CN102559588A - 一种模拟体内环境诱导脂肪基质细胞为神经干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
一种模拟体内环境诱导脂肪基质细胞为神经干细胞的方法，(1)选取离体鼠类脑组织中海马、大脑皮层或小脑部位，获得其可溶性物质；(2)选取离体鼠类皮下脂肪组织，获得脂肪基质细胞；(3)取脂肪基质细胞进行预处理后获得的重悬后脂肪基质细胞，加入培养基和鼠类脑组织中海马可溶性物质、大脑皮层或小脑可溶性物质，将细胞悬液培养后，通过鼠类脑组织中的海马、大脑皮层或小脑可溶性物质诱导脂肪基质细胞成神经干细胞。该方法采用鼠类脑组织的海马、大脑皮层和小脑部位等外环境所含可溶性物质作为生理诱导剂，诱导鼠类皮下组织中的脂肪基质细胞为神经干细胞，实现在生理条件下促使和加快种子细胞的形成。
Description
技术领域
本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种模拟体内环境诱导脂肪基质细胞为神经干细胞的方法。
背景技术
近年来，神经干细胞作为移植治疗神经退行性疾病的种子细胞，在基础研究与临床试验中引起了众多学者的关注。神经干细胞的诱导一直是神经医学领域中一个难点。主要原因在于：诱导环境中因子种类选择、因子浓度的确定以及神经干细胞状态长期维持；使用外来因子诱导而成的神经干细胞移植治疗的争论。
发明内容
本发明的目的在于提供一种模拟体内环境诱导脂肪基质细胞为神经干细胞的方法，该方法采用鼠类脑组织不同的部位如海马、大脑皮层和小脑部位等外环境所含可溶性物质作为生理诱导剂，诱导鼠类皮下组织中的脂肪基质细胞为神经干细胞从而实现在生理条件下促使和加速种子细胞的形成。
本发明的上述目的是通过如下技术方案来实现的：一种模拟体内环境诱导脂肪基质细胞为神经干细胞的方法，含以下步骤：
(1)选取离体鼠类脑组织中的海马、大脑皮层或小脑部位，置于DMEM F12培养基中，经摇床震荡和离心处理后，取上清液，过滤后灭菌获得鼠类脑组织中的海马、大脑皮层或小脑可溶性物质，保存备用；
(2)选取离体鼠类皮下脂肪组织，采用I型胶原酶消化后，使用胎牛血清或新牛血清终止消化，过滤，取滤液，离心后弃去上清液，在下层物质中加入培养基重悬细胞，接种，在培养基和体积百分含量为10％的胎牛血清或新牛血清中培养后，细胞扩增至第二代，经流式鉴定确认为脂肪基质细胞；
(3)取步骤(2)中获得的脂肪基质细胞进行预处理后获得的重悬后脂肪基质细胞，取出重悬后脂肪基质细胞，加入培养基和步骤(1)中制备的鼠类脑组织中海马、大脑皮层或小脑可溶性物质，将细胞悬液培养后，通过鼠类脑组织中的海马、大脑皮层或小脑可溶性物质诱导脂肪基质细胞成神经干细胞。
在上述步骤中：
步骤(1)中摇床震荡时的温度为4℃，震荡时间为1-3h。
步骤(1)中离心时的温度为4℃，离心机的转速为18000×g，离心时间为20-40min。
步骤(2)中I型胶原酶的体积百分含量为0.5-1.5％，消化时间为20-40min；所述培养基为DMEM、DMEM/高糖、DMEM/低糖或DMEM F12，其中DMEM为Dulbecco′sModified Eagle Medium培养基的缩写，下同。
步骤(2)中离心时的转速为1000-1200r/min，离心时间为1-10min。
步骤(3)中所述培养基为DMEM、DMEM/高糖、DMEM/低糖、DMEM F12或神经干细胞培养基，关于神经干细胞培养基，可参阅本申请人早期的申请号为02134314.4的专利。
步骤(3)中脂肪基质细胞进行预处理的具体过程为：取步骤(2)中培养的脂肪基质细胞，经胰酶消化后，收集细胞，离心，弃去上清液，下层物质采用培养基重悬细胞，得重悬后脂肪基质细胞，其中所述胰酶的体积百分含量为0.125-0.25％。
