CN102549161B - 植物或植物细胞中中断ckx3和至少另一个ckx基因得到改良的特性 - Google Patents

植物或植物细胞中中断ckx3和至少另一个ckx基因得到改良的特性 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种分离的植物细胞和一种转基因植物，其中所述分离的植物细胞和转基因植物在编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的至少内源CKX3基因和另一个不同于CKX3的基因上包含中断。本发明还涉及一种制备所述转基因植物的方法，及一种提高植物种子产量和/或增加株高的方法。

Description

植物或植物细胞中中断CKX3和至少另一个CKX基因得到改良 的特性
背景技术
为了能为不断增长的人口提供食物及其他植物源产品，人们一直对提高农业产量感兴趣。
可以各种不同方式来影响植物产量，例如通过改善植物生长特性或者通过延缓叶片衰老。已知许多机制和通路与植物的生长和发育有关。
细胞分裂素(cytokinin)是一种植物激素，在植物生长和发育的许多方面起着正调节和负调节的作用。细胞分裂素促进茎尖分生组织的形成及其活力，能建立库组织(sinktissue)，延缓叶片衰老，抑制根的生长和分支，并且在种子萌发和应激反应中起到作用(Mok，D.W.S.& Mok，M.C.(2001)Ann.Rev.Plant Physiol.MoI.Bio.52，89-118)。对缺乏细胞分裂素的植物进行分析表明，细胞分裂素在茎尖分生组织和根部分生组织中起着相反的作用，从而暗示该激素在器官生长的定量控制中具有很重要的功能(Werner T，Motyka V，Laucou V，Smets R，Van Onckelen H，Schmülling T，Plant Cell 2003，15(11)：2532-50；Werner T，Motyka V，Strnad M，Schmülling T，Proc Natl Acad Sci U S A 2001，98(18)：10487-92)。
细胞分裂素氧化/脱氢酶(Cytokinin oxidases/dehydrogenases，CKX)是调节植物激素细胞分裂素维持体内平衡的重要因素。拟南芥属(Arabidopsis)基因组编码七个CKX基因，该七个CKX基因具有不同的表达域(Werner等，2001；Werner等，2003)。各CKX蛋白具有不同的亚细胞定位和生化特性(Werner等，2003)。通过各单独CKX基因的过表达建立细胞分裂素缺乏的植物，结果表明细胞分裂素是茎尖分生组织活性的正调节因子，且是根分生组织活性的负调节因子。
最近证实，在水稻作物中，抑制特定CKX基因(与拟南芥CKX3同源的水稻CKX基因)功能，会导致所述水稻作物的载粒数增加(见US2006/0123507A1)。虽然这些结果是很有希望的，但仍然需要进一步提高植物的产量。
发明内容
本发明的目的在于提供合适的手段和方法，用于生产产量提高和/或生长特性得到改良的转基因植物。
本发明将按照下文的详细描述来实现这个目的。
本发明提供了一种分离的植物细胞和转基因植物，其中与没有中断的对照植物细胞或对照植物相比，所述分离的植物细胞和转基因植物中至少有两个不同的细胞分裂素氧化/脱氢酶基因的表达和/或活性因中断而被抑制。其中，第一个细胞分裂素氧化/脱氢酶基因是编码CKX3的内源基因或其直系同源序列(orthologue)，第二个细胞分裂素氧化/脱氢酶基因是不同于CKX3的、编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因或其直系同源序列。
令人惊讶的是，已经发现在植物中同时中断CKX3基因和编码CKX2、CKX4、CKX5或CKX6中的一个的第二细胞分裂素氧化/脱氢酶基因，会得到种子产量高于缺乏这种中断的植物的转基因植物，或只有一个细胞分裂素氧化/脱氢酶基因被中断的转基因植物。但是，单一中断CKX3仅导致轻微(但不显著)的种子产量的增加，如US2006/0123507A1中所报道的；单一中断CKX5对于种子产量并没有可测得的影响。令人惊讶的是，与野生型、单一中断CKX3和单一中断CKX5相比，同时中断CKX3和CKX2、CKX4、CKX5或CKX6中的一个，而不是同时中断CKX2和CKX4、或CKX2和CKX4和CKX5、或CKX4和CKX6、或CKX5和CKX6，会导致种子产量显著增加。同时中断CKX3和CKX5时，会观察到最显著的种子产量的增加。更令人惊讶的是，与野生型植株和包括单一中断CKX3或CKX5的转基因植物相比，发现同时中断CKX3和CKX2、CKX4、CKX5或CKX6中的一个，特别是同时中断CKX3和CKX5，会导致转基因植物的株高显著增加。因此，同时中断至少CKX3和另一个编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因(优选CKX1、CKX2、CKX4、CKX5、CKX6或CKX7)，会得到产量提高和/或生长特性得到改良的转基因植物。
第一方面，本发明涉及一种分离的植物细胞，该分离的植物细胞在至少以下基因中包含中断：
i)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源CKX3基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.1相同或有至少95％一致性的多肽序列；
以及
ii)与i)中定义的基因不同的、另一个编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因；
其中，与缺乏所述中断的相应对照植物细胞相比，所述中断抑制至少两个中断的细胞分裂素氧化/脱氢酶基因的表达和/或其产物活性。
第二方面，本发明涉及一种转基因植物，该转基因植物在至少以下基因中包含中断：
i)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源CKX3基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.1相同或有至少95％一致性的多肽序列；
以及
ii)与i)中定义的基因不同的、另一个编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因；
其中，与缺乏所述中断的相应对照植物相比，所述中断抑制至少两个中断的细胞分裂素氧化/脱氢酶基因的表达和/或其产物活性。应理解，基于本发明的目的，术语“转基因植物”不仅包括含如本发明所述中断的植物，而且还指其无论世代号的任何子代，即术语“转基因植物”包括第一代子代，以及第X代子代，条件是所述子代仍然包含亲本转基因植物中所包含的本发明的中断。
第三方面，本发明涉及一种相对于相应的对照植物、在植物中提高种子产量和/或增加株高和/或增加茎粗的方法，该方法包括在植物的至少以下基因中导入中断：
i)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源CKX3基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.1相同或有至少95％一致性的多肽序列；
以及
ii)与i)中定义的基因不同的、另一个编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因；
其中，与缺乏所述中断的相应对照植物相比，所述中断抑制至少两个中断的细胞分裂素氧化/脱氢酶基因的表达和/或其产物活性。
第四方面，本发明涉及一种生产与相应的对照植物相比，具有种子产量提高和/或株高增加的植物，其中所述植物在至少以下基因中包含中断：
i)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源CKX3基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.1相同或有至少95％一致性的多肽序列；
以及
ii)与i)中定义的基因不同的、另一个编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因；
其中，与缺乏所述中断的相应对照植物相比，所述中断抑制至少两个中断的细胞分裂素氧化/脱氢酶基因的表达和/或其产物活性。
本发明还涉及到一种分离的植物细胞，其中所述分离的植物细胞在至少以下基因中包含中断：
i)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源CKX3基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.1相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，所述直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.1的50个氨基酸、优选SEQID No.1的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.1的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
以及
ii)至少另一个内源基因：
a)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的CKX1基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.13相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，所述直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.13的50个氨基酸、优选SEQID No.13的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.13的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
b)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的CKX2基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.2相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，所述直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.2的50个氨基酸、优选SEQID No.2的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.2的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
c)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的CKX4基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.3相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，所述直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.3的50个氨基酸、优选SEQID No.3的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.3的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
d)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的CKX5基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.4相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，所述直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.4的50个氨基酸、优选SEQID No.4的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.4的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
e)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的CKX6基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.5相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，所述直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.5的50个氨基酸、优选SEQID No.5的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.5的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
或者
f)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的CKX7基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.6相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，所述直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.6的50个氨基酸、优选SEQID No.6的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.6的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
