BR112012000642A2

BR112012000642A2 - "rompimento de ckx3 e pelo menos outro gene de ckx em uma planta ou célula de planta que leva à características aperfeiçoadas"

Info

Publication number: BR112012000642A2
Application number: BR112012000642-8A
Authority: BR
Inventors: Schmülling Thomas; Bartrina Y Manns Isabel; Werner Tomás
Original assignee: Schmülling Thomas; Bartrina Y Manns Isabel; Werner Tomás
Priority date: 2009-07-10
Filing date: 2010-07-09
Publication date: 2020-06-02
Also published as: EA201200100A1; EP2451959A1; US20120167254A1; DK2451959T3; CN102549161A; CA2767490A1; CA2767490C; ES2621992T3; PT2451959T; WO2011004003A1; UA106621C2; LT2451959T; JP2012532594A; PL2451959T3; AU2010270138B2; ZA201200175B; SI2451959T1; EP2451959B1; JP5758889B2; AU2010270138A1

Abstract

rompimento de ckx3 e pelo menos outro gene de ckx em uma planta ou célula de planta que leva à características aperfeiçoadas a presente invenção refere-se a células de planta isoladas e plantas transgénicas compreendendo um rompimento em pelo menos um gene de ckx3 e em um gene adicional codificando uma citocina oxidase/ desidrogenase e sendo diferente de ckx3 bem como métodos de produção de tais plantas transgênicas e a métodos de aumento do rendimento de semente em uma planta e/ou altura da planta.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ROMPIMENTO DE CKX3 E PELO MENOS OUTRO GENE DE CKX EM UMA PLANTA OU CÉLULA DE PLANTA QUE LEVA À CARACTERÍSTICAS APERFEIÇOADAS.

A presente invenção refere-se a capacidade de suprir uma população continuamente em crescimento com alimento e outros produtos derivados de planta, as pessoas têm sempre estado interessadas em aperfeiçoar a produtividade na agricultura.

A produtividade de uma planta pode ser influenciada de várias maneiras diferentes, por exemplo, através do aperfeiçoamento das características de crescimento de planta ou através do retardo de senescência da folha. Há muitos mecanismos e cursos conhecidos que estão envolvidos em crescimento e desenvolvimento de planta.

A citocina é um hormônio de planta que desempenha papéis reguladores positivos e negativos em muitos aspectos de crescimento e desenvolvimento de planta. Ela estimula a formação e a atividade de meristemas de broto, e é capaz de estabelecer tecidos formadores, retardar a senescência de folha, inibir crescimento e ramificação de raiz e desempenhar um papel em germinação de semente e respostas a estresse (Mok, D. W. S. & Mok, M. C. (2001), Ann. Rev. Plant Physiol. Mol. Bio. 52, 89-118). Análise de plantas deficientes em citocina mostrou que a citocina desempenha papéis opostos em meristemas de broto e raiz e sugere que o hormônio tem uma função essencial em controle quantitativo de crescimento de órgão (Werner, T., Motyka, V., Laucou, V, Smets, R., Van Onckelen, H„ Schmülling, T., Plant Cell 2003, 15(11):2532-50; Werner, T., Motyka, V., Strnad, M., Schmülling, Τ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001, 98(18):10487-92).________________________________________________._______

Citocina oxidases/desidrogenases (CKX) são um fator importante para regular a homeostase do hormônio de planta citocina. O genoma de Arabidopsis codifica sete genes de CKX, que têm domínios de expressão distintos (Werner e outros, 2001; Werner e outros, 2003). As proteínas CKX diferem em sua localização subcelular e características bioquímicas (Werner

2/59 e outros, 2003). Superexpressão de genes de CKX individuais estabeleceu plantas deficientes em citocina e revelou que a citocina é um regulador positivo da atividade do meristema de broto e um regulador negativo de atividade de meristema de raiz.

Recentemente foi mostrado que em inibição da função de um gene de CKS particular em uma planta de arroz, o ortólogo de arroz para CKX3 de Arabidopsis thaliana, levou a um aumento em número de carregamento de partícula da dita planta de arroz (vide US 2006/0123507 A1). Embora esses resultados sejam promissores, permanece ainda a necessidade de mais aperfeiçoamento da produtividade de plantas.

É um objetivo da presente invenção prover meios e métodos adequados para produzir plantas transgênicas com características de produtividade e/ou crescimento aperfeiçoadas.

Este objetivo é alcançado pela presente invenção conforme mostrado em detalhes abaixo.

A presente invenção provê células de planta isoladas e plantas transgênicas onde a expressão e/ou a atividade de pelo menos dois genes de citocina oxidase/desidrogenase é inibida pelo rompimento comparado com uma célula de planta controle ou uma planta controle sem tais rompimentos, onde o primeiro gene de citocina oxidase/desidrogenase é um gene endógeno codificando CKS3 ou um ortólogo do mesmo e o segundo gene de citocina oxidase/desidrogenase é um gene endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase e sendo diferente de CKX3 ou seu ortólogo.

Surpreendentemente foi constatado que em uma planta rompimento simultâneo do gene de CKX3 e um segundo gene de citocina oxidase/desidrogenase codificando um de CKX2, CKX4, CKX5 ou CKX6 leva a plantas transgênicas com um rendimento de semente que é maior do que aquele de uma planta sem tais rompimentos ou plantas transgênicas onde apenas um gene de citocina oxidase/desidrogenase é rompido. Enquanto rompimento simples de CKX3 levou a um ligeiro aumento (mas não significante) em rendimento de semente, conforme relatado na US 2006/0123507 A1, rompimento simples de CKX5 não teve nenhum efeito mensurável sobre

3/59 rendimento de semente. Surpreendentemente, o rompimento simultâneo de CKX3 e um de CKX2, CKX4, CKX5 ou CKX6, mas não rompimento simultâneo de CKX2 e CKX4 ou CKX2 e CKX4 e CKX5 ou CKX4 e CKX6 ou CKX5 e CKX6, levou a um aumento significante em rendimento de semente comparado com rompimentos do tipo selvagem e simples de CKX3 e CKX5. Aumento mais significante em rendimento de semente foi observado para um rompimento simultâneo de CKX3 e CKX5. Mais surpreendentemente ainda foi constatado que rompimento simultâneo de CKX3 e um de CKX2, CKX4, CKX5 ou CKX6, em particular de CKX3 e CKX5, levou a plantas transgênicas com altura de planta significantemente aperfeiçoada comparado com plantas do tipo selvagem e plantas transgênicas compreendendo rompimento simples de CKX3 e CKX5. Desta maneira, rompimento simultâneo de pelo menos CK3 e um gene endógeno adicional codificando uma citocina oxidase/desidrogenase, preferivelmente de CKX1, CKX2, CKX4, CKX5, CKX6 ou CKX7, leva a plantas transgênicas com características de produtividade e/ou crescimento aperfeiçoadas.

Em um primeiro aspecto a presente invenção refere-se a uma célula de planta isolada compreendendo um rompimento em pelo menos;

i) um gene de CKX3 endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com SEQ ID N°:1 ou um ortólogo do mesmo;

e ii) um gene endógeno adicional codificando uma citocina oxidase/desidrogenase e sendo diferente do gene definido em i);

em que os ditos rompimentos inibem expressão e/ou atividade de um produto—dos—dois—pelo—menos—geoes—da—citocina—oxidase/desidrogenase comparado com uma célula de planta controle correspondente sem tais rompimentos.

Em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se a uma planta transgênica compreendendo um rompimento em pelo menos;

i) um gene de CKX3 endógeno codificando uma citocina oxi

4/59 dase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:1 ou um ortólogo do mesmo;

onde os ditos rompimentos inibem expressão e/ou atividade de um produto dos pelo menos dois genes da citocina oxidase/desidrogenase rompidos comparado com uma planta controle correspondente sem tais rompimentos. É compreendido que para o propósito da presente invenção o termo planta transgênica compreende não apenas a planta compreendendo os rompimentos da invenção, mas refere-se também a qualquer progênie da mesma sem importar o No. da geração, isto é, o termo planta transgênica compreende progênie de primeira geração bem como progênie da geração X^o, contanto que a dita progênie também compreenda ainda os rompimentos da invenção compreendidos pela planta transgênica de origem.

Em um terceiro aspecto, a invenção refere-se a um método de aumento de rendimento de semente em uma planta e/ou aumento da altura da planta e/ou aumento da espessura do caule com relação a uma planta controle correspondente, o método compreendendo introdução em uma planta de um rompimento em pelo menos:

i) um gene de CKX3 endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:1 ou um ortólogo do mesmo;

um oxi dase/desidrogenase e sendo diferente do gene definido em i);

em que os ditos rompimentos inibem expressão e/ou atividade de um produto dos pelo menos dois genes da citocina oxidase/desidrogenase rompidos comparado com uma planta controle correspondente sem tais rompimentos.

5/59

Em um quarto aspecto, a presente invenção refere-se a um método para produção de uma planta com um rendimento de semente e/ou altura de planta aumentado com relação a uma planta controle correspondente compreendendo rompimento em uma planta de pelo menos:

A presente invenção refere-se também a uma célula de planta isolada compreendendo um rompimento em pelo menos:

i) um gene de CKX3 endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:1 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:1 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos de SEQ ID N°:1, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°:1, mais preferivelmente em um comprimento integral de SEQ ID N°:1;

e ii) em pelo menos um gene endógeno adicional sendo:

a) um gene de CKX1 codificando um citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo

6/59 idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°: 13 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma de SEQ ID N°:13 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos de SEQ ID N°: 13, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°:13, mais preferivelmente todo o comprimento de SEQ ID N°:13;

b) um gene de CKX2 codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:1 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma de SEQ ID N°:2 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos de SEQ ID N°:2, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°:2, mais preferivelmente em todo o comprimento de SEQ ID N°:2;

c) um gene de CKX4 codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:3 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma de SEQ ID N°:3 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos de

ID

N°:3, mais preferivelmente em todo o comprimento de SEQ ID N°:3;

d) um gene de CKX5 codificando uma citocina oxida- se/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:4 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endóge

7/59 no codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma de SEQ ID N°:4 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos de SEQ ID N°:4, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°:4, mais preferivelmente em todo o comprimento de SEQ ID N°:4;

e) um gene de CKX6 codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:5 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma de SEQ ID N°:5 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos de SEQ ID N°:5, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°:5, mais preferivelmente em todo o comprimento de SEQ ID N°:5;

ou

f) um gene de CKX7 codificando uma citocina oxida- se/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:6 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma de SEQ ID N°:6 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos de SEQ ID N°:6, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°:6, mais preferivelmente em todo o comprimento de SEQ ID N°:6;-----em que os ditos rompimentos inibem expressão e/ou atividade de um produto dos pelo menos dois genes de citocina oxidase/desidrogenase rompidos comparado com uma célula de planta controle sem tais rompimentos.

