ES2621992T3

ES2621992T3 - La disrupción de la CKX3 y al menos otro gen de CKX en una planta o célula vegetal produce mejoras en los rasgos genéticos

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Publication number: ES2621992T3
Application number: ES10737815.0T
Authority: ES
Inventors: Thomas SCHMÜLLING; Isabel Bartrina Y Manns; Tomas Werner
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-07-10
Filing date: 2010-07-09
Publication date: 2017-07-05
Anticipated expiration: 2030-07-09
Also published as: UA106621C2; CA2767490A1; BR112012000642A2; WO2011004003A1; EA029226B1; US20120167254A1; DK2451959T3; EP2272969A1; SI2451959T1; CA2767490C; CN102549161A; EA201200100A1; PT2451959T; JP2012532594A; ZA201200175B; CN102549161B; EP2451959B1; AU2010270138A1; JP5758889B2; EP2451959A1

Abstract

Una célula vegetal aislada que comprende una disrupción (también llamada 'interrupción') en al menos: i) un gen endógeno de CKX3 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipéptidos que es idéntica a o tiene al menos un 80% de identidad con toda la longitud de 'SEQ ID No. 1' ('Identificador de secuencia nº 1'); y ii) en al menos un gen endógeno más, que es: a) un gen de CKX2 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipéptidos que es idéntica a o tiene al menos un 80% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 2; b) un gen de CKX4 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipéptidos que es idéntica a o tiene al menos un 80% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 3; c) un gen de CKX5 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipéptidos que es idéntica a o tiene al menos un 80% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 4; o 20 d) un gen de CKX6 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipéptidos que es idéntica a o tiene al menos un 80% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 5; de manera que las mencionadas disrupciones inhiben la expresión y/o actividad de un producto de los -al menos- dos genes de citoquinina oxidasa/deshidrogenasa interrumpidos en comparación con la correspondiente célula vegetal de control que carece de dichas disrupciones

Description

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La disrupcion de la CKX3 y al menos otro gen de CKX en una planta o celula vegetal produce mejoras en los rasgos geneticos

Descripcion

[0001] Para poder proveer a una poblacion en continuo crecimiento con alimentos y otros productos derivados de las plantas, las personas siempre han estado interesadas en mejorar la productividad de la agricultura.

[0002] La productividad de una planta puede verse influida de diversas formas; por ejemplo, mejorando las caracterlsticas de crecimiento de la planta o retrasando la senescencia de las hojas. Existen muchos mecanismos y medios relacionados con el crecimiento y el desarrollo de las plantas.

[0003] La citoquinina es una hormona vegetal que desempena funciones de regulacion positivas y negativas en muchos aspectos del crecimiento y el desarrollo de las plantas. Estimula la formacion y la actividad de meristemos apicales, puede establecer tejidos demanda ('sink tissues', en ingles) y retrasar la senescencia de las hojas, inhibe el crecimiento de las ralces y la formacion de ramas, y desempena un papel en la germinacion de las semillas y en las respuestas al estres (Mok, D. W. S. & Mok, M. C. (2001) Ann. Rev. Plant Physiol. Mol. Bio. 52, 89-1 18). El analisis de las plantas con deficiencias de citoquinina ha mostrado que la citoquinina desempena papeles opuestos en los meristemos apicales y radiculares y sugiere que la hormona tiene una funcion esencial en el control cuantitativo del crecimiento de los organos (Werner T, Motyka V, Laucou V, Smets R, Van Onckelen H, Schmulling T, 'Plant Cell' 2003,15(11):2532-50; Werner T, Motyka V, Strnad M, Schmulling T, Proc Natl Acad Sci U S A 2001, 98(18):10487- 92).

[0004] Las citoquininas oxidasa/deshidrogenasa (CKX, por sus siglas en ingles) son un factor importante para regular la homeostasis de la hormona vegetal citoquinina. El genoma de Arabidopsis codifica siete genes de CKX que tienen diferentes dominios de expresion (Werner et al., 2001; Werner et al., 2003). Las protelnas de CKX difieren en su localizacion subcelular y en sus caracterlsticas bioqulmicas (Werner et al., 2003). La sobreexpresion de genes individuales de CKX determino las plantas con deficiencias de citoquinina y revelo que la citoquinina es un regulador positivo de la actividad de los meristemos apicales y un regulador negativo de la actividad de los meristemos radiculares.

[0005] Recientemente, se ha demostrado que la inhibicion de una funcion de un gen de CKX particular de una planta de arroz, el ortologo del arroz para la CKX3 de Arabidopsis thaliana, provoca un aumento del numero de partlculas fertiles de dicha planta de arroz (ver US 2006/0123507 A1). A pesar de que estos resultados son prometedores, sigue existiendo una necesidad de mejorar aun mas la productividad de las plantas.

[0006] Es objeto de la presente invencion proporcionar los medios y metodos adecuados para producir plantas transgenicas con una productividad y/o caracterlsticas mejoradas.

[0007] La presente invencion alcanzara este objetivo del modo que se expone en las reivindicaciones y que se explicara con detalle a continuacion.

[0008] La presente invencion proporciona plantas transgenicas y celulas vegetales aisladas tal y como se explica en las reivindicaciones, de manera que la expresion y/o actividad de al menos dos genes de citoquinina oxidasa/deshidrogenasa diferentes se inhibe mediante una disrupcion (tambien llamada 'interrupcion' o 'alteration') en comparacion con una celula vegetal de control o una planta de control que carecen de dichas disrupciones, y de manera que el primer gen de citoquinina oxidasa/deshidrogenasa es un gen endogeno que codifica la CKX3 o un ortologo suyo, y el segundo gen de citoquinina oxidasa/deshidrogenasa es un gen endogeno que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa y es diferente a la CKX3 o el ortologo suyo.

[0009] De forma sorprendente, se ha descubierto que en una planta la disrupcion simultanea del gen de CKX3 y un segundo gen de citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que codifica una de entre CKX2, CKX4, CKX5 o CKX6 da como resultado plantas transgenicas con un rendimiento o production de semillas que es superior al de una planta que carece de dichas disrupciones o al de plantas transgenicas en las que solo se interrumpe un gen de citoquinina oxidasa/deshidrogenasa. Mientras que la disrupcion unica o simple de CKX3 produjo un ligero (pero no significativo) aumento del rendimiento de semillas, tal y como se explica en US 2006/0123507 A1, la disrupcion unica de CKX5 no tuvo ningun efecto apreciable en el rendimiento de semillas.

[0010] De forma sorprendente, la disrupcion simultanea de CKX3 y una entre CKX2, CKX4, CKX5 o CKX6, pero no la disrupcion simultanea de CKX2 y CKX4, o CKX2 y CKX4 y CKX5, o CKX4 y CKX6, o CKX5 y CKX6, provoco un aumento significativo del rendimiento de semillas en comparacion con las disrupciones simples y de tipo natural de CKX3 y CKX5. El aumento mas significativo del rendimiento de semillas se observo en el caso de la disrupcion simultanea de CKX3 y CKX5. De forma incluso mas sorprendente, se descubrio que la disrupcion simultanea de CKX3 y una entre cKX2, CKX4, CKX5 o CKX6, y en particular CKX3 y CKX5, producla plantas transgenicas con una altura de planta significativamente mejorada en comparacion con las plantas de tipo natural y las plantas transgenicas que contenlan disrupciones simples de CKX3 o CKX5. Asl, la disrupcion simultanea de al menos CKX3

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y un gen endogeno adicional que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa, preferiblemente CKX1, CKX2, CKX4, CKX5, CKX6 o CKX7, produce plantas transgenicas con una productividad y/o caracterlsticas de crecimiento mejoradas.

[0011] En un primer aspecto, la presente invencion esta relacionada con una celula vegetal aislada -tal y como se determina en las reivindicaciones- que comprende una disrupcion en al menos:

i) un gen de CKX3 endogeno que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica o tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con 'SEQ ID No. 1' ('Identificador de secuencia n° 1') o un ortologo suyo; y

ii) un gen endogeno adicional que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa y que es diferente al gen especificado en i);

de manera que las citadas disrupciones inhiben la expresion y/o actividad de un producto de los -al menos- dos genes de citoquinina oxidasa/deshidrogenasa interrumpidos ('disrupted', en ingles) en comparacion con la correspondiente celula vegetal de control que carece de dichas disrupciones.

[0012] En un segundo aspecto, la presente invencion esta dirigida a una planta transgenica -tal y como se determina en las reivindicaciones- que comprende una disrupcion en al menos:

i) un gen de CKX3 endogeno que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica o tiene al menos un 95% de identidad con SEQ ID No. 1 o un ortologo suyo; y

de manera que las citadas disrupciones inhiben la expresion y/o actividad de un producto de -al menos- los dos genes de citoquinina oxidasa/deshidrogenasa interrumpidos en comparacion con la correspondiente planta de control que carece de dichas disrupciones. Debe entenderse que, para los propositos de la presente invencion, el termino 'planta transgenica' no solo comprende una planta que contiene las disrupciones de la invencion como tales, sino que tambien hace referencia a cualquier progenie de esta, independientemente del numero de generacion; esto es, el termino 'planta transgenica' abarca la progenie de la primera generacion, as! como la progenie de la generacion n° X, siempre y cuando dicha progenie aun contenga las disrupciones de la invencion que contiene la planta transgenica madre.

[0013] En un tercer aspecto, la invencion esta relacionada con un metodo -tal y como se explica en las reivindicaciones- para aumentar el rendimiento de semillas de una planta y/o aumentar la altura de la planta y/o aumentar el grosor del tallo con respecto a la correspondiente planta de control, de manera que el metodo conlleva introducir en una planta una disrupcion en al menos:

i) un gen de CKX3 endogeno que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una

secuencia de polipeptidos que es identica o tiene al menos un 95% de identidad con SEQ ID No. 1 o un ortologo

suyo; y

de manera que las citadas disrupciones inhiben la expresion y/o actividad de un producto de los -al menos- dos genes de citoquinina oxidasa/deshidrogenasa interrumpidos en comparacion con la correspondiente planta de control que carece de dichas disrupciones.

[0014] En un cuarto aspecto, la presente invencion esta dirigida a un metodo -tal y como se explica en las reivindicaciones- para producir una planta con un rendimiento de semillas y/o una altura mayores con respecto a la correspondiente planta de control, y que incluye interrumpir en una planta al menos:

suyo; y

[0015] La presente invencion tambien esta relacionada con una celula vegetal aislada -tal y como se explica en las reivindicaciones- que comprende una disrupcion en al menos:

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i) un gen de CKX3 endogeno que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica o tiene al menos un 95% de identidad con SEQ ID No. 1 o un ortologo suyo, de manera que el ortologo es un gen endogeno que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos con al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 1 a lo largo de toda la longitud de SEQ ID No. 1; y

ii) en al menos un gen endogeno adicional:

a) un gen de CKX2 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica o tiene al menos un 95% de identidad con SEQ ID No. 2 o un ortologo suyo, de manera que el ortologo es un gen endogeno que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos con al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 2 a lo largo de toda la longitud de SEQ ID No. 2;

b) un gen de CKX4 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica o tiene al menos un 95% de identidad con SEQ ID No. 3 o un ortologo suyo, de manera que el ortologo es un gen endogeno que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos con al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 3 a lo largo de toda la longitud de SEQ ID No. 3;

c) un gen de CKX5 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica o tiene al menos un 95% de identidad con SEQ ID No. 4 o un ortologo suyo, de manera que el ortologo es un gen endogeno que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos con al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 4 a lo largo de toda la longitud de SEQ ID No. 4; o

d) un gen de CKX6 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica o tiene al menos un 95% de identidad con SEQ ID No. 5 o un ortologo suyo, de manera que el ortologo es un gen endogeno que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos con al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 5 a lo largo de toda la longitud de SEQ ID No. 5;

de manera que las citadas disrupciones inhiben la expresion y/o actividad de un producto de los -al menos- dos genes de citoquinina oxidasa/deshidrogenasa interrumpidos en comparacion con la correspondiente celula vegetal de control que carece de dichas disrupciones.