其中，与缺乏所述中断的相应对照植物细胞相比，所述中断抑制至少两个中断的细胞分裂素氧化/脱氢酶基因的表达和/或其产物活性。
本发明还涉及一种转基因植物，所述转基因植物在至少以下基因中包含中断：
i)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源CKX3基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.1相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，所述直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.1的50个氨基酸、优选SEQID No.1的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.1的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；以及
ii)至少另一个内源基因：
a)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的CKX1基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.13相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，所述直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.13的50个氨基酸、优选SEQ IDNo.13的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.13的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
b)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的CKX2基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.2相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，所述直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.2的50个氨基酸、优选SEQ IDNo.2的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.2的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
c)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的CKX4基因，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.3相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，所述直系同源多肽序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.3的50个氨基酸、优选SEQ ID No.3的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.3的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
d)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的CKX5基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.4相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，所述直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.4的50个氨基酸、优选SEQ IDNo.4的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.4的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
e)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的CKX6基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.5相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，所述直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.5的50个氨基酸、优选SEQ IDNo.5的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.5的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
或者
f)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的CKX7基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.6相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，所述直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.6的50个氨基酸、优选SEQ IDNo.6的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.6的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
其中，与缺乏所述中断的相应对照植物相比，所述中断抑制至少两个中断的细胞分裂素氧化/脱氢酶基因的表达和/或其产物活性。
本发明分离的植物细胞和/或本发明的转基因植物在至少以下基因中包含中断：
i)内源CKX3基因或其直系同源序列，所述内源CKX3基因包括与SEQ IDNo.7相同或有至少95％一致性的核酸序列；优选地，所述直系同源序列是如下的基因：包括与SEQ IDNo.7的300个核苷酸、优选SEQ ID No.7的500个核苷酸、更优选SEQ ID No.7的整个长度上的连续核酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的核酸序列；
以及
ii)至少另一个内源基因：
a)CKX1基因或其直系同源序列，所述CKX1基因包括与SEQ ID No.14相同或有至少95％一致性的核酸序列；优选地，所述直系同源序列是如下的内源基因：包括与SEQ IDNo.14的300个核苷酸、优选SEQ ID No.14的500个核苷酸、更优选SEQ ID No.14的整个长度上的连续核酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的核酸序列；
b)CKX2基因或其直系同源序列，所述CKX2基因包括与SEQ ID No.8相同或有至少95％一致性的核酸序列；优选地，所述直系同源序列是如下的内源基因：包括与SEQ IDNo.8的300个核苷酸、优选SEQ ID No.8的500个核苷酸、更优选SEQ ID No.8的整个长度上的连续核酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的核酸序列；
c)CKX4基因或其直系同源序列，所述CKX4基因包括与SEQ ID No.9相同或有至少95％一致性的核酸序列；优选地，所述直系同源序列是如下的内源基因：包括与SEQ IDNo.9的300个核苷酸、优选SEQ ID No.9的500个核苷酸、更优选SEQ ID No.9的整个长度上的连续核酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的核酸序列；
d)CKX5基因或其直系同源序列，所述CKX5基因包括与SEQ ID No.10相同或有至少95％一致性的核酸序列；优选地，所述直系同源序列是如下的内源基因：包括与SEQ IDNo.10的300个核苷酸、优选SEQ ID No.10的500个核苷酸、更优选SEQ ID No.10的整个长度上的连续核酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的核酸序列；
e)CKX6基因或其直系同源序列，所述CKX6基因包括与SEQ ID No.11相同或有至少95％一致性的核酸序列；优选地，所述直系同源序列是如下的内源基因：包括与SEQ IDNo.11的300个核苷酸、优选SEQ ID No.11的500个核苷酸、更优选SEQ ID No.11的整个长度上的连续核酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的核酸序列；
或者
f)CKX7基因或其直系同源序列，所述CKX7基因包括与SEQ ID No.12相同或有至少95％一致性的核酸序列；优选地，所述直系同源序列是如下的内源基因：包括与SEQ IDNo.12的300个核苷酸、优选SEQ ID No.12的500个核苷酸、更优选SEQ ID No.12的整个长度上的连续核酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的核酸序列；
其中，与缺乏所述中断的相应对照植物和对照植物细胞相比，所述中断抑制至少两个中断的细胞分裂素氧化/脱氢酶基因的表达和/或其产物活性。
优选地，本发明分离的植物细胞和/或本发明的转基因植物在以下基因中包含中断：
i)至少一种编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源CKX3基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.1相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，所述直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.1的50个氨基酸、优选SEQ ID No.1的100个氨基酸、更优选SEQID No.1的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
以及
ii)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源CKX5基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.4相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，所述直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.4的50个氨基酸、优选SEQID No.4的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.4的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列。
优选地，本发明分离的植物细胞和/或本发明的转基因植物在以下基因中包含中断：
i)内源CKX3基因或其直系同源序列，所述内源CKX3基因包括与SEQ IDNo.7相同或有至少95％一致性的核酸序列；优选地，所述直系同源序列是如下的基因：包括与SEQ IDNo.7的300个核苷酸、优选SEQ ID No.7的500个核苷酸、更优选SEQ ID No.7的整个长度上的连续核酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的核酸序列；
以及
ii)内源CKX5基因或其直系同源序列，所述CKX5基因包括与SEQ ID No.10相同或有至少95％一致性的核酸序列；优选地，所述直系同源序列是如下的内源基因：包括与SEQID No.10的300个核苷酸、优选SEQ ID No.10的500个核苷酸、更优选SEQ ID No.10的整个长度上的连续核酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的核酸序列。
在本发明的分离的植物细胞和/或本发明的转基因植物中，可通过结构性中断、反义多核苷酸基因抑制、双链RNA诱导的基因沉默、核酶技术、基因组中断、定向诱导基因组局部突变技术(tilling)、和/或同源重组来促使产生本发明的一个、多个或所有中断。
在本发明的分离的植物细胞和/或本发明的转基因植物中，本发明的一个、多个或所有中断可能是纯合中断(homozygous disruption)。
本发明的转基因植物优选选自十字花科(brassicaceae)、更优选地选自芸苔属(brassica)或拟南芥属(arabidopsis)。
本发明还涉及一种源自本发明转基因植物的细胞、器官、组织或转基因繁殖材料。其中，转基因繁殖材料包括本发明转基因植物的组成部分，例如，来自于本发明转基因植物的种子、块茎、甜菜根/肿的主根(swollen tap root)、或果实。
本发明还涉及一种相对于相应的对照植物，提高植物的种子产量和/或增加株高的方法，该方法包括在植物的至少以下基因中导入中断：
i)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源CKX3基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.1相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，所述直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.1的50个氨基酸、优选SEQID No.1的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.1的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
