CN104170744A - 一种澳豆真叶快速诱导再生植株的方法 - Google Patents
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Abstract
一种澳豆真叶快速诱导再生植株的方法，涉及澳豆种苗快繁技术，尤其是一种通过愈伤组织诱导产生再生植株的方法，包括成熟胚消毒、启动培养、愈伤组织诱导与分化、增殖培养与再分化、生根培养及炼苗移栽。其特征在于采用无菌真叶诱导愈伤组织，再通过愈伤组织分化产生不定芽，继而获得再生植株的方法。本发明的澳豆真叶快速诱导再生植株的方法生产成本低，诱导率高，分化时间短，生根苗健壮。无菌苗获得率达93.6%，出愈率达68.9%，芽分化率达84.7%，生根率达80.2%，移栽成活率达87.1%。能有效解决澳豆种苗生产需求，进行规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种澳豆真叶快速诱导再生植株的方法，属植物种苗快繁技术领域。
背景技术
澳豆（Narrow-leafed Lupin）属豆科蝶形花亚科羽扇豆属一年生草本植物，原产欧洲地中海地区，是澳大利亚出产的一种豆类作物。长期食用澳豆具有降低血糖指数、抑制食欲促进能量平衡、降低总胆固醇、降血压、改善肠胃健康等功效；澳豆富含丰富的蛋白质和合理的氨基酸组成，在食品配方中作为一种重要的功能成分和食品添加剂广泛应用于食品工业；澳豆豆芽可作为蔬菜补充或替代黄豆、绿豆豆芽，与黄豆豆芽相比，具有感官好，适合做火锅配料，无需像黄豆豆芽那样依赖化学药剂抑制须根生长，再加上产量高，每公斤澳豆比黄豆产豆芽高2.5公斤，可摄入大量异黄酮，预防癌，改善钙质防止骨质疏松，是一种绿色放心蔬菜。
目前，优良澳豆种子依靠进口，国内澳豆繁殖以播种为主，没有相应的种子采收和种苗培育专业机构，不但生产成本高，而且时间和数量上很难保证，限制了澳豆产业的形成和发展。此外，澳豆性凉爽、湿润、阳光充足，忌炎热、湿涝，在我国适合秋季播种，春末夏初收获，而秋季高温又对种苗培育不利，延误生产。因此，采用植物组织培养技术既能解决澳豆种苗供需矛盾，也能降低生产成本。
发明内容
本发明所要解决的问题是澳豆种苗供需矛盾，提供一种既可周年生产，又可降低生产成本的澳豆优良种苗高效培育方法。
实现本发明的技术方案是，本发明一种澳豆真叶快速诱导再生植株的方法主要包括成熟胚消毒、启动培养、愈伤组织诱导与分化、增殖培养与再分化、生根培养及炼苗移栽，本发明方法采取以下步骤：
1、成熟胚消毒：精选饱满、种皮完好的澳豆种子，室温下用蒸馏水浸泡12 天，使种子充分吸水膨胀，去掉种皮后，选取完整的种胚；在超净工作台上，采用0.5%的高锰酸钾溶液浸泡6min，无菌水漂洗3～5次，每次3min；再用3.0%的次氯酸钠溶液消毒8min，无菌水冲洗3～5次，每次5min。
2、启动培养：将步骤（1）处理好的成熟胚接种到启动培养基N6上，培养基中蔗糖为30 g/L，琼脂6 g/L，pH值为5.8～5.9。15～20天培养出生长旺盛、叶色浓绿的无菌苗，无菌苗获得率达93.6%。此期间内培养温度为（26±2）℃，光照强度2000～2500 Lx，每天光照10小时。
3、愈伤组织诱导与分化：取无菌苗小真叶，剪成0.2 cm×0.2 cm的小块，接种到愈伤组织与分化诱导培养基N6 + 2,4-D 0.8 mg/L + 6-BA 0.2 mg/L + AC 0.5 mg/L上，培养基中蔗糖为30 g/L，琼脂6 g/L，pH值为5.8～5.9。25～30天产生黄绿色疏松透明的愈伤组织，出愈率达68.9%。此期间内培养温度为（26±2）℃，光照强度2000～2500 Lx，每天光照10小时。
4、增殖培养与再分化：将愈伤组织上生长的绿色芽点切下，接种到增殖与再分化诱导培养基N6 + 2,4-D 0.8 mg/L + 6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.25 mg/L + AC 0.5 mg/L上，培养基中蔗糖为30 g/L，琼脂6 g/L，pH值为5.8～5.9。30天可分化出健康丛生芽，芽分化率达84.7%。此期间内培养温度为（26±2）℃，光照强度3000～3500 Lx，每天光照12小时。