A presente invenção refere-se também a uma planta transgênica

8/59 compreendendo um rompimento em pelo menos:

e ii) em pelo menos um gene endógeno adicional sendo:

a) um gene de CKX1 codificando um citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°: 13 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma de SEQ ID N°:13 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos de SEQ ID N°: 13, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°:13, mais preferivelmente todo o comprimento de SEQ ID N°:13;

b) um gene de CKX2 codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:2 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma de SEQ ID N°:2 em uma sequência de aminoácido contínua de 50

9/59 aminoácidos de SEQ ID N°:2, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°:2, mais preferivelmente em todo o comprimento de SEQ ID N°:2;

c) um gene de CKX4 codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:3 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma de SEQ ID N°:3 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos de SEQ ID N°:3, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°:3, mais preferivelmente em todo o comprimento de SEQ ID N°:3;

d) um gene de CKX5 codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:4 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma de SEQ ID N°:4 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos de SEQ ID N°:4, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°:4, mais preferivelmente em todo o comprimento de SEQ ID N°:4;

e) um gene de CKX6 codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:5 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma óitocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma de SEQ ID N°:5 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos de SEQ ID N°:5, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°:5, mais preferivelmente em todo o comprimento de SEQ ID N°:5;

10/59 ou

f) um gene de CKX7 codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:6 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma de SEQ ID N°:6 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos de SEQ ID N°:6, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°:6, mais preferivelmente em todo o comprimento de SEQ ID N°:6;

em que os ditos rompimentos inibem expressão e/ou atividade de um produto dos pelo menos dois genes de citocina oxidase/desidrogenase rompidos comparado com uma célula de planta controle sem tais rompimentos.

A célula de planta isolada da invenção e/ou a planta transgênica da invenção pode compreender um rompimento em pelo menos:

i) um gene de CKX3 compreendendo uma sequência de ácido nucleico sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:7 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:7 em uma sequência de ácido nucleico contínua de 300 nucleotídeos de SEQ ID N°:7, preferivelmente 500 nucleotídeos de SEQ ID N°:7, mais preferivelmente no comprimento todo de SEQ ID N°:7;

e - ------------------------—-— -—-———————--------------- ii) em pelo menos um gene endógeno adicional sendo:

a) um gene de CKX1 compreendendo uma sequência de ácido nucleico sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com SEQ ID N°:14 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo

11/59 menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:14 em uma sequência de ácido nucleico contínua de 300 nucleotídeos de SEQ ID N°:14, preferivelmente 500 nucleotídeos de SEQ ID N°:14, mais preferivelmente no comprimento todo de SEQ ID N°:14;

b) um gene de CKX2 compreendendo uma sequência de ácido nucleico sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com SEQ ID N .8 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:84 em uma sequência de ácido nucleico contínua de 300 nucleotídeos de SEQ ID N°:8, preferivelmente 500 nucleotídeos de SEQ ID N°:8, mais preferivelmente no comprimento todo de SEQ ID N°:8;

c) um gene de CKX4 compreendendo uma sequência de ácido nucleico sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com SEQ ID N°:9 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:9 em uma sequência de ácido nucleico contínua de 300 nucleotídeos de SEQ ID N°:9, preferivelmente 500 nucleotídeos de SEQ ID N°:9, mais preferivelmente no comprimento todo de SEQ ID N°:9;

d) um gene de CKX5 compreendendo uma sequência de ácido nucleico sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com SEQ ID N°:10 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno compreendendo uma sequência cfe ácido nucfeíco com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:10 em uma sequência de ácido nucleico contínua de 300 nucleotídeos de SEQ ID N°:100, preferivelmente 500 nucleotídeos de SEQ ID N°:10, mais preferivelmente no comprimento todo de SEQ ID N°:10;

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e) um gene de CKX6 compreendendo uma sequência de ácido nucleico sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com SEQ ID N°:11 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:11 em uma sequência de ácido nucleico contínua de 300 nucleotídeos de SEQ ID N°:11, preferivelmente 500 nucleotídeos de SEQ ID N°:11, mais preferivelmente no comprimento todo de SEQ ID Ν°Ί1;

ou

f) um gene de CKX7 compreendendo uma sequência de ácido nucleico sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com SEQ ID N°:12 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:12 em uma sequência de ácido nucleico contínua de 300 nucleotídeos de SEQ ID Ν°.Ί2, preferivelmente 500 nucleotídeos de SEQ ID N°:12, mais preferivelmente no comprimento todo de SEQ ID N°:12;

em que os ditos rompimentos inibem expressão e/o atividade de um produto de pelo menos dois genes de citocina oxigenasse/desidrogenase rompidos comparado com uma planta controle ou célula de planta controle sem tais rompimentos.

Preferivelmente a célula de planta isolada da invenção e/ou a planta transgênica da invenção compreende um rompimento em

i) pelo menos um gene de CKX3 endógeno codificando uma

tídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com SEQ ID N°:1 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, de identi13/59 dade de sequência com a SEQ ID N°:1 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos de SEQ ID N°:1, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°:1, mais preferivelmente em todo o comprimento de SEQ ID N°:1;

e ii) em urn gene de CKX5 endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:4 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:4 durante uma sequência de aminoácido contígua de 50 aminoácidos de SEQ ID N°:4, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°:4, mais preferivelmente em todo o comprimento de SEQ ID N°:4.

i) um gene de CKX3 endógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com SEQ ID N°:7 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:7 em uma sequência de ácido nucleico contínua de 300 nucleotídeos de SEQ ID N°:7, preferivelmente 500 nucleotídeos de SEQ ID N°:7, mais preferivelmente no comprimento todo de SEQ ID N°:7;

e--------------------------------------——————————-------------------------------------- ii) um gene de CKX5 endógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com SEQ ID N°:10 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo me

14/59 nos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:10 em uma sequência de ácido nucleico contínua de 300 nucleotídeos de SEQ ID N°:10, preferivelmente 500 nucleotídeos de SEQ ID N°:10, mais preferivelmente o comprimento todo de SEQ ID N°:10.

Na célula de planta isolada da invenção e/ou na planta transgênica da invenção, um, mais de um ou todos os rompimentos da invenção podem ser facilitados pelo rompimento estrutural, supressão de gene de polinucleotídeo de antissentido, silenciamento de gene induzido por RNA de filamento duplo, técnicas de ribozima, rompimentos genômicos, tilling e/ou recombinação homóloga.

Na célula de planta isolada da invenção e/ou na planta transgênica da invenção, um, mais de um ou todos os rompimentos da invenção podem ser rompimentos homozigotos.

A planta transgênica da invenção é preferivelmente selecionada da família Brassicaceae, mais preferivelmente do gênero Brassica ou Arabidopsis.

A presente invenção refere-se também a uma célula, órgão, tecido ou material de propagação transgênico derivado de uma planta transgênica da invenção. Material de propagação transgênico compreende partes de uma planta transgênica da invenção tais como sementes, tubérculos, beterrabas/raiz principal inchada ou frutas derivadas de uma planta transgênica da invenção.

A presente invenção refere-se também a um método de aumento do rendimento de uma semente de uma planta e/ou aumento da altura da planta com relação a uma planta controle correspondente, o método compreendendo introdução em uma planta de um rompimento em pelo menos:

i) um gene de CKX3 endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:1 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo me

15/59 nos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:1 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos de SEQ ID N°:1, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°:1, mais preferivelmente no comprimento todo de SEQ ID N°:1;

e ii) em pelo menos um gene endógeno adicional sendo:

a) um gene de CKX1 codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:13 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma citocina cinase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma de SEQ ID N°:13 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos de SEQ ID N°:13, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°:13, mais preferivelmente no comprimento todo de SEQ ID N°:13;

b) um gene de CKX2 codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:2 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma citocina cinase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma de SEQ ID N°:2 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos de SEQ ID N°:2, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°Xmais preferivelmente no comprimento todo de SEQ 1D N°:2;

c) um gene de CKX4 codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:3 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um

16/59 gene endógeno codificando uma citocina cinase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma de SEQ ID N°:3 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos de SEQ ID N°:3, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°:3, mais preferivelmente no comprimento todo de SEQ ID N°:3;

d) um gene de CKX5 codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:4 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma citocina cinase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma de SEQ ID N°:4 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos de SEQ ID N°:4, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°:4, mais preferivelmente no comprimento todo de SEQ ID N°:4;

e) um gene de CKX6 codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:5 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma citocina cinase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma de SEQ ID N°:5 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos de SEQ 1D N°:5, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°:5, mais preferivelmente no comprimento todo de SEQ ID N°:5;

ou

f) um gene de CKX7 codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo

17/59 idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:6 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma citocina cinase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma de SEQ ID N°:6 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos de SEQ ID N°:6, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°:6, mais preferivelmente no comprimento todo de SEQ ID N°:6;

em que os rompimentos inibem a expressão e/ou a atividade de um produto dos pelo menos dois genes de citocina oxidase/desidrogenase rompidos comparado com uma planta controle correspondente sem tais rompimentos.