步骤(3)中获得的重悬后脂肪基质细胞的浓度为1.0-3.0×106个细胞/mL。
步骤(3)中重悬后脂肪基质细胞与培养基的体积比为1∶1-4，重悬后脂肪基质细胞与步骤(1)中制备的鼠类脑组织中的海马、大脑皮层或小脑可溶性物质的体积比为1∶1-4。
步骤(3)中将细胞悬液培养时的条件为：在37℃，体积百分含量为5％CO2培养箱中培养。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明中的方法与目前使用的其他因子诱导方法相比，本发明方法为神经干细胞的诱导提供了一个生理环境，避免了当前一些“诱导间充质干细胞所成球为肿瘤化”的观点；而且比起目前常用方法，大大的缩短了诱导为神经干细胞的时间。
附图说明
图1是实施例1-3中采用的离体鼠类脑组织；
图2是是实施例1-3中采用的离体鼠类脑组织中的海马、大脑皮层和小脑部位；
图3是是实施例1-3中获得的离体鼠类脑组织中的海马、大脑皮层和小脑三个部位的可溶性物质；
图4是是实施例1-3中采用的离体鼠类脂肪基质细胞第2天倒置相差显微镜观察200×图示；
图5是是实施例1-3中采用的离体鼠类脂肪基质细胞第2天倒置相差显微镜观察400×图示；
图6是是实施例1-3中离体鼠类脂肪基质细胞流式鉴定中的阴性对照；
图7是是实施例1-3中离体鼠类脂肪基质细胞流式鉴定结果CD29为阳性；
图8是是实施例1-3中离体鼠类脂肪基质细胞流式鉴定结果CD44为阳性；
图9是是实施例1-3中离体鼠类脂肪基质细胞流式鉴定结果CD90为阳性；
图10是实施例1中脂肪基质细胞于含海马可溶性物质的DMEM F12培养基中诱导1d倒置相差显微镜观察，100×；
图11是实施例1中脂肪基质细胞于含海马可溶性物质的DMEM F12培养基中诱导1d倒置相差显微镜观察，200×；
图12是实施例2中脂肪基质细胞于含大脑皮层可溶性物质的DMEM F12培养基中诱导1d倒置相差显微镜观察，100×；
图13是实施例2中脂肪基质细胞于含大脑皮层可溶性物质的DMEM F12培养基中诱导1d倒置相差显微镜观察，200×；
图14是实施例3中脂肪基质细胞于含小脑可溶性物质的DMEM F12培养基中诱导1d倒置相差显微镜观察，100×；
图15是实施例3中脂肪基质细胞于含小脑可溶性物质的DMEM F12培养基中诱导1d倒置相差显微镜观察，200×；
图16是实施例1-3中P2脂肪基质细胞于20ng/mLEGF、bFGF和B-27中诱导5d倒置相差显微镜观察，100×(对照)，其中P2是细胞第二代(passage 2)的简写；
图17是实施例1-3中P2脂肪基质细胞于20ng/mLEGF、bFGF和B-27中诱导5d倒置相差显微镜观察200×(对照)；
图18是实施例1中P2脂肪基质细胞于含海马因子中诱导1d nestin表达免疫荧光鉴定阳性，200×；
图19是实施例1中中P2脂肪基质细胞于含海马因子中诱导1d DAPI染核，200×；
图20是实施例2中P2脂肪基质细胞于含大脑皮层因子中诱导1d nestin表达免疫荧光鉴定阳性，200×；
图21是实施例2中P2脂肪基质细胞于含大脑皮层因子中诱导1d DAPI染核，200×；
图22是实施例3中P2脂肪基质细胞于含小脑因子中诱导1d nestin表达免疫荧光鉴定阳性，200×；
图23是实施例3中P2脂肪基质细胞于含小脑因子中诱导1d DAPI染核，200×；
图24是实施例1-3中P2脂肪基质细胞诱导1d nestin表达免疫荧光鉴定阴性对照，200×；
图25是实施例1-3中P2脂肪基质细胞诱导1d DAPI染核阴性对照，200×；
图26是实施例1中P2脂肪基质细胞于含海马因子中诱导1d CD133表达免疫荧光鉴定阳性，200×；
图27是实施例1中P2脂肪基质细胞于含海马因子中诱导1d DAPI染核，200×；