5、生根培养：将步骤（4）2～3 cm的芽接种到生根培养基1/2MS + NAA 0.25 mg/L + IBA 0.25 mg/L上，培养基中蔗糖为30 g/L，琼脂6.5 g/L，pH值为5.9～6.0。20天可产生粗壮根，得到生根苗，生根率达80.2%。此期间内培养温度为（26±2）℃，光照强度3000～3500 Lx，每天光照12小时。
6、炼苗移栽：将在生根培养基上生长20小时左右，苗高4～5 cm，根长1～3 cm的生根苗，先在室温中渡过3天，再打开瓶塞渡过3～5天，冲洗干净根部培养基后，将根在800倍的多菌灵溶液中浸泡2min，移栽至消毒过的珍珠岩中。珍珠岩浇水后持水量控制在70～85%之间，每周用N6大量元素母液作为肥料进行喷洒一次，连续喷洒2次。30天后即可获得种苗，移栽成活率达87.1%。
本发明的有益效果是，本发明采用澳豆成熟胚获得无菌苗，再通过无菌苗真叶诱导愈伤组织，愈伤组织诱导不定芽，进而诱导产生再生植株的方法。无菌苗获得率达93.6%；出愈率达68.9%，愈伤组织呈黄绿色疏松透明状；芽分化率达84.7%，分化时间短且分化芽健康；生根率达80.2%，生根快且根系粗壮；移栽成活率达87.1%。本发明可快速进行澳豆种苗规模化生产，有利于澳豆的推广种植。
本发明适用于澳豆工厂化种苗培育。
附图说明
图1为一种澳豆真叶快速诱导再生植株的方法流程图。
具体实施方式
本实例以MS培养基为基本培养基进行对照，包括以下步骤：
1、成熟胚消毒：精选饱满、种皮完好的澳豆种子，室温下用蒸馏水浸泡12小时，使种子充分吸水膨胀，去掉种皮后，选取完整的种胚；在超净工作台上，采用0.5%的高锰酸钾溶液浸泡6min，无菌水漂洗3～5次，每次3min；再用3.0%的次氯酸钠溶液消毒8min，无菌水冲洗3～5次，每次5min。
2、启动培养：将步骤（1）处理好的成熟胚接种到启动培养基N6上培养15～20天。培养基中蔗糖为30 g/L，琼脂6 g/L，pH值为5.8～5.9。此期间内培养温度为（26±2）℃，光照强度2000～2500 Lx，每天光照10小时。
3、愈伤组织诱导与分化：取无菌苗小真叶，剪成0.2 cm×0.2 cm的小块，接种到愈伤组织与分化诱导培养基N6 + 2,4-D 0.8 mg/L + 6-BA 0.2 mg/L + AC 0.5 mg/L上培养25～30天。培养基中蔗糖为30 g/L，琼脂6 g/L，pH值为5.8～5.9。此期间内培养温度为（26±2）℃，光照强度2000～2500 Lx，每天光照10小时。
对照真叶小块接种到MS+ 2,4-D 0.8 mg/L + 6-BA 0.2 mg/L + AC 0.5 mg/L的愈伤组织与分化诱导培养基上。
4、增殖培养与再分化：将愈伤组织上生长的绿色芽点切下，接种到增殖与再分化诱导培养基N6 + 2,4-D 0.8 mg/L + 6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.25 mg/L + AC 0.5 mg/L上培养30天。培养基中蔗糖为30 g/L，琼脂6 g/L，pH值为5.8～5.9。此期间内培养温度为（26±2）℃，光照强度3000～3500 Lx，每天光照12小时。
对照绿色芽点接种到MS+ 2,4-D 0.8 mg/L + 6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.25 mg/L + AC 0.5 mg/L的增殖与再分化诱导培养基上。
5、生根培养：将步骤（4）2～3 cm的芽接种到生根培养基1/2MS + NAA 0.25 mg/L + IBA 0.25 mg/L上培养20天。培养基中蔗糖为30 g/L，琼脂6.5 g/L，pH值为5.9～6.0。此期间内培养温度为（26±2）℃，光照强度3000～3500 Lx，每天光照12小时。
6、炼苗移栽：将在生根培养基上生长20天左右，苗高4～5 cm，根长1～3 cm的生根苗，先在室温中度过3天，再打开瓶塞度过3～5天，冲洗干净根部培养基后，将根在800倍的多菌灵溶液中浸泡2 min，移栽至消毒过的珍珠岩中。珍珠岩浇水后持水量控制在70～85%之间，每周用N6大量元素母液作为肥料进行喷洒一次，连续喷洒2次。30天后即可获得种苗。
对照用MS大量元素母液作为肥料进行喷洒。
