CN102550410A - 一种提高白羽扇豆原生质体再生频率的培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种提高羽扇豆原生质体再生频率的培养基，其组成为：基本培养基：B5大量、微量+MS有机；激素的组合：0.5mg/LNAA+2.0mg/L6-BA+1.0mg/LTDZ+0.5mg/L赤霉素；其它成分：蔗糖5g/L+果糖126mg/L+核糖120mg/L+木糖120mg/L+甘露糖126mg/L+纤维二糖137mg/L+水解酪蛋白200mg/L+硝酸银5g/L+琼脂糖8g/L。该培养基解决了羽扇豆愈伤到植株这个瓶颈问题，对开展羽扇豆相关生物技术等均具有重要的意义。

Description

一种提高白羽扇豆原生质体再生频率的培养基
技术领域
本发明涉及一种提高羽扇豆原生质体再生频率的培养基，属于现代农业和植物生物技术研究领域。
背景技术
羽扇豆是一种具有极高应用价值的草本植物，其种子蛋白质含量高达50％，含油量为5％-20％，不仅可作食用，而且可作为优质的饲用。同时，羽扇豆花型美观，花期2个多月，有单色和复色，在室内、庭院、花坛等地方种植，极具装饰效果。目前在欧洲、澳大利亚、亚洲及非洲的许多国家均有种植，广泛栽培的品种主要有白羽扇豆(Lupinus albus)、窄叶羽扇豆(L.angustifolius)和黄羽扇豆(L.luteus)。我国羽扇豆仅局限于零星的栽培尝试，主要用于花卉。
羽扇豆是重要的经济植物，但其再生能力很差，不仅表现在愈伤到再生植株，而且表现在从植株到生根，是目前世界上公认的很难通过组织培养方法开展生物技术研究的植物之一。目前国内外只有1篇有关羽扇豆原生质体再生成植株的报道，且只得到1株再生植株，因此，限制其生物技术的开展，包括原生质体的融合，胚胎培救以及小孢子培养等；不利于羽扇豆相关的生物技术的研究。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，我们通过多年的实践，摸索出适于羽扇豆从愈伤到再生植株的培养基，解决了羽扇豆再生体系这个瓶颈问题。
本发明所述的提高白羽扇豆原生质体再生频率的培养基，其组成如下：
(1)基本培养基：B5大量、微量+MS有机；
(2)激素的组合：0.5mg/L NAA+2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L TDZ+0.5mg/L赤霉素；
(3)其它成分：蔗糖5g/L+果糖126mg/L+核糖120mg/L+木糖120mg/L+甘露糖126mg/L+纤维二糖137mg/L+水解酪蛋白200mg/L+硝酸银5g/L+琼脂糖8g/L。
本发明选用栽培品种‘白羽扇豆’为研究对象，从3个方面对培养基成分进行尝试。第一，选用4种基本培养基，分别是MS基本培养基，B5基本培养基，MS大量和微量再加上B5有机，B5大量和微量再加上MS有机；第二，在激素组合方面，选用2种不同生长素类(2，4-D和NAA)，再选用3种不同细胞分裂素类(6-BA，玉米素和TDZ)进行组合；第三，选用加赤霉素和不加赤霉素的方法。通过16种不同培养基的比较分析，找到了上述适合白羽扇豆原生质体再生成植株的培养基，再生频率高达40％。解决了羽扇豆愈伤到植株这个瓶颈问题，对开展羽扇豆相关生物技术(如原生质体再生，原生质融合，转基因研究，种质资源的保存和创新研究)等均具有重要的意义。
附图说明
图1白羽扇豆原生质体提取、分离、培养和愈伤的诱导照片。A是白羽扇豆种子；B是4-5周无菌苗照片；C是经酶切叶片；D是梯度离心分离原生质体；E是培养1周分裂原生质体；F是培养4周形成小愈伤；G是愈伤组织形成。
图2.白羽扇豆在同一基本培养基(B5大量、微量+MS有机)条件下不同激素组合出苗情况比较
A，0.5mg/L 2，4-D+2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L玉米素；
B，0.5mg/L 2，4-D+2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L玉米素+0.5mg/L赤霉素；
C，0.5mg/L NAA+2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L TDZ；
D，0.5mg/L NAA+2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L TDZ+0.5mg/L赤霉素。
图3是白羽扇豆在16种不同培养基再生率的比较。
具体实施方式
实施例1
筛选过程选用栽培品种白羽扇豆(Lupinus albus)作为实验材料；通过培育出4-5周无菌幼苗，取其幼叶；经酶切，分离原生质体；通过液体培养4-5周，获得愈伤组织；通过选用不同培养基组合，获得再生苗。具体操作如下：
