CN102579560A - 当归黄芪合剂水提物的制备方法及干预肺纤维化的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了当归黄芪合剂水提物的新用途,即当归黄芪合剂水提物在干预肺纤维化中的应用;当归黄芪合剂水提物的制备方法,取当归、黄芪按1:5质量比例混合粉碎为粗粉;用8倍量的70%乙醇或蒸馏水浸泡8~12小时,室温超声提取2次,每次20~30min,低速离心沉淀,工艺条件:转速3000r/min,时间10min;合并两次上清液,减压浓缩水提物,加蒸馏水定容,得当归黄芪合剂水提物。以当归黄芪合剂水提物作为活性成份,按照常规制药方法,制成临床上可以接受的、药剂学中所说的口服液、片剂、胶囊剂、散剂等。本发明为中药预防和治疗肺纤维化提供了新的药物。
Description
本申请是分案申请,原申请的申请日:2010年5月29日,原申请的申请号:201010190920.6,原申请的名称:当归黄芪合剂醇提物与水提物制备及干预肺纤维化的应用。
技术领域
本发明涉及中药或天然药物领域,具体涉及中药提取部位当归黄芪合剂醇提物与水提物在干预肺纤维化中的应用;本发明还涉及当归黄芪合剂醇提物与水提物的制备方法。
背景技术
肺纤维化(pulmonary fibrosis,PF)是多种原因引起急慢性肺疾病的共同结局,是危害当代人类健康的重要疾病,主要临床表现为刺激性干咳、进行性的呼吸困难和活动后明显加重等,最终可引起呼吸衰竭而死。此病确诊后平均存活期为2~4年,5年生存率仅50%,10年生存率仅为30%。目前PF病因尚不明确,可由病毒感染、免疫功能异常、环境污染及药物等引起。虽然PF病因各异,但病理过程相似:第一步是致病因子对血管内皮细胞和肺泡上皮细胞的弥漫性损害,启动炎症和免疫反应;二是多种炎症细胞参与,释放各种细胞因子和炎性介质,扩大组织损伤并引起间质增生;三是成纤维细胞、内皮细胞迁移、增殖,以及胶原和其他细胞外基质的代谢紊乱,同时进一步促使炎性损伤和增生反应加重,最终导致正常功能组织被取代和改建。实际上这三个过程同时存在,互相促进。
目前,西医临床上对PF的治疗是单独使用皮质类激素,或联用秋水仙碱和环磷酰胺等细胞毒性药物。但临床情况表明,皮质类激素的效果较差,不能改善非炎症阶段的纤维化过程,患者的好转率低;联合使用细胞毒性药物不能提高存活率,并伴有严重的毒性。因此,寻找更安全、有效的药物治疗是目前研究的热点。
对当归、黄芪治疗脏器纤维化的研究已有文献报道,涉及的内容为:(1)当归、黄芪单用具有抗大鼠肺纤维化作用;(2)当归黄芪合剂具有干预大鼠肾纤维化作用;(3)当归补血汤具有干预大鼠肝纤维化作用;(4)当归补血汤总苷具有干预大鼠肺纤维作用。但到目前为止,尚未见有关当归、黄芪合剂醇提物与水提物干预大鼠肺纤维化的研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供当归黄芪合剂醇提物与水提物的制备方法,以及当归黄芪合剂醇提物与水提物在制备用于干预肺纤维化的药物中的应用。本发明的实质是提供当归黄芪合剂新的制药用途。
一种当归黄芪合剂醇提物的制备方法,取当归、黄芪按1:5质量比例混合,粉碎为粗粉;用8倍量的体积百分比浓度为70%的乙醇浸泡8~12小时,室温超声提取2次,每次20~30min,合并两次滤液,减压浓缩醇提物回收乙醇至无醇味,加蒸馏水定容,得当归黄芪合剂醇提物(ethanol extract from Radix Angelica sinensis and Radix Astragali,简称EE)与(1g生药·ml-1药液);于2~10oC保存备用。
一种当归黄芪合剂水提物的制备方法,取当归、黄芪按1:5质量比例混合,粉碎为粗粉;用8倍量的蒸馏水浸泡8~12小时,室温超声提取2次,每次20~30min;低速离心沉淀,工艺条件:转速3000r/min,时间10 min;合并两次上清液,减压浓缩水提物,加蒸馏水定容,得当归黄芪合剂水提物(water extract from Radix Angelica sinensis and Radix Astragali,简称WE)(1g生药·ml-1药液);于2~10oC保存备用。
