CN102559711A - 鱼腥蓝细菌2-酮基-肌醇脱氢酶基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鱼腥蓝细菌2-酮基-肌醇脱氢酶基因、该基因的克隆方法及其应用。本发明鱼腥蓝细菌2-酮基-肌醇脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，所编码的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明以鱼腥蓝细菌的总DNA为模板，利用上下游引物扩增得到2-酮基-肌醇脱氢酶编码基因。该基因在光合模式生物蓝细菌中进行超量表达，能够显著提高转基因菌株对除草剂百草枯的抗性，揭示了该基因在构建抗除草剂转基因植物中的广阔运用前景。

Description

鱼腥蓝细菌2-酮基-肌醇脱氢酶基因及其应用

技术领域

本发明涉及鱼腥蓝细菌基因工程技术领域，具体涉及鱼腥蓝细菌2-酮基-肌醇脱氢酶基因，本发明还涉及该基因的克隆方法及其在抗百草枯除草剂转基因植物中的应用。

背景技术

杂草控制是农业生产管理中的重要环节。传统的杂草控制主要通过不断耕耘及人工除草进行。上个世纪四十年代，随着对杂草的化学控制技术的深入发展，一系列用于杂草控制的化学除草剂开始大量出现。目前应用最广泛的除草剂包括苯氧羧酸类的二四滴及其衍生物；苯甲酸类如百草敌等；有机磷类如草甘膦及其衍生物；联吡啶类如百草枯等。

抗除草剂转基因作物通过增加作物对特定除草剂的耐受能力，能够一次性高效杀灭杂草，进行无耕种植，减少水土流失；尤其在草坪工业、育种育苗领域有着传统除草剂难以比拟的优势。同时抗除草剂作物也能极大减轻除草剂本身对于作物的影响，增加农业产量。世界上第一个抗除草剂转基因作物是1996年美国出现的抗草甘膦转基因大豆，此后抗除草剂转基因油菜、棉花、玉米、甜菜、苜蓿等陆续推出商用种植。抗除草剂转基因作物的物质基础是抗除草剂的基因资源的分离和运用。以抗草甘膦为例，目前已经运用的主要有超表达EPSPs(5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶)或超表达草甘膦氧化酶和草甘膦N-乙酰转移酶来解除草甘膦对作物的毒性等。目前商品化最为广泛的是美国孟山都公司所拥有的Roundup Ready作物。目前全球已经有超过50个抗除草剂转基因作物进行了商业种植，主要的除草剂与抗性基因搭配为草甘膦---CP4epsps，草丁膦-pat或者bar，辛酰卤苯腈---bxn，磺酰脲类-surB。

“百草枯”又名“克无踪”，是世界上用量第二大的除草剂，仅次于草甘膦。它具有非选择性和触杀特性，因此被广泛用于农业和园艺除草以及棉花、大豆等的催枯。百草枯的作用机理是通过干扰光合植物的光合反应中心I(PSI)附件的电子传递，并介导生成活性氧(Reactive oxygen species)组分，对细胞产生致死效应。目前认为细胞主要通过增加对百草枯的外排能力或者降低其吸收能力来降低细胞内的百草枯浓度，从而提升对环境百草枯的抗性。目前尚无抗百草枯转基因作物的报道。涉及百草枯抗性的相关基因主要是一些编码ABC型转运子的基因如大肠杆菌的emrB、emrE等(Prosecka，Orlov et al.2009)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来自鱼腥蓝细菌的2-酮基-肌醇脱氢酶基因，以及该基因的克隆方法及其在抗百草枯除草剂转基因植物中的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种鱼腥蓝细菌2-酮基-肌醇脱氢酶基因，该基因是由1116个核苷酸组成，它的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

上述鱼腥蓝细菌2-酮基-肌醇脱氢酶基因所编码的多肽，由371个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。多肽的分子量大小约为41.22千道尔顿(kDa)。

上述鱼腥蓝细菌2-酮基-肌醇脱氢酶基因的克隆方法包括以下步骤：

(1)分离鱼腥蓝细菌总DNA；

(2)根据鱼腥蓝细菌的基因组序列，设计上下游引物：上游引物为GCCCATATGTTGGCAAAAAATGAG；下游引物为GCCCTCGAGGGAAATAGGTTATAAGTC，在上下游引物中分别引入NdeI和XhoI核酸内切酶酶切位点；

(3)以鱼腥蓝细菌总DNA为模板，利用上下游引物进行PCR扩增，得到PCR产物；

(4)回收PCR产物；

(5)将PCR产物利用NdeI和XhoI核酸内切酶连入克隆载体pBSpetE中，构建重组质粒；

(6)用重组质粒转化大肠杆菌，进行培养、活化。

该基因在光合模式生物蓝细菌中进行超量表达，能够显著提高转基因菌株对除草剂百草枯的抗性，揭示了该基因在构建抗除草剂转基因植物中的广阔应用前景。利用本发明所构建的转基因光合细菌对除草剂百草枯的抗性得到显著提高，这为开展抗除草剂转基因作物提供了新的候选基因资源。