Em um aspecto adicional a presente invenção refere-se a um método para produção de uma planta, preferivelmente uma planta transgênica, com um rendimento e/ou altura de planta maior com relação a uma planta controle correspondente, compreendendo rompimento em uma planta de pelo menos:

i) um gene de CKX3 endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:1 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID N°:1 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos de SEQ IP N°:X preferivelmente 100 aminoácidos _de_ SEQ ID.N°:1, mais preferivelmente no comprimento todo de SEQ ID N°:1;

e ii) em um pelo menos um gene endógeno adicional sendo:

a) um gene de CKX1 codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo

18/59 idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:13 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com SEQ ID N°:13 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos de SEQ ID N°:13, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°:13, mais preferivelmente no comprimento todo de SEQ ID N°:13;

b) um gene de CKX2 codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:2 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com SEQ ID N°:2 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos de SEQ ID N°:2, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°:2, mais preferivelmente no comprimento todo de SEQ ID N°:2;

c) um gene de CKX4 codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:3 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com SEQ ID N°:3 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos de SEQ ID N⁰:3, preferivelment^ mais preferivelmente no comprimento todo de SEQ ID N°:3;

d) um gene de CKX5 codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:4 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endóge

19/59 no codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com SEQ ID N°:4 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos de SEQ ID N°:4, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°:4, mais preferivelmente no comprimento todo de SEQ ID N°:4;

e) um gene de CKX6 codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:5 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com SEQ ID N°:5 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos de SEQ ID N°:5, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°:5, mais preferivelmente no comprimento todo de SEQ ID N°:5;

ou

f) um gene de CKX7 codificando uma citocina oxida- se/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:6 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com SEQ ID N°:6 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos de SEQ ID N°:6, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°:6, mais preferivelmente no comprimento todO-de. SEQ-lD N^o:6;_________ em que os ditos rompimentos inibem expressão e/ou atividade de um produto dos pelo menos dois genes de citocina oxidase/desidrogenase rompidos comparado com uma planta controle correspondente sem tais rompimentos.

Nos métodos da invenção, preferivelmente

20/59

i) pelo menos um gene de CKX3 endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:1 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:1 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos de SEQ ID N°:1, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°:1, mais preferivelmente em todo o comprimento de SEQ ID N°:1;

e iii) em um gene de CKX5 endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:4 ou um gene ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:4 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos de SEQ ID N°:4, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°:4, mais preferivelmente em todo o comprimento de SEQ ID N°:4, podem ser preferivelmente rompidos.

No método da invenção, preferivelmente:

i) um gene de CKX3 endógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:7 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:7 em uma sequência de ácido nucleico contínua de 300 nucleotí

21/59 deos de SEQ ID N°:7, preferivelmente 500 nucleotideos de SEQ ID N°:7, mais preferivelmente em todo o comprimento de SEQ ID N°:7;

e ii) em pelo menos um gene endógeno adicional sendo:

a) um gene de CKX1 compreendendo uma sequência de ácido nucleico sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:14 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:14 em uma sequência de ácido nucleico contínua de 300 nucleotideos de SEQ ID N°:14, preferivelmente 500 nucleotideos de SEQ ID Ν°.Ί4, mais preferivelmente no comprimento todo de SEQ ID N°:14;

b) um gene de CKX2 compreendendo uma sequência de ácido nucleico sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:8 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:8 em uma sequência de ácido nucleico contínua de 300 nucleotideos de SEQ ID N°:8, preferivelmente 500 nucleotideos de SEQ ID N°:8, mais preferivelmente no comprimento todo de SEQ ID N°:8;

c) um gene de CKX4 compreendendo uma sequência de ácido nucleico sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:9 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 45%, .pelo..m.enos.50%_r-pelo menos 60%. pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:9 em uma sequência de ácido nucleico contínua de 300 nucleotideos de SEQ ID N°:9, preferivelmente 500 nucleotideos de SEQ ID N°:9, mais preferivelmente no comprimento todo de SEQ ID N°:9;

d) um gene de CKX5 compreendendo uma sequência de ácido

22/59 nucleico sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:10 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:10 em uma sequência de ácido nucleico contínua de 300 nucleotídeos de SEQ ID N°:10, preferivelmente 500 nucleotídeos de SEQ ID N°:10, mais preferivelmente no comprimento todo de SEQ ID N°:10;

e) um gene de CKX6 compreendendo uma sequência de ácido nucleico sendo idêntico a ou tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:11 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:11 em uma sequência de ácido nucleico contínua de 300 nucleotídeos de SEQ ID N°:11, preferivelmente 500 nucleotídeos de SEQ ID N°:11, mais preferivelmente no comprimento todo de SEQ ID N°:11;

ou

f) um gene de CKX7 compreendendo uma sequência de ácido nucleico sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:12 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:12 em uma sequência de ácido nucleico contínua de 300 nucleotídeos de SEQ ID N°:12, preferivelmente 500 nucleotídeos de SEQ ID N°:12, mais preferivelmente no comprimento todo de SEQ-lD N⁰:12;________ são rompidos.

Em outro método preferido da invenção:

i) um gene de CKX3 endógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com SEQ ID N°:7 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o

23/59 ortólogo é um gene compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:7 em uma sequência de ácido nucleico contínua de 300 nucleotídeos de SEQ ID N°:7, preferivelmente 500 nucleotídeos de SEQ ID N°:7, mais preferivelmente no comprimento todo de SEQ ID N°:7;

e ii) um gene de CKX5 endógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com SEQ ID N°:10 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:10 em uma sequência de ácido nucleico contínua de 300 nucleotídeos de SEQ ID N°:10, preferivelmente 500 nucleotídeos de SEQ ID N°:10, mais preferivelmente no comprimento todo de SEQ ID N°:10, são rompidos.

Nos métodos da invenção, preferivelmente, um, mais de um ou todos os rompimentos são rompimentos homozigotos.

A presente invenção refere-se também a uma célula de planta isolada ou uma planta transgênica obtenível ou obtida através de um dos métodos da invenção.

Em uma modalidade, pelo menos um dos rompimentos na célula de planta isolada da invenção ou na planta transgênica da invenção é produzido através da introdução de pelo menos uma sequência de polinucleotídeo compreendendo uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99%, cerca de 99,5% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID N°:14 (CKX1), SEQ ID N°:7 (CKX3), SEQ ID N°:8 (CKX2), SEQ ID N°:9 (CKX4), SEQ ID N°:10 (CKX5), SEQ ID N°:11 (CKX6), SEQ ID N°:12 (CKX7) ou uma subsequência da mesma, ou um complemen

24/59 to da mesma, em uma célula de planta, de maneira que pelo menos uma sequência de polinucleotídeo seja ligada a um promotor em uma orientação de sentido ou antissentido. Em outra modalidade, o rompimento é introduzido na célula de planta ou na planta transgênica da invenção através da introdução de pelo menos uma sequência de nucleotídeo configurada para silenciamento ou interferência de RNA.

Em outra modalidade, um, mais de um ou todos os rompimentos em pelo menos um dos genes endógenos mencionados acima compreendem inserção de um ou mais transpossomos. Em ainda outra modalidade, um, mais de um ou todos os rompimentos podem compreender uma ou mais mutações por ponto em pelo menos um dos genes endógenos mencionados acima.

Um, mais de um ou todos os rompimentos em pelo menos um dos genes endógenos mencionados acima podem ser rompimentos homozigotos. Alternativamente, um, mais de um ou todos os rompimentos em pelo menos um dos genes endógenos mencionados acima podem ser um rompimento heterozigoto. Em certas modalidades, os rompimentos em pelo menos um dos genes endógenos mencionados acima podem incluir rompimentos homozigotos, rompimentos heterozigotos ou uma combinação de rompimentos homozigotos e rompimentos heterozigotos.

A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado que geralmente compreendido por um versado comum na técnica à qual a invenção pertence. Na descrição e na reivindicação da presente invenção, a terminologia que segue será usada de acordo com as definições descritas abaixo.

Conforme usado no presente relatório e nas reivindicações apensas, as formas singulares um, uma e o, a incluerrureferentes no singular e no plural a menos que o contexto dite claramente de outra maneira. Desta maneira, por exemplo, referência a uma célula inclui uma célula e uma combinação de duas ou mais células e similar.

O termo planta refere-se genericamente a qualquer uma de: plantas inteiras, partes ou órgãos de planta (por exemplo, folhas, caules,

25/59 raízes, etc), órgãos/estruturas vegetativos de broto (por exemplo, folhas, caules e tubérculos), raízes, flores e órgãos/estruturas florais (por exemplo, brácteas, sépala, pétalas, estame, carpelos, anteras e óvulos), semente (incluindo embrião, endosperma e revestimento de semente), fruta (o ovário maduro), tecido de planta (por exemplo, tecido vascular, tecido básico e similar), calo de cultura de tecido e células de planta (por exemplo, célulasguarda, células ovo, tricromos e similar) e progênie das mesmas. O termo planta significa geralmente todos aqueles organismos que são capazes de fotossíntese. Incluídos como plantas no escopo da invenção estão todos os gêneros e espécies das plantas superiores e inferiores do reino de planta. Plantas maduras significa plantas em qualquer estágio de desenvolvimento além da muda. Muda significa uma planta imatura jovem em um estágio desenvolvimental inicial. Plantas anuais, perenes, monocotiledôneas e/ou dicotiledôneas são preferidas. Preferência é dada a plantas da família de planta que segue: Brassicaceae, em particular a plantas dos gêneros Brassica e Arabidopsis.

Célula de planta, conforme aqui usado, inclui ainda, sem limitação, células obtidas de ou encontradas em uma planta ou uma parte da mesma: sementes, culturas, culturas em suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, folhas, raízes, brotos, gametófitos, esporófitos, pólen e microscoporos. Células de planta podem também ser compreendidas incluir células modificadas, tais como protoplastos, obtidas dos tecidos mencionados acima.