图28是实施例2中P2脂肪基质细胞于含大脑皮层因子中诱导1d CD133表达免疫荧光鉴定阳性，200×；
图29是实施例2中P2脂肪基质细胞于含大脑皮层因子中诱导1d DAPI染核，200×；
图30是实施例3中P2脂肪基质细胞于含小脑因子中诱导1d CD133表达免疫荧光鉴定阳性，200×；
图31是实施例3中P2脂肪基质细胞于含小脑因子中诱导1d DAPI染核，200×；
图32是实施例1-3中P2脂肪基质细胞诱导1d CD133表达免疫荧光鉴定阴性对照，200×；
图33是实施例1-3中P2脂肪基质细胞诱导1d DAPI染核阴性对照，200×；
图34是实施例1中P2脂肪基质细胞于含海马因子中诱导1d nestin表达共聚焦显微镜鉴定阳性，800×；
图35是实施例1中P2脂肪基质细胞于含海马因子中诱导1d DAPI染核，800×；
图36是实施例2中P2脂肪基质细胞于含大脑皮层因子中诱导1d nestin表达共聚焦显微镜鉴定阳性，800×；
图37是实施例2中P2脂肪基质细胞于含大脑皮层因子中诱导1d DAPI染核，800×；
图38是实施例3中P2脂肪基质细胞于含小脑因子中诱导1d nestin表达共聚焦显微镜鉴定阳性，800×；
图39是实施例3中P2脂肪基质细胞于含小脑因子中诱导1d DAPI染核，800×；
图40是实施例1-3中P2脂肪基质细胞诱导1d nestin表达共聚焦显微镜鉴定阴性对照，800×；
图41是实施例1-3中P2脂肪基质细胞诱导1d DAPI染核阴性对照，800×；
图42是实施例1-3中P2脂肪基质细胞于含海马因子中诱导1d CD133表达共聚焦显微镜鉴定阳性，800×；
图43是实施例1中P2脂肪基质细胞于含海马因子中诱导1d DAPI染核，800×；
图44是实施例2中P2脂肪基质细胞于含大脑皮层因子中诱导1d CD133表达共聚焦显微镜鉴定阳性，800×；
图45是实施例2中P2脂肪基质细胞于含大脑皮层因子中诱导1d DAPI染核，800×；
图46是实施例3中P2脂肪基质细胞于含小脑因子中诱导1d CD133表达共聚焦显微镜鉴定阳性，800×；
图47是实施例3中P2脂肪基质细胞于含小脑因子中诱导1d DAPI染核，800×；
图48是实施例1-3中P2脂肪基质细胞诱导1d CD133表达共聚焦显微镜鉴定阴性对照，800×；
图49是实施例1-3中P2脂肪基质细胞诱导1d DAPI染核阴性对照，800×；
图50是实施例1-3中采用western blot法检测脂肪基质细胞nestin蛋白表达情况和P2脂肪基质细胞于含海马、大脑皮层和小脑因子中诱导1dnestin蛋白表达情况，其中1条带为P2脂肪基质细胞nestin蛋白表达情况，2，3，4条带分别为P2脂肪基质细胞于含海马、脑皮层和小脑因子中诱导1d nestin蛋白表达情况；
图51是实施例1-3中采用western blot法检测脂肪基质细胞CD133蛋白表达情况和P2脂肪基质细胞于含海马、大脑皮层和小脑因子中诱导1d CD133蛋白表达情况，其中1条带为P2脂肪基质细胞CD133蛋白表达情况，2，3，4条带分别为P2脂肪基质细胞于含海马、脑皮层和小脑因子中诱导1d CD133蛋白表达情况；
图52是实施例1-3中1、2、3、4条带为内参GAPDH表达情况，western blot法检测。
具体实施方式
实施例1
(一)大鼠海马可溶性物质的提取步骤：
(1)将离体鼠类脑组织中的海马部位，置于装有2mL冷的DMEM F12培养基的离心管中，如图1、2和3中所示；其中DMEM F12购自hyclone公司，下同；
(2)将装有海马部位的离心管置于4℃的摇床震荡2小时；
(3)在4℃下高速离心30分钟，离心机转速为18000×g(rcf)；
(4)取离心管上清液，过滤灭菌(图3)，分装，做好标记，-80℃超低温保存，备用。