附图说明

图1：是本发明实施例中构建克隆载体pBSpetE1580和超表达载体pRL25TpetE1580的示意图；

图2：是本发明实施例分离转基因蓝细菌中的重组质粒的酶切后的凝胶电泳图；

M：是分子量标准；

1：重组质粒经过NotI和XhoI双酶切的琼脂糖凝胶电泳结果。

图3：是本发明实施例中转基因蓝细菌对百草枯抗性测试的直观图；

图4：是本发明实施例中转基因蓝细菌对百草枯抗性的统计图。

具体实施方案

以下是结合附图和实施例对本发明作的进一步阐述。需要说明的是，本发明的实施例对于本发明只有说明作用，而没有限制作用。

有关DNA的标准操作方法和所使用的药品均参考《分子克隆实验指南》所描述的内容(参见J.萨姆布鲁克等，2002，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，北京)。

实施例1 鱼腥蓝细菌2-酮基-肌醇脱氢酶基因的克隆

以鱼腥蓝细菌的总DNA为模板，扩增得到2-酮基-肌醇脱氢酶编码基因(申请人将其命名为1580，下同)。将1580基因连接入克隆载体pBSpetE中，然后进行测序和序列分析，具体步骤为：

(1)鱼腥蓝细菌总DNA的分离：离心收集约20mL的蓝细菌菌体，加入400μL TE缓冲液(pH7.5)，150μL的玻璃珠(Sigma G-9143)，20μL10％的SDS，以及450μL苯酚/氯仿(1∶1)混合物，全速振荡三次，每次1min，每次间隔放置在冰上冷却，然后全速(13,000rpm)离心混合物1分钟，取上清，用等体积的苯酚/氯仿(1∶1)反复抽提，直至苯酚/氯仿交界处看不到变性的蛋白质，取上清，加入1/10体积的3M NaAc，混合，再加入2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，混合，全速(13,000rpm)离心5min，加入70％乙醇洗涤一次，沉淀干燥，最后溶于50μL水中，利用紫外分光光度计进行DNA浓度测量，在-20℃保存备用；

(2)根据鱼腥蓝细菌的基因组序列，设计上下游引物：上游引物为GCCCATATGTTGGCAAAAAATGAG；下游引物为GCCctcgagGGAAATAGGTTATAAGTC，在上下游引物中分别引入NdeI和XhoI核酸内切酶酶切位点；

(3)以鱼腥蓝细菌总DNA为模板，利用与上下游引物进行PCR扩增，得到PCR产物。扩增反应的具体条件为：利用高保真PCR试剂盒，加入终浓度为1pmol/μL的上下游引物；25pmol/μL的dNTP，25pmol/μL的Mg2+及试剂盒所附带的相关反应缓冲液和DNA聚合酶；混匀以后，将反应管置于PCR仪上，按照下列程序进行PCR反应：95℃预变性5分钟；95℃预变性30秒，57℃预变性45秒，68℃预变性1分钟，进行25个循环；68℃5分钟，4℃5分钟；

(4)回收PCR产物：采用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物；

(5)如图1所示，将PCR产物利用Nde I和Xho I核酸限制性内切酶连入克隆载体pBSpetE中，构建具有氨苄青霉素抗性的重组质粒pBSpetE1580；

(6)用重组质粒转化大肠杆菌，进行培养、活化：用pBSpetE1580转化大肠杆菌E.coli TG1，并涂布在氨苄青霉素抗性平板(Ampr，终浓度为100ug/ml)。将抗性平板置于37℃培养箱中培养8-12h，待转化子长到一定大小以后，将菌落接入5ml的液体LB培养基(LB培养基配方：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠0.5％，pH 7.0)活化培养。

实施例2转基因鱼腥蓝细菌的构建

(1)鱼腥蓝细菌超表达载体的构建

本发明使用一个蓝细菌高效启动子petE作为1580启动子，然后选择一个多拷贝质粒pRL25T作为表达载体，将1580置于petE驱动下，通过pRL25T，实现在光合细菌蓝细菌中的高效表达(Shi，Li et al.2007)，具体实施步骤为：

将实施例1中的重组克隆pBSpetE1580置于petE启动子之后，如图1所示；接下来，利用核酸内切酶NotI和XhoI将petE和1580一起切下来；然后用相同的酶消化pRT25T，进行酶连，生成具有卡那霉素抗性的鱼腥蓝细菌超表达载体pRL25TpetE1580。