以及
ii)至少另一个内源基因：
a)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的CKX1基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.13相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，所述直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.13的50个氨基酸、优选SEQ IDNo.13的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.13的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
b)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的CKX2基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.2相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，所述直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.2的50个氨基酸、优选SEQ IDNo.2的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.2的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
c)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶编码的CKX4基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.3相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，所述直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.3的50个氨基酸、优选SEQID No.3的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.3的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
d)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的CKX5基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.4相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，所述直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.4的50个氨基酸、优选SEQ IDNo.4的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.4的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
e)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的CKX6基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.5相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，所述直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.5的50个氨基酸、优选SEQ IDNo.5的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.5的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
或者
f)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的CKX7基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.6相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，所述直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.6的50个氨基酸、优选SEQ IDNo.6的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.6的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
其中，与缺乏所述中断的相应对照植物相比，所述中断抑制至少两个中断的细胞分裂素氧化/脱氢酶基因的表达和/或其产物活性。
本发明的另一方面涉及一种生产植物、优选转基因植物的方法；其中相对于相应对照植物，所述本发明的植物种子产量得到提高和/或株高增加。所述方法包括在植物的至少以下基因中导入中断：
i)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源CKX3基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.1相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，所述直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.1的50个氨基酸、优选SEQID No.1的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.1的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
以及
ii)至少另一个内源基因：
a)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的CKX1基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.13相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，所述直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.13的50个氨基酸、优选SEQ IDNo.13的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.13的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
b)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的CKX2基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.2相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，所述直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.2的50个氨基酸、优选SEQ IDNo.2的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.2的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
c)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的CKX4基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.3相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，所述直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.3的50个氨基酸、优选SEQ IDNo.3的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.3的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
d)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的CKX5基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.4相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，所述直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.4的50个氨基酸、优选SEQ IDNo.4的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.4的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
e)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的CKX6基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.5相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，所述直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.5的50个氨基酸、优选SEQ IDNo.5的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.5的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
或者
f)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的CKX7基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.6相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，所述直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.6的50个氨基酸、优选SEQ IDNo.6的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.6的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
其中，与缺乏所述中断的相应对照植物相比，所述中断抑制至少两个中断的细胞分裂素氧化/脱氢酶基因的表达和/或其产物活性。
本发明的方法中，优选中断以下基因：
i)至少一种编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源CKX3基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.1相同或有至少95％性一致的多肽序列；优选地，所述直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.1的50个氨基酸、优选SEQ ID No.1的100个氨基酸、更优选SEQID No.1的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
以及
ii)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源CKX5基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.4相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，所述直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.4的50个氨基酸、优选SEQID No.4的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.4的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列。
本发明的方法中，优选中断以下基因：
i)内源CKX3基因或其直系同源序列，所述内源CKX3基因包括与SEQ IDNo.7相同或有至少95％一致性的核酸序列；优选地，所述直系同源序列是如下的基因：包括与SEQ IDNo.7的300个核苷酸、优选SEQ ID No.7的500个核苷酸、更优选SEQ ID No.7的整个长度上的连续核酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的核酸序列；
以及
ii)至少另一个内源基因：
a)CKX1基因或其直系同源序列，所述CKX1基因包括与SEQ ID No.14相同或有至少95％一致性的核酸序列；优选地，所述直系同源序列是如下的内源基因：包括与SEQ IDNo.14的300个核苷酸、优选SEQ ID No.14的500个核苷酸、更优选SEQ ID No.14的整个长度上的连续核酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的核酸序列；