[0016] La presente invencion tambien hace referencia a una planta transgenica que comprende una disrupcion en al menos:

ii) en al menos un gen endogeno adicional:

de manera que las citadas disrupciones inhiben la expresion y/o actividad de un producto de los -al menos- dos

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genes de citoquinina oxidasa/deshidrogenasa interrumpidos en comparacion con la correspondiente planta de control que carece de dichas disrupciones.

[0017] La celula vegetal aislada de la invencion y/o la planta transgenica de la invention pueden comprender una disruption en al menos:

i) un gen de CKX3 endogeno que comprende una secuencia de acido nucleico que es identica o tiene al menos un 95% de identidad con SEQ ID No. 7 o un ortologo suyo, de manera que el ortologo es un gen que comprende una secuencia de acido nucleico con al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 7 a lo largo de toda la longitud de SEQ ID No. 7; y

ii) en al menos un gen endogeno adicional:

a) un gen de CKX2 que comprende una secuencia de acido nucleico que es identica o tiene al menos un 95% de identidad con SEQ ID No. 8 o un ortologo suyo, de manera que el ortologo es un gen endogeno que comprende una secuencia de acido nucleico con al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 8 a lo largo de toda la longitud de SEQ ID No. 8;

b) un gen de CKX4 que comprende una secuencia de acido nucleico que es identica o tiene al menos un 95% de identidad con SEQ ID No. 9 o un ortologo suyo, de manera que el ortologo es un gen endogeno que comprende una secuencia de acido nucleico con al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 9 a lo largo de toda la longitud de SEQ ID No. 9;

c) un gen de CKX5 que comprende una secuencia de acido nucleico que es identica o tiene al menos un 95% de identidad con SEQ ID No. 10 o un ortologo suyo, de manera que el ortologo es un gen endogeno que comprende una secuencia de acido nucleico con al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 10 a lo largo de toda la longitud de SEQ ID No. 10; o

d) un gen de CKX6 que comprende una secuencia de acido nucleico que es identica o tiene al menos un 95% de identidad con SEQ ID No. 11 o un ortologo suyo, de manera que el ortologo es un gen endogeno que comprende una secuencia de acido nucleico con al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 11 a lo largo de toda la longitud de SEQ ID No. 11;

de manera que las citadas disrupciones inhiben la expresion y/o actividad de un producto de los -al menos- dos genes de citoquinina oxidasa/deshidrogenasa interrumpidos en comparacion con la correspondiente planta de control o celula vegetal de control que carecen de dichas disrupciones.

[0018] Preferiblemente, la celula vegetal aislada de la invencion y/o la planta transgenica de la invencion comprenden una disrupcion en

i) al menos un gen de CKX3 endogeno que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica o tiene al menos un 95% de identidad con SEQ ID No. 1 o un ortologo suyo, de manera que el ortologo es un gen endogeno que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos con al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 1 a lo largo de toda la longitud de SEQ ID No. 1; y

ii) en un gen de CKX5 endogeno que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica o tiene al menos un 95% de identidad con SEQ ID No. 4 o un ortologo suyo, de manera que el ortologo es un gen endogeno que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos con al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 4 a lo largo de toda la longitud de SEQ ID No. 4.

[0019] Preferiblemente, la celula vegetal aislada de la invencion y/o la planta transgenica de la invencion comprenden una disrupcion en

ii) un gen de CKX5 endogeno que comprende una secuencia de acido nucleico que es identica o tiene al menos un 95% de identidad con SEQ ID No. 10 o un ortologo suyo, de manera que el ortologo es un gen endogeno que comprende una secuencia de acido nucleico con al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 10 a lo largo de toda la longitud de SEQ ID No. 10.

[0020] En la celula vegetal aislada de la invencion y/o la planta transgenica de la invencion, una, mas de una o todas las disrupciones de la invencion pueden verse favorecidas por la disrupcion estructural, la supresion antisentido de genes polinucleotldicos, el silenciamiento genico inducido por ARN bicatenario, las tecnicas con ribozimas, el 'Tilling' y/o la recombinacion homologa.

[0021] En la celula vegetal aislada de la invencion y/o la planta transgenica de la invencion, una, mas de una o todas

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las disrupciones de la invencion pueden ser disrupciones homocigoticas (o disrupciones homocigotas).

[0022] Preferiblemente, la planta transgenica de la invencion se selecciona de la familia Brassicaceae y, mas preferiblemente, de los generos Brassica o Arabidopsis.

[0023] La presente invencion tambien esta dirigida al material celular, organico, tisular o de propagacion transgenica derivado de una planta transgenica de la invencion. El material de propagacion transgenica incluye partes de una planta transgenica de la invencion como semillas, tuberculos, ralces tlpicas -hinchadas o de remolacha- o frutos/frutas derivados de una planta transgenica de la invencion.

[0024] La presente invencion tambien esta dirigida a un metodo para aumentar el rendimiento de semillas de una planta y/o aumentar la altura de una planta con respecto a la correspondiente planta de control, de manera que el metodo comprende introducir en una planta una disrupcion en al menos:

ii) en al menos un gen endogeno adicional:

[0025] En un aspecto adicional, la presente invencion esta dirigida a un metodo para producir una planta, preferiblemente una planta transgenica, con un rendimiento de semillas y /o altura mayores con respecto a la correspondiente planta de control, y que comprende interrumpir en una planta al menos:

ii) en al menos un gen endogeno adicional:

b) un gen de CKX4 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica o tiene al menos un 95% de identidad con SEQ ID No. 3 o un ortologo suyo, de manera que el ortologo es un gen endogeno que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que

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comprende una secuencia de polipeptidos con al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 3 a lo largo de toda la longitud de SEQ ID No. 3;

[0026] En los metodos de la invencion, preferiblemente

ii) en un gen de CKX5 endogeno que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica o tiene al menos un 95% de identidad con SEQ ID No. 4 o un ortologo suyo, de manera que el ortologo es un gen endogeno que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos con al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 4 a lo largo de toda la longitud de SEQ ID No. 4;

preferiblemente pueden estar interrumpidos ('disrupted', en ingles).

[0027] En el metodo de la invencion, preferiblemente:

ii) en al menos un gen endogeno adicional:

estan interrumpidos.

[0028] En otro metodo preferido de la invencion:

ii) un gen de CKX5 endogeno que comprende una secuencia de acido nucleico que es identica o tiene al

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menos un 95% de identidad con SEQ ID No. 10 o un ortologo suyo, de manera que el ortologo es un gen endogeno que comprende una secuencia de acido nucleico con al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 10 a lo largo de toda la longitud de SEQ ID No. 10,

estan interrumpidos.

[0029] En los metodos de la invencion, preferiblemente una, mas de una o todas las disrupciones son disrupciones homocigoticas.

[0030] La presente divulgacion tambien esta dirigida a una celula vegetal aislada o una planta transgenica que se pueden obtener o se han obtenido siguiendo uno de los metodos de la invencion.

[0031] Tambien se desvela el hecho de que al menos una de las disrupciones en la celula vegetal aislada de la invencion o en la planta transgenica de la invencion se produce introduciendo al menos una secuencia de polinucleotidos que comprende una secuencia de acido nucleico que tiene al menos alrededor del 70%, al menos alrededor del 75%, al menos alrededor del 80%, al menos alrededor del 85%, al menos alrededor del 90%, al menos alrededor del 95%, al menos alrededor del 99%, al menos alrededor del 99,5% o una mayor identidad de secuencia con SEQ ID No. 14 (CKX1), SEQ ID No. 7 (CKX3), SEQ ID No. 8 (CKX2), SEQ ID No. 9 (CKX4), SEQ ID No. 10 (CKX5), SEQ ID No. 11 (cKx6), SEQ ID No. 12 (CKX7) o una subsecuencia de ellas, o un complemento de ellas, en una celula vegetal, de manera que la -al menos una- secuencia de polinucleotidos esta unida con un promotor en orientacion de sentido o antisentido. En otra realizacion, la disrupcion se introduce en la celula vegetal o la planta transgenica de la invencion introduciendo al menos una secuencia de polinucleotidos configurada para el silenciamiento o interferencia por ARN.

[0032] Tambien se desvela el hecho de que una, mas de una o todas las disrupciones en al menos uno de los genes endogenos previamente mencionados comprenden la insercion de uno o mas transposones.

[0033] Tambien se desvela el hecho de que una, mas de una o todas las disrupciones pueden comprender una o mas mutaciones puntuales en al menos uno de los genes endogenos previamente mencionados.

[0034] Una, mas de una o todas las disrupciones en al menos uno de los genes endogenos previamente mencionados pueden ser disrupciones homocigoticas. De manera alternativa, una, mas de una o todas las disrupciones en al menos uno de los genes endogenos previamente mencionados pueden ser disrupciones heterocigoticas (o disrupciones heterocigotas). Las disrupciones en al menos uno de los genes endogenos previamente mencionados pueden incluir disrupciones homocigoticas, disrupciones heterocigoticas o una combinacion de disrupciones homocigoticas y disrupciones heterocigoticas.

[0035] A menos que se especifique lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientlficos que se usan en el presente texto tienen el mismo significado que aquel que entiende normalmente una persona con conocimientos y habilidades habituales en el ambito al que pertenece la invencion. Para describir y reivindicar la presente invencion, se usara la siguiente terminologla de acuerdo con las definiciones que se ofrecen mas abajo.

[0036] Tal y como se usan en esta especificacion y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares 'un', 'una', 'el' y 'la' hacen referencia al singular y al plural a menos que el texto indique claramente lo contrario. Asl, por ejemplo, la referencia a 'una celula' incluye una celula y la combinacion de una o mas celulas, y otros casos similares.

[0037] El termino 'planta' hace referencia, de manera generica, a cualquiera de estos/as: plantas enteras, organos o partes de plantas (por ejemplo, hojas, tallos, ralces, etc.), estructuras/organos vegetales apicales (por ejemplo, hojas, tallos y tuberculos), ralces, flores y estructuras/organos de las flores (por ejemplo, bracteas, sepalos, petalos, estambres, carpelos, anteras y ovulos), semillas (incluyendo el embrion, el endosperma y la cascara de la semilla), frutos (el ovario maduro), tejido vegetal (por ejemplo, tejido vascular, tejido basal y similares), callos de cultivo celular y celulas vegetales (por ejemplo, celulas de guarda, ovulos, tricomas y similares), y su progenie. Normalmente, el termino 'planta' hace referencia a todos los organismos que son capaces de realizar la fotoslntesis. Incluidos como plantas, dentro del alcance de la invencion, se encuentran todos los generos y especies de las plantas superiores e inferiores del reino vegetal. 'Plantas maduras' hace referencia a las plantas que se encuentran en cualquier etapa de desarrollo posterior a la etapa de plantula. 'Plantula' hace referencia a una planta joven e inmadura en una etapa temprana de desarrollo. Se prefieren las plantas anuales, perennes, monocotiledoneas y/o dicotiledoneas. Se dara preferencia a las plantas pertenecientes a esta familia de plantas: Brassicaceae, en particular las plantas de los generos Brassica y Arabidopsis.

