g下离心30 min ~ 40 min。

5.根据权利要求1所述的降低芸豆凝集素血凝活性且提高其促α-淀粉酶抑制活性的方法，其特征在于：在步骤（3）中通过动态微射流均质处理过程中产生的高频振荡、高速撞击、强烈剪切、空穴爆炸的综合作用改变芸豆凝集素的聚集状态。