(二)脂肪间基质细胞的取材、培养：
(1)将鼠类离体脂肪组织少许置于体积百分含量为1％的2mL I型胶原酶消化30分钟；
(2)使用胎牛血清或新牛血清终止消化，400目滤网过滤，取滤液，1000r/min离心5分钟；
(3)弃离心后上清液，加入DMEM F12培养基2mL重悬细胞，接种到培养瓶里，以DMEM F12+体积百分含量为10％的胎牛血清为培养基，此处DMEM F12培养基还可以采用DMEM、DMEM/高糖、DMEM/低糖、DMEM F12或神经干细胞培养基等替代，在37℃、体积百分含量为5％CO2培养箱中培养；
(4)细胞扩增至第二代(图4、5)，采用显微镜，在200X和400X下可以发现细胞呈梭形生长，进行流式鉴定和诱导。
(三)脂肪间基质细胞的流式鉴定：
(1)采用体积百分含量为0.25％的胰酶消化2瓶长满的脂肪基质细胞，PBS清洗3次；
(2)分别使用100μL PBS将细胞重悬成4管(1管为阴性对照)，其余3管一次加入流式抗体CD29，CD44和CD90，室温孵育5分钟；
(3)将细胞收集后，重悬，加入抗体，即可上机，流式细胞仪检测结果如图6、7、8和9中所示，使用流式细胞仪对细胞表面CD29，CD44和CD90表达的鉴定呈阳性，说明分离获得的是脂肪基质细胞；
(四)使用大鼠海马可溶性物质诱导脂肪基质细胞成神经干细胞：
(1)取5瓶长满的脂肪基质细胞，使用体积百分含量为0.25％胰酶消化，收集细胞，1000r/min离心5分钟；
(2)弃上清液，使用3mLDMEM F12培养基重悬细胞，取1mL细胞悬液(约为1.0×106个细胞)，获得脂肪基质细胞，加入3mLDMEM F12培养基和1mL大鼠海马可溶性物质；
(3)将离心管中5mL细胞悬液接种于25cm2培养瓶中，在37℃5％CO2培养箱中培养；
(4)观察并拍照(图10-17)，从图10-11、16-17中的P2脂肪基质细胞于含海马可溶性物质中诱导1d倒置相差显微镜观察100X、200X可以看出细胞生长呈球形，即通过鼠类脑组织中的海马可溶性物质诱导脂肪细胞基质获得了神经干细胞(即神经球)，同时将P2脂肪基质细胞于20ng/mLEGF、bFGF和B-27中诱导5d倒置相差显微镜观察，在其100X(对照)和200X(对照)可以看出该细胞生长呈球形，也获得了神经干细胞。
(五)神经干细胞鉴定：
由于nestin蛋白和CD133蛋白均为神经干细胞高亲和表达蛋白，实验中常用此蛋白来鉴定神经干细胞。本实验通过免疫荧光(图18-19、26-27、24-25)、激光共聚焦(图34-35、42-43、40-41)、western blot来鉴定nestin蛋白和CD133蛋白的表达(图50-52)。使用以上3种方法来对神经干细胞的鉴定。
其中免疫荧光包括如下步骤：
(1)收集神经干细胞于离心管中，用磷酸缓冲液(PBS)清洗2遍；
(2)4％多聚甲醛固定20分钟，PBS清洗3次；
(3)1％Triton破膜10分钟；
(4)PBS清洗3次；
(5)山羊封闭血清37度封闭30分钟；
(6)一抗(抗-nestin和抗-CD133抗体，稀释比例为1∶200)孵育，过夜后，37℃复温1小时；
(7)PBS清洗3次；
(8)二抗(羊抗兔，稀释比例为1∶200)37℃孵育1小时；
(9)PBS清洗3次；
(10)加入DAPI，涂片于荧光显微镜观察，拍照。
其中激光共聚焦显微镜观察简要步骤：
(1)收集神经干细胞于离心管中，用磷酸缓冲液(PBS)清洗2遍；
(2)4％多聚甲醛固定20分钟，PBS清洗3次；
(3)1％Triton破膜10分钟；
(4)PBS清洗3次；
(5)山羊封闭血清37度封闭30分钟；
(6)一抗(抗-nestin和抗-CD133抗体，稀释比例为1∶200)孵育，过夜后，37℃复温1小时；