O termo rompimento ou rompido conforme aqui usado significa que um gene pode ser estruturalmente rompido de maneira a compreender pelo menos uma mutação ou alteração estrutural de maneira que o gene rompido é incapaz de direcionar a expressão eficiente de um produto de gene integralmente funcional de comprimento integral. O termo rompimento ou rompido também compreende que o gene rompido ou um de seus produtos pode ser funcionalmente inibido ou inativado de maneira que o gene ou não é expressão ou é incapaz de expressar eficientemente um produto de gene de comprimento integral e/ou integralmente funcional. Inibição ou

26/59 inativação funcional pode resultar de um rompimento e/ou interrupção estrutural de expressão no nível de transcrição ou tradução. Inibição ou inativação funcional pode ser também obtida, por exemplo, através de métodos tais como supressão de gene de polinucleotídeo de antissentido, silenciamento de gene induzido por RNA de filamento duplo, técnicas de ribozima e similar. A inibição de expressão e/ou atividade pode ser o resultado de, por exemplo, construtos de antissentido, construtos de sentido, construtos de silenciamento de RNA, interferência de RNA, rompimentos genômicos (por exemplo, transpossomos, tilling, recombinação homóloga, etc) e/ou similar. Rompimento através de inibição funcional também compreender uma inibição de um gene ou de seus produtos através de interação com um composto químico, preferivelmente um composto químico interagindo especificamente com o dito gene ou produto de gene. A inibição de expressão e/ou atividade pode ser medida através da determinação da presença e/ou da quantidade de transcrito (por exemplo, através de técnicas de Northern blotting ou RT-PCR) e/ou através da determinação da presença e/ou da quantidade de polipeptídeo de comprimento integral ou truncado codificado pelo dito gene (por exemplo, através de ELISA ou Western blotting) e/ou através da determinação da presença e/ou da quantidade de atividade de citocina oxidase/desidrogenase do produto do gene da citocina oxidase/desidrogenase. O termo rompimento ou rompido conforme aqui usado deve ser compreendido que um rompimento também compreende um rompimento que é eficaz apenas em uma parte de uma planta, em um tipo de célula ou tecido particular tal como, por exemplo, o meristema reprodutor ou o ápice do broto. Um rompimento pode ser conseguido através da interação com ou afetando dentro de uma região de codificação, dentro de uma região de não codificação e/ou dentro de uma região reguladora tal como, por exemplo, uma região promotora de um gene particular.

O termo transgênico refere-se a uma planta que tem sequências de ácido nucleico incorporadas, incluindo, mas não limitado a, genes, polinucleotídeos, DNA, RNA, etc, e/ou alterações nos mesmos (por exemplo, mutações, mutações por ponto ou similar), que foram introduzidas em uma

27/59 planta comparado com uma planta não introduzida através de processos que não são processos essencialmente biológicos para a produção de plantas. Desta maneira, o termo planta transgênica compreende não apenas plantas compreendendo ácidos nucleicos não endógenos, mas refere-se explicitamente também a plantas que carregam mutações em um gene endógeno, por exemplo, mutações por ponto, que foram introduzidas na dita planta transgênica comparado com uma planta não introduzida através de processo que não são processos essencialmente biológicos para a produção de plantas.

O termo endógeno refere-se a qualquer sequência de gene ou ácido nucleico que já está presente em uma dada célula ou organismo tal como, por exemplo, uma planta. O termo exógeno refere-se a quaisquer sequências de gene ou ácido nucleico que não são endógenas.

Um elemento transponível (TE) ou elemento genético transponível é uma sequência de DNA que pode se mover de um local para outro em uma célula. Movimento de um elemento transponível pode ocorrer de epissoma para epissoma, de epissoma para cromossomo, de cromossomo para cromossomo ou de cromossomo para epissoma. Elementos transponíveis são caracterizados pela presença de sequências de repetição invertidas em seus terminais. Mobilização mediada enzimaticamente por uma transposase. Estruturalmente, um elemento transponível é categorizado como um transposon (TN) ou um elemento de sequência de inserção (elemento IS) com base na presença ou ausência, respectivamente, de sequências genéticas em adição àquelas necessárias para mobilização do elemento. Um mini-transposon ou elemento mini-IS tipicamente não tem sequências codificando uma transposase.

O termo ácido nucleico ou polinucleotideo é geralmente usado em seu significado reconhecido na técnica para se referir a um polímero de ácido nucleico ribose (RNA) ou ácido nucleico desoxirribose (DNA), ou um análogo do mesmo, por exemplo, um polímero de nucleotídeo compreendendo modificações dos nucleotídeos, um ácido nucleico de peptídeo ou similar. Em certas aplicações, o ácido nucleico pode ser um polímero que

28/59 inclui tipos de monômero múltiplos, por exemplo, ambas as subunidades de RNA e DNA. Um ácido nucleico pode ser, por exemplo, um cromossomo ou segmento cromossomal, um vetor (por exemplo, um vetor de expressão), um cassete de expressão, um polímero de DNA ou RNA nu, o produto de uma reação em cadeia da polimerase (PCR), um oligonucleotídeo, uma sonda, etc. Um ácido nucleico pode ser, por exemplo, de filamento simples e/ou filamento duplo. A menos que de outra maneira indicado, uma sequência de ácido nucleico particular da invenção compreende ou codifica opcionalmente sequências complementares, em adição a qualquer sequência explicitamente indicada.

O termo sequência de polinucleotídeo, sequência de ácido nucleico ou sequência de nucleotídeo refere-se a uma sequência de nucleotídeos contígua em um ácido nucleico simples ou a uma representação, por exemplo, um conjunto de caracteres, da mesma. Isto é, uma sequência de polinucleotídeo é um polímero de nucleotídeo (um oligonucleotídeo, um DNA, um ácido nucleico, etc) ou um conjunto de caracteres representando um polímero de nucleotídeo, dependendo do contexto. A partir de qualquer sequência de polinucleotídeo especificada, ou o ácido nucleico dado ou a sequência de polinucleotídeo complementar (por exemplo, o ácido nucleico complementar) pode ser determinado.

O termo subsequência ou fragmento é qual quer porção de uma sequência inteira.

Um cassete de expressão é um construto de ácido nucleico, por exemplo, vetor, tal como um plasmídeo, um vetor viral, etc, capaz de produzir transcritos e, potencialmente, polipeptídeos codificados por uma sequência de polinucleotídeo. Um vetor de expressão é capaz de produzir transcritos em uma célula exógena_T por exemplo, uma célula bacteriana, ou uma célula de planta, in vivo ou in vitro, por exemplo, um protoplasto de planta culturado. Expressão de um produto pode ser ou constitutiva ou induzível dependendo, por exemplo, do promotor selecionado. Configurações de interferência ou silenciamento de antissentido, sentido ou RNA que não são ou não podem ser traduzidas são expressamente incluídas por esta defini

29/59 ção. No contexto de um vetor de expressão, um promotor é dito estar operavelmente ligado ou funcionalmente ligado a uma sequência de polinucleotídeo se ele for capaz de regulagem da expressão da sequência de polinucleotídeo associada. O termo também se aplica a construtos de gene exógeno alternativos, tais como transgenes expressos ou integrados. Similarmente, o termo operavelmente ou funcionalmente ligado se aplica igualmente a sequências reguladoras transcripcionais alternativas ou adicionais tais como aumentadores, associadas com uma sequência de polinucleotídeo.

Uma sequência de polinucleotídeo, sequência de ácido nucleico ou gene é dita codificar uma molécula de RNA de sentido ou antissentido, ou molécula de silenciamento ou interferência de RNA ou um polipeptídeo, se a sequência de polinucleotídeo puder ser transcrita (em forma unida ou não unida) e/ou traduzida no RNA ou polipeptídeo, ou uma subsequência da mesma. O versado na técnica tem consciência da degeneração do código genético, permitindo várias sequências de ácido nucleico diferentes codificando a mesma sequência de aminoácido ou polipeptídeo e não tem quaisquer dificuldades na determinação de se uma dada sequência de ácido nucleico codifica uma dada sequência de aminoácido ou polipeptídeo.

Expressão de um gene ou expressão de um ácido nucleico significa transcrição de DNA em RNA (opcionalmente incluindo modificação do RNA, por exemplo, união), tradução de RNA em um polipeptídeo (possivelmente incluindo modificação subsequente do polipeptídeo, por exemplo, modificação pós-traducional), ou ambas a transcrição e a tradução, conforme indicado pelo contexto.

O termo gene ou sequência de gene é usado amplamente para se referir a qualquer ácido nucleico associado com uma função biológica. Genes tipicamente incluem sequências de codificação e/ou sequências reguladoras requeridas para expressão de tais sequências de codificação. O termo gene se aplica a uma sequência genômica específica, bem como a um cDNA ou um mRNA codificado por esta sequência genômica. Genes também incluem segmentos de ácido nucleico não expressos que, por e

30/59 xemplo, formam sequências de reconhecimento, para outras proteínas. Sequências reguladoras não expressas incluem promotores e aumentadores, aos quais proteínas reguladoras tais como fatores de transcrição se ligam, resultando em transcrição de sequências adjacentes ou próximas.

Um polipeptídeo é um polímero compreendendo dois ou mais resíduos de aminoácido (por exemplo, um peptídeo ou uma proteína). O polímero pode compreender ainda elementos de não aminoácido tais como marcadores, extintores, grupos de bloqueio ou similar e pode compreender opcionalmente modificações tais como glicosilação e similar. Os resíduos de aminoácido do polipeptídeo podem ser naturais ou não naturais e podem ser não substituídos, não modificados, substituídos ou modificados.

Conforme aqui usado, o termo gene de citocina oxidase/desidrogenase refere-se a um gene codificando um polipeptídeo com atividade de citocina oxidase/desidrogenase. Uma citocina oxidase/desidrogenase é uma enzima que catalisa a reação química:

N6-dimetilaliladenina + aceitador + H₂O adenina + 3metilbut-2-enal + aceitador reduzido

Os três substratos desta enzima são N6-dimetilaliladenina, aceitador e H₂O, enquanto seus três produtos são adenina, 3-metilbut-2-enal e aceitador reduzido. Preferivelmente o termo atividade de citocina oxidase/desidrogenase compreende a atividade de um dado polipeptídeo em catalisar uma reação de oxidorredutase com pelo menos uma das citocinas como substrato. O versado na técnica tem conhecimento de meios e métodos para determinar se um dado polipeptídeo tem atividade de citocina oxidase/desidrogenase ou não e determinar o nível de atividade de citocina oxidase/desidrogenase de um polipeptídeo ou sonda particular em valores absolutos e/ou com relaçãojax)iitro_p^^ Há uma orienta^ ção ampla na literatura em como um dado polipeptídeo pode ser testado para tal atividade, vide, por exemplo, EC 1.5.99.12. Mais preferivelmente, o termo atividade de citocina oxidase/desidrogenase compreende a atividade de um dado polipeptídeo em catalisar uma reação de oxidorredutase com pelo menos uma das citocinas como substrato, preferivelmente com uma

31/59 atividade de não menos do que 30% da atividade de AtCKX3 (CKX3 com SEQ ID N°:1), preferivelmente de não menos do que 50% da atividade de AtCKX3.