[0038] Tal y como se usa en el presente texto, 'celula vegetal' incluye ademas -sin limitaciones- las celulas obtenidas a partir de o que se encuentran en una planta o una parte de esta: semillas, cultivos, cultivos en suspension, embriones, regiones meristematicas, tejido calloso, hojas, ralces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen y microesporas. Tambien puede entenderse que las celulas vegetales incluyen celulas modificadas, como los protoplastos, obtenidas a partir de los tejidos previamente mencionados.

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[0039] Tal y como se usan en el presente texto, los terminos 'disrupcion' (o 'interrupcion') e 'interrumpido' significan que un gen puede estar estructuralmente interrumpido de manera que comprenda al menos una mutacion o alteracion estructural y de manera que el gen interrumpido no pueda dirigir eficazmente la expresion de un producto genico completamente funcional y cuya longitud es completa. Los terminos 'disrupcion' o 'interrumpido' tambien abarcan el hecho de que el gen interrumpido o uno de sus productos puede ser inhibido o desactivado funcionalmente de manera que el gen no se expresa o no puede expresar eficazmente un producto genico completo ('full-length', en ingles) y/o completamente funcional. La inhibition o desactivacion funcional puede ser el resultado de una disrupcion estructural y/o una interrupcion de la expresion tanto a nivel de transcription como de traduction. La inhibicion o desactivacion funcional tambien puede conseguirse, por ejemplo, siguiendo metodos como la supresion antisentido de genes polinucleotldicos, el silenciamiento genico inducido por ARN bicatenario, las tecnicas con ribozimas, y similares. La inhibicion de la expresion y/o la actividad puede ser el resultado de, por ejemplo, constructos antisentido, constructos con sentido, constructos de silenciamiento por ARN, interferencias por ARN, disrupciones genomicas (por ejemplo, transposones, 'Tilling', recombination homologa, etc.), y/o similares. La disrupcion mediante inhibicion funcional tambien incluye la inhibicion de un gen o uno de sus productos mediante la interaction con un compuesto qulmico, preferiblemente un compuesto qulmico que interactua especlficamente con dicho gen o producto genico. La inhibicion de la expresion y/o actividad puede medirse determinando la presencia y/o cantidad de la transcripcion (por ejemplo, mediante 'Northern blot' o tecnicas de RT-PCR) y/o determinando la presencia y/o cantidad de polipeptidos completos o truncados codificados por el citado gen (por ejemplo, mediante la tecnica ELISA o mediante 'Western blot') y/o determinando la presencia y/o cantidad de la actividad de la citoquinina oxidasa/deshidrogenasa del producto del gen de citoquinina oxidasa/deshidrogenasa interrumpido. Debe entenderse que, tal y como se usan en el presente texto, los terminos 'disrupcion' o 'interrumpido' implican que una disrupcion tambien incluye la disrupcion que solo es efectiva en una parte de la planta, particularmente en un tejido o tipo de celula como, por ejemplo, el meristemo reproductivo o el apice del brote. Puede obtenerse una disrupcion interactuando con o influyendo en una region de codification, en una region de no codification y/o en una region de regulation como, por ejemplo, una region promotora de un gen particular.

[0040] El termino 'transgenico/a' hace referencia a una planta que ha incorporado secuencias de acido nucleico, incluyendo -pero sin limitarse a- genes, polinucleotidos, ADN, ARN, etc., y/o alteraciones o modificaciones en ellos (por ejemplo, mutaciones, mutaciones puntuales o similares), que se han introducido en una planta, en comparacion con una planta en la que no se han introducido, mediante procesos que no son procesos esencialmente biologicos para la production de plantas. De este modo, el termino 'planta transgenica' no solo incluye las plantas que comprenden acidos nucleicos no endogenos, sino que tambien hace referencia de forma expllcita a las plantas que portan mutaciones en un gen endogeno, por ejemplo, mutaciones puntuales, que han sido introducidas en la citada planta transgenica, en comparacion con una planta en la que no se han introducido, mediante procesos que no son procesos esencialmente biologicos para la produccion de plantas.

[0041] El termino 'endogeno' hace referencia a cualquier secuencia genetica o de acido nucleico que ya esta presente en una celula u organismo determinado como, por ejemplo, una planta. El termino 'exogeno' hace referencia a cualquier secuencia genetica o de acido nucleico que no es endogena.

[0042] Un 'elemento transponible' (TE) o 'elemento genetico transponible' es una secuencia de ADN que puede moverse de un sitio a otro de una celula. El movimiento de un elemento transponible puede suceder de episoma a episoma, de episoma a cromosoma, de cromosoma a cromosoma, o de cromosoma a episoma. Los elementos transponibles se caracterizan por la presencia de secuencias repetidas inversas en sus extremos. La movilizacion es regulada enzimaticamente por una 'transposasa'. Estructuralmente, un elemento transponible se clasifica como un 'transposon' (TN) o un 'elemento de secuencia de insertion' (elemento IS) dependiendo de la presencia o ausencia, respectivamente, de secuencias geneticas adicionales a las necesarias para la movilizacion del elemento. Normalmente, un minitransposon o elemento mini-IS carecen de secuencias que codifican una transposasa.

[0043] Normalmente, los terminos 'acido nucleico' o 'polinucleotido' se usan con el significado que tienen en este campo para hacer referencia a un pollmero de acido nucleico (ARN) o acido desoxirribonucleico (ADN), o un analogo de estos, por ejemplo, un pollmero de nucleotidos que contiene modificaciones de los nucleotidos, un acido nucleico peptldico, o similares. En algunas aplicaciones, el acido nucleico puede ser un pollmero que incluye multiples tipos de monomeros, por ejemplo, subunidades de ARN y ADN. Un acido nucleico puede ser, por ejemplo, un cromosoma o un segmento de cromosoma, un vector (por ejemplo, un vector de expresion), un casete de expresion, un pollmero de ADN o ARN desnudo, el producto de una reaction en cadena de la polimerasa (PCR), un oligonucleotido, una sonda, etc. Un acido nucleico puede ser, por ejemplo, monocatenario y/o bicatenario. A menos que se indique lo contrario, una secuencia particular de acido nucleico de la invention opcionalmente comprende o codifica secuencias complementarias, ademas de cualquier secuencia que se indique de manera expllcita.

[0044] Los terminos 'secuencia de polinucleotidos', 'secuencia de acido nucleico' o 'secuencia de nucleotidos' hacen referencia a secuencias contiguas de nucleotidos en un unico acido nucleico o a una representation de estas, por ejemplo, una cadena o secuencia de caracteres. Es decir, segun el contexto, una 'secuencia de polinucleotidos' es un pollmero de nucleotidos (un oligonucleotido, un ADN, un acido nucleico, etc.) o una cadena de caracteres que representa un pollmero de nucleotidos. A partir de cualquier secuencia de polinucleotidos dada, es posible

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determinar tanto el acido nucleico en cuestion como la secuencia de polinucleotidos complementaria (por ejemplo, el acido nucleico complementario).

[0045] El termino 'subsecuencia' o 'fragmento' hace referencia a una parte o porcion de una secuencia entera.

[0046] Un 'casete de expresion' es un constructo de acido nucleico, por ejemplo, un vector, como un plasmido, un vector vlrico, etc., capaz de producir transcritos y, potencialmente, polipeptidos codificados por una secuencia de polinucleotidos. Un vector de expresion es capaz de producir transcritos en una celula exogena, por ejemplo, una celula bacteriana o una celula vegetal, 'in vivo' o 'in vitro', por ejemplo, un protoplasto vegetal cultivado. La expresion de un producto puede ser tanto constitutiva como inducible, dependiendo, por ejemplo, del promotor seleccionado. Las configuraciones antisentido, con sentido o de interferencia o silenciamiento por ARN que no se traducen o no se pueden traducir se incluyen de manera expresa en esta definicion. En el contexto de un vector de expresion, un promotor esta 'unido operativamente' o 'unido funcionalmente' a una secuencia de polinucleotidos si es capaz de regular la expresion de la secuencia de polinucleotidos asociada. El termino tambien se aplica a los constructos de genes exogenos alternativos, como los transgenes expresados o integrados. De manera similar, los terminos 'unido operativamente' o 'unido funcionalmente' se aplican por igual a las secuencias reguladoras transcripcionales - alternativas o tradicionales- como los 'enhancers' o amplificadores, asociados con una secuencia de polinucleotidos.

[0047] Se dice que una secuencia de polinucleotidos, una secuencia de acido nucleico o un gen 'codifican' una molecula de ARN con sentido o antisentido, o una molecula de silenciamiento o interferencia por ARN o un polipeptido, si la secuencia de polinucleotidos puede transcribirse (en una forma empalmada o no empalmada) y/o traducirse en el ARN o polipeptido, o una subsecuencia de estos. Una persona con experiencia en la materia advierte facilmente la degeneracion del codigo genetico, de manera que diversas secuencias de acidos nucleicos diferentes codifican la misma secuencia de aminoacidos o polipeptido, y no tiene ninguna dificultad para determinar si una secuencia de acido nucleico dada codifica una determinada secuencia de acido nucleico o polipeptido.

[0048] 'Expresion de un gen' o 'expresion de un acido nucleico' hacen referencia a la transcripcion de ADN en ARN (que incluye opcionalmente la modificacion del ARN, por ejemplo, el 'splicing' o 'corte y empalme'), la traduccion de ARN en un polipeptido (que incluye, posiblemente, la consiguiente modificacion del polipeptido, por ejemplo, modificacion postraduccional), o tanto la transcripcion como la traduccion, dependiendo del contexto.

[0049] Los terminos 'gen' o 'secuencia genetica' se usan de manera amplia para referirse a cualquier acido nucleico asociado con una funcion biologica. Normalmente, los genes incluyen secuencias de codificacion y/o las secuencias de regulacion necesarias para la expresion de las citadas secuencias de codificacion. El termino 'gen' se aplica a una secuencia genomica especlfica, as! como a un ADNc o un ARNm codificados por dicha secuencia genomica. Los genes tambien incluyen los segmentos de acido nucleico no expresados que, por ejemplo, forman secuencias de reconocimiento para otras protelnas. Las secuencias reguladoras no expresadas incluyen promotores y 'enhancers', a los que se unen protelnas reguladoras como los factores de transcripcion, lo que da como resultado la transcripcion de las secuencias adyacentes o cercanas.

Un 'polipeptido' es un pollmero que comprende dos o mas residuos de aminoacidos (por ejemplo, un peptido o una protelna). Adicionalmente, el pollmero puede comprender elementos no aminoacidos como etiquetas, 'quenchers' (o inhibidores de fluorescencia), grupos de bloqueo o similares, y, opcionalmente, puede comprender modificaciones como glicosilacion o similares. Los residuos de aminoacido del polipeptido pueden ser naturales o no naturales y pueden estar sin sustituir, sin modificar, sustituidos o modificados.

[0050] Tal y como se utiliza en el presente texto, el termino 'gen de citoquinina oxidasa/deshidrogenasa' hace referencia a un gen que codifica un polipeptido con actividad de citoquinina oxidasa/deshidrogenasa. Una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa es una enzima que cataliza la siguiente reaccion qulmica:

N6-dimetilaliladenina + aceptor + H2O □ adenina + 3-metilbut-2-enal + aceptor reducido

[0051] Los tres sustratos de esta enzima son N6-dimetilaliladenina, el aceptor y H2O, mientras que sus tres productos son adenina, 3-metilbut-2-enal y el aceptor reducido. Preferiblemente, el termino 'actividad de citoquinina oxidasa/deshidrogenasa' incluye la actividad de un determinado polipeptido para catalizar una reaccion de oxidorreductasa con al menos una de las citoquininas como sustrato. Una persona con habilidades y conocimientos en este campo conoce perfectamente los medios y metodos para determinar si un polipeptido dado tiene actividad de citoquinina oxidasa/deshidrogenasa o no, y para determinar el nivel de la actividad de citoquinina oxidasa/deshidrogenasa de un polipeptido o sonda particular en valores absolutos y/o relativos con respecto a otro polipeptido o sonda. Existe abundante informacion en la literatura sobre como puede analizarse un polipeptido para determinar dicha actividad (ver, por ejemplo, EC 1.5.99.12). Mas preferiblemente, el termino 'actividad de citoquinina oxidasa/deshidrogenasa' incluye la actividad de un determinado polipeptido para catalizar una reaccion de oxidorreductasa con al menos una de las citoquininas como sustrato, preferiblemente con una actividad que no sea menor que un 30% de la actividad de AtCKX3 (CKX3 con SEQ ID No. 1), y preferiblemente que no sea menor que un 50% de la actividad de AtCKX3.