(7)PBS清洗3次；
(8)二抗(羊抗兔，稀释比例为1∶200)37℃孵育1小时；
(9)PBS清洗3次；
(10)加入DAPI，涂片于激光共聚焦显微镜观察，拍照。
其中Western blot包括以下步骤：
(1)分离胶和积层胶，制胶板；
(2)蛋白变性：准备蛋白样本(收集到的神经干细胞的蛋白，其中含有nestin蛋白和CD133蛋白)，加入等体积的2×上样Buffer稀释，置于沸水中煮10min(预染marker煮5min)；
(3)加样：每孔加入20～40μL样品
(4)电泳：置于电泳槽中电泳45min，恒定电流90mA(2块板)，如为1块板则电流为50mA；
(5)取出胶板，用切割刀修好胶；
(6)将胶置于转膜液中浸泡；
(7)按顺序放好下列物质：黑面→海绵→滤纸→胶→NC膜→滤纸(用吸管赶去气泡)→海绵；
(8)置于转膜槽中于，黑面对黑面，加上冰块，加入转膜液；
(9)装好电极，于恒定电压100V下，90min；
(10)丽春红染膜；
(11)用TBST洗去丽春红；
(12)封闭：加入5％脱脂奶粉+TBST，常温摇床摇1h；
(13)回收封闭液，加入一抗(抗-nestin抗体和抗-CD133抗体，用5％BSA+TBS稀释，稀释倍数为1∶200)；
(14)置于4℃摇床摇过夜；
(15)回收一抗，TBST洗膜，10min，共3次；
(16)加入二抗(二抗为辣根过氧化酶羊抗兔，用5％脱脂奶粉+TBS稀释，稀释倍数为1∶1000)，常温摇床摇1h；
(17)回收二抗，TBST洗膜，10min，共3次；
(18)将膜置于发光液中浸泡约1min；
(19)将膜铺于曝光盒中，于暗室中曝光，洗胶片。
目前普遍认为nestin蛋白和CD133是神经干细胞高亲和表达的蛋白，免疫荧光和激光共聚焦显微镜是利用抗原抗体结合的原理来鉴定的，western blot方法是先将神经干细胞里nestin蛋白和CD133蛋白提取出来，然后电泳，利用抗原抗体特异结合的原理来检测。Western blot中的条带就是蛋白质显示出来的。
免疫荧光来鉴定nestin蛋白和CD133蛋白的表达见图18、19、26和27，图片中的结果表明，通过鼠类脑组织中的海马可溶性物质诱导脂肪细胞基质获得了神经干细胞(即神经球)。
激光共聚焦来鉴定nestin蛋白和CD133蛋白的表达，如图34、35、42和43的结果表明，通过鼠类脑组织中的海马可溶性物质诱导脂肪细胞基质获得了神经干细胞(即神经球)。
Western blot来鉴定nestin蛋白和CD133蛋白的表达，如图50-52所示，图片中的结果表明，通过鼠类脑组织中的海马可溶性物质诱导脂肪细胞基质获得了神经干细胞(即神经球)，其中nestin蛋白有3个亚型，有3个分子量，Nestin蛋白的分子量依次是110、177和270KD，CD133的分子量是120KD。
实施例2
(一)大鼠大脑皮层可溶性物质的提取步骤：
(1)将离体鼠类脑组织中的大脑皮层部位，置于装有2mL冷的DMEM F12培养基的离心管中，如图1、2和3中所示；
(2)将装有大脑皮层部位离心管置于4℃的摇床震荡2小时；
(3)在4℃下高速离心20分钟，离心机转速为18000×g(rcf)；
(4)取离心管上清液，分别过滤灭菌(图3)，并分装，做好标记，-80℃超低温保存，备用。
(二)脂肪间基质细胞的取材、培养：
(1)将鼠类离体脂肪组织少许置于体积百分含量为1％的2mL I型胶原酶消化30分钟；
(2)使用胎牛血清终止消化，400目滤网过滤，取滤液，1000r/min离心5分钟；
(3)弃离心后上清液，加入DMEM F12培养基2mL重悬细胞，接种到培养瓶里，以DMEM F12+体积百分含量为10％的胎牛血清为培养基，在37℃、体积百分含量为5％CO2培养箱中培养。