当归黄芪合剂醇提物与水提物在制备用于干预肺纤维化的药物中的应用:以当归黄芪合剂醇提物或水提物作为活性成份,按照常规制药方法,制成临床上可以接受的、药剂学中所说的常规内服剂型,如口服液、片剂、胶囊剂、散剂等。
发明人经过研究发现,上述当归黄芪合剂醇提物与水提物均具有减慢实验性大鼠肺间质纤维化的进程,对肺间质纤维化早期具有一定的治疗作用。本发明尚未见任何相关文献报道及使用。
实验例 本发明干预大鼠肺纤维化药效学研究结果
1 当归黄芪合剂醇提物与水提物干预大鼠肺纤维化作用
1.1实验材料 受试药物:当归黄芪合剂醇提物或水提物;受试动物:SD大鼠,♀、♂各半,体重170~200g,甘肃中医学院实验动物中心提供。
1.2造模及给药 80只大鼠随机分为空白组、模型组、醋酸泼尼松组、EE组和WE组,共5组,每组16只。常规饲养一周后,各大鼠腹腔注射10%水合氯醛,3ml·kg-1,麻醉仰位固定。颈部除毛,碘酒精消毒,纵向切口暴露气管,除空白组外,各大鼠均用注射器经两气管软骨环间隙朝向心端刺入气管,约1.0~1.5cm,回抽无阻力后向气管内注入博莱霉素,5mg·kg-1,空白组一次性气管内注入等容积生理盐水,立即将动物直立旋转3~5min,使药物在肺内充分分布,缝合各层组织,局部酒精消毒。造模24h后,EE组和WE组分别灌胃给予当归黄芪合剂醇提物或水提物6g生药·kg-1·d-1;空白组及模型组灌胃给予等容量的蒸馏水;醋酸泼尼松组灌胃给予醋酸泼尼松6 mg·kg-1·d-1。连续给药28d。
1.3观测指标 于第14、28d每组各处死8只大鼠。取全肺称重,按公式:肺指数=肺湿重/体重,计算肺指数;取右肺0.1g置于试管中水解,按试剂盒说明书方法检测肺组织中Hyp的含量。取左肺10%甲醛固定,做HE染色和Masson染色,进行定性定量观察。借助Image-Pro Plus专业图像分析软件以取3个视野测量胶原纤维面积求平均值法评价纤维化形成的病理变化,并根据Szapiel等提供的评价标准进行分级评分。
评价标准:①0级:无肺泡炎。②1级:轻度肺泡炎,显微镜下见肺泡间隔由于单核细胞等浸润而增宽,但病变仅局限于局部和胸膜底部,病变区域少于全肺的20%,肺泡结构正常。③2级:中度肺泡炎,肺泡炎性病变广泛,受累面积占全肺的20%~50%,胸膜基底部较严重。④3级:弥漫性肺泡炎,病变范围>50%,偶见肺泡腔内有单核细胞及出血造成实变。以取10个视野评分求平均值法反映肺泡炎的程度。
2结果
2.1 EE或WE对肺纤维化大鼠肺组织Masson染色观察的影响 肺组织Masson染色病理图见附图3、4。图3、4结果显示,空白组大鼠肺结构清晰,各观察点均未出现明显改变。模型组第14d肺泡间隔明显增宽增厚,胶原纤维明显增多;模型组第28d肺泡结构破坏,肺泡壁显著增厚肺间质纤维化瘢痕形成,胶原纤维成弥漫性增多,毛细血管腔闭塞。醋酸泼尼松组、EE组或WE组三组较模型组均明显减轻,第28d仍有胶原纤维形成,且肺泡壁增厚,以EE组和醋酸泼尼松组疗效较好。形态计量学定量见表1-1。
2.2 EE或WE对肺纤维化大鼠肺泡炎HE染色评分的影响 肺组织HE染色病理图见附图1、2。图1、2结果显示,模型组大鼠在各时期均表现有程度不等的肺泡炎。第14d肺泡炎减轻,成纤维细胞大量增生,肺泡腔缩小,肺泡间隔明显增宽,部分视野下可见大片的团块状炎症浸润和纤维化灶。第28d肺间质纤维化程度最重,且多为中重度,肺泡壁显著增厚,且肺泡结构紊乱,肺泡腔多由胶原纤维、成纤维细胞及淋巴细胞占据,毛细血管腔闭塞。空白对照组大鼠各时间点肺泡结构基本保持正常。肺泡炎半定量结果见表1-2,给药第14d,醋酸泼尼松组、EE组或WE组与模型组组间差异有统计学意义(P<0.01, P<0.05, P<0.05),各给药组组间差异均无统计学意义。给药第28d,醋酸泼尼松组、EE组或WE组与模型组组间差异均有统计学意义(p<0.01),但醋酸泼尼松组、EE 组或WE组组间差异均无统计学意义。
2.3 EE或WE对肺纤维化大鼠肺指数的影响 EE或WE对肺纤维化大鼠肺指数的影响见表1-3。结果显示,给药第14d和第28d,醋酸泼尼松组、EE组和WE组与模型组组间差异均有统计学意义(p<0.05),但醋酸泼尼松组、EE组和WE组组间差异均无统计学意义。
