CN102559757B - 猫杯状病毒感染性克隆及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了猫杯状病毒感染性克隆，通过在FCV病毒的全长cDNA的两端连接酶切位点，之后将序列连接到表达载体中得到。实验结果表明，使用本发明克隆生产得到的FCV，与亲本毒具有相似的特性，具有很好地感染性，可使细胞明显变性，滴度高，传代稳定。

Description

猫杯状病毒感染性克隆及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种正义RNA病毒表达载体及其构建方法和应用，特别涉及一种猫杯状病毒感染性克隆及其构建方法和应用。

背景技术

单股正链RNA病毒的碱基序列与mRNA完全相同，可直接起到病毒mRNA的作用。因此，该类病毒称为正义RNA病毒，其裸RNA具有感染性。该类病毒基因组复制的特点是先合成(-)RNA，再以之作为合成(+)RNA的模板。Racaniello和Baltimore于1981年首次成功的构建了动物RNA病毒的感染性克隆，他们把脊髓灰质炎病毒(Poliovirus，PV)基因组的全长cDNA克隆到pBR322载体中，用该重组质粒转染哺乳动物细胞后，可以产生具有感染性的病毒粒子，从此拉开了动物RNA病毒反向遗传学研究的序幕。随后其它一些正链RNA病毒的反向遗传学系统也在不断被成功建立。Sumiyoshi等(1992)采用分段克隆的方法成功拯救了日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus JEV)。分段克隆即将黄病毒的全基因组分成两段或者多个片段构成重组质粒然后体外连接成全长cDNA分子，再进行体外转录或拯救，以此解决了黄病毒科中一些病毒基因组cDNA的亚克隆在寄主细菌中常不能稳定增殖的问题。FMDV的第一个感染性cDNA由Zibert A等于1990年构建成功，随后Riederd等也成功构建了A型FMDV的感染性克隆，他们各自采用不同的方法克服了FMDV基因组中Poly(C)尾巴的问题。Almazán(2000)等利用BAC系统首次成功构建出了猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis coronavirus TGEV)的全长cDNA分子克隆，并实现了病毒拯救。这是反向遗传学发展史上的一个突破性进展，TGEV感染性克隆的成功构建表明RNA病毒的反向遗传学操作将不再受到基因组大小的限制。2006年，St-Jean等利用BAC系统又成功拯救出具有神经毒力的人冠状病毒(Human corona virus，HCoV)。此外，Casais等(2001)率先利用痘病毒做载体成功构建了鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)的反向遗传研究系统，为建立其它冠状病毒的感染性克隆提供了范例。其后，Thiel等(2001)也将人冠状病毒的全长cDNA克隆到痘病毒载体中，并能稳定的增值病毒cDNA。Yount等(2002)在体外采用顺次连接的方法获得了MHV的全长cDNA，以其为模板进行体外转录，获得了具有感染性的全长RNA。这种策略虽然可行，但是存在RNA获得率低，病毒拯救效率低的缺陷。  Coley等(2005)将体外装配好的鼠肝炎病毒(Mouse hepatitis virus，MHV)的全长cDNA分子克隆至痘苗病毒载体中，然后用豆苗病毒感染靶细胞，通过体内转录过程实现了MHV的拯救，用该方法拯救出的病毒不仅滴度高，而且具有很强的侵略性，与母本毒相似。至此冠状病毒的反向遗传学研究系统已经完全走向成熟。

猫杯状病毒(Feline Calicivirus，FCV)，属于杯状病毒科，是一种正链RNA病毒。是猫上呼吸道疾病的主要病原，主要引起猫的急性口腔溃疡、上呼吸道感染和慢性胃肠炎疾病，该病发病率较高，但死亡率较低。几乎所有的猫科动物对FCV都易感。一岁以下的猫最易感，潜伏期为2～3天，病猫临床症状表现为采食困难、打喷嚏、流涎、口腔溃疡、结膜炎等。有些毒株可以引起急性关节炎，猫表现出跛行。FCV呈世界性分布，可能感染所有的猫科动物。自首次在猫身上分离到该病毒后，之后从猎豹和老虎体内也分离到该病毒。