[0052] Tal y como se utiliza en el presente texto, el termino 'ortologo' hace referencia a un gen de una especie,

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preferiblemente diferente a Arabidopsis thaliana, que muestra la mayor similitud, preferiblemente la mayor identidad de secuencia, con el gen especificado de Arabidopsis thaliana, ya que ambos genes se originaron a partir de un antepasado comun. Preferiblemente, el termino 'ortologo' denota un gen endogeno que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa y comprende una secuencia (polipeptido o acido nucleico) con al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 99% de identidad de secuencia con una determinada secuencia a la que se refiere el respectivo ortologo, y preferiblemente a lo largo de una longitud de secuencia particular. Mas preferiblemente, el termino 'ortologo' denota un gen endogeno, derivado de una especie diferente de Arabidopsis thaliana, que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa y comprende una secuencia con al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 99% de identidad de secuencia con una determinada secuencia de Arabidopsis thaliana a la que se refiere el respectivo ortologo, y preferiblemente a lo largo de una longitud de secuencia particular.

[0053] El termino 'recombinante' indica que el material (por ejemplo, una celula, un acido nucleico o una protelna) se ha alterado de manera artificial o sintetica (no natural) por medio de la intervencion humana. Al material se le puede realizar la alteracion o modification estando en su entorno o estado natural o fuera de el. Por ejemplo, un 'acido nucleico recombinante' es uno que se ha hecho recombinando acidos nucleicos, por ejemplo, durante la donation, el barajado de ADN u otros procedimientos; un 'polipeptido recombinante' o una 'protelna recombinante' es un polipeptido o protelna que se produce mediante la expresion de un acido nucleico recombinante. Los ejemplos de celulas recombinantes incluyen celulas que contienen acidos nucleicos recombinantes y/o polipeptidos recombinantes.

[0054] El termino 'vector' hace referencia a los medios mediante los cuales un acido nucleico puede propagarse y/o transferirse entre organismos, celulas o componentes celulares. Los vectores incluyen plasmidos, virus, bacteriofagos, pro-virus, fagemidos, transposones y cromosomas artificiales, y similares, que se reproducen de forma autonoma o pueden integrarse en un cromosoma de una celula huesped. Un vector tambien puede ser un polinucleotido de ARN desnudo, un polinucleotido de ADN desnudo, un polinucleotido compuesto tanto de ADN como de ARN en la misma cadena, un ADN o ARN conjugado con polilisina, un ADN o ARN conjugado con peptidos, un ADN conjugado con liposomas o similares, que no se reproducen de forma autonoma.

[0055] En el contexto de la presente invention, el termino 'aislado' hace referencia a un material biologico, como un acido nucleico o un polipeptido, que esta basicamente libre de componentes que normalmente acompanan o interactuan con el en su entorno natural. Opcionalmente, el material aislado comprende material que no se halla con el material en su entorno natural, por ejemplo, una celula. Por ejemplo, si el material se encuentra en su entorno natural, como una celula, el material se ha colocado en un lugar de la celula (por ejemplo, el genoma o un elemento genetico) que no es nativo respecto a un material que se encuentra en ese entorno. Por ejemplo, un acido nucleico que existe de forma natural (por ejemplo, una secuencia codificante, un promotor, un 'enhancer', etc.) se alsla si se introduce mediante medios no naturales en un locus del genoma (por ejemplo, un vector, como un plasmido o un vector vlrico, o un amplicon) que no es nativo para ese acido nucleico. Una celula vegetal aislada, por ejemplo, puede estar en un entorno (por ejemplo, un sistema de cultivo celular o purificado a partir de un cultivo celular) diferente al entorno nativo de las celulas vegetales de tipo natural (por ejemplo, una planta entera).

[0056] Tal y como se utiliza en el presente texto, 'promotor' hace referencia a una zona o region de ADN secuencia arriba a partir del comienzo de la transcription y que esta relacionada con el reconocimiento y la union de la polimerasa de ARN y otras protelnas para iniciar la transcripcion. Un 'promotor vegetal' es un promotor capaz de iniciar la transcripcion en celulas vegetales. Los promotores vegetales ejemplares incluyen -pero no se limitan a- aquellos que se obtienen a partir de plantas, virus vegetales y bacterias que comprenden genes expresados en celulas vegetales, como Agrobacterium o Rhizobium. Los ejemplos de promotores bajo control de desarrollo incluyen promotores que, preferiblemente, inician la transcripcion en ciertos tejidos, como hojas, ralces o semillas, o en regiones como las regiones del endosperma y el embrion, o las regiones meristematicas. Estos promotores se denominan 'preferidos para un tejido' o 'especlficos para un tejido'. Un promotor regulado temporalmente dirige la expresion en epocas o momentos particulares, como entre 0-25 dlas despues de la polinizacion. Un promotor 'preferido para un tipo de celulas' dirige la expresion principalmente en ciertos tipos de celulas de uno o mas organos, por ejemplo, celulas vasculares de las ralces o de las hojas. Un promotor 'inducible' es un promotor que se encuentra bajo control ambiental y puede ser inducible o desrepresible. Los ejemplos de las condiciones ambientales que pueden influir en la transcripcion mediante promotores inducibles incluyen las condiciones anaerobicas o la presencia de luz. Los promotores 'especlficos para un tejido', 'especlficos para un tipo de celula' e inducibles forman la clase de los 'promotores no constitutivos'. Un promotor 'constitutivo' es un promotor que esta activo en la mayorla de condiciones ambientales y en todos o casi todos los tejidos, durante todas o casi todas las etapas de desarrollo.

[0057] Tal y como se usa en el presente texto, la 'transformation' es el proceso mediante el que se 'transforma' una celula por medio de ADN exogeno cuando dicho ADN exogeno ha sido introducido dentro de la membrana celular. El ADN exogeno puede estar o puede no estar integrado (unido covalentemente) en el ADN cromosomico que constituye el genoma de la celula. En las procariotas y la levadura, por ejemplo, el ADN exogeno puede mantenerse en un elemento episomal, como un plasmido. Respecto a las celulas eucariotas, superiores, una celula transformada o transfectada de manera estable es aquella en la que el ADN exogeno se ha integrado en el cromosoma de manera

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que es heredado por las celulas hijas mediante replicacion cromosomica. Esta estabilidad se demuestra mediante la capacidad que tiene la celula eucariota para establecer llneas celulares o clones compuestos de una poblacion de celulas hijas que contienen el ADN exogeno.

[0058] Para los propositos de la presente invention, la 'identidad' de secuencia se determina objetivamente mediante cualquiera de los numerosos metodos que existen. Las personas con conocimientos y experiencia en este campo conocen perfectamente dichos metodos y pueden escoger un metodo adecuado sin que esto les suponga una carga de trabajo innecesaria. Una variedad de metodos para determinar las relaciones entre dos o mas secuencias (por ejemplo, identidad, similitud u homologla) estan disponibles y son bien conocidos en este campo. Los metodos incluyen el alineamiento manual, el alineamiento de secuencias asistido por ordenador y combinaciones de estos, por ejemplo. Diversos algoritmos (que generalmente se implementan mediante ordenador) para realizar un alineamiento de secuencias estan disponibles ampliamente o pueden ser producidos por una persona versada en la materia. Estos metodos incluyen, por ejemplo, el algoritmo de homologla local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482; el algoritmo de alineamiento homologo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443; el metodo para la busqueda de similitudes de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 2444; y/o las implementaciones por ordenador de estos algoritmos (e.g. GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el 'Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0', Genetics Computer Group, 575 Science Dr. , Madison, WI, EE UU).

[0059] Por ejemplo, el software para realizar un analisis de identidad de secuencias (y similitud de secuencias) utilizando el algoritmo de BLAST se describe en Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. Este software esta disponible publicamente, por ejemplo, a traves del National Center for Biotechnology Information (Centro Nacional para la Information Biotecnologica de EE UU) accediendo a su pagina web:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Este algoritmo requiere que primero se identifiquen los pares de alta puntuacion (HSPs) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia problema o secuencia 'query' ('query sequence', en ingles), que se corresponden o cumplen con algunos valores positivos de un puntaje umbral T cuando se alinean con una palabra con la misma longitud de una secuencia de la base de datos. Se denomina T a la puntuacion de palabras del umbral local. Estas primeras busquedas de palabras locales funcionan como semillas para iniciar busquedas y encontrar HSPs mas largos que las contengan. Despues, las busquedas por palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia, tan lejos como pueda aumentar la puntuacion de alineamiento acumulada. En el caso de las secuencias de nucleotidos, las puntuaciones acumuladas se calculan utilizando los parametros M (puntuacion de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre > 0) y N (puntuacion de penalization para los residuos no coincidentes; siempre < 0). Para las secuencias de aminoacidos se utiliza una matriz de puntuacion para calcular la puntuacion acumulada. La extension o propagation de las busquedas por palabras en ambas direcciones se detiene cuando: la puntuacion de alineamiento acumulada baja de una cantidad X desde su valor maximo obtenido; la puntuacion acumulada llega a cero o por debajo debido a la acumulacion de una o mas alineaciones de residuos con puntuaciones negativas; o se alcanza el final de cualquiera de las secuencias. Los parametros del algoritmo de BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de alineacion. El programa BLASTN (para secuencias de nucleotidos) utiliza como parametros por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, un llmite de 100, M=5, N=-4 y una comparacion de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoacidos, el programa BLASTP (BLAST Protein) usa como parametros por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuacion BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915).

[0060] Ademas, el algoritmo de BLAST realiza un analisis estadlstico de la similitud entre dos secuencias (ver, por ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787). Una medida de similitud que proporciona el algoritmo de BLAST es la probabilidad de suma mas pequena (p (N) ), que proporciona un indicio de la probabilidad de que una coincidencia entre dos nucleotidos o secuencias de aminoacidos pueda ocurrir por casualidad. Por ejemplo, un acido nucleico se considera similar a la secuencia de referencia (y, por lo tanto, en este contexto, homologo) si la probabilidad de suma mas pequena en una comparacion del acido nucleico de prueba y el acido nucleico de referencia es menor que alrededor de 0,1, o menor que alrededor de 0,01, e incluso menor que alrededor de 0,001.