(2)转基因蓝细菌的分离和鉴定

将上述超表达载体利用蓝细菌三亲本杂交技术转入蓝细菌，实现其超量表达。具体方法如下：

首先将超表达载体pRL25TpetE1580转化大肠杆菌E.coli HB101/pRL623，然后在添加卡那霉素和氯霉素抗性的LB平板上获取转化子，并挑取单菌落接入具有同样抗生素的20毫升液体LB培养基中培养到对数期。同时，在终浓度为100μg/mL Amp(氨苄西林)的LB培养基中，培养大肠杆菌E.coli J53/RP4 20mL至对数生长期后期。鱼腥蓝细菌因生长周期长，需提前培养，以确保进行三亲本杂交试验时蓝细菌也处于对数生长期。

等量混合培养好的两种大肠杆菌，5000rpm离心5min，除去培养基；然后加入不含有抗生素的LB 30ml，轻微悬浮菌体，然后5000rpm离心5min；去除培养基后，加入1ml的不含有抗生素的LB，轻微悬浮待用；通过5000rpm离心5min，收集10ml左右蓝细菌培养物，然后将蓝细菌加入已经混合好的大肠杆菌中。光照静置培养1-2小时后均匀地涂布在不含抗生素的BG11平板上。平板在28℃光照培养箱中培养24小时后，在培养基下加入100μg/mL的新霉素，继续培养，大约7～10天(或更长时间约2周)后，转基因蓝细菌单菌落将会产生，然后将单菌落转接到新鲜的含对应抗生素的平板上进行活化，最后接入液体BG11培养基中进行扩大培养。

将获取的转基因蓝细菌按照实施例1所提供的方案分离蓝细菌总DNA，然后将总DNA转入大肠杆菌E.coli TG1，然后在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上筛选菌落，将获取的菌落接种到液体LB培养基中进行扩大培养后分离质粒DNA。对分离出来的质粒DNA进行酶切验证，结果如图2所示，表明转基因蓝细菌中含有我们在本实施例中转入的重组质粒，将转基因蓝细菌命名为OE1580。

申请人将上述含有2-酮基肌醇脱氢酶基因的大肠杆菌工程菌(拉丁文名称为Escherichia coli TG1)命名为GC1101，申请人于2011年6月24日将该工程菌送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为：CCTCC NO：M2011214。

重组大肠杆菌(工程菌)GC1101的生物学及遗传学特性：

①生物学特性：菌体直杆状，营养体呈链状或单生，长1-3微米，宽0.4-0.7微米，革兰氏染色阴性，无芽胞，在牛肉膏蛋白胨培养基上菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑、呈灰色，在生理盐水中容易分散。生长温度范围为15-46℃，最适生长温度为37℃。兼性厌氧，在有氧条件下生长良好。在含0.5％NaCl的牛肉膏蛋白胨培养基中生长，最适生长pH为6.8-8.0。在葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、木胶糖、阿拉伯胶等培养基中产酸产气，甲基红反应阳性。

②遗传学特性：本发明是以大肠杆菌E.coli TG1为出发菌株得到的基因工程菌，含有本发明得到的2-酮基肌醇脱氢酶基因片段1580。经继代培养，2-酮基肌醇脱氢酶基因1580能够在工程菌中稳定存在，对受体菌的生长无重大影响。

实施例3转基因鱼腥蓝细菌的抗百草枯活性测试

将转基因蓝细菌和作为对照的原始野生型蓝细菌一起活化培养得到约400ml的培养物，至OD750＝0.3左右，分装到7个50ml小三角瓶中。然后分别加入百草枯至终浓度为0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2μM，继续光照培养6天，取样观察。本实施例进行了多次平行试验，其中一次试验结果如图3所示，野生型蓝细菌在含有百草枯终浓度0.2μM以后就开始死亡；而突变体可以耐受的百草枯浓度达到1.2μM。多次平行试验的统计结果如图4所示，同野生型相比，转基因蓝细菌可以耐受更高浓度的百草枯，这说明1580具有显著提升绿色植物对百草枯耐受的潜力。

Claims (4)

1.鱼腥蓝细菌2-酮基-肌醇脱氢酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述的鱼腥蓝细菌2-酮基-肌醇脱氢酶基因所编码的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.根据权利要求1所述的鱼腥蓝细菌2-酮基-肌醇脱氢酶基因的克隆方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)分离鱼腥蓝细菌总DNA；

(2)根据鱼腥蓝细菌的基因组序列，设计上下游引物：上游引物为GCCCATATGTTGGCAAAAAATGAG；下游引物为GCCCTCGAGGGAAATAGGTTATAAGTC，在上下游引物中分别引入Nde I和XhoI核酸内切酶酶切位点；

(3)以鱼腥蓝细菌总DNA为模板，利用上下游引物进行PCR扩增，得到PCR产物；

(4)回收PCR产物；

(5)将PCR产物利用Nde I和XhoI核酸内切酶连入克隆载体pBSpetE中，构建重组质粒；

(6)用重组质粒转化大肠杆菌，进行培养、活化。

4.根据权利要求1所述的鱼腥蓝细菌2-酮基-肌醇脱氢酶基因在抗百草枯除草剂转基因植物中的应用。

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