猫杯状病毒属于杯状病毒科，杯状病毒科现有四个属：兔病毒属(Lagovirus)、诺瓦克病毒属(Norovirus)、扎幌样病毒属(Sappovirus)、以及水泡疹病毒属(Vesirus)。其中诺瓦克样病毒和扎幌样病毒合称人类杯状病毒(Human calicivirus HuCV)，它们是引起成人和儿童非细菌性急性胃肠炎的主要病原体，HuCV不仅可以引发肠道感染，也能引起心肌损害。而兔病毒属的主要成员兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus RHDV)则是一种烈性毁灭性病毒性传染病，已经列入二类动物病原微生物，对养兔业和实验兔危害极大。尽管此类病毒已发现很多年，但由于缺乏相应的细胞培养系统，使得相关研究仍然缓慢。同科的猫杯状病毒却能够在猫肾细胞(CRFK)中培养增殖。因此科学家们以它作为研究模型，试图解决目前存在的问题，现对FCV的分子生物学及反向遗传学的研究进展进行综述。

在RNA病毒家族中，杯状病毒是一类不易引起人们重视的病毒。随着其重要成员偌瓦克病毒(NV)的发现，人们才开始重视该科病毒的研究。因为它可以引起人类的非细菌性肠胃炎，对人类的健康威胁极大。遗憾的是该科的大多数病毒都不能在体外培养，给病毒的分离和研究带来很大不便。反向遗传学技术的兴起给研究这些病毒带来了希望。但水泡疹样病毒属(如FCV)例外，它可以在CRFK(猫肾细胞)中高滴度的增殖，因此它往往被作为杯状病毒研究的模型。Stanislav V.Sosnovtsev(1995)等最早利用RT-PCR的方法克隆了FCVUrbana株的全基因组，运用T7RNA聚合酶启动子在体外转录了FCV mRNA，同时在5′-端加上帽状结构，恢复了具有感染性的FCV病毒粒子。Kyeong-OK Chang等采用同样的方法恢复了具有感染性的猪的杯状病毒。Jorg Oliver Thumfart等采用体外转录的方法和构建真核表达质粒的方法，都成功恢复了FCV病毒粒子。并且把绿色荧光蛋白基因(GFP)插入FCV衣壳蛋白基因位置后，构建了感染性嵌合DNA克隆质粒，转录细胞GFP获得了表达，嵌合病毒基因组可自我复制，并且被包装成病毒粒子。

但是，现有的猫杯状病毒感染性克隆普遍感染性不高，滴度较低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的猫杯状病毒感染性克隆。

本发明的另一个目的在于提供上述猫杯状病毒感染性克隆的构建方法。

本发明的再一个目的在于提供上述猫杯状病毒感染性克隆在表达外源蛋白中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

猫杯状病毒感染性克隆，通过在FCV病毒的全长cDNA的两端连接酶切位点，之后将序列连接到表达载体中得到。

表达载体为去除了f1、ori、SV40、neo、plyA序列的商品化质粒pcDNA3，优选的，表达载体的3’端连接有核酶。核酶优选为自剪切型核酶。

上述猫杯状病毒感染性克隆的构建方法，包括以下步骤：

1)使用PCR法扩增FCV全长cDNA，并在两端引入酶切位点；

2)将商品化质粒pcDNA3的f1、ori、SV40、neo、plyA序列去除，得到改造质粒；

3)在改造质粒上引入核酶序列；

4)克隆出FCV全长基因组并连接到真核表达载体pCDNA中，得到猫杯状病毒感染性克隆。

优选的，引入核酶序列时包括如下步骤：

1)以pCDNA3为模板以DNA3HDRZ1和DNA3B为引物，进行PCR，PCR程序是：95℃5min；98℃10s，55℃15s，72℃4min，30个循环；72℃10min，得到PCR产物pHDRZ1；

2)以pHDRZ1为模板，以DNA3HDRZ2和DNA3B为引物，PCR程序是：95℃5min；98℃10s，55℃15s，72℃4min，30个循环；72℃10min，得到的PCR产物命名为pHDRZ2；

3)以pHDRZ2为模板，以DNA3HDRZ3和DNA3B为引物，PCR程序是：95℃5min；98℃10s，59℃15s，72℃4min，30个循环；72℃10min，得到的PCR产物命名为pCDNA-HDRZ；

4)胶回收pCDNA-HDRZ连接pMD18-T载体，转化，得到改造载体；

其中，引物的序列为：

DNA3HDRZ1：5′-GGACGCACGTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGGGCGCTGATCAGCCTCGACTGTGC-3′；(SEQ ID NO：1)