(4)细胞扩增至第二代(图4、5)，采用显微镜，在200X和400X下可以发现细胞呈梭形生长。进行流式鉴定和诱导。
(三)脂肪间基质细胞的流式鉴定：
(1)采用体积百分含量为0.25％的胰酶消化2瓶长满的脂肪基质细胞，PBS清洗3次；
(2)分别使用100μL PBS将细胞重悬成4管(1管为阴性对照)，其余3管一次加入流式抗体CD29，CD44和CD90，室温孵育5分钟；
(3)将细胞收集后，重悬，加入抗体，即可上机，流式细胞仪检测结果如图6、7、8和9中所示，使用流式细胞仪对细胞表面CD29，CD44和CD90表达的鉴定呈阳性，说明分离获得的是脂肪基质细胞。
(四)使用大鼠大脑皮层可溶性物质诱导脂肪基质细胞成神经干细胞：
(1)取5瓶长满的脂肪基质细胞，使用体积百分含量为0.25％胰酶消化，收集细胞，1000r/min离心5分钟；
(2)弃上清液，使用3mLDMEM F12培养基重悬细胞，然后分到离心管中，每管1mL细胞悬液(约为1.0×106个细胞)，获得脂肪基质细胞，在离心管中加3mL DMEM F12培养基和1mL大鼠大脑皮层可溶性物质；
(3)将离心管中5mL细胞悬液接种于25cm2培养瓶中，在37℃5％CO2培养箱中培养；
(4)观察并拍照(图10-17)，从图10-11、16-17中的P2脂肪基质细胞于含海马可溶性物质中诱导1d倒置相差显微镜观察100X、200X可以看出细胞生长呈球形，即通过鼠类脑组织中的海马可溶性物质诱导脂肪细胞基质获得了神经干细胞(即神经球)，同时将P2脂肪基质细胞于20ng/mLEGF、bFGF和B-27中诱导5d倒置相差显微镜观察，在其100X(对照)和200X(对照)可以看出该细胞生长呈球形，也获得了神经干细胞。
(五)神经干细胞鉴定：
由于nestin蛋白和CD133蛋白均为神经干细胞高亲和表达蛋白，实验中常用此蛋白来鉴定神经干细胞。本实验通过免疫荧光(图22-23、24-25、28-29)、激光共聚焦(图36-37、40-41、44-45、48-49)、westernblot来鉴定nestin蛋白和CD133蛋白的表达(图50-52)。使用以上3种方法来对神经干细胞的鉴定。
由于nestin蛋白和CD133蛋白均为神经干细胞高亲和表达蛋白，实验中常用此蛋白来鉴定神经干细胞。本实验通过免疫荧光(图18-19、26-27、24-25)、激光共聚焦(图34-35、42-43、40-41)、western blot来鉴定nestin蛋白和CD133蛋白的表达(图50-52)。使用以上3种方法来对神经干细胞的鉴定。
目前普遍认为nestin蛋白和CD133是神经干细胞高亲和表达的蛋白，免疫荧光和激光共聚焦显微镜是利用抗原抗体结合的原理来鉴定的，western blot方法是先将神经干细胞里nestin蛋白和CD133蛋白提取出来，然后电泳，利用抗原抗体特异结合的原理来检测。Western blot中的条带就是蛋白质显示出来的。检测方法同实施例1中所述。
免疫荧光来鉴定nestin蛋白和CD133蛋白的表达见图20、21、28和29，图片中的结果表明，通过鼠类脑组织中的大脑皮层可溶性物质诱导脂肪细胞基质获得了神经干细胞(即神经球)。
激光共聚焦来鉴定nestin蛋白和CD133蛋白的表达，如图36、37、44和45中的结果表明，通过鼠类脑组织中的大脑皮层可溶性物质诱导脂肪细胞基质获得了神经干细胞(即神经球)。
Western blot来鉴定nestin蛋白和CD133蛋白的表达，如图50-52所示，图片中的结果表明，通过鼠类脑组织中的大脑皮层可溶性物质诱导脂肪细胞基质获得了神经干细胞(即神经球)，其中nestin蛋白有3个亚型，有3个分子量，Nestin蛋白的分子量依次是110、177和270KD，CD133的分子量是120KD。
综上所述，脂肪基质细胞在大鼠皮层可溶性物质中诱导后，为表达nestin和CD133阳性的神经干细胞。