[0061] Otro ejemplo de un algoritmo util de alineacion de secuencias es PILEUP. PILEUP crea una alineacion de secuencias multiple a partir de un grupo de secuencias relacionadas utilizando alineaciones progresivas por pares. Tambien puede trazar un arbol que muestra la agrupacion de relaciones usada para crear la alineacion. PILEUP utiliza una simplification del metodo de alineacion progresiva de Feng y Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35: 351-360. El metodo utilizado es similar al metodo que describen Higgins y Sharp (1989) CABIOS5 : 151-153. El programa puede alinear, por ejemplo, hasta 300 secuencias con una longitud maxima de 5 000 letras. El procedimiento de alineaciones multiples comienza con la alineacion por pares de las dos secuencias mas parecidas, lo que produce una agrupacion de dos secuencias alineadas. Posteriormente, esta agrupacion puede alinearse con la siguiente secuencia o agrupacion de secuencias alineadas mas parecida. Dos agrupaciones de secuencias pueden alinearse mediante una simple extension de la alineacion por pares de dos secuencias individuales. La alineacion final se consigue mediante una serie de alineaciones por pares progresivas. Tambien puede usarse el programa para trazar un dendrograma o representacion en forma de arbol de las agrupaciones de relaciones. El programa funciona disenando secuencias especlficas y las coordenadas de sus aminoacidos o nucleotidos para las regiones de comparacion de secuencias.

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[0062] Otro ejemplo de un algoritmo que es adecuado para multiples alineaciones de secuencias de ADN o aminoacidos es el programa CLUSTaLw (Thompson, J. D. et al. (1994) Nucl. Acids. Res. 22: 4673-4680). CLUSTALW realiza multiples comparaciones por pares entre grupos de secuencias y las junta en una alineacion multiple basandose en la homologla. Las penalizaciones de apertura de espacio ('Gap open', en ingles) y de extension de espacio ('Gap extension', en ingles) pueden ser, por ejemplo, l0 y 0,05, respectivamente. Para las alineaciones de aminoacidos, el algoritmo de BLOSUM puede utilizarse como una matriz de peso proteico. Ver Henikoff y Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EE UU 89: 10915-10919.

[0063] La celula vegetal aislada o la planta transgenica de la invencion pueden producirse por medios convencionales como, por ejemplo, la transformacion. Basicamente, la transformation de celulas vegetales y protoplastos puede llevarse a cabo siguiendo cualquiera de las diversas formas que resultan conocidas para aquellas personas con experiencia y conocimientos en el campo de la biologla molecular, incluyendo -pero sin limitarse a- los metodos descritos en el presente texto. Ver, como norma general, 'Methods in Enzymology', Vol. 153 (Recombinant DNA Part D) Wu y Grossman (eds.) 1987, Academic Press. Tal y como se utiliza en el presente texto, el termino 'transformacion' significa alteration o modification del genotipo de una planta huesped o celula vegetal mediante la introduction de una secuencia de acido nucleico, por ejemplo, una secuencia de acido nucleico 'heterologo', 'exogeno' o 'foraneo'. La secuencia de acido nucleico heterologo no tiene por que originarse necesariamente a partir de una fuente diferente, pero, en algun momento, sera externa a la celula en la que sea introducida. Ademas de Berger, Ausubel y Sambrook, las referencias generales utiles para la donation, cultivo y regeneration de celulas vegetales incluyen a Jones (ed) (1995) 'Plant Gene Transfer and Expression Protocols - Methods in Molecular Biology', Volumen 49,, Humana Press, Towata, NJ, EE UU; Payne et al. (1992) 'Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems', John Wiley & Sons, Inc. New York, NY (Payne), EE UU; y Gamborg y Phillips (eds) (1995) 'Plant Cell, Tissue and Organ Culture'; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin, Heidelberg, New York, EE UU) (Gamborg). Diversos medios de cultivo celular se describen en Atlas and Parks (eds), 'The Handbook of Microbiological Media', (1993) CRC Press, Boca Raton, FL (Atlas), EE UU. Se puede encontrar information adicional sobre el cultivo de celulas vegetales en la literatura comercial como el catalogo 'Life Science Research Cell Culture Catalogue' (1998), de Sigma-Aldrich, Inc (St Louis, MO, EE UU) (Sigma-LSRCCC) y, por ejemplo, el catalogo 'Plant Culture Catalogue and supplement' (1997), tambien de Sigma-Aldrich, Inc (St Louis, MO, EE UU) (Sigma- PCCS). Se pueden encontrar especificaciones adicionales relacionadas con el cultivo de celulas vegetales en Croy, (ed.) (1993), 'Plant Molecular Biology', Bios Scientific Publishers, Oxford, Reino Unido.

[0064] Una, mas de una o todas las disrupciones en al menos uno de los genes endogenos previamente mencionados pueden favorecerse introduciendo y expresando en una celula vegetal o una planta una secuencia de polinucleotidos transgenica, por ejemplo, con configuraciones con sentido o antisentido, o configuraciones de silenciamiento o interferencia por ARN, etc., de manera que la secuencia de polinucleotidos transgenica comprende una secuencia de acido nucleico, que es la siguiente o es complementaria a:

a) una secuencia o subsecuencia de un gen de CKX3 endogeno que codifica una citoquinina

oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica o tiene al menos un 95% de identidad con SEQ ID No. 1 o un ortologo suyo;

b) una secuencia o subsecuencia de un gen de CKX2 endogeno que codifica una citoquinina

oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica o tiene al menos un 95% de identidad con SEQ ID No. 2 o un ortologo suyo;

c) una secuencia o subsecuencia de un gen de CKX4 endogeno que codifica una citoquinina

oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica o tiene al menos un 95% de identidad con SEQ ID No. 3 o un ortologo suyo;

d) una secuencia o subsecuencia de un gen de CKX5 endogeno que codifica una citoquinina

oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica o tiene al menos un 95% de identidad con SEQ ID No. 4 o un ortologo suyo;

e) una secuencia o subsecuencia de un gen de CKX6 endogeno que codifica una citoquinina

oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica o tiene al menos un 95% de identidad con SEQ ID No. 5 o un ortologo suyo; o

f) una secuencia o subsecuencia de un gen endogeno que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que tiene al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con una entre SEQ ID No. 1, 2, 3, 4 o 5 a lo largo de toda la longitud;

y comprenden un promotor, inhibiendo as! la expresion y/o actividad de -al menos- el gen de citoquinina oxidasa/deshidrogenasa interrumpido en comparacion con la correspondiente celula vegetal de control o planta de control que carecen de dichas disrupciones (por ejemplo, su progenitor no transgenico o una planta no transgenica de la misma especie). La secuencia de polinucleotidos transgenica puede introducirse por medio de tecnicas que incluyen -pero no se limitan a-, por ejemplo, electroporation, bombardeo con microproyectiles, transferencia mediada por Agrobacterium, u otros metodos disponibles. En algunos aspectos de la invencion, el polinucleotido esta unido con el promotor en una orientation con sentido o en una orientation antisentido o esta configurado para el silenciamiento o interferencia por ARN.

[0065] Entre la literatura destacada que describe la aplicacion del silenciamiento de genes dependiente de la

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homologla se incluye: Jorgensen, Trends Biotechnol. 8 (12): 340-344 (1990); Flavell, Proc. Natl. Acad. Sci. (EE UU) 91: 3490-3496 (1994); Finnegan et al., Bio/Technology 12: 883-888 (1994); Neuhuber et al., Mol. Gen. Genet. 244: 230-241 (1994); Flavell et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci., EE UU, 91: 3490-3496; Jorgensen et al. (1996) Plant Mol. Biol. 31: 957-973; Johansen y Carrington (2001) Plant Physiol. 126: 930-938; Broin et al. (2002) Plant Cell 14: 14171432; Stoutjesdijk et al. (2002) Plant Physiol. 129: 1723- 1731; Yu et al. (2003) Phytochemistry 63: 753-763; y las Patentes de EE UU nos 5,034,323; 5,283,184 y 5,942,657.

[0066] De manera alternativa, otro enfoque para el silenciamiento genico puede ser el uso de tecnologla antisentido (Rothstein et al. en 'Plant Mol. Cell. Biol.' 6: 221-246 (1989); Liu et al. (2002) 'Plant Physiol.' 129: 1732-1743 y las Patentes de EE UU Nos 5,759,829 y 5,942,657. El uso de acidos nucleicos antisentido es bien conocido en este campo. Un acido nucleico antisentido tiene una region de complementariedad con un acido nucleico diana, por ejemplo, una secuencia genetica de un gen particular, un ARNm o un ADNc. El acido nucleico antisentido puede ser un ARN, un ADN, un APN o cualquier otra molecula apropiada. Puede formarse un duplex (o doblete) entre la secuencia antisentido y su secuencia con sentido complementaria, lo que da como resultado la desactivacion del gen. El acido nucleico antisentido puede inhibir la expresion genica formando un duplex con un ARN transcrito a partir del gen, formando un triplex (o triplete) con el ADN duplex, etc. Un acido nucleico antisentido puede producirse por medio de diversas tecnicas bien establecidas (por ejemplo, la slntesis qulmica de un oligonucleotido o ARN antisentido -opcionalmente, pueden incluir nucleotidos modificados y/o ligamientos que aumentan la resistencia a la degradation o mejoran la absorcion celular- o la transcription 'in vitro'). Los acidos nucleicos antisentido y el uso de estos se describen, por ejemplo, en la USP (Patente de EE UU) 6,242,258 de Haselton y Alexander (5 de junio, 2001) titulada 'Methods for the selective regulation of DNA and RNA transcription and translation by photoactivation'; USP 6,500, 615; USP 6,498, 035; USP 6,395, 544; USP 5,563, 050; E. Schuch et al (1991) 'Symp Soc. Exp Biol' 45: 117-127; de Lange et al., (1995) 'Curr Top Microbiol Immunol' 197: 57-75; Hamilton et al. (1995) 'Curr Top Microbiol Immunol' 197: 77-89; Finnegan et al., (1996) 'Proc Natl 'Acad Sci, EE UU 93: 8449-8454; Uhlmann y A. Pepan (1990), Chem. Rev. 90: 543; P. D. Cook (1991), 'Anti-Cancer Drug Design' 6: 585; J. Goodchild, 'Bioconjugate Chem. 1' (1990) 165; y, S. L. Beaucage y R. P. lyer (1993), Tetrahedron 49: 6123; y F. Eckstein, Ed. (1991), 'Oligonucleotides and Analogues - A Practical Approach', IRL Press.

[0067] Las moleculas de ARN catallticas o ribozimas tambien pueden usarse para inhibir la expresion de unos genes particulares seleccionados. Es posible disenar ribozimas que, de manera especlfica, forman parejas con practicamente cualquier ARN diana deseado y descomponen el esqueleto de fosfodiester en una localizacion especlfica, desactivando as! las funciones del ARN diana. Cuando lleva a cabo esta escision o descomposicion, la propia ribozima no se ve alterada y, por lo tanto, puede reciclar y descomponer otras moleculas. La inclusion de secuencias de ribozimas en ARNs antisentido les confiere actividad para descomponer ARN, aumentando as! la actividad de los constructos. Se han identificado diversas clases de ribozimas. Por ejemplo, una clase de ribozimas se deriva de diversos ARNs pequenos y circulares que pueden autodescomponerse (o autoescindirse) y reproducirse en plantas. Los ARNs son capaces de reproducirse por si solos (ARNs viroides) o con un virus auxiliar (ARNs satelite). Los ejemplos de ARN incluyen ARNs del viroide de la mancha de sol del aguacate y los ARNs satelite del virus de la mancha anular del tabaco, el virus del veteado transitorio de la alfalfa, el virus del moteado suave del tabaco, el virus del moteado nodoso de la flor de genero Solanum y el virus del moteado del trebol subterraneo. El diseno y el uso de ribozimas especlficas para el ARN diana ya ha sido descrito. Ver, por ejemplo, Haseloff et al. (1988) Nature, 334: 585-591.

[0068] Otro metodo para desactivar un gen particular seleccionado inhibiendo la expresion es mediante la supresion de sentido. Se ha demostrado que la introduction de casetes de expresion en los que un acido nucleico esta configurado en la orientation con sentido con respecto al promotor es un medio eficaz para bloquear la transcripcion de un gen diana deseado. Ver, por ejemplo, Napoli et al. (1990), 'The Plant Cell' 2: 279-289, y las Patentes de EE UU Nos 5,034,323, 5,231,020 y 5,283,184.