DNA3HDRZ2：

5′-TCCACCTCCTCGCGGTCCGACCTGGGCATCCGAAGGAGGACGCACGTCCACTCG-3′；(SEQ ID NO：2)

DNA3HDRZ3：

5′-ATTTAAATGCGGCCGCGGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTCGCGGTC-3′(SEQ IDNO：3)

DNA3B：5′-TTAATTAAGCTAGCAGTTAGCCAGA

TGC-3′(SEQ ID NO：4)。

通过将外源蛋白编码序列引入本发明的猫杯状病毒感染性克隆中，即可表达翻译得到外源蛋白。

本发明的有益效果是：

实验结果表明，使用本发明克隆生产得到的FCV，与亲本毒具有相似的特性，具有很好地感染性，可使细胞明显变性，滴度高，传代稳定。有利于长期使用。

通过引入核酶序列，有助于基因组3`端的精确组装。

附图说明

图1是FCV全序列的PCR产物的电泳图；

图2是改造的pcDNA3载体的电泳图；

图3是引入核酶过程中间序列的PCR产物的电泳图；

图4是病毒复制的动力曲线图。

具体实施方式

全长的扩增

PCV的全序列如GenBank ID：GU214989.1所示。

使用引物：FCVNORZ：5′-GCAGAGCTCTCTGGCTAACTGTAAAAGAAATTTGAGAC-3′(SEQ ID NO：5)(下划线部为Sac I酶切位点)。前半部分为pCDNA序列，后半部分为FCV序列。FCVhouB：5′-TTTTCTAGAGCGGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′(SEQID NO：6)。(下划线为Not I酶切位点)。以含有DCV全长的质粒为模板，使用PrimeSTAR^TMHSDNAPolymerase扩增，反应体系：PrimeSTAR 0.5μL，dNTP(2.5mM)4μL，5×PS Buffer10μL，FCVNORZ(10mM)1μL，FCVhouB(10mM)1μL，pFCV0.5μL，ddH₂O up to50μL。PCR程序：95℃5min；98℃10s，59℃15s，72℃4min，30个循环；72℃10min。

琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物

以1×TAE缓冲液配制1％琼脂糖凝胶，每个加样槽中加入5μL PCR产物，λDNA/HindIIIMarker做对照，80V电泳30min，观察结果。其结果如图1所示，图中，1为PCR产物，M为Marker。

产物的回收和纯化

按DNA小量凝胶回收试剂盒的使用说明进行，具体操作如下：PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳后，用洁净的手术刀在紫外灯下快速切下含有目的片段的凝胶，使它尽可能的小，放入1.5M Eppendorf管中称重，向胶块中加入3倍体积溶胶液PN，50℃水浴放置10min。将上一步所得的溶液加入吸附柱CA1中，13,000r/rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附管重新放入收集管中。向吸附柱中加入700μL漂洗液PW(使用前以1∶4加入无水乙醇)13,000r/rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。向吸附柱中加入500μL漂洗液PW，13,000r/rpm离心30s，倒掉废液。将离心柱放回收集管中，13,000r/rpm离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱于室温或50℃温箱5min，彻底晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步实验。将吸附柱放到一个干净的Eppendorf管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量65～70℃水浴预热的洗脱缓冲液EB，室温放置2min。13,000r/rpm离心1min收集DNA溶液。为了提高DNA回收量，可以将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，13,000r/rpm离心1min收集DNA溶液。

载体的改造

通过PCR方法去掉商品化质粒pcDNA3中原有的f1、ori、SV40、neo、plyA序列，以：PDNA3F：5’-CGGTATCAGCTCACTCAA-3’(SEQ ID NO：7)和PDNA3B：5’-TGGTTCTTTCCGCCTCAG-3’(SEQ ID NO：8)为引物扩增改造后的质粒。

PCR程序是：95℃5min；98℃10s，55℃15s，72℃3min30s，30个循环；72℃10min。

将PCR产物进行电泳，其结果如图2所示，图中，1为PCR产物，M为Marker。

回收PCR产物对其进行磷酸化，使用T4 Polymucleotide Kinase。体系是：纯化PCR产物25μL，10×T4 Buffer 5μL，T4 PNK 2μL，ATP 0.5μL，补水至50μL。自连后转化感受态细胞JM109，挑单菌落并鉴定阳性质粒。送Invitrogen测序。然后再抽提质粒。改造后的载体命名为pCDNA。