7、试验处理无菌苗获得率93.6%，出愈率68.9%，芽分化率84.7%，生根率80.2%，移栽成活率达87.1%。对照无菌苗获得率82.4%，出愈率57.1%，芽分化率76.7%。
实施例2
本实例以KT和IAA作为愈伤组织诱导分化和增殖培养再分化的主要生长素为对照，包括以下步骤：
1、成熟胚消毒：精选饱满、种皮完好的澳豆种子，室温下用蒸馏水浸泡12小时，使种子充分吸水膨胀，去掉种皮后，选取完整的种胚；在超净工作台上，采用0.5%的高锰酸钾溶液浸泡6min，无菌水漂洗3～5次，每次3min；再用3.0%的次氯酸钠溶液消毒8min，无菌水冲洗3～5次，每次5min。
2、启动培养：将步骤（1）处理好的成熟胚接种到启动培养基N6上培养15～20天。培养基中蔗糖为30 g/L，琼脂6 g/L，pH值为5.8～5.9。此期间内培养温度为（26±2）℃，光照强度2000～2500 Lx，每天光照10小时。
3、愈伤组织诱导与分化：取无菌苗小真叶，剪成0.2 cm×0.2 cm的小块，接种到愈伤组织与分化诱导培养基N6 + 2,4-D 0.8 mg/L + 6-BA 0.2 mg/L + AC 0.5 mg/L上培养25～30天。培养基中蔗糖为30 g/L，琼脂6 g/L，pH值为5.8～5.9。此期间内培养温度为（26±2）℃，光照强度2000～2500 Lx，每天光照10小时。
对照真叶小块接种到N6+ KT 1.0 mg/L + 6-BA 0.2 mg/L + AC 0.5 mg/L的愈伤组织与分化诱导培养基上。
4、增殖培养与再分化：将愈伤组织上生长的绿色芽点切下，接种到增殖与再分化诱导培养基N6 + 2,4-D 0.8 mg/L + 6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.25 mg/L + AC 0.5 mg/L上培养30天。培养基中蔗糖为30 g/L，琼脂6 g/L，pH值为5.8～5.9。此期间内培养温度为（26±2）℃，光照强度3000～3500 Lx，每天光照12小时。
对照绿色芽点接种到N6+ KT 1.0 mg/L + 6-BA 0.5 mg/L + IAA 0.25 mg/L + AC 0.5 mg/L的增殖与再分化诱导培养基上。
5、生根培养：将步骤（4）2～3 cm的芽接种到生根培养基1/2MS + NAA 0.25 mg/L + IBA 0.25 mg/L上培养20天。培养基中蔗糖为30 g/L，琼脂6.5 g/L，pH值为5.9～6.0。此期间内培养温度为（26±2）℃，光照强度3000～3500 Lx，每天光照12小时。
6、炼苗移栽：将在生根培养基上生长20天左右，苗高4～5 cm，根长1～3 cm的生根苗，先在室温中度过3天，再打开瓶塞度过3～5天，冲洗干净根部培养基后，将根在800倍的多菌灵溶液中浸泡2 min，移栽至消毒过的珍珠岩中。珍珠岩浇水后持水量控制在70～85%之间，每周用N6大量元素母液作为肥料进行喷洒一次，连续喷洒2次。30天后即可获得种苗。
7、试验处理出愈率68.9%，愈伤组织呈黄绿色疏松透明状；芽分化率84.7%。对照出愈率39.5%，愈伤组织呈暗黄色疏松状；芽分化率52.1%。
实施例3
本实例以1/2 N6为生根培养基和移栽时不喷洒N6大量元素母液作为对照，包括以下步骤：
1、成熟胚消毒：精选饱满、种皮完好的澳豆种子，室温下用蒸馏水浸泡12小时，使种子充分吸水膨胀，去掉种皮后，选取完整的种胚；在超净工作台上，采用0.5%的高锰酸钾溶液浸泡6min，无菌水漂洗3～5次，每次3min；再用3.0%的次氯酸钠溶液消毒8min，无菌水冲洗3～5次，每次5min。
2、启动培养：将步骤（1）处理好的成熟胚接种到启动培养基N6上培养15～20天。培养基中蔗糖为30 g/L，琼脂6 g/L，pH值为5.8～5.9。此期间内培养温度为（26±2）℃，光照强度2000～2500 Lx，每天光照10小时。
3、愈伤组织诱导与分化：取无菌苗小真叶，剪成0.2 cm×0.2 cm的小块，接种到愈伤组织与分化诱导培养基N6 + 2,4-D 0.8 mg/L + 6-BA 0.2 mg/L + AC 0.5 mg/L上培养25～30天。培养基中蔗糖为30 g/L，琼脂6 g/L，pH值为5.8～5.9。此期间内培养温度为（26±2）℃，光照强度2000～2500 Lx，每天光照10小时。