O termo ortólogo conforme usado aqui refere-se a um gene de uma espécie, preferivelmente diferente de Arabidopsis thaliana, que mostra similaridade mais alta, preferivelmente identidade de sequência mais alta, com o gene especificado de Arabidopsis thaliana porque ambos os genes se originaram de um ancestral comum. Preferivelmente, o termo ortólogo significa um gene endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase e compreendendo uma sequência (polipeptídeo ou ácido nucleico) com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com uma dada sequência que o respectivo ortólogo refere-se, preferivelmente em um comprimento de sequência particular. Mais preferivelmente, o termo ortólogo significa um gene endógeno, que é derivado de uma espécie diferente de Arabidopsis thaliana, codificando uma citocina oxidase/desidrogenase e compreendendo uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com uma dada sequência de Arabidopsis thaliana que o respectivo ortólogo refere-se, preferivelmente em um comprimento de sequência particular.

O termo recombinante indica que o material (por exemplo, uma célula, um ácido nucleico ou uma proteína) foi artificialmente ou sinteticamente (não naturalmente) alterado por intervenção humana. A alteração pode ser realizada no material dentro de, ou removido de, seu ambiente ou estado natural. Por exemplo, um ácido nucleico recombinante é um que é feito através de recombinação de ácidos, por exemplo, durante clonagem, embaralhamento de DNA ou outros procedimentos; um polipeptídeo recombinante ou proteína recombinante é um polipeptídeo ou proteína que é produzido através da expressão de um ácido nucleico recombinante. Exemplos de células recombinantes incluem células contendo ácidos nucleicos recombinantes e/ou polipeptídeos recombinantes.

O termo vetor refere-se aos meios através dos quais um ácido

32/59 nucleico pode ser propagado e/ou transferido entre organismos, células ou componentes celulares. Vetores incluem plasmídeos, vírus, bacteriófago, pró-vírus, fagemídeos, transpossomos e cromossomos artificiais, e similar, que replicam autonomamente ou podem interagir em um cromossomo de uma célula hospedeiro. Um vetor pode ser também um polinucleotídeo de RNA nu, um polinucleotídeo de DNA nu, um polinucleotídeo composto de ambos o DNA e o RNA dentro do mesmo filamento, um DNA ou RNA conjugado à poli-lisina, um DNA ou RNA conjugado a peptídeo, um DNA conjugado a lipossoma, ou similar, que não estão replicando autonomamente.

No contexto da presente invenção, o termo isolado refere-se a um material biológico, tal como um ácido nucleico ou um polipeptídeo, que é substancialmente livre de componentes que normalmente o acompanham ou interagem com ele em seu ambiente de ocorrência natural. O material isolado opcionalmente compreende material não encontrado com o material em seu ambiente natural, por exemplo, uma célula. Por exemplo, se o material estiver em seu ambiente natural, tal como uma célula, o material foi substituído em um local na célula (por exemplo, genoma ou elemento genético) não nativo por um material encontrado naquele ambiente. Por exemplo, um ácido nucleico de ocorrência natural (por exemplo, uma sequência de codificação, um promotor, um aumentador, etc) se torna isolado se ele for introduzido através de meios de ocorrência não natural em um local do genoma (por exemplo, um vetor, tal como um vetor de plasmídeo ou vírus, ou amplicon) não nativo para aquele núcleo. Uma célula de planta isolada, por exemplo, pode estar em um ambiente (por exemplo, um sistema de cultura celular ou purificado da cultura celular) que não o ambiente nativo de células de planta do tipo selvagem (por exemplo, uma planta inteira).

Um promotor, conforme aqui usado, inclui referência a uma região de DNA a montante do início de transcrição e envolvida em reconhecimento e ligação de polimerase de RNA e outras proteínas para iniciar transcrição. Um promotor de planta é um promotor capaz de iniciar transcrição em células de planta. Promotores de planta exemplares incluem, mas não estão limitados a, aqueles que são obtidos de plantas, vírus de planta e bac

33/59 térias que compreendem genes expressos em células de planta, tal como Agrobacterium ou Rhizobium. Exemplos de promotores sob controle desenvolvimental incluem promotores que preferivelmente iniciam a transcrição em certos tecidos, tais como folhas, raízes ou sementes, ou espacialmente em regiões tais como regiões de endosperma, embrião ou meristemáticas. Tais promotores são referidos como preferidos de tecido ou específicos de tecido”. Um promotor temporariamente regulado direciona a expressão em momentos particulares, tal como entre 0-25 dias após polinação. Um promotor preferido de tipo de célula direciona principalmente expressão em certos tipos de célula em um ou mais órgãos, por exemplo, células vasculares em raízes ou folhas. Um promotor induzível é um promotor que está sob controle ambiental e pode ser induzível ou desrepressível. Exemplos de condições ambientais que podem afetar a transcrição por promotores induzíveis incluem condições anaeróbicas ou a presença de luz. Promotores específicos de tecido, específicos de tipo de célula e induzíveis constituem a classe de promotores não constitutivos. Um promotor constitutivo é um promotor que é ativo sob a maioria das condições ambientais e em todos ou quase todos os tecidos, em todos ou quase todos os estágios de desenvolvimento.

Transformação, conforme aqui usado, é o processo através do qual uma célula é transformada por DNA exógeno quando tal DNA exógeno foi introduzido dentro da membrana de célula. DNA exógeno pode ou não ser integrado (covalentemente ligado) ao DNA cromossomal formando o genoma da célula. Em procariontes e leveduras, por exemplo, o DNA exógeno pode ser mantido em um elemento epissomal, tal como um plasmídeo. Com relação a células eucarióticas superiores, uma célula estavelmente transformada ou transfectada é uma onde o DNA exógeno se tornou integrado ao cromossomo de maneira que ele é herdado por células filhas através de replicação de cromossomo. Esta estabilidade é demonstrada pela habilidade da célula eucariótica em estabelecer linhagens de célula ou clones compreendidos de uma população de células filhas contendo o DNA exógeno.

Para o propósito da presente invenção, identidade de sequên

34/59 cia é objetivamente determinada através de qualquer um de vários métodos. O versado na técnica tem conhecimento desses métodos e pode escolher um método adequado sem experimentação indevida. Uma variedade de métodos para determinação das relações entre duas ou mais sequências (por exemplo, identidade, similaridade e/ou homologia) está disponível e é bem conhecida na técnica. Os métodos incluem alinhamento manual, alinhamento de sequência auxiliado por computador e combinações dos mesmos, por exemplo. Vários algoritmos (que são geralmente implementados por computador) para realização de alinhamento de sequência estão amplamente disponíveis ou podem ser produzidos por um versado na técnica. Esses métodos incluem, por exemplo, o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; o algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; o método de pesquisa por similaridade de Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:2444; e/ou através de implementações computadorizadas desses algoritmos (por exemplo, GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package Release, 7.0, Genetic Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl).

Por exemplo, software para realização de análise de identidade de sequência (e similaridade de sequência) usando o algoritmo BLAST é descrito em Atlschul e outros (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. Este software está publicamente disponível, por exemplo, do National Center for Biotechnology Information na world wide web no ncbi.nlm.nih.gov. Este algoritmo envolve primeiro identificação de pares de sequência de score alto (HSPs) através da identificação de palavras curtas de comprimento W na sequência de investigação, que ou combinam ou satisfazem algum score T limiar de valor positivo quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência de banco de dados. T é referido como o limiar de score de palavra da vizinhança. Essas combinações de palavra da vizinhança iniciais agem como sementes para início de pesquisas para encontrar HSPs mais longos contendo-as. As combinações de palavra são então estendidas em ambas as direções ao longo de cada sequência até o máximo que o sco

35/59 re de alinhamento cumulativo puder ser aumentado. Scores cumulativos são calculados usando, para sequências de nucleotídeo, os parâmetros M (score de recompensa para um par de resíduos compatíveis; sempre > 0) e N (score de penalidade para resíduos não compatíveis; sempre < 0). Para sequências de aminoácido, uma matriz de scoring é usada para calcular o score cumulativo. Extensão das combinações de palavra em cada direção é então parada quando: o score de alinhamento cumulativo cai pela quantidade X de seu valor máximo atingido; o score cumulativo cai para zero ou menos, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduo de scoring negativo; ou o final de qualquer sequência ser atingido. Os parâmetros de algoritmo BLAST W, T e X determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeo) usa como defaults um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, um cutoff de 100, M=5, N=-4 e uma comparação de ambos os filamentos. Para sequências de aminoácido, o programa BLASTP (Proteína BLAST) usa como defaults um comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10 e uma matriz de scoring BLOSUM62 (vide Henikoff & Henikoff (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915).

Ainda, o algoritmo BLAST realiza uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (vide, por exemplo, Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5787). Uma medida de similaridade provida pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (p (N)), que provê uma indicação da probabilidade de uma combinação entre duas sequências de nucleotídeo ou aminoácido ocorrer por acaso. Por exemplo, um ácido nucleico é considerado similar a uma sequência de referência (e, então, neste contexto, homóloga) se a menor probabilidade de soma em uma comparação do acido nucleico de teste com o ácido nucleico de referência for menor do que cerca de 0,1 ou menor do que cerca de 0,01 ou até mesmo menor do que cerca de 0,001.

Outro exemplo de um algoritmo de alinhamento de sequência útil é PILEUP. PILEUP cria um alinhamento de sequência múltiplo a partir de um grupo de sequências relacionadas usando alinhamentos em pares, progres

36/59 sivos. Ele pode também pôr em gráfico uma árvore mostrando as relações de agrupamento usadas para criar o alinhamento. PILEUP usa uma simplificação do método de alinhamento progressivo de Feng & Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35:351-360. O método usado é similar ao método descrito por Higgins & Sharp (1989) CABIOS5:151-153. O programa pode alinhar, por exemplo, até 300 sequências de um comprimento máximo de 5.000 letras. O procedimento de alinhamento múltiplo começa com o alinhamento em pares das duas sequências mais similares, produzindo um agrupamento de duas sequências alinhadas. Este agrupamento pode ser então alinhado com a próxima sequência mais relacionada ou agrupamento de sequências alinhadas. Dois agrupamentos de sequências podem ser alinhados por uma extensão simples do alinhamento em par de duas sequências individuais. O alinhamento final é conseguido por uma série de alinhamentos em par, progressivos. O programa pode também ser usado para pôr em gráfico uma representação em dendograma ou árvore de relações de agrupamento. O programa é rodado através da designação de sequências específicas e suas coordenadas de aminoácido ou nucleotídeo para regiões de comparação de sequência.