[0069] Las disrupciones de la invention tambien pueden producirse usando silenciamiento o interferencia por ARN (RNAi), que tambien pueden denominarse silenciamiento genico post-transcripcional (PTGS) o cosupresion. En el contexto de esta invencion, el 'silenciamiento por ARN' (tambien llamado RNAi o interferencia por mediation del ARN) hace referencia a cualquier mecanismo mediante el que la presencia de un ARN monocatenario o, normalmente, un ARN bicatenario en una celula da como resultado la inhibition de la expresion de un gen diana que comprende una secuencia identica o casi identica a la del ARN, incluyendo -pero sin limitarse a- la interferencia por ARN, la represion de la traduction de un ARNm diana transcrito a partir del gen diana sin alterar la estabilidad del ARNm y el silenciamiento transcripcional (por ejemplo, la acetilacion de histonas y la formation de heterocromatina, que provocan la inhibicion de la transcripcion del ARNm diana). En la 'interferencia por ARN', la presencia del ARN monocatenario o bicatenario en la celula provoca una escision endonucleolltica y la degradacion del ARNm diana.

[0070] En una realization, un transgen (por ejemplo, una secuencia y/o subsecuencia de un gen o secuencia codificante de interes) se introduce en una celula vegetal para interrumpir uno o mas genes mediante silenciamiento o interferencia por ARN (RNAi). Por ejemplo, una secuencia o subsecuencia (el transgen) incluye una pequena subsecuencia, por ejemplo, con una longitud de 21-25 bases, una subsecuencia mayor, por ejemplo, con una longitud de alrededor de 25-100 bases o alrededor de 100-2000 (o alrededor de 200-1500 o alrededor de 250-1000 bases, etc.) y/o la secuencia de codification entera o el gen seleccionados de o que son complementarios con:

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f) una secuencia o subsecuencia de un gen endogeno que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que tiene al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con una entre SEQ ID No. 1, 2, 3, 4 o 5 a lo largo de toda la longitud

[0071] Preferiblemente, un transgen incluye una region en la secuencia o subsecuencia que tiene una longitud de alrededor de 21-25 bases con al menos un 80%, al menos un 90% o al menos un 99% de identidad con una subsecuencia de una de las secuencias con SEQ ID No. 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 14.

[0072] El uso de la RNAi para inhibir la expresion genica en diversos tipos de celulas (incluyendo, por ejemplo, celulas vegetales) y organismos, por ejemplo, mediante la expresion de ARN horquillado ('stem loop') (o shRNA) o de las dos helices de un ARN interferente, por ejemplo, se describe correctamente en la literatura, al igual que los metodos para determinar los ARNs interferentes adecuados para apuntar a un gen deseado y para generar dichos ARNs interferentes. Por ejemplo, la interferencia por ARN se describe en las publicaciones de solicitudes de patentes 20020173478, 20020162126 y 20020182223, y en Cogoni y Macino (2000), 'Post-transcriptional gene silencing across kingdoms', Genes Dev., 10: 638-643; Guru T. (2000), 'A silence that speaks volumes' Nature 404: 804-808; Hammond et al., (2001), 'Post-transcriptional Gene Silencing by Double-stranded RNA' Nature Rev. Gen. 2: 110-119; Napoli et al., (1990), 'Introduction of a chalcone synthase gene into Petunia results in reversible cosuppression of homologous genes in trayas.', Plant Cell 2: 279-289; etc.

[0073] Las secuencias o subsecuencias de polinucleotidos que van a expresarse para inducir la RNAi pueden expresarse, por ejemplo, bajo el control de un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor especlfico para un tejido. En algunas realizaciones, la expresion a partir de un promotor especlfico para un tejido puede ser ventajosa.

[0074] Una, mas de una o todas las disrupciones en al menos uno de los genes endogenos previamente mencionados pueden introducirse mediante, por ejemplo, la desactivacion basada en transposones. Por ejemplo, el paso de desactivacion incluye producir una o mas mutaciones en un gen, que es:

i) un gen de CKX3 endogeno que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica o tiene al menos un 95% de identidad con SEQ ID No. 1 o un ortologo suyo, de manera que el ortologo es un gen endogeno que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos con al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 1 a lo largo de toda la longitud de SEQ ID No. 1; y/o

ii) en al menos un gen endogeno adicional, que es:

c) un gen de CKX5 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica o tiene al menos un 95% de identidad con SEQ ID No. 4 o un ortologo suyo, de manera que el ortologo es un gen endogeno que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos con al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con

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SEQ ID No. 4 a lo largo de toda la longitud de SEQ ID No. 4; o

de manera que una o mas mutaciones en la secuencia genica comprenden una o mas inserciones de transposones y de manera que las disrupciones inihiben la expresion y/o actividad de -al menos- el gen interrumpido de citoquinina oxidasa/deshidrogenasa en comparacion con la correspondiente celula vegetal de control o planta de control que carecen de dichas disrupciones. Por ejemplo, las mutaciones -una o mas- comprenden una disrupcion homocigotica en uno o mas genes previamente mencionados o las mutaciones -una o mas- comprenden una disrupcion heterocigotica en uno o mas genes previamente mencionados o una combinacion de disrupciones homocigoticas y disrupciones heterocigoticas.

[0075] Los transposones se identificaron por primera vez en el malz, y fue Barbara McClintock quien lo hizo a finales de la decada de 1940. La familia Mutator de los elementos transponibles, por ejemplo, los elementos transponibles del Mutator de Robertson ('Robertson's Mutator) (Mu), se usan normalmente en la mutagenesis de genes vegetales, ya que estan presentes con un numero de copias elevado (10-100) y se insertan preferentemente en los genes o cerca de estos.

[0076] Los elementos transponibles pueden clasificarse en dos categorlas amplias segun su modo de transposicion. Estas se denominan Clase I y Clase II; ambas tienen aplicaciones como mutagenos y como vectores de entrega. Los elementos transponibles de la Clase I se transponen mediante un intermediario de ARN y usan transcriptasas inversas, es decir, son retroelementos. Hay al menos tres tipos de elementos transponibles de Clase I: retrotransposones, retroposones, elementos de tipo SINE. Normalmente, los retrotransposones contienen LTRs y genes que codifican protelnas virales de cubierta (gag) y genes de transcriptasa inversa, RnaseH, integrasa y polimerasa (pol). Se han descrito numerosos retrotransposones en especies vegetales. Estos retrotransposones se movilizan y se desplazan mediante un intermediario de ARN en una reaccion catalizada mediante transcriptasa inversa y Rnasa H codificadas por el transposon. Los ejemplos se incluyen en los grupos de Tyl-copia y Ty3-gypsy, as! como en las clasificaciones de tipo SINE y de tipo LINE. Puede encontrarse una exposicion mas detallada en Kumar y Bennetzen (1999) 'Plant Retrotransposons in Annual Review of Genetics' 33: 479.

[0077] Ademas, los elementos transponibles de ADN como Ac, Taml y En/Spm tambien se encuentran en una gran variedad de especies vegetales, y pueden utilizarse en la invencion.

[0078] Los transposones (y los elementos IS) son herramientas habituales para la introduccion de mutaciones en celulas vegetales. Estos elementos geneticos moviles se liberan en las celulas, por ejemplo, mediante un cruce sexual, se selecciona la transposicion y se analizan los mutantes de insercion resultantes, por ejemplo, en busca de un fenotipo de interes. Despues, los genes interrumpidos pueden introducirse en otras plantas cruzando las plantas transgenicas o aisladas con una planta no interrumpida, por ejemplo, mediante cruce sexual. Puede utilizarse cualquiera de las diversas tecnicas estandares de reproduccion, dependiendo siempre de las especies que se van a cruzar. La localizacion de un TN en un genoma de una planta transgenica o aislada puede determinarse mediante metodos conocidos, por ejemplo, la secuenciacion de las regiones adyacentes, tal y como se describe en el presente texto. Por ejemplo, una reaccion de PCR de la planta puede usarse para amplificar la secuencia, que posteriormente puede someterse a un diagnostico de secuenciacion para confirmar su origen. De manera opcional, se examinan los mutantes de insercion en busca del fenotipo deseado, como la inhibicion de la expresion o actividad de un gen de interes en comparacion con una planta de control.

[0079] Tambien puede usarse el Tilling para identificar una disrupcion de la presente invencion. El termino tecnico 'Tilling' es un acronimo que proviene del ingles: 'Targeting Induced Local Lesions In Genomes' ('Deteccion de lesiones locales inducidas en genomas'). Ver, por ejemplo, McCallum et al., (2000), 'Targeting Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) for Plant Functional Genomics', Plant Physiologv 123: 439-442; McCallum et al., (2000), 'Targeted screening for induced mutations', Nature Biotechnology, 18: 455-457; y Colbert et al., (2001), 'High- Throughput Screening for Induced Point Mutations', Plant Physiology 126: 480-484.

[0080] El Tilling combina puntos de mutacion de alta densidad con la deteccion sensible y rapida de las mutaciones. Normalmente, se usa metanosulfonato de etilo (EMS) para mutagenizar semillas de planta. El EMS alquiliza la guanina, lo que normalmente provoca un desapareamiento ('mispairing', en ingles). Por ejemplo, se empapan las semillas en una solucion de eMs de alrededor de 10-20 mM durante alrededor de 10-20 horas; se lavan las semillas y luego se siembran. Las plantas de esta generacion se conocen como M1. Despues, las plantas M1 se autofertilizan o autofecundan. Las mutaciones que estan presentes en las celulas que forman los tejidos reproductivos son heredadas por la siguiente generacion (M2). Normalmente, las plantas M2 se examinan en busca de mutaciones en el gen deseado y/o de fenotipos especlficos. Por ejemplo, se agrupa el ADN de plantas M2 y se detectan las mutaciones en un gen de interes mediante la deteccion de la formacion de heteroduplex. Normalmente, el ADN se prepara a partir de cada planta M2 y se agrupa. El gen deseado se amplifica mediante PCR. Despues, la

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muestra agrupada se desnaturaliza y se templa para permitir la formacion de heteroduplex. Si una mutacion esta presente en una de las plantas, los productos de la PCR seran de dos tipos: de tipo natural (o silvestre) y mutantes. Las agrupaciones que incluyen heteroduplex se identifican separando la reaccion de PCR, por ejemplo, mediante DPHPLC ('Cromatografla llquida de desnaturalizacion de alto rendimiento'). La DPHPLC detecta desequilibrios o disparidades en los heteroduplex creados mediante el derretimiento y templado (endurecimiento) de ADN heteroalelico. La cromatografla se realiza mientras se calienta el ADN. Los heteroduplex tienen una estabilidad termica menor y forman burbujas de fusion ('melting bubbles', en ingles), lo que provoca un movimiento mas rapido en la columna de cromatografla. Cuando los heteroduplex estan presentes ademas de los homoduplex esperados, se observa un doble pico. Como resultado de ello, se identifican las agrupaciones que portan la mutacion en un gen de interes. Despues, los ADN individuales de plantas que constituyen la poblacion agrupada que se ha seleccionado pueden identificarse y secuenciarse. Opcionalmente, la planta que posee una mutacion deseada en un gen de interes puede cruzarse con otras plantas para eliminar las mutaciones de fondo.