2.4 EE或WE对肺纤维化大鼠肺组织Hyp含量的影响 EE或WE对肺纤维化大鼠肺组织Hyp含量的影响见表1-4。结果显示,给药第14d和第28d,醋酸泼尼松组、EE组和WE组与模型组组间差异均有统计学意义(p<0.05),但醋酸泼尼松组、EE组和WE组组间差异均无统计学意义。
与模型组比较:a P<0.05
与模型组比较:a P<0.05,b P<0.01
与模型组比较:a P<0.05
表1-4 EE或WE对肺纤维化大鼠肺组织Hyp含量的影响 ±s, n=8
与模型组比较:a P<0.05
3 结论
经气管穿刺注入BLM造成大鼠肺纤维化,已是目前国内外公认的成熟方法而被广泛应用。本研究设模型组与空白组作对照,病理形态学观察结果和形态计量学测定结果与文献报道一致相符,第14d表现为肺泡间质水肿并出现梭形细胞,肺泡壁内成纤维细胞增生,肺指数升高,第28d肺纤维化瘢痕形成,表明动物模型复制成功。本实验结果还显示应用EE或WE后急性肺泡炎减轻,肺纤维化进展缓慢,第28d疗效明显。表明EE或WE均可减轻BLM所致大鼠肺组织的损伤,减少肺脏胶原的沉积,对大鼠肺间质纤维化早期具有防治作用。
Hyp是胶原蛋白的一种特有氨基酸,不同组织中Hyp含量可作为衡量其胶原组织代谢的重要指标,组肺组织中Hyp含量升高, 表明肺组织出现肺纤维化病理过程。本研究结果显示EE或WE均能显著降低肺组织中 Hyp水平,提示EE或WE均对肺纤维化过程具有干预作用。
中医临床研究表明肺间质纤维化多因正气亏损,外邪袭肺,气血循行受阻致气滞血癖,脉络失通。气阴亏虚、肺络癖阻是肺纤维化形成的病理学特征。在病变过程中,气虚、阴伤与血疲三者又互为因果,互相影响,从而加重了肺的纤维化程度。黄芪补气行血;当归养血行气,两者合用既补气血,又通肺络。充分体现了活血化瘀法是治疗本病的有效方法。
现代研究证实,当归所含阿魏酸、藁本内酯、当归多糖等,黄芪中所含黄芪甲苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮、黄芪多糖等有效成分。赵奎君等利用高效液相色谱法和比色法,以当归和黄芪配伍比例分别为:l:1,1:3,l:5,l:7,l:10的当归补血汤为研究对象,测定方中阿魏酸、藁本内酯、黄芪甲苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮及总多糖的含量;结果表明李东垣的经典方(当归、黄芪1:5)中以上成分的含量最高,以黄芪、当归按5:1配伍最为合理,是有科学依据的。陶艳艳等采用6g·kg-1·d-1(相当于60kg成人临床剂量的10倍量)对当归补血汤的不同配比(5:1,1:1,1:5)进行了抗实验性大鼠肝纤维化的药效学研究,结果显示,在不同配比的当归补血汤中,黄芪当归5:1的经典配比方剂综合效果较好。因此,本实验中采用了6g·kg-1·d-1灌胃给药剂量和当归黄芪经典配比1:5。
本实验研究EE或WE对BLM诱导的大鼠肺间质纤维化均有较好的治疗作用,且两组间治疗效果差异无统计学意义。提示当归黄芪合剂水提物或醇提物均可用于肺纤维化治疗,为中药预防和治疗肺纤维化提供了新的药物。
附图说明
图1是EE或WE对肺纤维化大鼠肺组织病理变化的影响(HE染色×200,14d),
图2是EE或WE对肺纤维化大鼠肺组织病理变化的影响(HE染色×200,28d),
图3是EE或WE对肺纤维化大鼠肺组织病理变化的影响(Masson染色×200,14d),
图4是EE或WE对肺纤维化大鼠肺组织病理变化的影响(Masson染色×200,28d)。
图1至图4中:
A:空白组,B:模型组,C:EE组,D:WE组,E:醋酸泼尼松组。
具体实施方式
下述当归与黄芪药材,由甘肃中医学院鉴定教研室晋玲副教授鉴定,分别为 Radix Angelica sinensis和Radix Astragalus。
实施例1 制备当归黄芪合剂口服液
称取黄芪300g ,当归60g;