Um exemplo adicional de um algoritmo que é adequado para alinhamentos de sequência de DNA, ou aminoácido, múltiplos é o programa CLUSTALW (Thompson, J.D. e outros, (1994) Nucl. Acids. Res. 22:46734680). CLUSTALW realiza comparações em partes múltiplas entre grupos de sequências e as monta em um alinhamento múltiplo com base em homologia. Penalidades de abertura de lacuna e extensão de lacuna podem ser, por exemplo, 10 e 0,05, respectivamente. Para alinhamentos de aminoácido, o algoritmo BLOSUM pode ser usado como uma matriz de peso de proteína. Vide, por exemplo, Henikoff e Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915-10919.

A célula de planta isolada ou a planta transgênica da invenção pode ser produzida através de meios convencionais tais como, por exemplo, transformação. A transformação de células de planta e protoplastos pode ser realizada essencialmente de qualquer uma das várias maneiras conhecidas

37/59 daqueles versados na técnica de biologia molecular de planta incluindo os, mas não limitado aos, métodos descritos aqui. Vide, em geral, Methods in Enzymology, Vol. 153 (Recombinant DNA Part D) Wu and Grossman (eds.) 1987, Academic Press. Conforme aqui usado, o termo transformação significa alteração do genótipo de uma planta hospedeiro ou célula de planta através da introdução de uma sequência de ácido nucleico, por exemplo, uma sequência de ácido nucleico heteróloga, exógena ou estranha. A sequência de ácido nucleico heteróloga não precisa necessariamente se originar de uma fonte diferente, mas ela vai, em algum ponto, ser externa à célula à qual ela é introduzida. Em adição a Berger, Ausubel e Sambrook, referências gerais úteis para clonagem, cultura e regeneração de célula de planta incluem Jones (ed.) (1995) Plant Gene Transfer and Expression Protocols—Methods in Molecular Biology, Volume 49, Humana Press Towata, N.J.; Payne e outros (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems, John Wiley & Sons, Inc. Nova York, NY (Payne); e Gamborg e Phillips (eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg Nova York) (Gamborg). Uma variedade de meios de cultura celular é descrita em Atlas e Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL (Atlas). Informação adicional para cultura de célula de planta é encontrada em literatura comercial disponível tal como Life Science Research Cell Culture Catalogue (1998) da Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) (Sigma-LSRCCC) e, por exemplo, o Plant Culture Catalogue and supplement (1997) da SigmaAldrich, Inc. (St. Louis, MO) (Sigma-PCCS). Detalhes adicionais com relação à cultura de célula de planta são encontrados em Croy (ed.) (1993) Plant Molecular Biology Bios Scientific Publishers, Oxford, U.K.

Um. mais de um ou todos os rompimentos em pelo menos um dos genes endógenos mencionados acima podem ser facilitados através da introdução e expressão em uma célula de planta ou uma planta de uma sequência de polinucleotídeo transgênica, por exemplo, em configurações de antissentido ou sentido, ou configurações de silenciamento ou interferência de RNA, etc, onde a sequência de polinucleotídeo transgênica compreende

38/59 uma sequência de ácido nucleico estando ou sendo complementar a:

a) uma sequência ou subsequência de um gene de CKX3 endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com SEQ ID N°:1 ou um ortólogo do mesmo;

b) uma sequência ou subsequência de um gene de CKX1 endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo de SEQ ID N°:13 ou um ortólogo do mesmo;

c) uma sequência ou subsequência de um gene de CKX2 endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:2 ou um ortólogo do mesmo;

d) uma sequência ou subsequência de um gene de CKX4 endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:3 ou um ortólogo do mesmo;

e) uma sequência ou subsequência de um gene de CKX5 endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:4 ou um ortólogo do mesmo;

f) uma sequência ou subsequência de um gene de CKX6 endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:5 ou um ortólogo do mesmo;

g) uma sequência ou subsequência de um gene de CKX7 endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:6 ou um ortólogo do mesmo;

ou

h) uma sequência ou subsequência de um gene endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos

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60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma das SEQ ID N^oS: 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 13 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos, preferivelmente 100 aminoácidos, mais preferivelmente em todo o comprimento;

e compreende um promotor, desta maneira inibindo a expressão e/ou atividade do pelo menos um gene da citocina oxidase/desidrogenase rompido comparado com uma célula de planta controle correspondente ou planta sem tais rompimentos (por exemplo, seu parente não transgênico ou uma planta não transgênica da mesma espécie). A sequência de polinucleotídeo transgênica pode ser introduzida através de técnicas incluindo, mas não limitado a, por exemplo, eletroporação, bombardeamento de microprojétil, transferência mediada por Agrobacterium ou outros métodos disponíveis. Em certos aspectos da invenção, o polinucleotídeo é ligado ao promotor em uma orientação de sentido ou em uma orientação de antissentido ou é configurado para silenciamento ou interferência de RNA.

Literatura relevante descrevendo a aplicação de silenciamento de gene dependente de homologia inclui: Jorgensen, Trends Biotechnol, 8 (12):340-344 (1990); Flavell, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 91:3490-3496 (1994); Finnegan e outros, Bio/Technology 12:883-888 (1994); Neuhuber e outros, Mol. Gen. Genet. 244:230-241 (1994); Flavell e outros (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:3490-3496; Jorgensen e outros (1996) Plant Mol. Biol. 31:957-973; Johansen e Carrington (2001) Plant Physiol. 126:930-938; Broin e outros (2002) Plant cell 14:1417-1432; Stoutjesdijk e outros (2002) Plant Physiol. 129:1723-1732; Yu e outros (2003) Phytochemistry 63:753763; e Patentes U.S. N^oS. 5.034.323, 5.283.184 e 5.942.657.

Alternativamente, outra abordagem para silenciamento de gene pode ser com o uso de tecnologia de antissentido (Rothstein e outros em Plant Mol. Cell. Biol. 6:221-246 (1989); Liu e outros (2002) Plant Physiol. 129:1732-1743 e Patentes U.S. N^oS. 5.759.829 e 5.942.657. Uso de ácidos nucleicos de antissentido é bem conhecido na técnica. Um ácido nucleico de antissentido tem uma região de complementaridade para um ácido nucleico alvo, por exemplo, uma sequência de gene genômica particular, um mRNA,

40/59 ou cDNA. O ácido nucleico de antissentido pode ser RNA, DNA ou PNA ou qualquer outra molécula apropriada. Um dúplex pode se formar entre a sequência de antissentido e sua sequência de sentido complementar, resultando em inativação do gene. O ácido nucleico de antissentido pode inibir expressão de gene através da formação de um dúplex com um RNA transcrito a partir do gene, por exemplo, através da formação de um triplex com DNA dúplex, etc. Um ácido nucleico de antissentido pode ser produzido através de várias técnicas bem estabelecidas (por exemplo, síntese química de um RNA de antissentido ou oligonucleotídeo (incluindo opcionalmente nucleotídeos modificados e/ou ligações que aumentam a resistência à degradação ou melhoram a absorção celular) ou transcrição in vitro). Ácidos nucleicos de antissentido e seu uso são descritos, por exemplo, na USP 6.242.258 para Haselton e Alexander (5 de junho de 2001) intitulado Methods for the selective regulation of DNA and RNA transcription and translation by photoactivation; USP 6.500.615; USP 6.498.035; USP 6.395.544; USP 5.563.050; E. Schuch e outros (1991) Symp. Soc. Exp. Biol. 45:117-127; de Lange e outros (1995) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197:57-75; Hamilton e outros (1995) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197:77-89; Finnegan e outros (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8449-8454; Uhlmann e A. Pepan (1990), Chem. Rev. 90:543; P.D. Cook (1991), Anti-Cancer Drug Design 6:585; J. Goodchild, Bioconjugate Chem. 1 (1990) 165; e S.L. Beaucage e R.P. Lyer (1993), Tetrahedron 49:6123; e F. Eckstein, Ed. (1991), Oligonucleotides and Analogues-A Practical Approach, IRL Press.

Moléculas de RNA catalíticas ou ribozimas podem ser também usadas para inibir expressão de genes selecionados particulares. É possível projetar ribozimas que emparelham especificamente com virtualmente qualquer RNA alvo desejado e clivam a estrutura principal fosfodiéster em um local específico, desta maneira inativando funcionalmente o RNA alvo. Ao realizar esta divagem, a ribozima não é alterada em si, e é então capaz de reciclar e clivar outras moléculas. A inclusão de sequências de ribozima dentro de RNAs de antissentido confere atividade de divagem de RNA a eles, desta maneira aumentando a atividade dos construtos. Várias classes de

41/59 ribozimas foram identificadas. Por exemplo, uma classe de ribozimas é derivada de vários RNAs circulares pequenos que são capazes de autoclivagem e replicação em plantas. Os RNAs podem replicar ou sozinhos (RNAs viroides) ou com um vírus auxiliar (RNAs satélites). Exemplos de RNAs incluem RNAs de avocado sunblotch viroid e os RNAs satélites de tobacco ringspot virus, lucerne transient streak virus, velvet tobacco mottle virus, solanum nodiflorum mottle virus e subterranean clover mottle virus. O projeto e o uso de ribozimas específicas de RNA alvo foram descritos. Vide, por exemplo, Haseloff e outros (1988) Nature, 334:585-591.

Outro método para inativar urn gene selecionado particular através da inibição da expressão é através de supressão de sentido. Introdução de cassetes de expressão onde um ácido nucleico é configurado na orientação de sentido com relação ao promotor foi mostrada ser um meio eficaz através do qual bloquear a transcrição de um gene alvo desejado. Vide, por exemplo, Napoli e outros (1990), The Plant Cell 2:279-289 e Patentes U.S. N°^s. 5.034.323, 5.231.020 e 5.283.184.