实施例3
(一)大鼠小脑可溶性物质的提取步骤：
(1)将离体鼠类脑组织中的小脑部位，置于装有2mL冷的DMEM F12培养基的离心管中，如图1、2和3中所示；
(2)将装有小脑的离心管置于4℃的摇床震荡2小时；
(3)在4℃下高速离心30分钟，离心机转速为18000×g(rcf)；
(4)取离心管上清液，分别过滤灭菌(图3)，并分装，做好标记，-80℃超低温保存，备用。
(二)脂肪间基质细胞的取材、培养：
(1)将鼠类离体脂肪组织少许置于体积百分含量为1％的2mL I型胶原酶消化30分钟；
(2)使用胎牛血清终止消化，400目滤网过滤，取滤液，1000r/min离心5分钟；
(3)弃离心后上清液，加入DMEM F12培养基2mL重悬细胞，接种到培养瓶里，以DMEM F12+体积百分含量为10％的胎牛血清为培养基，在37℃、体积百分含量为5％CO2培养箱中培养。
(4)细胞扩增至第二代(图4、5)，采用显微镜，在200X和400X下可以发现细胞呈梭形生长。进行流式鉴定和诱导。
(三)脂肪间基质细胞的流式鉴定：
(1)采用体积百分含量为0.25％的胰酶消化2瓶长满的脂肪基质细胞，PBS清洗3次；
(2)分别使用100μLPBS将细胞重悬成4管(1管为阴性对照)，其余3管一次加入流式抗体CD29，CD44和CD90，室温孵育5分钟；
(3)将细胞收集后，重悬，加入抗体，即可上机，流式细胞仪检测结果如图6、7、8和9中所示，使用流式细胞仪对细胞表面CD29，CD44和CD90表达的鉴定呈阳性，说明分离获得的是脂肪基质细胞。
(四)使用大鼠小脑可溶性物质诱导脂肪基质细胞成神经干细胞：
(1)取5瓶长满的脂肪基质细胞，使用体积百分含量为0.25％胰酶消化，收集细胞，1000r/min离心5分钟；
(2)弃上清液，使用3mLDMEM F12培养基重悬细胞，然后分到离心管中，每管1mL细胞悬液(约为1.0×106个细胞)，获得脂肪基质细胞，在离心管中加3mL DMEM F12培养基和1mL大鼠小脑可溶性物质；
(3)将离心管中5mL细胞悬液接种于25cm2培养瓶中，在37℃5％CO2培养箱中培养；
(4)观察并拍照(图10-17)，从图10-11、16-17中的P2脂肪基质细胞于含海马可溶性物质中诱导1d倒置相差显微镜观察100X、200X可以看出细胞生长呈球形，即通过鼠类脑组织中的海马可溶性物质诱导脂肪细胞基质获得了神经干细胞(即神经球)，同时将P2脂肪基质细胞于20ng/mLEGF、bFGF和B-27中诱导5d倒置相差显微镜观察，在其100X(对照)和200X(对照)可以看出该细胞生长呈球形，也获得了神经干细胞。
(五)神经干细胞鉴定：
由于nestin蛋白和CD133蛋白均为神经干细胞高亲和表达蛋白，实验中常用此蛋白来鉴定神经干细胞。本实验通过免疫荧光(图22-23、24-25、30-31和32-33)、激光共聚焦(图38-39、40-41、46-47、48-49)、western blot来鉴定nestin蛋白和CD133蛋白的表达(图50-52)。使用以上3种方法来对神经干细胞的鉴定。检测方法同实施例1中所述。
免疫荧光来鉴定nestin蛋白和CD133蛋白的表达见图22、23、30和31，图片中的结果表明，通过鼠类脑组织中的小脑可溶性物质诱导脂肪细胞基质获得了神经干细胞(即神经球)。
激光共聚焦来鉴定nestin蛋白和CD133蛋白的表达，如图38、39、46和47中的结果表明，通过鼠类脑组织中的小脑可溶性物质诱导脂肪细胞基质获得了神经干细胞(即神经球)。
Western blot来鉴定nestin蛋白和CD133蛋白的表达，如图50-52所示，图片中的结果表明，通过鼠类脑组织中的小脑可溶性物质诱导脂肪细胞基质获得了神经干细胞(即神经球)，其中nestin蛋白有3个亚型，有3个分子量，Nestin蛋白的分子量依次是110、177和270KD，CD133的分子量是120KD。