4、增殖培养与再分化：将愈伤组织上生长的绿色芽点切下，接种到增殖与再分化诱导培养基N6 + 2,4-D 0.8 mg/L + 6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.25 mg/L + AC 0.5 mg/L上培养30天。培养基中蔗糖为30 g/L，琼脂6 g/L，pH值为5.8～5.9。此期间内培养温度为（26±2）℃，光照强度3000～3500 Lx，每天光照12小时。
5、生根培养：将步骤（4）2～3 cm的芽接种到生根培养基1/2MS + NAA 0.25 mg/L + IBA 0.25 mg/L上培养20天。培养基中蔗糖为30 g/L，琼脂6.5 g/L，pH值为5.9～6.0。此期间内培养温度为（26±2）℃，光照强度3000～3500 Lx，每天光照12小时。
对照芽接种到生根培养基1/2 N6 + NAA 0.25 mg/L + IBA 0.25 mg/L上。
6、炼苗移栽：将在生根培养基上生长20天左右，苗高4～5 cm，根长1～3 cm的生根苗，先在室温中度过3天，再打开瓶塞度过3～5天，冲洗干净根部培养基后，将根在800倍的多菌灵溶液中浸泡2min，移栽至消毒过的珍珠岩中。珍珠岩浇水后持水量控制在70～85%之间，每周用N6大量元素母液作为肥料进行喷洒一次，连续喷洒2次。30天后即可获得种苗。
对照生根苗移栽后不喷洒N6大量元素母液作为肥料。
7、试验处理培养20 d时生根率80.2%，移栽成活率达87.1%。对照处理培养28 d时生根率71.9%，移栽成活率83.5%。
Claims (3)
1.一种澳豆真叶快速诱导再生植株的方法，包括成熟胚消毒、启动培养、愈伤组织诱导与分化、增殖培养与再分化、生根培养及炼苗移栽步骤，其特征在于，所述方法步骤为：
（1）精选饱满、种皮完好的澳豆种子，室温下用蒸馏水浸泡12小时，使种子充分吸水膨胀，去掉种皮后，选取完整的种胚；在超净工作台上，采用0.5%的高锰酸钾溶液浸泡6 min，无菌水漂洗3～5次，每次3min；再用3.0%的次氯酸钠溶液消毒8 min，无菌水冲洗3～5次，每次5min；
（2）将步骤（1）处理好的成熟胚接种到启动培养基N6上，培养基中蔗糖为30 g/L，琼脂6 g/L，pH值为5.8～5.9；15～20天培养出生长旺盛、叶色浓绿的无菌苗；
（3）取无菌苗小真叶，剪成0.2 cm×0.2 cm的小块，接种到愈伤组织与分化诱导培养基N6 + 2,4-D 0.8 mg/L + 6-BA 0.2 mg/L + AC 0.5 mg/L上，培养基中蔗糖为30 g/L，琼脂6 g/L，pH值为5.8～5.9；25～30天产生黄绿色疏松透明的愈伤组织；
（4）将愈伤组织上生长的绿色芽点切下，接种到增殖与再分化诱导培养基N6 + 2,4-D 0.8 mg/L + 6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.25 mg/L + AC 0.5 mg/L上，培养基中蔗糖为30 g/L，琼脂6 g/L，pH值为5.8～5.9；30天可分化出健康丛生芽；
（5）将步骤（4）2～3 cm的芽接种到生根培养基1/2MS + NAA 0.25 mg/L + IBA 0.25 mg/L上，培养基中蔗糖为30 g/L，琼脂6.5 g/L，pH值为5.9～6.0；20 天可产生粗壮根，得到生根苗；
（6）将在生根培养基上生长20天，苗高4～5 cm，根长1～3 cm的生根苗，先在室温中度过3天，再打开瓶塞度过3～5天，冲洗干净根部培养基后，将根在800倍的多菌灵溶液中浸泡2 min，移栽至消毒过的珍珠岩中；珍珠岩浇水后持水量控制在70～85%之间，每周用N6大量元素母液作为肥料进行喷洒一次，连续喷洒2次；30天后即可获得种苗。
2.根据权利要求1所述一种澳豆真叶快速诱导再生植株的方法，所述步骤（2）和步骤（3）期间内培养温度为（26±2）℃，光照强度2000～2500 Lx，每天光照10 小时。
3.根据权利要求1所述一种澳豆真叶快速诱导再生植株的方法，所述步骤（4）和步骤（5）期间内培养温度为（26±2）℃，光照强度3000～3500 Lx，每天光照12 小时。
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