Os rompimentos da invenção podem também ser produzidos usando silenciamento ou interferência de RNA (RNAi), que pode ser também chamado silenciamento de gene pós-transcripcional (PTGS) ou cosupressão. No contexto da presente invenção, silenciamento de RNA (também chamado RNAi ou interferência mediada por RNA) refere-se a qualquer mecanismo através do qual a presença de um RNA de filamento simples ou, tipicamente, filamento duplo em uma célula resulta em inibição de expressão de um gene alvo compreendendo uma sequência idêntica ou quase idêntica àquela do RNA, incluindo, mas não limitado a, interferência de RNA, repressão de tradução de um mRNA alvo transcrito a partir do gene alvo sem alteração da estabilidade dos mRNA's e silenciamento transcripcional (por exemplo, acetilação de histona e formação de heterocromatina levando à inibição de transcrição do mRNA alvo). Em interferência de RNA a presença do RNA de filamento simples ou filamento duplo na célula leva à divagem endonucleolitica e então degradação do mRNA alvo.

Em uma modalidade, um transgene (por exemplo, uma sequên

42/59 cia e/ou subsequência de um gene ou sequência de codificação de interesse) é introduzido em uma célula de planta para romper um ou mais genes através de silenciamento ou interferência de RNA (RNAi). Por exemplo, uma sequência ou subsequência (o transgene) inclui uma subsequência pequena, por exemplo, cerca de 21-25 bases de comprimento, uma subsequência maior, por exemplo, cerca de 25-100 ou cerca de 100-2000 (ou cerca de 200-1500, cerca de 250-1000, etc) bases de comprimento, e/ou a sequência de codificação toda ou gene selecionado de ou sendo complementar a:

a) uma sequência ou subsequência de um gene de CKX3 endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:1 ou um ortólogo do mesmo;

b) uma sequência ou subsequência de um gene de CKX1 endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:13 ou um ortólogo do mesmo;

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ou

h) uma sequência ou subsequência de um gene endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma das SEQ ID NOs:1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 13 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos, preferivelmente 100 aminoácidos, mais preferivelmente em todo o comprimento.

Preferivelmente, um transgene inclui uma região na sequência ou subsequência que é de cerca de 21-25 bases de comprimento com pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 99% de identidade com uma subsequência de uma das sequências com a SEQ ID N°:7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 14.

Uso de RNAi para inibição de expressão de gene em vários tipos de células (incluindo, por exemplo, células de planta) e organismos, por exemplo, através de expressão de um RNA grampo de cabelo {stem-loop) ou dos dois filamentos de um RNA de interferência, por exemplo, é bem descrito na literatura, como o são métodos para determinação de RNA(s) de interferência apropriados para se direcionarem a um gene desejado, e para geração de tais RNAs de interferência. Por exemplo, interferência de RNA é descrita, por exemplo, nas publicações de pedido de patente U.S. 20020173478, 20020162126 e 20020182223 e em Cogoni e Macino (2000), Post-transcriptional gene silencing across kingdoms, Genes Dev., 10:638 643; Guru, T. (2000), A silence that speaks volumes, Nature 404:804-808; Hammond e outros (2001), Post-transcriptional Gene Silencing by Doublestranded RNA, Nature Rev. Gen. 2:110-119; Napoli e outros (1990) Introduction of a chaicone synthase gene into Petunia results in reversible cosupression of homologous gene in trayas. Plant Cell 2:279-289, etc.

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A(s) sequência(s) ou subsequência(s) de polinucleotídeo a serem expressas para induzir RNAi podem ser expressas, por exemplo, sob controle de um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor específico de tecido. Expressão a partir de um promotor específico de tecido pode ser vantajosa em certas modalidades.

Um, mais de um ou todos os rompimentos em pelo menos um dos genes endógenos mencionados acima podem ser introduzidos através de, por exemplo, inativação de gene baseada em transposon. Por exemplo, a etapa de inativação compreende produção de uma ou mais mutações em um gene sendo:

i) um gene de CKX3 endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:1 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:1 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos de SEQ ID N°:1, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°:1, mais preferivelmente no comprimento todo de SEQ ID N°:1;

e/ou ii) em pelo menos um gene endógeno adicional sendo:

a) um gene de CKX1 codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:13 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma de SEQ ID N°:13 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos de SEQ ID N°:13, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°:13, mais preferivelmente em todo o comprimento de SEQ ID N°:13;

45/59

b) um gene de CKX2 codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:2 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma de SEQ ID N°:2 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos de SEQ ID N°:2, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°:2, mais preferivelmente em todo o comprimento de SEQ ID N°:2;

e) um gene de CKX6 codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo

46/59 idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:5 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma de SEQ ID N°:5 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos de SEQ ID N°:5, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°:5, mais preferivelmente em todo o comprimento de SEQ ID N°:5;

ou

em que a uma ou mais mutações na sequência de gene compreendem uma ou mais inserções de transposon e onde os rompimentos inibem expressão e/ou atividade do pelo menos um gene de citocina oxidase/desidrogenase rompido comparado com uma célula de planta controle correspondente ou planta sem tais rompimentos. Por exemplo, as uma ou mais mutações compreendem um rompimento homozigoto em um ou mais genes mencionados acima ou a uma ou mais mutações compreendem um rompimento heterozigoto em um ou mais genes mencionados acima ou uma combinação de ambos os rompimentos homozigotos e rompimentos heterozigotos.

Transpossomos foram primeiro identificados em milho por Barbara McClintock no final dos anos 40. A família Mutante de elementos trans

47/59 poníveis, por exemplo, elementos transponíveis Mutantes de Robertson (Mu), é tipicamente usada em mutagênese de gene de planta, porque eles estão presentes em número de cópia alto (10-100) e se inserem preferivelmente em e em torno dos genes.

Elementos transponíveis podem ser categorizados em duas classes amplas com base em seu modo de transposição. Esses são designados Classe I e Classe II; ambos têm aplicações como agentes mutagênicos e como vetores de aplicação. Elementos transponíveis de Classe I transpõem por um intermediário de RNA e usam transcriptases reversas, isto é, eles são retroelementos. Há pelo menos três tipos de elementos de transposição de Classe I, por exemplo, retrotranspossomos, retroposons, elementos tipo SINE. Retrotranspossomos tipicamente contêm LTRs, e genes codificando proteínas de revestimento virais (gag) e transcriptase reversa, genes de RnaseH, integrase e polimerase (pol). Vários retrotranspossomos foram descritos em espécies de planta. Tais retrotranspossomos se mobilizam e se deslocam através de um intermediário de RNA em uma reação catalisada por transcriptase reversa e RNase H codificado pelo transposon. Exemplos se encaixam nos grupos Tyl-copia e Ty3-gypsy bem como nas classificações tipo SINE e tipo LINE. Uma discussão mais detalhada pode ser encontrada em Kumar e Bennetzen (1999) Plant Retrotranspossomos in Annual Review of Genetics 33:479.

Ainda, elementos transponíveis de DNA tais como Ac, Taml e En/Spm são também encontrados em uma ampla variedade de espécies de planta e podem ser utilizados na invenção.

Transpossomos (e elementos IS) são ferramentas comuns para introdução de mutações em células de planta. Esses elementos genéticos móveis são aplicados a células, por exemplo, através de um cruzamento sexual, transposição é selecionada e os mutantes de inserção resultantes são avaliados, por exemplo, quanto a um fenótipo de interesse. Os genes rompidos podem ser introduzidos em outras plantas através de cruzamento das plantas isoladas ou transgênicas com uma planta não rompida, por exemplo, através de um cruzamento sexual. Qualquer uma de várias técni

48/59 cas de procriação padrão pode ser usada, dependendo da espécie a ser cruzada. A localização de uma TN dentro de um genoma de uma planta isolada ou transgênica pode ser determinada através de métodos conhecidos, por exemplo, sequenciamento de regiões de flanqueamento conforme descrito aqui. Por exemplo, uma reação de PCR de uma planta pode ser usada para amplificar a sequência, que pode então ser diagnosticamente sequenciada para confirmar sua origem. Opcionalmente, os mutantes de inserção são avaliados quanto a um fenótipo desejado, tal como a inibição de expressão ou atividade de um gene de interesse comparado com uma planta controle.

TILLING pode ser também usado para identificar um rompimento da presente invenção. TILLING é Targeting Induced Local Lesions [n Genome. Vide, por exemplo, McCallum e outros (2000), Targeting Induced Local Lesions in Genomes (TILLING) for Plant Functional Genomics, Plant Physiology 123:439-442; McCallum e outros (2000), Targeted screening for induced mutations, Nature Biotechnology 18:455-457; e, Colbert e outros (2001), High-Throughput Screening for Induced Point Mutations, Plant Physiology 126:480-484.

TILLING combina mutações por ponto de alta densidade com detecção sensível rápida das mutações. Tipicamente, etil metanossulfonato (EMS) é usado para realizar mutagênese de semente de planta. EMS alquila guanina, que tipicamente leva à falta de emparelhamento. Por exemplo, as sementes são embebidas em solução de cerca de 10-20 mM de SEM por cerca de 10 a 20 horas; as sementes são lavadas e então semeadas. As plantas desta geração são conhecidas como M1. Plantas M1 são então autofertilizadas. Mutações que estão presentes em células que formam os tecidos reprodutores são herdadas pela próxima geração (M2). Tipicamente, plantas M2 são avaliadas quanto à mutação no gene desejado e/ou quanto a fenótipos específicos. Por exemplo, DNA de plantas M2 é agrupado e mutações em um gene de interesse são detectadas através da detecção de formação de heterodúplex. Tipicamente, DNA é preparado a partir de cada planta M2 e agrupado. O gene desejado é amplificado através de PCR. A

49/59 amostra agrupada é então desnaturada e anelada para permitir a formação de heterodúplexes. Se uma mutação estiver presente em uma das plantas; os produtos de PCR serão de dois tipos: tipo selvagem e mutante. Agrupamentos que incluem os heterodúplexes são identificados por separação da reação por PCR, por exemplo, através de Denaturing High Performance Liquid Chromatography (DPHPLC). DPHPLC detecta incompatibilidades em heterodúplexes criados através de fusão e anelamento de DNA heteroalélico. Cromatografia é realizada enquanto aquecendo o DNA. Heterodúplexes têm estabilidade térmica menor e formam bolhas de fusão resultando em movimento mais rápido na coluna de cromatografia. Quando heterodúplexes estão presentes em adição aos homodúplexes esperados, um pico duplo é visto. Como resultado, os grupos que carregam a mutação em um gene de interesse são identificados. DNA individual de plantas que formam a população agrupada selecionada pode então ser identificado e sequenciado. Opcionalmente, a planta que possui uma mutação desejada em um gene de interesse pode ser cruzada com outras plantas para remover mutações de base.