综上所述，脂肪基质细胞在大鼠小脑可溶性物质中诱导后，为表达nestin和CD133阳性的神经干细胞。
实际上，采用离体鼠类脑组织中的海马、大脑皮层和小脑部位中的两种或者三种，也可以采用本发明中的方法诱导脂肪基质细胞形成神经干细胞，此处不再列举。
以上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的范围，均可实现本发明的目的。
Claims (10)
1.一种模拟体内环境诱导脂肪基质细胞为神经干细胞的方法，其特征是含以下步骤：
(1)选取离体鼠类脑组织中的海马、大脑皮层或小脑部位，置于DMEM F12培养基中，经摇床震荡和离心处理后，取上清液，过滤后灭菌获得鼠类脑组织中的海马、大脑皮层或小脑可溶性物质，保存备用；
(2)选取离体鼠类皮下脂肪组织，采用I型胶原酶消化后，使用胎牛血清或新牛血清终止消化，过滤，取滤液，离心后弃去上清液，在下层物质中加入培养基重悬细胞，接种，在培养基和体积百分含量为10％的胎牛血清或新牛血清中培养后，细胞扩增至第二代，经流式鉴定确认为脂肪基质细胞；
(3)取步骤(2)中获得的脂肪基质细胞进行预处理后获得的重悬后脂肪基质细胞，取出重悬后脂肪基质细胞，加入培养基和步骤(1)中制备的鼠类脑组织中海马、大脑皮层或小脑可溶性物质，将细胞悬液培养后，通过鼠类脑组织中的海马、大脑皮层或小脑可溶性物质诱导脂肪基质细胞成神经干细胞。
2.根据权利要求1中所述的模拟体内环境诱导脂肪基质细胞为神经干细胞的方法，其特征是：步骤(1)中摇床震荡时的温度为4℃，震荡时间为1-3h。
3.根据权利要求1中所述的模拟体内环境诱导脂肪基质细胞为神经干细胞的方法，其特征是：步骤(1)中离心时的温度为4℃，离心机的转速为18000×g，离心时间为20-40min。
4.根据权利要求1中所述的模拟体内环境诱导脂肪基质细胞为神经干细胞的方法，其特征是：步骤(2)中I型胶原酶的体积百分含量为0.5-1.5％，消化时间为20-40min；所述培养基为DMEM、DMEM/高糖、DMEM/低糖或DMEM F12。
5.根据权利要求1中所述的模拟体内环境诱导脂肪基质细胞为神经干细胞的方法，其特征是：步骤(2)中离心时的转速为1000-1200r/min，离心时间为1-10min。
6.根据权利要求1中所述的模拟体内环境诱导脂肪基质细胞为神经干细胞的方法，其特征是：步骤(3)中所述培养基为DMEM、DMEM/高糖、DMEM/低糖、DMEM F12或神经干细胞培养基。
7.根据权利要求6中所述的模拟体内环境诱导脂肪基质细胞为神经干细胞的方法，其特征是步骤(3)中脂肪基质细胞进行预处理的具体过程为：取步骤(2)中培养的脂肪基质细胞，经胰酶消化后，收集细胞，离心，弃去上清液，下层物质采用培养基重悬细胞，得重悬后脂肪基质细胞，其中所述胰酶的体积百分含量为0.125-0.25％。
8.根据权利要求1中所述的模拟体内环境诱导脂肪基质细胞为神经干细胞的方法，其特征是：步骤(3)中获得的重悬后脂肪基质细胞的浓度为1.0-3.0×106个细胞/mL。
9.根据权利要求1中所述的模拟体内环境诱导脂肪基质细胞为神经干细胞的方法，其特征是：步骤(3)中重悬后脂肪基质细胞与培养基的体积比为1∶1-4，重悬后脂肪基质细胞与步骤(1)中制备的鼠类脑组织中的海马、大脑皮层或小脑可溶性物质的体积比为1∶1-4。
10.根据权利要求1中所述的模拟体内环境诱导脂肪基质细胞为神经干细胞的方法，其特征是步骤(3)中将细胞悬液培养时的条件为：在37℃，体积百分含量为5％CO2培养箱中培养。
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