将以上2味药材混合均匀,粉碎为粗粉;用2880ml的体积百分比浓度为70%乙醇(以下70%乙醇均指体积百分比浓度)浸泡12小时,室温超声提取2次,每次20min,合并两次滤液,减压浓缩至溶液相对密度为1.1,静置,过滤,加蒸馏水定容至1000ml,加入质量百分比浓度为0.15%山梨酸,搅匀,分装,灭菌,得当归黄芪合剂口服液。
用法用量: 口服,一次10ml,一日3次。用时摇匀。
实施例2 制备当归黄芪合剂口服液
称取黄芪300g ,当归60g;
将以上2味药材混合均匀,粉碎为粗粉;用2880ml的蒸馏水浸泡10小时,室温超声提取2次,第一次25min,第二次20min;低速离心沉淀,工艺条件:转速3000r/min,时间10 min;合并两次上清液;减压浓缩至溶液相对密度为1.1,静置,过滤,加蒸馏水定容至1000ml,加入质量百分比浓度为0.15%山梨酸,搅匀,分装,灭菌。
用法用量: 口服,一次10ml,一日3次。用时摇匀。
实施例3 制备当归黄芪合剂肠溶片
称取黄芪300g ,当归60g;
将以上2味药材混合均匀,粉碎为粗粉;用2880ml的70%乙醇浸泡8小时,室温超声提取2次,第一次30min,第二次20min,合并两次滤液;在 40oC~50oC减压浓缩至相对密度为1.35左右稠膏,真空干燥得干膏。
将干膏直接用摇摆式颗粒机粉碎成14目颗粒,喷洒70%乙醇调整颗粒水分,加3g硬脂酸镁、30 g滑石粉混匀,用14目筛整粒后压片,每片重0.5g,包肠溶衣。
用法用量:口服,一次5~6片,一日3次。
实施例4 制备当归黄芪合剂肠溶片
称取黄芪300g ,当归60g;
将以上2味药材混合均匀,粉碎为粗粉;用2880ml的蒸馏水浸泡8小时,室温超声提取2次,第一次30min,第二次20min;低速离心沉淀,工艺条件:转速3000r/min,时间10 min;合并两次上清液;在 40oC~50oC减压浓缩至相对密度为1.30左右稠膏,真空干燥得干膏。
将干膏直接用摇摆式颗粒机粉碎成14目颗粒,喷洒70%乙醇调整颗粒水分,加3g硬脂酸镁、30 g滑石粉混匀,用14目筛整粒后压片,每片重0.5g,包肠溶衣。
用法用量:口服,一次5~6片,一日3次。
实施例5 制备当归黄芪合剂胶囊
称取黄芪300g ,当归60g;
将以上2味药材混合均匀,粉碎为粗粉;用2880ml的蒸馏水浸泡9小时,室温超声提取2次,每次25min;低速离心沉淀,转速3000r/min,时间10 min;合并两次上清液;在40oC~50oC减压浓缩至相对密度为1.25左右稠膏,真空干燥得干膏。
将干膏直接用粉碎机粉碎成60目颗粒,加60g微粉硅胶混匀,用全自动胶囊填充机填充入硬胶囊,每粒装量0.5g。
用法用量:口服,一次5~6粒,一日3次。
实施例6 制备当归黄芪合剂胶囊
称取黄芪300g ,当归60g;
将以上2味药材混合均匀,粉碎为粗粉;分别用2880ml的70%乙醇浸泡12小时,室温超声提取2次,每次20min,合并两次滤液,在40oC~50oC减压浓缩至相对密度为1.25左右稠膏,真空干燥得干膏。
将干膏直接用粉碎机粉碎成60目颗粒,加60g微粉硅胶混匀,用全自动胶囊填充机填充入硬胶囊,每粒装量0.5g。
用法用量:口服,一次5~6粒,一日3次。
上述的实施例是对本发明当归黄芪合剂醇提物与水提物干预肺纤维化作用的进一步说明,但这并不意味着对本发明的限制,任何应用当归黄芪合剂醇提物与水提物进行干预肺纤维化作用,都应属于本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种当归黄芪合剂水提物的制备方法,取当归、黄芪按1:5质量比例混合,粉碎为粗粉;用8倍量的蒸馏水浸泡8~12小时,室温超声提取2次,每次20~30min;低速离心沉淀,工艺条件:转速3000r/min,时间10 min;合并两次上清液,减压浓缩水提物,加蒸馏水定容,得当归黄芪合剂水提物。
2.一种权利要求1所述的当归黄芪合剂水提物的制备方法所得的当归黄芪合剂水提物在制备用于干预肺纤维化的药物中的应用:以当归黄芪合剂水提物作为活性成份,按照常规制药方法,制成临床上可以接受的、药剂学中所说的口服液、片剂、胶囊剂和散剂。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120718 |