[0081] Tambien pueden emplearse otros metodos mutagenicos para introducir una disrupcion de la invencion. Los metodos para introducir mutaciones geneticas en genes vegetales y seleccionar plantas con los rasgos o caracteres deseados son bien conocidos. Por ejemplo, las semillas u otros materiales vegetales pueden tratarse con una sustancia qulmica mutagenica siguiendo las tecnicas estandares. Estas sustancias qulmicas incluyen -pero no se limitan a- las siguientes: sulfato de dietilo, etilenimina y N-nitroso-N-etilurea. De manera alternativa, puede usarse radiacion ionizante de fuentes como rayos X y rayos gamma.

[0082] Tambien pueden emplearse otros metodos de deteccion utilizados para detectar mutaciones en un gen de interes, por ejemplo, electroforesis capilar (por ejemplo, electroforesis capilar desnaturalizante constante y polimorfismo conformacional de cadena sencilla). En otro ejemplo, los heteroduplex se pueden detectar utilizando enzimologla para reparar disparidades ('mismatch repair enzymology', en ingles) (por ejemplo, endonucleasa CEL I del apio). CEL I reconoce una disparidad -o desajuste- y corta exactamente en el lado 3' de la misma. La posicion precisa de la base de la disparidad puede determinarse cortando con la enzima de reparacion de disparidades y aplicando despues una electroforesis en gel desnaturalizante. Ver, por ejemplo, Oleykowski et al., (1998), 'Mutation detection using a novel plant endonuclease', Nucleic Acid Res. 26: 4597-4602; y Colbert et al., (2001), 'High- Throughput Screening for Induced Point Mutations', Plant Physiology, 126: 480-484.

[0083] La planta que contiene las disrupciones deseadas de la invencion puede cruzarse con otras plantas para introducir las disrupciones en otra planta. Esto puede hacerse usando tecnicas de reproduccion estandares.

[0084] Tambien puede utilizarse la recombinacion homologa para introducir una disrupcion de la invencion. La recombinacion homologa se ha demostrado en plantas. Ver, por ejemplo, Puchta et al. (1994), Experientia 50: 277284; Swoboda et al. (1994),

EMBOJ. 13: 484- 489; Offringa et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7346-7350; Kempin et al. (1997) Nature 389: 802-803; y Terada et al., (2002), 'Efficient gene targeting by homologous recombination in rice', Nature Biotechnology, 20 (10): 1030-1034.

[0085] La recombinacion homologa puede usarse para inducir modificaciones geneticas dirigidas marcando o apuntando especlficamente a un gen de interes 'in vivo'. Las mutaciones en partes seleccionadas de una secuencia genetica seleccionada (incluyendo 5' secuencia arriba, 3' secuencia abajo y regiones intragenicas), como, por ejemplo:

ii) en al menos un gen endogeno adicional, que es:

a) un gen de CKX2 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica a o tiene al menos un 95% de identidad con SEQ ID No. 2 o un ortologo suyo, de manera que el ortologo es un gen endogeno que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos con al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 2 a lo largo de toda la longitud de SEQ ID No. 2;

b) un gen de CKX4 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica a o tiene al menos un 95% de identidad con SEQ ID No. 3 o un ortologo suyo, de manera que el ortologo es un gen endogeno que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos con al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 3 a lo largo de toda la longitud de SEQ ID No. 3;

c) un gen de CKX5 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica a o tiene al menos un 95% de identidad con SEQ ID No. 4 o un ortologo suyo, de manera que el ortologo es un gen endogeno que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que

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comprende una secuencia de polipeptidos con al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 4 a lo largo de toda la longitud de SEQ ID No. 4; o

d) un gen de CKX6 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica a o tiene al menos un 95% de identidad con SEQ ID No. 5 o un ortologo suyo, de manera que el ortologo es un gen endogeno que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos con al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 5 a lo largo de toda la longitud de SEQ ID No. 5;

se realizan 'in vitro' y se introducen en la planta deseada usando tecnicas estandares. El gen mutado interactuara con el gen diana natural (o de tipo silvestre) de tal forma que en las plantas transgenicas tendra lugar la recombinacion homologa y la sustitucion dirigida del gen de tipo silvestre.

[0086] Las celulas vegetales aisladas y/o las plantas transgenicas de la invencion, que pueden ser consumidas por humanos y animales, tambien pueden usarse -por ejemplo, directamente o tras un proceso de preparacion- como pienso o alimento.

[0087] Adicionalmente, la invencion esta relacionada con el uso de las previamente mencionadas celulas vegetales aisladas y/o plantas transgenicas de la invencion, y con las celulas y cultivos celulares, como, por ejemplo, ralces, hojas, etc., en el caso de organismos vegetales transgenicos; y con materiales de reproduccion transgenica como semillas, tuberculos, ralces tlpicas -hinchadas o de remolacha- o frutos/frutas derivados de ellos para la produccion de alimentos, piensos, productos farmaceuticos o productos qulmicos finos.

[0088] A continuation, la presente invencion se describe con mas detalle mediante el uso de ejemplos:

FIGURAS:

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FIG. 1 (La Figura 1): muestra las posiciones del ADN-T y de las inserciones de transposones en los mutantes de ckx. Los mutantes de insertion se identificaron mediante 'screening' (tambien llamado 'cribado') de PCR, y el sitio de insertion se determino mediante secuenciacion de ADN del fragmento llmite. Las franjas negras representan los exones, mientras que las franjas blancas representan los intrones y los triangulos indican las inserciones de ADN-T. G, coleccion de aDn-T de gAbI-KAT; S, coleccion de ADN-T de Salk; T, coleccion de ADN-T de Torrey Mesa; Z, coleccion de transposones de ZIGIA.

FIG. 2: muestra la caracterizacion de ADN-T de ckx y los alelos de insercion de los transposones. Ausencia de expresion de los genes de CKX en los mutantes de insercion. El ARN de las plantulas de 10 dlas se usa como plantilla ('template', en ingles) para el analisis de RT-PCR. La Actin2 (Actina 2) se amplifico como control.

FIG. 3: muestra el contenido de citoquinina en mutantes de ckx3 ckx5 e inflorescencias de tipo silvestre. Se cosecharon 0,5 g de inflorescencias de Arabidopsis por cada muestra y se agruparon 30 dlas despues de la germination. Se cosecharon cinco muestras biologicas independientes para cada genotipo. Los datos que se muestran son los valores promedio del contenido de citoquinina [pmol/g de peso fresco] ± s. d. ('desviacion estandar'); n = 5. tZ, transzeatina; tZR; trans-zeatin ribosida; tZRMp, trans-zeatin ribosida 5'-monofosfato; tZ9G, trans-zeatin 9-glucosida; tZROG, trans-zeatin ribosida O-glucosida; iP, N6-(A2isopentenil)adenina; iPR, N6- (A2isopentenil)adenosina; iPRMP, N6-(A2isopentenil)adenosina 5'-monofosfato; iP9G, N6-(A2isopentenil)adenina 9- glucosida.

FIG. 4: muestra una comparacion de morfologla apical de mutantes de tipo silvestre y ckx. Numero de silicuas producido por los mutantes de tipo silvestre y de ckx en el tallo principal durante un ciclo vital. Las plantas de tipo silvestre formaron 54,7 silicuas (100%). Altura de la planta de Arabidopsis de tipo silvestre y los mutantes de ckx al finalizar el tiempo de floracion. La altura de las plantas de tipo silvestre fue de 39,5 cm (100%). Los datos representan los valores promedio ± s. d. ('desviacion estandar') (n = 13-17). *, P < 0,01 comparado con el tipo silvestre; • = P < 0,01 comparado con ckx3.

FIG. 5: muestra el fenotipo de la flor y el rendimiento de semillas de los mutantes de ckx. a, b, Flores en etapa 13 (a) y los correspondientes gineceos (b). De izquierda a derecha se muestran ckx3, ckx5 y ckx3 ckx5 de tipo silvestre. c, Superficie del petalo de los mutantes de ckx, flores en etapa 14, 39 dlas despues de la germinacion (n = 30). d, Numero de ovulos por gineceo (n = 12). e, Rendimiento de semillas de tipo silvestre y ckx3 ckx5 en condiciones de camara de crecimiento (n = 30). Los datos representan los valores promedio ± s. d. *, P < 0,01 comparado con el tipo silvestre.

FIG. 6: muestra el numero de silicuas producidas por los mutantes de tipo silvestre y ckx en el tallo principal durante un ciclo vital (n = 15). Las plantas de tipo silvestre formaron 54,7 silicuas (100%). Los datos representan los valores promedio ± s. d. ('desviacion estandar'). *, P < 0,01 comparado con WT (de tipo silvestre); •, P < 0,01 comparado con ckx3.

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FIG. 7: muestra ovulos jovenes de tipo silvestre y de mutante de ckx3 ckx5. La preparacion de los ovulos se realizo de acuerdo con la escala grafica de Schneitz et al.: 10pm. El numero de ovulos aumenta en los mutantes de ckx3 ckx5 en comparacion con las plantas de tipo silvestre.

EJEMPLOS:

METODOS

Material vegetal y condiciones de crecimiento

[0090] El ecotipo Columbia (Col-0) de Arabidopsis thaliana se uso como el tipo silvestre. Los mutantes de insercion de ADN-T ckx2-S1 (SALK_068485), ckx3-S1 (SALK_050938), ckx4-S1 (SALK_055204), ckx5-S1 (SALK_064309) y ckx6-S1 (SALK_070071) provenlan del 'Salk Institute Genomic Analysis Laboratory' (Alonso et al., (2003) Science 301, 653-657), el mutante de insercion del transposon ckx4-Z provenla de la coleccion de transposones de ZIGIA (Baumann E, Lewald J, Saedler H, Schulz B, Wisman E (1998), 'Successful PCR-based reverse genetic screens using an En-1-mutagenised Arabidopsis thaliana population generated via single-seed descent'. Theoretical and Applied Genetics 97: 729-734), ckx5-G2 (Line ID 332B10) y ckx7-G1 (Line ID 363C02) provenlan de la coleccion GABI-KAT (Rosso, M.G., Li, Y., Strizhov, N., Reiss, B., Dekker, K., and Weisshaar, B. (2003) Plant Mol. Biol. 53, 247259) y ckx7-T1 (SAIL_515_A07) provenla del Torrey Mesa Research Institute (ahora Syngenta). Para verificar el partidor (o 'primer') genomico 1 de insercion de aDN-T y el partidor del extremo izquierdo, y para hallar llneas homocigoticas, se usaron los partidores genomicos 1 y 2 (tabla 1). Los mutantes dobles se obtuvieron mediante cruces y las inserciones se confirmaron mediante PCR genomica con partidores extremos ('border primers', en ingles) de un gen especlfico y de ADN-T (tabla 1). La llnea mutante ckx4-Z no se uso como pareja de cruce. Las plantas crecieron en el invernadero en una tierra a 22° C con condiciones de dla largo (16 h de luz / 8 h de oscuridad). Para medir los rendimientos de semilla, las plantas crecieron en camaras de crecimiento (Percival AR- 66L) en una tierra a 24° C en Q100 mE y con una humedad del 65% con condiciones de dla largo.

Analisis de la expresion de CKX

[0091] El ARN total se extrajo de las plantulas de acuerdo con Verwoerd et al. (Verwoerd et al., 1989). El ARN se trato com ADNasa I libre de ARNasa (Fermentas, St. Leon-Rot, Alemania) a 37° C durante 30 minutos. Se anadio un microlitro de 25 mM de EDTA a 65° C durante 10 min. El ARN (0,5 pg) se uso para una reaccion de RT-PCR. Todos los pares de partidores que se usaron abarcaron los respectivos sitios de insercion del ADN-T (tabla 2). En todas las reacciones de RT-PCR, los partidores para la Actin2 (Actina2) se usaron como controles. La RT-PCR se realizo con el kit de un paso de RT-PCR ('One-Step RT-PCR kit') (Qiagen, Hilden, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. La PCR comprendio 35 ciclos de 30 s a 94° C, 30 s a 57° C y 2 min. a 72° C.