b)CKX2基因或其直系同源序列，所述CKX2基因包括与SEQ ID No.8相同或有至少95％一致性的核酸序列；优选地，所述直系同源序列是如下的内源基因：包括与SEQ IDNo.8的300个核苷酸、优选SEQ ID No.8的500个核苷酸、更优选SEQ ID No.8的整个长度上的连续核酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的核酸序列；
c)CKX4基因或其直系同源序列，所述CKX4基因包括与SEQ ID No.9相同或有至少95％一致性的核酸序列；优选地，所述直系同源序列是如下的内源基因：包括与SEQ IDNo.9的300个核苷酸、优选SEQ ID No.9的500个核苷酸、更优选SEQ ID No.9的整个长度上的连续核酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的核酸序列；
d)CKX5基因或其直系同源序列，所述CKX5基因包括与SEQ ID No.10相同或有至少95％一致性的核酸序列；优选地，所述直系同源序列是如下的内源基因：包括与SEQ IDNo.10的300个核苷酸、优选SEQ ID No.10的500个核苷酸、更优选SEQ ID No.10的整个长度上的连续核酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的核酸序列；
e)CKX6基因或其直系同源序列，所述CKX6基因包括与SEQ ID No.11相同或有至少95％一致性的核酸序列；优选地，所述直系同源序列是如下的内源基因：包括与SEQ IDNo.11的300个核苷酸、优选SEQ ID No.11的500个核苷酸、更优选SEQ ID No.11的整个长度上的连续核酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的核酸序列；
或者
f)CKX7基因或其直系同源序列，所述CKX7基因包括与SEQ ID No.12相同或有至少95％一致性的核酸序列；优选地，所述直系同源序列是如下的内源基因：包括与SEQ IDNo.12的300个核苷酸、优选SEQ ID No.12的500个核苷酸、更优选SEQ ID No.12的整个长度上的连续核酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的核酸序列。
本发明另一个优选方法中，中断以下基因：
i)内源CKX3基因或其直系同源序列，所述内源CKX3基因包括与SEQ IDNo.7相同或有至少95％一致性的核酸序列；优选地，所述直系同源序列是如下的基因：包括与SEQ IDNo.7的300个核苷酸、优选SEQ ID No.7的500个核苷酸、更优选SEQ ID No.7的整个长度上的连续核酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的核酸序列；
以及
ii)内源CKX5基因或其直系同源序列，所述内源CKX5基因包括与SEQ IDNo.10相同或有至少95％一致性的核酸序列；优选地，所述直系同源序列是如下的内源基因：包括与SEQ ID No.10的300个核苷酸、优选SEQ ID No.10的500个核苷酸、更优选SEQ ID No.10的整个长度上的连续核酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的核酸序列。
在本发明的方法中，优选的一个、多个或所有中断是纯合中断。
本发明还涉及由本发明的方法之一可获得或获得的分离的植物细胞或转基因植物。
在一个实施例中，通过在植物细胞中导入至少一种多核苷酸序列，以在本发明分离的植物细胞或本发明转基因植物中产生至少一个中断；其中，所述导入的多核苷酸序列含有与SEQ ID No.14(CKX1)、SEQ ID No.7(CKX3)、SEQ ID No.8(CKX2)、SEQ ID No.9(CKX4)、SEQ ID No.10(CKX5)、SEQ ID No.11(CKX6)、SEQ ID No.12(CKX7)、或其子序列、或其互补序列有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％、约99.5％或更高序列一致性的核酸序列，且使所述至少一种多核苷酸序列与启动子正义或反义连接。在另一个实施例中，通过导入至少一种用于RNA沉默或RNA干扰的多核苷酸序列，以在本发明的植物细胞或转基因植物中导入中断。
在另一个实施例中，至少一个上述内源基因中的一个、多个或所有中断包括一个或多个转座子的插入。在另一个实施例中，一个、多个或所有中断可以包括至少一个上述内源基因中的一个或多个点突变。
至少一个上述内源基因中的一个、多个或所有中断可以是纯合中断。可选择地，至少一个上述内源基因中的一个、多个或所有中断可以是杂合中断。在某些实施例中，至少一个上述内源基因中的中断可以包括纯合中断、杂合中断、或纯合中断和杂合子断的结合。
除非另有限定，否则，本发明使用的所有技术术语和科学术语所具有的含义与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同。在本发明的说明书及权利要求中，下列术语与下文所记载的定义一致。
在本说明书和所附权利要求中所用的单数形式(“a”，“an”和“the”)包括单数和复数，除非文中另有规定。因此，例如“细胞(a cell)”包括一个细胞、及两个或两个以上细胞的结合等等。
术语“植物”一般是指以下任意一种：整株植物、植物的组成部分或器官(如叶、茎、根等)、茎部营养器官/结构(如叶、茎和块茎)、根、花和花器官/结构(如苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(包括胚、胚乳、种皮)、果实(成熟的子房)、植物组织(如维管组织、基本组织等)、愈伤组织培养、植物细胞(如保卫细胞、卵细胞、表皮毛等)、及相同的子代。术语“植物”一般是指所有能够进行光合作用的生物体。本发明范围内的植物，包括植物领域所有种属中的高等植物和低等植物。成熟植物是指在幼苗之后任意发育阶段的植物。幼苗是指在早期发育阶段的幼小不成熟的植物。优选一年生植物、多年生植物、单子叶植物、和/或双子叶植物。优先考虑十字花科的植物，尤其是芸苔属和拟南芥属的植物。
本发明所用的植物细胞还包括，但不限于，得自或发现于植物或其组成部分中的细胞。如细胞可来自或发现于：种子、培养物、悬浮培养物、胚、分生组织区域、愈伤组织、叶、根，茎、配子体、孢子体、花粉、及小孢子中。植物细胞也可以理解为包括从上述组织中获得的经改变的细胞，如原生质体。
本发明所用的术语“中断”或“中断的”是指基因可以被结构性中断，以使该基因包括至少一个突变或结构改变，从而使中断的基因无法引导全长且全功能基因产物的有效表达。术语“中断”或“中断的”还包括中断的基因或其一种产物被功能性抑制或去活性化，从而使基因不表达、或者不能有效表达具有全长和/或全功能的基因产物。可通过结构中断、或在转录或翻译水平干扰表达，来获得功能抑制或去活性化。功能抑制或去活性化也可以经由以下方法来实现，例如：反义多核苷酸基因抑制、双链RNA诱导的基因沉默、核酶技术等。表达和/或活性的抑制可为以下处理的结果，例如：反义结构、正义结构、RNA沉默结构、RNA干扰、基因组中断(如转座子、定向诱导基因组局部突变技术、同源重组等)等。由功能抑制实现的中断还包括通过与化合物相互作用，来抑制基因或其产物之一；其中，所述化合物优选为与所述基因或基因产物有特异性相互作用的化合物。可以通过以下方法测量表达和/或活性的抑制情况：测定转录物的存在和/或含量，例如，通过Northern杂交或逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术；和/或测定所述基因编码的全长或截短的多肽的存在和/或含量，例如，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)或免疫印迹(Western blotting)；和/或测定中断的细胞分裂素氧化/脱氢酶基因产物——细胞分裂素氧化/脱氢酶的活性的存在和/或含量。本发明所使用的术语“中断”或“中断的”可以理解为，所述中断还包括只在植物的一个组成部分、特定细胞类型或组织(例如生殖分生组织或茎尖)中能够有效的中断。可以通过与编码区、非编码区、和/或调控区(如特定基因的启动子区域)的相互作用或影响上述区域，来实现中断。
术语“转基因”是指并入了核酸序列(包括但不限于基因、多核苷酸、脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)等)和/或变化(例如突变、点突变等)的植物；其中，与未导入的植物不同，所述植物是通过用于生产植物的、且不必是生物学的方法而导入了所述核酸序列和/或变化。因此，术语“转基因植物”不仅包括含有非内源核酸的植物，还明确包括内源基因发生突变(如点突变)的植物。其中，与非导入植物相比，所述转基因植物是通过用于生产植物的、且不必是生物学的方法而导入所述突变。
术语“内源的”涉及已经存在于特定细胞或器官等(如植物)中的任何基因或核酸序列。术语“外源的”涉及不是内源的任何基因或核酸序列。
术语“转座因子”(Transposable Element，TE)或“转座性遗传因子”是可以在细胞内从一个位置移动至另一个位置的DNA序列。转座因子的移动可以从附加体到附加体、从附加体到染色体、从染色体到染色体、或从染色体到附加体。转座因子的特征是在其末端有反向重复序列。该转移是通过“转座酶”酶介导的。在结构上，基于存在或不存在除了因子转移所必需的那些基因序列之外的基因序列，而将转座因子分别归类为“转座子”(TN)或“插入序列因子”(IS因子)。微型转座子或微型-IS因子通常缺乏编码转座酶的序列。
术语“核酸”或“多核苷酸”一般是使用其在本领域公认的含义，是指RNA或DNA的聚合物、或其类似物，例如，包含核苷酸、肽核酸等的修饰的核苷酸聚合物。在某些应用中，核酸是包括多种单体类型的聚合物，例如同时包括RNA和DNA亚单位。核酸可以是，例如，染色体或染色体片段、载体(如表达载体)、表达盒(expression cassette)、裸DNA或RNA聚合物、聚合酶链反应(PCR)的产物、寡核苷酸、探针等。核酸可以是，例如，单链和/或双链的。除非另有说明，本发明的特定核酸序列除了明确表示的任何序列以外，还可以选择性包括或编码互补序列。
术语“多核苷酸序列”、“核酸序列”或“核苷酸序列”是指在单个核酸中的核苷酸连续序列、或表示为例如其字串。也就是说，根据上下文，“多核苷酸序列”是核苷酸的聚合物(寡核苷酸、DNA、核酸等)、或代表核苷酸聚合物的字串。经由任何指定的多核苷酸序列，可确定特定的核酸或互补的多核苷酸序列，例如互补的核酸。
术语“子序列”或“片段”是整个序列的任何部分。
“表达盒”是例如载体(如质粒、病毒载体)等核酸结构，能够产生转录本，且能够潜在地产生多核苷酸序列所编码的多肽。表达载体能够在外源性细胞(如细菌细胞或植物细胞)中、在体内(in vivo)或体外(in vitro)(例如，培养的植物原生质体)中产生转录本。基于例如选定的启动子，产物的表达可以是组成性表达或者诱导性表达。本定义明确包括没有被翻译或不能被翻译的反义结构、正义结构、或RNA干扰或或沉默结构。在表达载体的情况中，如果启动子能够调节相关联的多核苷酸序列的表达，则称启动子被“可操作性连接”或“功能性连接”至多核苷酸序列。该术语也适用于可替代的外源性基因结构，如表达或整合的转基因。同样地，术语“可操作性连接”或“功能性连接”同样适用于替代或补充地与多核苷酸序列相关联的转录调控序列，如增强子。
如果多核苷酸序列可以被转录(以剪接或者非剪接形式)和/或翻译成RNA或多肽、或其子序列，则称多核苷酸序列、核酸序列或基因“编码”正义或反义RNA分子、或RNA沉默或干扰分子、或多肽。为本领域技术人员公知地，由于遗传密码的简并性，使得许多不同的核酸序列编码相同的氨基酸序列或多肽，且可无困难地确定给定的核酸序列是否编码给定的氨基酸序列或多肽。
“基因表达”或“核酸表达”是指DNA转录成RNA(可选地，包括RNA的修饰，如剪接)、RNA翻译成多肽(可能包括多肽后续的修饰，例如翻译后修饰)、或转录和翻译都发生，根据上下文决定。
术语“基因”或“基因序列”广泛地指与生物学功能相关的任何核酸。基因通常包括编码序列、和/或该编码序列表达所需的调控序列。术语“基因”适用于特定的基因组序列，同时还适用于该基因组序列编码的cDNA或mRNA。基因还包括不表达的核酸片段，来自例如形成其他蛋白的识别序列。不表达的调控序列包括结合转录因子等调控蛋白的启动子和增强子，以在相邻或附近序列起始转录。
“多肽”是包括两个或两个以上氨基酸残基的聚合物，如多肽或蛋白。该聚合物还可以包括非氨基酸元素，如标记、猝灭剂、保护基等。另外该聚合物还可以选择性地包括修饰，如糖基化等。多肽的氨基酸残基可以是自然的或非自然的，且可以是未被取代的、未经修饰的、被取代的或经修饰的。
本发明所使用的“细胞分裂素氧化/脱氢酶基因”是指编码具有细胞分裂素氧化/脱氢酶活性多肽的基因。细胞分裂素氧化/脱氢酶是催化如下化学反应的酶：
该酶的三个底物是N6-二甲基烯丙基腺嘌呤、受体和H2O，而它的三个产物是腺嘌呤、3-甲基-2-丁烯醛和还原受体。优选地，术语“细胞分裂素氧化/脱氢酶活性”包括如下的活性：给定多肽利用至少一种细胞分裂素作为底物，以催化氧化还原反应。本领域技术人员具有公知的手段和方法，以确定给定的多肽是否具有细胞分裂素氧化/脱氢酶的活性，或确定特定的多肽或探针的细胞分裂素氧化/脱氢酶活性水平的绝对值、和/或与另一种多肽或探针相比的相对值。在文献中有许多如何测试给定多肽的这种活性的指导，例如，参见EC1.5.99.12。更优选地，术语“细胞分裂素氧化/脱氢酶活性”包括如下的活性：给定多肽利用至少一种细胞分裂素作为底物，以催化氧化还原反应；该活性优选不低于AtCKX3活性的30％(CKX3为SEQ ID No.1)，优选不低于AtCKX3活性的50％。
本发明使用的术语“直系同源序列”是指：源自同一物种(优选不同于拟南芥)的基因，显示出与拟南芥的特定基因具有最高的相似性，优选具有最高的序列一致性，因为这两个基因均来自于共同的起源。优选地，术语“直系同源系列”表示：编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，包括与所述同源直系序列对应的给定序列有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％一致性的序列(多肽或核酸)，优选是在特定序列长度上具有上述的序列一致性。更优选地，术语“直系同源序列”表示：源自与拟南芥不同种、且编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，包括与所述同源直系序列对应的拟南芥给定序列有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％一致性的序列，优选是在特定序列长度上具有上述的序列一致性。