产物的连接、转化与阳性克隆质粒的鉴定

1)大肠杆菌感受态细胞的制备

在无菌条件下，挑取保存的JM109菌种，划线接种于不含抗生素的LB琼脂平板上，37℃倒置培养16h左右。挑取单个菌落，接种到3mL不含抗生素的LB培养液中，37℃振摇培养过夜。次日无菌吸取1mL细菌培养液加入到预热至37℃的100mL不含抗生素的LB培养液中，37℃剧烈振摇培养。培养至培养物的OD600＝0.4～0.5(约2.5～3h)后，冰浴15min，使培养物冷却至0℃。在无菌条件下(注意，以下操作均需严格无菌且在冰水浴中进行)，将细菌培养液转移到2个无菌且冰预冷的50mL聚丙烯离心管中，4℃条件下离心(4,000r/rpm)10min，弃上清；回收细菌沉淀，每管加入10mL冰预冷的75mmol/L CaCl₂、10mmol/LTris·Cl(pH 6.5)溶液重悬沉淀，冰浴10min，4℃4,000r/rpm离心10min，彻底弃上清；每管用2mL冰浴冷的CaCl₂保存液(75mmol/L CaCl₂、10mmol/L Tris.Cl、pH 6.5、15％(v/v)甘油)将菌体沉淀悬起。将重悬好的感受态细胞分装于无菌微量离心管中，每管100μL，置-70℃超低温冰箱冻存备用。

2)扩增产物与pMD18-T连接

将琼脂糖凝胶回收纯化的PCR产物与pMD18-T载体连接，连接反应体系为：DNA回收片段3μL，pMD18-T载体0.5μL，ligation Rase 1μL加水补至10μL，于16℃连接过夜。

3)连接产物的转化

在冰水中融化一支JM 109感受态细胞，将10μL连接产物加入其中并轻轻混匀，冰浴30min，42℃热冲击90s后，立即冰浴5min，加500μL LB(37℃)培养基，37℃以80-100r/rpm振摇1h，取50μL～200μL加到含Amp(50μg/mL)的LB琼脂板上，待菌液吸收后将平板倒置，于37℃培养过夜或14h～16h，可出现转化菌落。

4)阳性克隆质粒的鉴定

菌液PCR鉴定

挑取单菌落，做菌液PCR鉴定。反应体系如下：

取一洁净0.2mL PCR管，加10×Ex Taq buffer 5μL，2.5mM dNTP 2μL，上游引物1μL，下游引物1μL，菌液1μL，Ex Taq酶0.5μL，补水至25μL，瞬时离心10s，放置PCR仪上进行循环扩增，参数同上。

1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR反应产物，观察并记录结果。

质粒的小量制备(碱裂解法)

挑取单克隆，在含有Amp的LB培养基中培养，参照TaKaRa质粒提取试剂盒中说明书提取重组质粒。

质粒PCR鉴定

反应体系为：取一洁净0.2mL PCR管，加10×ExTaq buffer 5μL，2.5mM dNTP2μL，上游引物1μL，下游引物1μL，质粒0.1μL，Ex Taq酶0.5μL，补水至25μL，瞬时离心10s，放置PCR仪上进行循环扩增。PCR反应参数同上。1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR反应产物，观察并记录结果。阳性质粒命名为pMD-pCDNA。

核酶的引入

为了便于体内转录，并使合成的RNA就有精确地末端结构，在改造后的载体pCDNA的-3′端通过多重PCR(Multi-PCR)分三步在基因组-3′端引入Hep atitis delta ribozyme(HdvRz，88bp)。HdvRz的自我剪切位点在其5′-末端的鸟嘌呤之后的磷酸二酯键。

使用PrimeSTARTMHS DNAPolymerase以保证序列的真实性。

HdvRz的序列(88bp)

5′-GGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTCGCGGTCCGACCTGGGCATCCGAAGGAGGACGCACGTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGGGCG-3′(SEQ ID NO：9)。

引入核酶引物：

上游引物

DNA3HDRZ1

5′-GGACGCACGTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGGGCGCTGATCAGCCTCGACTGTGC-3′(SEQ ID NO：1)下划线为pCDNA3序列，其它为HDVRZ；

DNA3HDRZ2

5′-TCCACCTCCTCGCGGTCCGACCTGGGCATCCGAAGGAGGACGCACGTCCACTCG-3′(SEQ ID NO：2)

DNA3HDRZ3

5′-ATTTAAATGCGGCCGCGGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTCGCGGTC-3′(SEQ IDNO：3)下划线部分依次为Smi I和Not I序列，其它为DNA3HDRZ2重复序列。