Microscopfa electronica de barrido

[0092] Se utilizo una tecnica de microscopla electronica de barrido tal y como la describen Krupkova et al. (Krupkova, E., Immerzeel, P., Pauly, M., y Schmulling, T. (2007) Plant J. 50, 735-750) usando un microscopio LEO 430 (Zeiss, Oberkochen, Alemania).

Medicion de Citoquinina

[0093] Se cultivaron plantas en tierra hasta que la inflorescencia principal tuviera 10 cm de altura (aproximadamente 30 dlas despues de la germinacion). Para cada muestra se agruparon 0,5 g de inflorescencias con flores de la etapa 1 a la etapa 15 (Smyth, D.R., Bowman, J.L., y Meyerowitz, E.M. (1990) 'Plant Cell 2', 755-767), se recogieron cinco muestras independientes y se analizo cada genotipo. El contenido de citoquinina se determino mediante espectrometrla de masas en tandem por electrospray / cromatografla llquida de ultra-rendimiento (Novak, O., Hauserova, E., Amakorova, P., Dole al, K., y Strnad, M. (2008) Phytochemistry 69, 2214-2224).

Superficie del petalo

[0094] El area de los petalos se midio con el programa Scion Image (Scion Corporation, Frederick, Maryland, EE UU) a partir de imagenes digitales de organos diseccionados .

Determinacion de la altura final de la planta y parametros de rendimiento

[0095] La altura final de la planta y el numero de silicuas en el tallo principal se determinaron despues de que hubiera acabado la floracion. Para el analisis del rendimiento de las semillas, las plantas se colocaron en bolsas de papel despues de que la floracion hubiera acabado. Despues de que las plantas se conservaran en seco durante tres semanas mas, se determino el peso total de las semillas.

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Microscopfa de luz

[0096] Para contar y observar los ovulos, se despejaron los gineceos y se montaron tal y como se ha descrito (Malamy y Benfey, 1997). Todas las muestras se observaron con un microscopio Axioskop 2 plus (Zeiss, Jena, Alemania).

Recuento y preparacion de ovulos

[0097] Los ovulos de mutantes de tipo silvestre y de ckx3 ckx5 se prepararon, analizaron y clasificaron como se describe en Schneitz et al (1995) ('Wild-type ovule development in Arabidopsis thaliana: a light microscope study of cleared whole-mount tissue'. Plant J. 7, /31-749).

[0098] Segun parece, la capacidad que tiene el tejido placentario para poner en marcha el primordio ovular se ve aumentada en los mutantes de ckx3 ckx5 en comparacion con las plantas de tipo silvestre, lo que da como resultado un mayor numero promedio y una mayor densidad de ovulos y semillas en los carpelos.

Claims

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Reivindicaciones

1. Una celula vegetal aislada que comprende una disrupcion (tambien llamada 'interrupcion') en al menos:

i) un gen endogeno de CKX3 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica a o tiene al menos un 80% de identidad con toda la longitud de 'SEQ ID No. 1' ('Identificador de secuencia n° 1');

y

ii) en al menos un gen endogeno mas, que es:

a) un gen de CKX2 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica a o tiene al menos un 80% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 2;

b) un gen de CKX4 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica a o tiene al menos un 80% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 3;

c) un gen de CKX5 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica a o tiene al menos un 80% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 4;

o

d) un gen de CKX6 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica a o tiene al menos un 80% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 5;

de manera que las mencionadas disrupciones inhiben la expresion y/o actividad de un producto de los -al menos- dos genes de citoquinina oxidasa/deshidrogenasa interrumpidos en comparacion con la correspondiente celula vegetal de control que carece de dichas disrupciones.
2. Una planta transgenica que comprende una disrupcion en al menos:

i) un gen endogeno de CKX3 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica a o tiene al menos un 80% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 1;

y

ii) en al menos un gen endogeno mas, que es:

a) un gen de CKX2 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica a o tiene al menos un 80% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 2;

b) un gen de CKX4 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica a o tiene al menos un 80% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 3;

c) un gen de CKX5 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica a o tiene al menos un 80% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 4;

o

d) un gen de CKX6 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica a o tiene al menos un 80% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 5;

de manera que las mencionadas disrupciones inhiben la expresion y/o actividad de un producto de los -al menos- dos genes de citoquinina oxidasa/deshidrogenasa interrumpidos en comparacion con la correspondiente planta de control que carece de dichas disrupciones.
3. Una celula vegetal aislada de la reivindicacion 1 o una planta transgenica de la reivindicacion 2, que comprenden una disrupcion en al menos:

i) un gen endogeno de CKX3 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica a o tiene al menos un 95% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 1;

y

ii) en al menos un gen endogeno mas, que es:

a) un gen de CKX2 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica a o tiene al menos un 95% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 2;

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b) un gen de CKX4 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica a o tiene al menos un 95% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 3;

c) un gen de CKX5 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica a o tiene al menos un 95% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 4;

o

d) un gen de CKX6 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica a o tiene al menos un 95% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 5.
4. La celula vegetal aislada de una de las reivindicaciones 1 y 3, o la planta transgenica de una de las reivindicaciones 2 y 3, de manera que al menos:

i) un gen endogeno de CKX3 que comprende una secuencia de acido nucleico que es identica a o tiene al menos un 80% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 7;

y

ii) al menos un gen endogeno mas, que es:

a) un gen de CKX2 que comprende una secuencia de acido nucleico que es identica a o tiene al menos un 80% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 8;

b) un gen de CKX4 que comprende una secuencia de acido nucleico que es identica a o tiene al menos un 80% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 9;

c) un gen de CKX5 que comprende una secuencia de acido nucleico que es identica a o tiene al menos un 80% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 10;

o

d) un gen de CKX6 que comprende una secuencia de acido nucleico que es identica a o tiene al menos un 80% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 1;

estan interrumpidos.
5. La celula vegetal aislada de la reivindicacion 1 o la planta transgenica de la reivindicacion 2, de manera que

i) al menos un gen endogeno de CKX3 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica a o tiene al menos un 80% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 1;

y

ii) al menos un gen endogeno de CKX5 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica a o tiene al menos un 80% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 4;

estan interrumpidos.
6. La celula vegetal aislada de la reivindicacion 4 o la planta transgenica de la reivindicacion 4, de manera que

i) al menos un gen endogeno de CKX3 que comprende una secuencia de acido nucleico que es identica a o tiene al menos un 80% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 7;

y

ii) al menos un gen endogeno de CKX5 que comprende una secuencia de acido nucleico que es identica a o tiene al menos un 80% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 10;

estan interrumpidos.
7. La celula vegetal aislada de cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 4, 5, 6 o la planta transgenica de cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 4, 5, 6, de manera que una, mas de una o todas las disrupciones se facilitan mediante la disrupcion estructural, la supresion antisentido de genes polinucleotldicos, el silenciamiento genico inducido por ARN bicatenario, las tecnicas con ribozimas, las disrupciones genomicas, el 'Tilling' y/o la recombinacion homologa.
8. La celula vegetal aislada de cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 4, 5, 6 y 7 o la planta transgenica de cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 4, 5, 6 y 7, de manera que una, mas de una o todas las disrupciones son disrupciones homocigoticas.
9. La planta transgenica de cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8, de manera que la planta se selecciona de la familia Brassicaceae, preferiblemente de los generos Brassica o Arabidopsis.
10. Una celula, organo, tejido o material de reproduccion transgenico derivados de la planta transgenica de

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cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9, de manera que la celula, organo, tejido o material de reproduction transgenico comprenden las mencionadas disrupciones en el mencionado gen endogeno de CKX3 y en al menos uno de los mencionados genes endogenos de CKX2, CKX4, CKX5 o CKX6.
11. Un metodo para aumentar el rendimiento de semillas de una planta y/o aumentar la altura de la planta y/o aumentar el grosor del tallo con respecto a la correspondiente planta de control, de manera que el metodo incluye introducir una disruption en una planta en al menos:

i) un gen endogeno de CKX3 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica a o tiene al menos un 80% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 1;

y

ii) en al menos un gen endogeno mas, que es:

a) un gen de CKX2 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica a o tiene al menos un 80% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 2;

b) un gen de CKX4 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica a o tiene al menos un 80% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 3;

c) un gen de CKX5 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica a o tiene al menos un 80% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 4;

o

d) un gen de CKX6 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica a o tiene al menos un 80% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 5;

de manera que las mencionadas disrupciones inhiben la expresion y/o actividad de un producto de los -al menos- dos genes de citoquinina oxidasa/deshidrogenasa interrumpidos en comparacion con la correspondiente planta de control que carece de dichas disrupciones.
12. Un metodo para producir una planta con un mayor rendimiento de semillas y/o una mayor altura de planta con respecto a la correspondiente planta de control, de manera que conlleva interrumpir en una planta al menos:

i) un gen endogeno de CKX3 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica a o tiene al menos un 80% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 1;

y

ii) en al menos un gen endogeno mas, que es:

a) un gen de CKX2 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica a o tiene al menos un 80% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 2;

b) un gen de CKX4 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica a o tiene al menos un 80% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 3;

c) un gen de CKX5 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica a o tiene al menos un 80% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 4;

o

d) un gen de CKX6 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica a o tiene al menos un 80% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 5;

de manera que las mencionadas disrupciones inhiben la expresion y/o actividad de un producto de los -al menos- dos genes de citoquinina oxidasa/deshidrogenasa interrumpidos en comparacion con la correspondiente planta de control que carece de dichas disrupciones.
13. El metodo de la reivindicacion 11 o el metodo de la reivindicacion 12, de manera que al menos

i) un gen endogeno de CKX3 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una secuencia de polipeptidos que es identica a o tiene al menos un 80% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 1;

y

ii) un gen endogeno de CKX5 que codifica una citoquinina oxidasa/deshidrogenasa que comprende una

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secuencia de polipeptidos que es identica a o tiene al menos un 80% de identidad con toda la longitud de SEQ ID No. 4

estan interrumpidos.
14. El metodo de cualquiera de la reivindicaciones 11 a 13, de manera que una, mas de una o todas las disrupciones son disrupciones homocigoticas.

Atom

A12g41510 2235 bp

AtCKX2

Al2g195M 2990 bp

Atcm

At5g5E9JK)

3331 bp

Atom

AM J2S740 26? i bp

imagen1

imagen2

G2 Si

AtC KX5

Al1g7M5Q

23Wbp

Atcm

At3g634i{3 1935 bp

AtCKX7

N5fl21462 3213 bp

imagen3

imagen4

FIG. 1

imagen5

Q&nctipo tz________[ZR_________tZRMP_________tZSG MLXi

trponatural 4,1 ± 1.1 10.7 ±5.9 174.6 ±7R I 23 ±0,3 3.4 ±0.8

ch3cfix5 15.5 ±3.7 '16.0 ±5.4 ] 129,0 ±295.9 18.0 ±20 17.3 ± 1.7

genotipo iZROQ jP iPR iPRMP |P9G

tipo natural 33 ± LI 0.23 ±0,09 0.16 ±0.13 30.0 ± |0.2 0.20 ±024

trfaJdxJ 34.6 ±2tf 0.29 ±ttl0 0.35 ±0.10 100.5 ±25.0 0,20 ±0.00

FIG. 3

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cn

tipo natural c^x3 ckxS Ckx3 tipo natural

ckff5 ckx5

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numero de silicuas [%)

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