术语“重组”表示通过人为干预、经人工或合成(非天然)的方式改变的材料(如细胞、核酸或蛋白)。这种改变可以对处于(或移出)自然环境或自然状态中的材料进行。例如，“重组核酸”是指例如在克隆、DNA改组(DNAshuffling)或其他过程中通过重组核酸而得到的核酸；“重组多肽”或“重组蛋白”是重组核酸表达所产生的多肽或蛋白。重组细胞的例子包括含有重组核酸和/或重组多肽的细胞。
术语“载体”是指可以使核酸在有机体、细胞或细胞组分之间繁殖和/或转移的工具。载体包括可自主复制或整合到宿主细胞染色体上的质粒、病毒、噬菌体、原病毒、噬菌粒、转座子、及人工染色体等。载体也可以是不能自主复制的裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、在同一链中由DNA和RNA共同组成的多核苷酸、多聚赖氨酸结合的DNA或RNA、肽结合的DNA或RNA、脂质体结合的DNA等。
在本发明的上下文中，术语“分离的”是指基本上与其在自然存在的环境中共存或相互作用的组分分离的生物材料，如核酸或多肽。分离的材料可选地包括没有在其自然环境(例如细胞)中发现的材料。例如，如果材料仍在其自然环境，如细胞中，但被放置在细胞内该环境中材料非自然存在的位置上，例如，基因组或遗传因素上。例如，如果由非天然的工具(例如载体，如质粒载体、或病毒载体、或扩增子)将自然存在的核酸导入对核酸来说非天然存在的基因组的位点(如编码序列、启动子、增强子等)上，则该核酸为分离的核酸。分离的植物细胞，例如，可以在如细胞培养系统或从细胞培养纯化的环境中，而不是在野生型植物细胞的天然环境(如整个植物)中。
本发明使用的“启动子”，包括DNA上游的转录起始区域，且参与RNA聚合酶和其他蛋白的识别和结合，以起始转录。“植物启动子”是指能够在植物细胞中起始转录的启动子。植物的启动子的例子包括但不仅限于：从植物、植物病毒、及包含在植物细胞中表达的基因的细菌(如农杆菌(Agrohacterium)或根瘤菌(Rhizobium))中获得的启动子。在发育控制下的启动子的例子包括：在特定组织(如叶、根、种子)、或在如胚乳、胚或分生区域等空间优先起始转录的启动子。这些启动子被称为“组织优选”的或“组织特异性”的。时间调节性的启动子在特定时间启动表达，如授粉后“0-25天”之间。“细胞类型优选”启动子，主要在一种或多种器官中一定类型的细胞中启动表达，例如，在根或叶的维管细胞中。“可诱导的”启动子是在环境控制下可诱导或可去抑制的启动子。可通过可诱导的启动子影响转录的环境条件的例子，包括厌氧条件或光存在的条件。组织特异性、细胞类型特异性、和可诱导的启动子构成“非组成性”启动子这一类别。“组成性”启动子是指在大多数环境条件、在所有或几乎所有的组织、在发育过程的所有或几乎所有的阶段都有活性的启动子。
本发明使用的“转化”是指如下的过程：当将外源DNA导入细胞膜时，则称细胞被外源DNA“转化”。外源DNA可能整合(共价连接)或可能没有整合至构成细胞基因组的染色体DNA上。例如，在原核生物和酵母中，外源DNA可保持在附加因子(如质粒)上。对于更高级的真核细胞，稳定转化或转染的细胞为外源DNA整合到细胞的染色体上，从而能够通过染色体复制遗传给子细胞。这种稳定性指真核细胞能够建立含有外源DNA子细胞群的细胞系或克隆的能力。
基于本发明的目的，序列“一致性”是由许多任意方法客观确定的。熟练的技术人员熟知这些方法，可以在没有负担的情况下选择合适方法。可有多种确定两条或两条以上序列之间关系(如一致性、相似性和/或同源性)的方法，并且这些方法在本领域是公知的。这些方法包括例如人工比对、计算机辅助序列比对、及其组合。很多执行序列比对的算法(一般是由计算机实施的)被广泛使用，或者熟练的技术人员可以制作序列比对的算法。这些方法包括，例如：局部同源性算法(Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482)；同源性比对算法(Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443)；寻找相似性的方法(Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85：2444)；和/或这些算法的计算机实现(例如威斯康星遗传学软件包发布(Wisconsin Genetics Software Package Release)7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA，遗传学计算机组(Genetics Computer Group)，575ScienceDr.，麦迪逊，威斯康星州(WI))。
例如，使用BLAST算法执行序列一致性(序列相似性)分析的软件记载于Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410中。这个软件是可公开使用的，例如通过在全球性网站ncbi.nlm.nih.gov.的国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)上使用。该算法首先通过识别待查序列中长度为W的短字串确定高得分序列片段(High Sequence Pairs，HSP)，待查序列中长度为W的短字串当与数据库序列中长度相同的字串进行比对时匹配或满足某正阈值得分T。T是指邻近字串得分阈值。这些初始的邻近的命中字串作为起始搜索的种子，以寻找包含这些命中字串的更长的HSP。然后该命中字串沿着每条序列向两侧延伸，直至累计比对得分是增加的。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖分；总是＞0)和N(不匹配残基的罚分；始终＜0)计算累计得分。对于氨基酸序列，使用打分矩阵(scoring matrix)来计算累计得分。命中字串在每个方向上的延伸会在以下情况下停止：累计比对得分自其达到的最高值下降X；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累计得分为零或零以下；或者，到达任一序列的末端。BLAST算法的参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。对于核苷酸序列而言，BLASTN程序默认使用字串长度(W)为11，预期值(E)为10，截止值为100，M＝5，N＝-4，对两条链均进行比对。对于氨基酸序列，BLASTP(BLAST蛋白)程序默认使用字串长度(W)为3，预期值(E)为10，使用BLOSUM62打分矩阵(参见Henikoff & Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)。
此外，BLAST算法执行两个序列之间相似性的统计学分析(参见例如Karlin &Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787)。BLAST算法提供的相似性的测量标准是最小的总和概率(p(N))，用于指示两条核苷酸序列或者氨基酸序列之间匹配偶然出现的概率。例如，如果测试核酸与对照核酸比对的最小的总和概率小于约0.1、或小于约0.01、甚至小于约0.001，则认为该测试核酸与对照序列是相似的，因此，在本文的上下文中，则认为这两条序列是同源的。
另一个有用的序列比对算法的例子是PILEUP。PILEUP采用累积、成对的比对方法，从一组相关序列中创建多序列比对。该算法也可以绘制聚类关系树，该聚类关系用于创建比对。PILEUP采用了简化的累积比对方法(Feng & Doolittle(1987)J.Mol.Evol.35：351-360)。所使用的方法与Higgins & Sharp((1989)CABIOS5：151-153)的方法类似。该程序可以比对例如多达300条最大长度为5000个字母的序列。多序列比对程序始于两条最相似序列的成对比对，产生两条比对序列的集群。然后该集群与下一个最相关序列或比对序列的集群进行比对。可以由两条单独序列成对比对的简单延伸来进行两个序列集群的比对。通过一系列累积、成对的比对来获得最终的比对结果。该程序也可用于绘制代表聚类关系的系统树图或树。为对照序列的区域指定特定序列及其氨基酸或者核苷酸坐标，从而以运行该程序。
另一个适合多DNA或氨基酸序列比对的算法的例子是CLUSTALW程序(Thompson，J.D.等(1994)Nucl.Acids.Res.22：4673-4680)。CLUSTALW在多组序列之间进行多对比较，并基于同源性对这些序列进行多重比对。缺口打开和缺口扩展的罚分可以例如分别为10和0.05。对于氨基酸比对，BLOSUM算法可用作蛋白分子重矩阵。参见例如Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919。
本发明的分离的植物细胞或转基因植物可以通过如转化等常规手段获得。植物细胞和原生质体的转化可以采用对于植物分子生物学领域的技术人员公知的各种方式进行，包括但不限于本发明描述的方法。一般参见《酶学方法》(Methods in Enzymology)，卷153，重组DNA部分D(Recombinant DNA Part D)(Wu和Grossman编著1987，科学出版社(AcademicPress))。本发明所使用的术语“转化”是指通过导入“异源性”、“外源性”或“异质的”核酸序列来改变宿主植物或植物细胞的基因型。异源性核酸序列不一定需要源自不同的来源，但是对于要导入的细胞来说，在某种程度上是外来的。除Berger、Ausubel和Sambrook之外，对于植物细胞克隆、培养和再生有用的参考资料一般包含Jones(编著)(1995)的《植物基因转移和表达试验方案-分子生物学方法》(Plant Gene Transfer and ExpressionProtocols-Methods in Molecular Biology)卷49(Humana Press Towata，新泽西州(NJ))；Payne等(1992)的《在液体系统中的植物细胞和组织培养》(Plant Cell and TissueCulture in Liquid Systems)(John Wiley & Sons，Inc.纽约，纽约州(Payne))；以及，Gamborg和Phillips(编著)(1995)的《植物细胞、组织和器官培养》(Plant Cell，Tissueand Organ Culture)；《基本方法-施普林格实验手册》(Fundamental Methods SpringerLab Manual)(施普林格出版社(Springer-Verlag)(柏林海德堡(Berlin Heidelberg)，纽约(New York))(Gamborg))。Atlas和Parks(编著)的《微生物培养基手册》(The Handbookof Microbiological Media)(1993)(CRC出版社，博卡拉顿(Boca Raton)，佛罗里达州(FL)(Atlas))中描述了各种各样的细胞培养基。另外还可以在可得到的商业文献中找到植物细胞培养的更多信息，例如西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich Inc)(圣路易斯(StLouis)，密苏里州(MO))提供的《生命科学研究细胞培养目录》(Life Science ResearchCell Culture Catalogue，Sigma-LSRCCC)(1998)和，例如，同样由Sigma-Aldrich公司(StLouis，MO)提供的《植物培养目录和增刊》(Plant CultureCatalogue and supplement，Sigma-PCCS)(1997)。另外，还可以从Croy(编著)(1993)的《植物分子生物学》(PlantMolecular Biology)(Bios科学出版社，牛津，英国)中找到关于植物细胞培养更多的细节。
通过将处于反义或正义结构、或RNA沉默或干扰结构等中的转基因多核苷酸序列导入植物细胞或植物中，并在其中进行表达，从而促使在至少上述一个内源基因中发生一个、多个或所有中断；其中，转基因多核苷酸序列包括以下核酸序列或其互补序列：
a)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源CKX3基因的序列或子序列或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.1相同或有至少95％一致性的多肽序列；
b)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源CKX1基因的序列或子序列或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括SEQ ID No.13的多肽序列；
c)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源CKX2基因的序列或子序列或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.2相同或有至少95％一致性的多肽序列；
d)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源CKX4基因的序列或子序列或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.3相同或有至少95％一致性的多肽序列；
e)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源CKX5基因的序列或子序列或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.4相同或有至少95％一致性的多肽序列；