(1)将白羽扇豆种子(图1A)用96％酒精先处理15秒，然后用3％次氯酸钠处理15分钟，有灭菌的重蒸水冲洗3次，再在灭菌的重蒸水浸泡2小时，便于种子吸水发芽。
(2)灭过菌的种子(图1B)放在1/2MS培养基中(没有有机成份)+20克蔗糖，pH5.8，在光照培养箱生长4周(25℃，16h光照/8小时不见光，1500lx)。
(3)取无菌幼叶(图1C)经酶解(0.5％离析酶R-10，1％纤维素酶‘Onozuka’，0.9％甘露醇)，过夜，分离原生质体前轻微震荡10分钟。
(4)经50μm滤网过滤、洗涤(0.154Mol/L氯化钠，0.125Mol/L氯化钙，0.005Mol/L氯化钾，0.005Mol/L葡萄糖，pH，5.8)，离心，用蔗糖溶液[0.6Mol/L蔗糖，10mM/L氯化钙，0.1％2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)，pH，5.8]梯度离心；得原生质体(图1D)
(5)将分离的原生质体用吸管吸出，经洗涤，用液体培养基稀释至3×105个原生质体/mL的密度。液体培养基的成分为(MS培养基，0.127g/L蔗糖，0.126g/L甘露醇，68.46g/L果糖，1mg/L萘乙酸钠(NAA)，0.2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，0.5mg/L玉米素(Zeatin)，pH，5.6)。图1E为不见光条件上(25℃)生长1周，原生质体开始分裂，细胞壁开始形成(图1E)。
(6)在上述液体培养基里生长4周的情况，形成小的愈伤组织(图1F)。
(7)将上述小的愈伤组织转入固体培养基中诱导愈伤组织和植株的形成(图1G)；所述的固体培养基设计了16种不同培养基(表1)：
方式一：基本培养基种类的选择，我们选用4种，分别以MS大量、微量、有机(培养基1-4)，B5大量、微量、有机(5-8)，MS大量、微量加上B5有机(培养基9-12)，B5大量、微量加上MS有机(培养基13-16)；
方式二：在激素组合方面，首先选用2种不同生长素类(2，4-D和NAA)，再选用3种不同细胞分裂素类(6-BA，玉米素和TDA)进行比较；
方式三：选用加赤霉素和不加赤霉素进行比较。
表1用于白羽扇豆愈伤组织再生植株培养基成分比较
Figure BDA0000126889820000051
注：2，4-D，2，4-二氯苯氧乙酸；NAA，萘乙酸钠；6-BA，6-苄氨基腺嘌呤；TDZ，噻苯隆，pH＝5.8；再生率＝出苗数/供试愈伤数×100％。
图2是白羽扇豆在同一基本培养基(B5大量、微量+MS有机)条件下不同激素组合出苗情况比较。
图3是白羽扇豆在16种不同培养基再生率的比较，其中
(1)横坐标为4种不同类型基本培养基(1，MS为基本培养基；2，B5为基本培养基；3，MS大量、微量+B5有机；4，B5大量、微量+MS有机)
(2)纵坐标：白羽扇豆愈伤组织再生率(％)，每个处理3次重复，每个重复60个愈伤，共180个愈伤。
(3)4种激素组合：
处理1：0.5mg/L 2，4-D+2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L玉米素；
处理2：0.5mg/L 2，4-D+2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L玉米素+0.5mg/L赤霉素；
处理3：0.5mg/L NAA+2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L TDZ；
处理4：0.5mg/L NAA+2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L TDZ+0.5mg/L赤霉素。
综合比较16种培养基愈伤组织的再生率(表1和图3)，可以明显看出：4种不同类型基本培养基中以第4种为最佳，即B5大量、微量+MS有机。如果用该种培养基作为基本培养基，从激素的组合来看，0.5mg/L NAA+2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L TDZ+0.5mg/L赤霉素为最佳，再生率达40％。该组合在4种不同基本培养基条件下再生率均为最高。

Claims (1)

1.一种提高白羽扇豆原生质体再生频率的培养基，其特征在于组成如下：
（1）基本培养基：B5大量、微量 + MS有机；
（2）激素的组合：0.5 mg/L NAA + 2.0 mg/L 6-BA + 1.0 mg/L TDZ + 0.5 mg/L赤霉素；
（3）其它成分：蔗糖5 g/L + 果糖126 mg/L + 核糖120 mg/L + 木糖120 mg/L + 甘露糖126 mg/L + 纤维二糖137 mg/L + 水解酪蛋白200 mg/L + 硝酸银5 g/L + 琼脂糖8g/L。
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