下游引物

DNA3B

5′-TTAATTAAGCTAGCAGTTAGCCAGAGAGCTCTGC-3′(SEQ ID NO：4)双线为pCDNA3TATA盒后序列，下划依次为PacI、NheI、NotI序列。

多重PCR的步骤如下：

1)第一步PCR以pCDNA3为模板，以DNA3HDRZ1和DNA3B为引物。PCR程序是：95℃5min；98℃10s，55℃15s，72℃4min，30个循环；72℃10min。得到的PCR产物命名为pHDRZ1；

2)第二步PCR以pHDRZ1为模板，以DNA3HDRZ2和DNA3B为引物。PCR程序是：95℃5min；98℃10s，55℃15s，72℃4min，30个循环；72℃10min。得到的PCR产物命名为pHDRZ2；

3)第三步PCR以pHDRZ2为模板，以DNA3HDRZ3和DNA3B为引物。PCR程序是：95℃5min；98℃10s，59℃15s，72℃4min，30个循环；72℃10min。得到的PCR产物命名为pCDNA-HDRZ；

胶回收pCDNA-HDRZ连接pMD18-T载体，转化，挑单菌落，鉴定阳性克隆，送Invitrogen测序。阳性质粒命名为pMD-pCDNA-HDRZ。

pHDRZ1、pHDRZ2、pCDNA-HDRZ的电泳图如图3所示。图中，1～3为PCR产物pHDRZ1、pHDRZ2、pCDNA-HDRZ，M为Marker。

全基因组真核表达载体的构建

用NotI和SacI处理pMD-pCDNA-HDRZ，得到含有NotI和SacI两个酶切位点的pCDNA-HDRZ表达载体，纯化后-20℃保存备用，用Hind III处理用Prime STAR ^TMHS DNA Polymerase扩增得到的FCV全长片段，FCV变成前后两个片段FCVqian(3.2k)和FCVhou(4.7k)，FCVqian再用Sac I和Hind III处理，FCVhou用Hind III和Not I处理，分别纯化后与之前经Not I和Sac I处理过的pCDNA-HDRZ载体，连接、转化、鉴定，阳性命名为pCDNA-HDRZ-FCV。

得到的载体pCDNA-HDRZ-FCV可用于外源蛋白的表达。

病毒的拯救

因为FCV可以在细胞上培养，所以可以直接在敏感的细胞系中拯救病毒。方法：采用脂质体转染法将FCV全基因组真核表达载体pCDNA-HDRZ-FCV转染F81细胞。

感染性克隆的鉴定

转染敏感细胞

转染后继续培养，观察细胞病变的出现情况。至少盲传三代，若出现典型的细胞病变则继续传代。

盲传三代后收获出现CPE的细胞培养物，反复冻融三次后，抽提病毒总RNA，然后用特异引物进行RT-PCR，如果能扩增到特异性条带，则证明被检细胞中含有拯救的病毒。

拯救病毒与亲本病毒的区别鉴定

由于在构建感染性克隆的时候，预先在病毒的cDNA序列中插入了一个“遗传标志”(geneticmarker)即分子标签-限制性内切酶Mlu I，该酶切位点。通过对该分子标签的检测，将由感染性克隆衍生的病毒与野生型病毒区分开来。首先用特异性引物将含有该酶切位点的片段扩增出来，然后用Mlu I消化此片段，结果预期可产生两个片段。而野生型病毒的相应扩增片段中不含有Mlu I酶切位点，则不能被切割，从而将两者区别开来。将拯救出来的病毒命名为rmFCV。

拯救毒与亲本毒复制动力学比较

按常法滴定拯救毒rmFCV和亲本毒FCV的TCID₅₀效价，然后做病毒复制动力学实验，具体步骤如下：

①F81铺满单层时，弃去培养液，用PBS液洗三次，将拯救毒rmFCV和亲本毒FCV分别接种，接种量为100TCID₅₀ 100μL，置37℃、5％CO₂孵育1h后，弃去病毒液，再用PBS液洗三次，加入8mL细胞维持液(含1％FBS和100U/mL双抗的1640)，置37℃CO₂培养箱中培养；