f)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源CKX6基因的序列或子序列或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.5相同或有至少95％一致的多肽序列；
g)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源CKX7基因的序列或子序列或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.6相同或至少95％一致性的多肽序列；
或者
h)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因的序列或子序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.1、2、3、4、5、6或13中的一条序列上的50个氨基酸、优选100个氨基酸、更优选在整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
且所述转基因多核苷酸序列包括启动子。从而与相应的缺乏这种中断的对照植物细胞或植物(如非转基因亲本或同一种的非转基因植物)相比，所述转基因多核苷酸序列至少能够抑制中断的细胞分裂素氧化/脱氢酶基因的表达和/或活性。转基因的核苷酸序列可以采用如下方法(但不限于)导入，例如：电穿孔、微弹轰击、土壤杆菌介导的转化、或其他可用的方法。在本发明的某些方面，核苷酸正向或反向地连接在启动子上，或设置为RNA沉默或RNA干扰。
描述同源依赖性基因沉默的应用的相关文献包括：Jorgensen，TrendsBiotechnol.8(12)：340-344(1990)；Flavell，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)91：3490-3496(1994)；Finnegan等，Bio/Technology 12：883-888(1994)；Neuhuber等，Mol.Gen.Genet.244：230-241(1994)；Flavell等，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3490-3496；Jorgensen等，(1996)Plant Mol.Biol.31：957-973；Johansen和Carrington(2001)Plant Physiol.126：930-938；Broin等，(2002)Plant Cell 14：1417-1432；Stoutjesdijk等，(2002)Plant Physiol.129：1723-1731；Yu等，(2003)Phytochemistry63：753-763；和美国专利号5,034,323、5,283,184和5,942,657。
此外，另一种基因沉默的方法，可以利用反义技术，如Rothstein等PlantMol.Cell.Biol.6：221-246(1989)；Liu等(2002)Plant Physiol.129：1732-1743和美国专利号5,759,829和5,942,657。反义核酸的使用在本领域中是公知的。反义核酸具有与特定基因组基因序列、mRNA、或cDNA等目标核酸互补的区域。反义核酸可以是RNA、DNA、PNA或任何其他适合的分子。反义序列与其互补的正义序列形成双链体，从而导致该基因失活。反义核酸通过与基因转录的RNA形成双链体、与双链DNA形成三链体等来抑制该基因的表达。反义核酸可以经由许多已得到确认的技术来制备，例如，反义RNA或寡核苷酸的化学合成法或体外转录法；其中，化学合成的反义RNA或寡核苷酸可选地包括修饰的核苷酸和/或键，以增强抗降解的能力或提高被细胞吸收的能力。反义核酸及其使用描述在如下文献中，例如：Haselton和Alexander的USP6,242,258(2001年6月5号)，题目为：《由光活化选择性调控DNA和RNA转录和翻译的方法》(Methods for the selective regulation of DNA and RNAtranscription and translation by photoactivation)；USP6,500,615；USP6,498,035；USP6,395,544；USP5,563,050；E.Schuch等(1991)Symp Soc.Exp Biol 45：117-127；deLange等，(1995)Curr Top Microbiol Immunol 197：57-75；Hamilton等(1995)Curr TopMicrobiol Immunol 197：77-89；Finnegan等，(1996)Proc Natl Acad Sci USA93：8449-8454；Uhlmann和A.Pepan(1990)，Chem.Rev.90：543；P.D.Cook(1991)，Anti-Cancer DrugDesign 6：585；J.Goodchild，Bioconjugate Chem.1(1990)165；以及，S.L. Beaucage和R.P.Iyer(1993)，Tetrahedron 49：6123；以及F.Eckstein编著(1991)，《寡核苷酸及其类似物-实用方法》(Oligonucleotides and Analogues-A Practical Approach)，IRL出版社。
催化RNA分子或核酶也可以用来抑制特定基因的表达。可以设计核酶，以使该核酶在实际操作中与任何期望的目标RNA进行配对，并在特异位置剪切磷酸双酯骨架，从而使目标RNA功能性失活。在进行这种剪切时，核酶本身并未改变，因此能够重复使用，以剪切其他分子。如果反义RNA内包含核酶序列，则可给予该反义RNA的RNA-切割活性，从而增加了该反义RNA结构的活性。已经确定了许多核酶种类，例如，一类核酶衍生自许多小的环状RNA，该环状RNA在植物中具有能自剪切和复制的能力。RNA可以独自复制(类病毒RNA)，或使用辅助病毒(卫星RNA)进行复制。RNA的例子包括：源自鳄梨日斑类病毒(avocado sunblotchviroid)的RNA；以及，源自烟草环斑病毒(tobacco ringspot virus)、紫花苜蓿短暂条纹病毒(lucerne transient streak virus)、绒毛烟草斑驳病毒(velvet tobacco mottlevirus)、茄属植物斑驳病毒(solanum nodiflorum mottle virus)和地三叶草斑驳病毒(subterranean clovermottle virus)的卫星RNA。对目标RNA-特异性核酶的设计和使用已有描述。参见例如，Haseloff等(1988)Nature，334：585-591。
通过抑制表达使特定选择的基因失活的另一种方法是正义抑制。已证实，其中核酸相对于启动子是正向配置的表达盒的导入，是阻断期望目标基因转录的有效手段。参见，例如，Napoli等(1990)，The Plant Cell 2：279-289，和美国专利号5,034,323、5,231,020和5,283,184。
也可以使用RNA沉默或RNA干扰(RNAi)技术来制造本发明的中断。RNA沉默或RNA干扰也可以称为转录后基因沉默(PTGS)或共抑制。在本发明的上下文中，“RNA沉默”(也称为RNAi或RNA介导的干扰)是指如下的机制：通过该机制，存在于细胞中的单链RNA或典型的双链RNA抑制目标基因的表达；其中该目标基因包含与该RNA相同或几乎相同的序列。该机制包括，但不仅限于：RNA干扰；抑制目标基因转录的目标mRNA的翻译，且不会改变该mRNA的稳定性；以及，转录沉默，如导致目标mRNA转录被抑制的组蛋白乙酰化和异染色质的形成。在“RNA干扰”中，存在于细胞中的单链RNA或双链RNA导致核苷酸链内切，随后使目标mRNA发生降解。
在一个实施例中，将转基因(例如感兴趣的基因或编码序列的序列和/或子序列)导入植物细胞，通过RNA沉默或RNA干扰(RNAi)来中断一个或多个基因。例如，序列或子序列(转基因)包括：小的子序列，例如长度约21-25个碱基；较大的子序列，例如长度约25-100或100-2000(或约200-1500，约250-1000等)个碱基；和/或，整个编码序列或基因。所述序列或子序列选自以下序列或其互补序列：
a)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源CKX3基因的序列或子序列或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.1相同或至少有95％一致性的多肽序列；
b)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源CKX1基因的序列或子序列或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.13相同或至少有95％一致性的多肽序列；
c)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源CKX2基因的序列或子序列或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.2相同或至少有95％一致性的多肽序列；
d)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源CKX4基因的序列或子序列或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.3相同或至少有95％一致性的多肽序列；
e)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源CKX5基因的序列或子序列或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.4相同或至少有95％一致性的多肽序列；
f)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源CKX6基因的序列或子序列或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.5相同或至少有95％一致性的多肽序列；
g)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源CKX7基因的序列或子序列或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.6相同或至少有95％一致性的多肽序列；
或者
h)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因的序列或子序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID Nos：1、2、3、4、5、6或13中的一条序列的50个氨基酸、优选100个氨基酸、更优选整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列。
优选地，转基因包括在序列或子序列中包含长度约21-25个碱基、且与SEQIDNo.7、8、9、10、11、12或14有至少80％、至少90％、或至少99％一致性的区域。
例如通过发夹(茎环)RNA的表达或干扰RNA双链的表达，利用RNAi在许多细胞类型(包括，如植物细胞)和器官中抑制基因表达，这在很多文献中有很清楚的描述。另外，确定靶向期望基因的适当干扰RNA的方法、及产生该干扰RNA的方法同样在文献中有详细的描述。例如，RNA干扰描述在以下文献中，例如：美国专利申请公开20020173478、20020162126和20020182223；Cogoni和Macino(2000)，“Post-transcriptional gene silencingacross kingdoms”Genes Dev.，10：638-643；Guru T.(2000)，“A silence that speaksvolumes”Nature 404：804-808；Hammond等，(2001)，“Post-transcriptional GeneSilencing by Double-stranded RNA”Nature Rev.Gen.2：110-119)；Napoli等，(1990)“Introduction of a chalcone synthase gene into Petunia results in reversibleco-suppression of homologous genes in trayas.”Plant Cell 2：279-289；等。
例如，在组成性启动子、可诱导启动子、或组织特异性启动子的控制下，表达要表达以诱导RNAi的多核苷酸序列或子序列。在特定实施例中，在组织特异性启动子的控制下进行表达是有利的。
可以经由，例如基于转座子的基因失活来导入至少一个上述内源基因中的一个、多个或所有的中断。例如，失活步骤包括在以下基因中产生一个或多个突变：
i)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源CKX3基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.1相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，其中直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.1的50个氨基酸、优选SEQID No.1的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.1的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
和/或
ii)至少另一个内源基因：
a)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的CKX1基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.13相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，其中直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.13的50个氨基酸、优选SEQ IDNo.13的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.13的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
b)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的CKX2基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.2相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，其中直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.2的50个氨基酸、优选SEQ IDNo.2的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.2的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
c)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的CKX4基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.3相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，其中直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.3的50个氨基酸、优选SEQ IDNo.3的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.3的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
d)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的CKX5基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.4相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，其中直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.4的50个氨基酸、优选SEQ IDNo.4的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.4的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
e)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的CKX6基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.5相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，其中直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.5的50个氨基酸、优选SEQ IDNo.5的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.5的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
或者
f)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的CKX7基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.6相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，其中直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.6的50个氨基酸、优选SEQ IDNo.6的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.6的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
其中，基因序列中的一个或多个突变包括一个或多个转座子的插入。并且与缺乏这种中断的相应对照植物细胞或植物相比，其中所述中断至少抑制中断的细胞分裂素氧化/脱氢酶基因的表达和/或活性。例如，所述一个或多个突变包括在上述一个或多个基因中的纯合中断；或所述一个或多个突变包括在上述一个或多个基因中的杂合中断、或纯合中断和杂合中断的结合。
在20世纪40年代后期，Barbara McClintock首次在玉米中发现了转座子。在植物基因诱变中通常使用转座因子的Mutator家族，例如Robertson′s Mutator(Mu)转座因子。因为该家族存在高拷贝数(10-100)，且优选插入基因中和基因附近。
转座因子基于其转座模式，可以分为两大类，且命名为类I和类II。这两类转座因子都可用作致变物和传递载体。类I转座因子由RNA作介导并使用反转录酶进行转座，也就是说，类I转座因子是逆转录因子。类I转座因子至少有三种类型，如反转录转座子、返座元(retroposon)、短散在核重复序列类(SINE-like)因子。反转录转座子通常包含长末端重复序列(LTR)、编码病毒外壳蛋白(gag)和反转录酶的基因、核糖核酸酶(RNase)H、整合酶基因和聚合酶(pol)基因。已描述，在植物物种中存在大量的反转录转座子。在反转录酶和RNaseH催化的反应中，这种反转录转座子经由RNA中间体进行活动和移位；其中，反转录酶和RNase H是由转座子编码的。归入Tyl-copia和Ty3-gypsy组的例子也可归入SINE-like和长散在核重复序列类(LINE-like)的分类中。在Kumar和Bennetzen(1999)PlantRetrotransposons(Annual Review of Genetics 33：479)中可以找到更详细的讨论。
此外，还发现DNA转座因子，如Ac，Taml和En/Spm，广泛存在于种类繁多的植物种类中，且这些DNA转座因子可以用于本发明中。
转座子(和IS因子)是在植物细胞中导入突变的常用工具。例如通过有性杂交(sexual cross)，将这些可移动的遗传因子传递到细胞中。例如，为了得到感兴趣的表型，而选择转座和筛选得到的插入突变体。然后可以通过分离的或转基因植物与非中断植物进行杂交，如通过有性杂交，将中断的基因导入其他植物中。根据要杂交的物种，可使用任何标准的育种技术。转座子(TN)在分离的或转基因植物基因组内的位置可由已知方法确定，例如，通过本发明描述的侧翼区的测序。例如，可使用依据植物的PCR反应，以扩增序列，这样可以进行诊断性测序，以确认该序列的来源。可选择地，筛选插入突变体，以得到具有期望表型的突变体。如相比对照植物，感兴趣基因的表达或活性被抑制。
定向诱导基因组局部突变技术也可以被用来确定本发明的中断。定向诱导基因组局部突变技术定向诱导基因组局部突变技术。参见，例如，McCallum等，(2000)，“TargetingInduced Local Lesion In Genomes(TILLING)for Plant Functional Genomics”PlantPhysiologv 123：439-442；McCallum等，(2000)，“Targeted screening for inducedmutations”Nature Biotechnologv 18：455-457；以及，Colbert等，(2001)，“High-Throughput Screening for the Induced Point Mutation”Plant Physiology 126：480-484。
定向诱导基因组局部突变技术结合了高密度点突变和突变的快速灵敏检测。典型地，使用甲烷磺酸乙酯(EMS)诱变处理植物种子。EMS使鸟嘌呤烷基化，而这通常会导致错配。例如，将种子浸泡在约10-20mM的EMS溶液中，约10-20小时；然后洗净种子，随后进行播种。这一代的植物被称为M1。然后M1植物进行自花受精。存在于形成繁殖组织的细胞中的突变，会遗传给下一代(M2)。典型地，筛选M2植物，以得到在期望的基因中存在突变和/或具有特定表型的植物。例如，将源自M2植物的DNA制成基因库，然后通过检测异源双链的形成来检测感兴趣基因中的突变。典型地，从每株M2植物制备DNA，并将该DNA制成基因库。通过PCR扩增期望的基因。然后将制库的样品变性、退火，以形成异源双链。如果突变存在于其中一株植物中，则PCR产物将有两种类型：野生型和突变型。通过分离PCR反应产物，例如通过变性高效液相色谱法(DPHPLC)，来确认包括异源双链的基因库。DPHPLC检测异等位DNA在解链和退火过程中形成的异源双链中的错配。在加热DNA的同时，进行色谱分析。异源双链具有较低的热稳定性，且形成气泡，从而导致异源双链在色谱柱中运动更快。因此当异源双链与预期的同源双链同时存在时，可以看到双峰。从而确认出在感兴趣基因上发生了突变的基因库。然后，可确认组成该选出的基因库群组的、源自植物的各DNA，并对其进行测序。可选择地，在感兴趣的基因上具有期望突变的植物可以与其他植物杂交，以去除背景突变。
其他诱变方法也可以用于导入本发明的中断。在植物基因中导入突变及选择具有理想性状的植物的方法是公知的。例如，根据标准技术，种子或其他植物材料可以用具有致突变的化学物质处理。这些化学物质包括，但不仅限于：硫酸二乙酯、吖丙啶和N-亚硝基-N-乙基脲。可替代地，可以使用来自例如X射线或伽玛射线源的电离辐射进行诱变。
可采用的检测感兴趣基因中突变的其他方法，如毛细管电泳(如固定变性剂毛细管电泳(constant denaturant capillary electrophoresis)和单链构象异构多态分析技术(single-stranded conformational polymorphism))。在另一个例子中，异源双链可以用错配修复酶学(如源自芹菜的核酸内切酶CEL I)进行检测。CEL I识别错配，并在错配的3′侧进行精确切割。因此可由错配修复酶进行切割，然后进行例如变性凝胶电泳，以确定错配碱基的精确位点。参见，例如：Oleykowski等，(1998)，“Mutation detection using anovel plant endonuclease”Nucleic Acid Res.26：4597-4602；和，Colbert等，(2001)，“High-Throughput Screening for Induced Point Mutations”，Plant Physiology 126：480-484。
本发明的包含期望中断的植物可以与其他植物杂交，以将该中断导入另一植物中。这可以通过标准的育种技术来实现。
同源重组也可用于导入本发明的中断。已证明植物中存在同源重组。参见，例如：Puchta等(1994)，Experientia 50：277-284；Swoboda等(1994)，EMBOJ.13：484-489；Offringa等(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：7346-7350；Kempin等(1997)Nature389：802-803；以及，Terada等，(2002)，“Efficient gene targeting by homologousrecombination in rice”Nature Biotechnology，20(10)：1030-1034。
同源重组经由特异性靶向体内感兴趣的基因，可用于诱导目标基因的改变。使用标准技术，在选定基因序列的选定部位(包括5′上游、3′下游和内含子(intragenicregion))体外制造突变，并将该突变的基因导入期望的植物中；其中，该选定的基因序列例如：
i)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源CKX3基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.1相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，所述直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.1的50个氨基酸、优选SEQID No.1的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.1的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
和/或
ii)至少一个内源基因：
a)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的CKX1基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.13相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，所述直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.13的50个氨基酸、优选SEQ IDNo.13的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.13的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
b)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的CKX2基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.2相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，所述直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.2的50个氨基酸、优选SEQ IDNo.2的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.2的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