②于8h，16h，24h，32h、40h、48h分别取细胞上清200μL，滴定其TCID₅₀效价；

③接毒、取样、TCID₅₀效价测定均重复3次，统计分析后，绘制病毒复制动力曲线图。其动力曲线图如图4所示。由图可知，拯救毒rmFCV与亲本毒FCV具有基本一致的复制动力学曲线。

<110>  广东省农业科学院兽医研究所

 

<120>  猫杯状病毒感染性克隆及其构建方法和应用

 

<130> 

 

<160>  9    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  55

<212>  DNA

<213>  人工引物

 

<400>  1

ggacgcacgt ccactcggat ggctaaggga gggcgctgat cagcctcgac tgtgc            55

 

 

<210>  2

<211>  54

<212>  DNA

<213>  人工引物

 

<400>  2

tccacctcct cgcggtccga cctgggcatc cgaaggagga cgcacgtcca ctcg             54

 

 

<210>  3

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<212>  DNA

<213>  人工引物

 

<400>  3

atttaaatgc ggccgcgggt cggcatggca tctccacctc ctcgcggtc                   49

 

 

<210>  4

<211>  34

<212>  DNA

<213>  人工引物

 

<400>  4

ttaattaagc tagcagttag ccagagagct ctgc                                   34

 

 

<210>  5

<211>  38

<212>  DNA

<213>  人工引物

 

<400>  5

gcagagctct ctggctaact gtaaaagaaa tttgagac                               38

 

 

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<211>  55

<212>  DNA

<213>  人工引物

 

<400>  6

ttttctagag cggccgcttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttt            55

 

 

<210>  7

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工引物

 

<400>  7

cggtatcagc tcactcaa                                                     18

 

 

<210>  8

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工引物

 

<400>  8

tggttctttc cgcctcag                                                     18

 

 

<210>  9

<211>  88

<212>  DNA

<213>  丁肝病毒

 

<400>  9

gggtcggcat ggcatctcca cctcctcgcg gtccgacctg ggcatccgaa ggaggacgca       60

 

cgtccactcg gatggctaag ggagggcg                                          88

Claims (1)

1.猫杯状病毒感染性克隆的构建方法，通过在FCV病毒的全长cDNA的两端连接酶切位点，之后将序列连接到表达载体中得到，所述表达载体为去除了f1、 ori 、SV40、 neo和plyA序列的商品化质粒pcDNA3，表达载体的3’端连接有自剪切型核酶；

其构建方法包括以下步骤：

1)  使用PCR法扩增FCV全长cDNA，并在两端引入酶切位点，得到FCV全长基因组；

2)  将商品化质粒pcDNA3的f1、 ori 、SV40、 neo和plyA序列去除，得到改造质粒，命名为pCDNA；

3)  在改造质粒pCDNA的3’端引入核酶序列，得到的产物命名为pCDNA-HDRZ；

4)  将克隆出FCV全长基因组与pCDNA-HDRZ相连接，得到猫杯状病毒感染性克隆；

其中，引入核酶序列时包括如下步骤：

1)  以pCDNA为模板，以DNA3HDRZ1和DNA3B为引物，进行PCR，PCR程序是：95℃ 5min；98℃10s，55℃15s，72℃4min，30个循环；72℃10min，得到PCR产物pHDRZ1；

2)  以pHDRZ1为模板，以DNA3HDRZ2和DNA3B为引物，PCR程序是：95℃ 5min；98℃10s，55℃15s，72℃4min，30个循环；72℃10min，得到的PCR产物命名为pHDRZ2；

3)  以pHDRZ2为模板，以DNA3HDRZ3和DNA3B为引物，PCR程序是：95℃ 5min；98℃10s，59℃15s，72℃4min，30个循环；72℃10min，得到的PCR产物命名为pCDNA-HDRZ；

4)  胶回收pCDNA-HDRZ连接pMD18-T载体，转化，得到改造载体；

其中，引物的序列为：

DNA3HDRZ1：5′-GGACGCACGTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGGGCGCTGATCAGCCTCGACTGTGC 3′；（SEQ ID NO：1）

DNA3HDRZ2：

5′-TCCACCTCCTCGCGGTCCGACCTGGGCATCCGAAGGAGGACGCACGTC CACTCG-3′；（SEQ ID NO：2）

DNA3HDRZ3：

5′-ATTTAAATGCGGCCGCGGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTCGCGGTC-3′（SEQ ID NO：3）

DNA3B：5′- TTAATTAAGCTAGCAGTTAGCCAGAGAGCTCTGC-3′（SEQ ID NO：4）。

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