c)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的CKX4基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.3相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，所述直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.3的50个氨基酸、优选SEQ IDNo.3的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.3的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
d)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的CKX5基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.4相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，所述直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.4的50个氨基酸、优选SEQ IDNo.4的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.4的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
e)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的CKX6基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.5相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，所述直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.5的50个氨基酸、优选SEQ IDNo.5的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.5的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列；
或者
f)编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的CKX7基因或其直系同源序列，所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.6相同或有至少95％一致性的多肽序列；优选地，所述直系同源序列是编码细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源基因，且所述细胞分裂素氧化/脱氢酶包括与SEQ ID No.6的50个氨基酸、优选SEQ IDNo.6的100个氨基酸、更优选SEQ ID No.6的整个长度上的连续氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少60％、至少80％、或至少90％一致性的多肽序列。
突变基因与目标野生型基因相互作用，以使转基因植物中出现同源重组，从而使野生型基因发生靶向置换。
本发明的分离的植物细胞和/或转基因植物，可以由人类和动物食用，也可例如直接或经已知的处理之后，作为食品或饲料使用。
本发明还涉及使用本发明上述分离的植物细胞和/或转基因植物、细胞、细胞培养、组成部分(例如，根、叶等转基因植物的器官)、及源自转基因植物的转基因繁殖材料(如种子、块茎、甜菜根/肿的主根或果实)，以制造食品或饲料、药物或精细化学品。
下面，本发明将通过实例作进一步地说明。
附图说明
图1为在ckx突变体中T-DNA和转座子插入的位置；通过PCR筛选确定插入的突变体，由对边界序列的DNA进行测序确定插入位点；黑色方格代表外显子，白色方格代表内含子，三角形表明T-DNA插入；G，GABI-KAT T-DNA-组织(collection)；S，Salk T-DNA-组织；T，托里梅萨(Torrey Mesa)T-DNA-组织；Z，ZIGIA转座子组织；
图2为ckx T-DNA和转座子插入的等位基因的特性；CKX基因在插入突变体中不表达；以来自10日龄幼苗的RNA作为模板，进行RT-PCR分析；扩增肌动蛋白(Actin)2作为对照；
图3为在ckx3 ckx5突变体和野生型花序中细胞分裂素的含量；每个样品采集0.5克的拟南芥花序，并制成基因库30DAG；每种基因型采集五个独立的生物样品；其中数据为细胞分裂素含量的平均值[pmol/g鲜重]±s.d.；n＝5；tZ，反式玉米素；tZR，反式玉米素核苷；tZRMP，反式玉米素核苷-5′-单磷酸；tZ9G，反式玉米素9-葡萄糖苷；tZROG，反式玉米素核苷O-葡萄糖苷；iP，N6-(Δ2异戊烯基)腺嘌呤；iPR，N6-(Δ2异戊烯基)腺苷；iPRMP，N6-(Δ2异戊烯基)腺嘌呤5′-单磷酸；iP9G，N6-(Δ2异戊烯基)腺嘌呤9-葡萄糖苷；
图4为野生型和ckx突变体的茎形态学的比较；在一个生命周期中，野生型和ckx突变体的主茎结出的角果数目；野生型植株结出54.7个角果(100％)；株高为拟南芥野生型和ckx突变体在开花结束时的株高；野生型植株的高度为39.5厘米(100％)；数据表示平均值±s.d.(n＝13-17)；*，P＜0.01，与野生型相比较；·＝P＜0.01，与ckx3相比较。
图5为ckx突变体的花表型和种子产量；a，b，发育阶段13的花(a)及相应的雌蕊(b)，从左至右为野生型、ckx3、ckx5、和ckx3 ckx5；c，ckx突变体发育阶段14的花的花瓣表面，39DAG(n＝30)；d，每个雌蕊群的胚珠数(n＝12)；e，野生型和ckx3 ckx5在生长箱条件下的种子产量(n＝30)；数据为平均值±s.d.；*，P＜0.01，与野生型相比较；
图6为一个生命周期中，野生型和ckx突变体主茎结出的角果的数目(n＝15)；野生型植株结有54.7个角果(100％)；数据为平均值±s.d.；*，P＜0.01，与WT相比较；·，P＜0.01，与ckx3相比较；
图7为野生型和ckx3ckx5突变体的幼胚珠；根据Schneitz等描述的方法确定胚珠的发育阶段；比例尺：10μm；与野生型植株相比，ckx3 ckx5突变体的胚珠的数量增加。
具体实施方式
实例
方法
植物材料和生长条件
使用拟南芥Columbia(Col-0)的生态型作为野生型。T-DNA插入突变体ckx2-S1(SALK_068485)、ckx3-S1(SALK_050938)、ckx4-S1(SALK_055204)、ckx5-S1(SALK_064309)、及ckx6-S1(SALK_070071)来自萨克研究所基因组分析实验室(Salk institute genomicanalysis laboratory)(Alonso等，(2003)Science 301，653-657)；转座子插入突变体ckx4-Z来自ZIGIA转座子组织(Baumann E，Lewald J，Saedler H，Schulz B，Wisman E(1998)SuccessfulPCR-based reverse genetic screens using an En-7-mutagenisedArabidopsis thaliana population generated via single-seed descent.Theoreticaland Applied Genetics 97：729-734)；ckx5-G2(系编号332B 10)和ckx7-G1(系编号363C02)来自GABI-KAT组织(Rosso，M.G.，Li，Y.，Strizhov，N.，Reiss，B.，Dekker，K.，和Weisshaar，B.(2003)Plant Mol.Biol.53，247-259)；以及，ckx7-T1(SAIL_515_A07)来自托里梅萨研究所(现为先正达公司(Syngenta))。为了验证T-DNA插入基因组引物1和左边缘引物，并找到纯合系，而采用基因组引物1和2(表1)。通过杂交获得双突变体，且通过使用基因特异性和T-DNA边缘引物(表1)的基因组PCR来证实基因中存在插入。突变系ckx4-Z没有用于杂交。植物在22℃、长日照(16h光照/8h黑暗)条件下，生长于温室的土壤中。用于测量种子产量的植物在24℃、～100μE和65％的湿度、在长日照条件下，生长在生长箱的土壤中(Percival AR-66L)。
CKX表达的分析
根据Verwoerd等(Verwoerd等，1989)的方法，从幼苗中提取总RNA。用无RNase的脱氧核糖核酸酶(DNase)I(富酶泰斯公司(Fermentas)，圣莱昂-罗特(St.Leon-Rot)，德国)在37℃下处理RNA30分钟。在65℃下加入1微升25mM的乙二胺四乙酸(EDTA)，处理10分钟。使用0.5μg的RNA进行RT-PCR反应。所有使用的引物对都跨越各自的T-DNA插入位点(表2)。在所有的RT-PCR反应中，都使用Actin2引物作为对照。使用一步法RT-PCR试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，希尔登(Hilden)，德国)根据制造商的说明书进行RT-PCR。PCR包括35个循环，每个循环为：94℃，30秒；57℃，30秒；72℃，2分钟。
扫描电子显微镜
使用LEO 430显微镜(蔡司公司(Zeiss)，上科亨(Oberkochen)，德国)，且依照Krupková等描述的方法(Krupková，E.，Immerzeel，P.，Pauly，M.，和Schmüilling，T.(2007)Plant J.50，735-750)操作扫描电子显微镜。
细胞分裂素的测定
植物在土壤里生长，直至主花序高约10厘米(约30DAG)。对于每个样品，将发育阶段1到发育阶段15的花(Smyth，D.R.，Bowman，J.L.，和Meyerowitz，E.M.(1990)Plant Cell2，755-767)的～0.5克花序制成基因库，并且每个样品收集5个独立样品并分析各自的基因类型。采用超高效液相色谱-串联质谱法确定细胞分裂素含量(Novák，O.，Hauserová，E.，Amakorová，P.，K.，和Strnad，M.(2008)Phytochemistry 69，2214-2224)。
花瓣表面积
使用Scion Image程序(布鲁克公司(Scion Corporation)，弗雷德里克(Frederick)，马里兰州，美国)，对解剖器官进行数字成像，以测量花瓣的面积。
最终株高和产量参数的确定
在开花终止后，确定最终的株高和主茎上的角果数目。为了分析种子的产量，在开花终止后，要将植株放入纸袋。植株保持干燥，继续放置三个星期以后，测定种子的总重量。
光学显微镜
为了进行胚珠的计数和观察，依照Malamy和Benfey(1997)描述的方法进行雌蕊的清理和固定。所有样品使用Axioskop 2plus显微镜观察(Zeiss，耶拿(Jena)，德国)。
胚珠计数和确定发育阶段
依照Schneitz等(1995)Wild-type ovule development in Arabidopsisthaliana：a light microscope study of cleared whole-mount tissue.Plant J.7，/31-749中描述的方法，制备、分析野生型和ckx3 ckx5突变的胚珠，并确定其发育阶段。
与野生型植株相比，在ckx3 ckx5突变体中的胎座组织启动胚珠原基的能力得到增强，从而能够得到更多的胚珠，且心皮内具有更高密度的胚珠和种子。
表1.用于验证图1所示T-DNA插入的引物
表2.用于图2所示RT-PCR分析的引物

Claims (6)

1.一种相对于相应的对照植物、提高植物的种子产量和/或增加株高的方法，其特征在于，所述方法包括在植物的以下基因中导入中断：
i)编码多肽序列如SEQ ID No.1所示的细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源CKX3基因；
以及
ii)编码多肽序列如SEQ ID No.4所示的细胞分裂素氧化/脱氢酶的CKX5基因；
其中，与缺乏所述中断的相应对照植物细胞相比，所述中断抑制两个中断的所述细胞分裂素氧化/脱氢酶基因的表达和/或其产物活性。
2.一种相对于相应的对照植物、制造种子产量提高和/或株高增加的植物的方法，其特征在于，所述方法包括在植物中中断以下基因：
i)编码多肽序列如SEQ ID No.1所示的细胞分裂素氧化/脱氢酶的内源CKX3基因；
以及
ii)编码多肽序列如SEQ ID No.4所示的细胞分裂素氧化/脱氢酶的CKX5基因；
其中，与缺乏所述中断的相应对照植物相比，所述中断抑制两个中断的所述细胞分裂素氧化/脱氢酶基因的表达和/或其产物活性。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，通过结构性中断、反义多核苷酸基因抑制、双链RNA诱导的基因沉默、核酶技术、基因组中断、定向诱导基因组局部突变技术、和/或同源重组，促使发生一个或两个所述中断。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，一个或两个所述中断是纯合中断。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述植物选自十字花科。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述植物选自芸苔属或拟南芥属。
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