Outros métodos mutagênicos podem ser também empregados para introduzir um rompimento da invenção. Métodos para introdução de mutações genéticas em genes de planta e seleção de plantas com características desejadas são bem conhecidos. Por exemplo, sementes e outro material de planta podem ser tratados com uma substância química mutagênica, de acordo com técnicas padrão. Tais substâncias químicas incluem, mas não estão limitadas a, o que segue: sulfato de dietila, etileno imina e N-nitroso-N-etilureia. Alternativamente, radiação de ionização de fontes tais como raios X ou raios gama pode ser usada.

Outros métodos de detecção para detecção de mutações em um gene de interesse podem ser empregados, por exemplo, eletroforese capilar (por exemplo, eletroforese capilar desnaturante constante e polimorfismo conformacional de filamento simples). Em outro exemplo, heterodúplexes podem ser detectados usando enzimologia de reparo de incompatibilidade (por exemplo, endonuclease de CEL I de aipo). CEL I reconhece

50/59 uma incompatibilidade e cliva exatamente no lado 3' da incompatibilidade. A posição de base precisa da incompatibilidade pode ser determinada através de corte com a enzima de reparo de incompatibilidade seguido por, por exemplo, eletroforese em gel desnaturante. Vide, por exemplo, Oleykowski e outros (1998), Mutation detection using a novel plant endonuclease, Nucleic Acid Res. 26:4597-4602; e Colbert e outros (2001), HighThroughput Screening for Induced Point Mutations, Plant Physiology, 126:480-484.

A planta contendo o(s) rompimento(s) desejado(s) da invenção pode ser cruzada com outras plantas para introduzir os rompimentos em outra planta. Isto pode ser feito usando técnicas de procriação padrão.

Recombinação homóloga pode ser também usada para introduzir um rompimento da invenção. Recombinação homóloga foi demonstrada em plantas. Vide, por exemplo, Puchta e outros (1994), Experientia 50:277284; Swoboda e outros (1994), EMBO J. 13:484-489; Offringa e outros (1993), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:7346-7350; Kempin e outros (1997) Nature 389:802-803; e Terada e outros (2002), Efficient gene targeting by homologous recombination in rice, Nature Biotechnology, 20 (10):10301034.

Recombinação homóloga pode ser usada para induzir modificações de gene alvo ao se direcionar especificamente a um gene de interesse in vivo. Mutações em porções selecionadas de uma sequência de gene selecionada (incluindo 5' a montante, 3' a jusante e regiões intragênicas) tais como, por exemplo:

i) um gene de CKX3 endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com SEQ ID N%kotrum ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:1 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoáci

51/59 dos de SEQ ID N°:1, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°:1, mais preferivelmente o comprimento integral de SEQ ID N°:1;

e/ou ii) em pelo menos um gene endógeno adicional sendo:

a) um gene de CKX1 codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°: 13 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma de SEQ ID N°:13 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos de SEQ ID N°:13, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°:13, mais preferivelmente o comprimento todo de SEQ ID N°:13;

b) um gene de CKX2 codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:2 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma de SEQ ID N°:2 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos de SEQ ID N°:2, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°:2, mais preferivelmente o comprimento todo de SEQ ID N°:2;

c) um gene de CKX4 codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQID N°:3 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma de SEQ ID N°:3 em uma sequência de aminoácido contínua de 50

52/59 aminoácidos de SEQ ID N°:3, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°:3, mais preferivelmente o comprimento todo de SEQ ID N°:3;

d) um gene de CKX5 codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:4 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma de SEQ ID N°:4 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos de SEQ ID N°:4, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°:4, mais preferivelmente o comprimento todo de SEQ ID N°:4;

e) um gene de CKX6 codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:5 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma de SEQ ID N°:5 em uma sequência de aminoácido contínua de 50 aminoácidos de SEQ ID N°:5, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°:5, mais preferivelmente o comprimento todo de SEQ ID N°:5;

ou

f) um gene de CKX7 codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:6 ou um ortólogo do mesmo, preferivelmente onde o ortólogo é um gene endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo com pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma de SEQ ID N°:6 em uma sequência de aminoácido contínua de 50

53/59 aminoácidos de SEQ ID N°:6, preferivelmente 100 aminoácidos de SEQ ID N°:6, mais preferivelmente o comprimento todo de SEQ ID N°:6;

são feitas in vitro e introduzidas na planta desejada usando técnicas padrão. O gene mutado vai interagir com o gene do tipo selvagem alvo de tal maneira que recombinação homóloga e substituição direcionada do gene do tipo selvagem vão ocorrer em plantas transgênicas.

Células de planta isoladas e/ou plantas transgênicas da invenção, que podem ser consumidas por humanos e animais, podem ser também usadas, por exemplo, diretamente ou após preparação conhecida per se, como alimentos e rações.

A invenção refere-se ainda ao uso das células de planta isoladas descritas acima e/ou plantas transgênicas da invenção e das células, culturas de célula, partes, tais como, por exemplo, raízes, folhas, etc, no caso de organismos de planta transgênica, e material de propagação transgênico tais como sementes, tubérculos, beterrabas/raízes principais inchadas ou frutas derivadas delas para a produção de alimentos ou rações, agentes farmacêuticos ou produtos químicos.

A seguir a presente invenção é descrita mais por meio de exemplos.

FIGURAS:

A figura 1: mostra as posições de inserções de T-DNA e transposon nos mutantes de ckx. Os mutantes de inserção foram identificados através de avaliação de PCR e o sítio de inserção determinado através de sequenciamento de DNA do fragmento de borda. Caixas pretas representam exons, caixas brancas representam introns e triângulos indicam inserções de T-DNA. G, coleção GABI-KAT T-DNA; S, coleção Salk T-DNA; T, coleção Torrey Mesa T-DNA; Z, coleção de transposon ZIGIA.

A figura 2 mostra a caracterização de T-DNA de ckx e alelos de inserção de transposon. Ausência de expressão de gene de CKX em mutantes de inserção. RNA de mudas de 10 dias de vida foi usado como molde para a análise de RT-PCR. Actina2 foi amplificada como controle.

A figura 3 mostra teor de citocina em mutante de ckx3 ckx5 e

54/59 inflorescências do tipo selvagem. 0,5 g de inflorescências de Arabidopsis por amostra foi colhido e agrupado 30 DAG. Cinco amostras biológicas independentes foram colhidas para cada genótipo. Os dados mostrados são valores médios de teor de citocina [pmol/g peso fresco] ± s.d.; n=5. tZ, frans-zeatina; tZR; írans-zeatina ribosídeo; tZRMP, /rans-zeatina ribosídeo 5'-monofosato; tZ9G, trans-zeatina 9-glicosídeo; tZROG, frans-zeatina ribosídeo O-glicosídeo; iP, N⁶-(A²isopentenil)adenina; iPR, N⁶-(Aisopentenil)adenosina; iPRMP, N⁵-(A²isopentenil)adenosina 5'-monofosfato; iP9G, N⁶-(A²isopentenil)adenina 9-glicosídeo.

A figura 4 mostra uma comparação de morfologia de broto do tipo selvagem e mutantes de ckx. Números de síliquas geradas por tipo selvagem e mutantes de ckx no caule principal durante um ciclo de vida. Plantas do tipo selvagem tinham formado 54,7 síliquas (100%). A altura de planta de mutantes do tipo selvagem e ckx de Arabidopsis no final do tempo de floração. A altura de plantas do tipo selvagem foi 39,5 cm (100%). Dados representam valores médios ± s.d. (n = 13-17). *, P<0,01 comparado com tipo selvagem; * = P < 0,01 comparado com ckx3.

A figura 5 mostra fenótipo de flor e rendimento de semente de mutantes de ckx. Flores de estágio 13 a, b, (a) e a ginoecia correspondente (b). Da esquerda para a direita são mostrados ckx3, ckx5 e ckx3 ckx5 do tipo selvagem, c, Superfície de pétala de mutantes de ckx, flores estágio 14, 39 DAG (n=30). D, Número de óvulos por gineceu (n=12). e, Rendimento de semente de ckx3 ckx5 do tipo selvagem sob condições de câmara de crescimento (n=30). Dados representam valores médios ± s.d. *, P < 0,01 comparado com tipo selvagem.

A figura 6 mostra o número de síliquas geradas por tipo selvagem e mutantes de ckx no caule principal durante um ciclo de vida (n = 15). Plantas do tipo selvagem tinham formado 54,7 síliquas (100%). Dados representam valores médios ± s.d. *, P < 0,01 em comparação com tipo selvagem. ’, P < 0,01 em comparação com ckx3.

A figura 7 mostra óvulos jovens de tipo selvagem e mutantes de ckx3 ckx5. Preparação de óvulos de acordo com Schneitz e outros. Barra de

55/59 escala: 10 pm. O número de óvulos é aumentado em mutantes de ckx3 ckx5 comparado com plantas do tipo selvagem.

Exemplos:

Métodos

Material de Planta e Condições de Crescimento

O ecotipo Columbia (Col-0) de Arabidopsis thaliana foi usado como o tipo selvagem. Os mutantes de inserção de T-DNA ckx2-S1 (SALK_068485), ckx3-S1 (SALK_050938), ckx4-S1 (SALK_055204), ckx5S1 (SALK_064309) e ckx6-S1 (SALK_070071) eram do Salk Institute Genomic Analysis Laboratory (Alonso e outros (2003) Science 301, 653-657), o mutante de inserção de transposon ckx4-Z era da coleção de transposon ZIGIA (Baumann, E., Lewaid, J., Saedler, H., Schulz, B., Wisman, E. (1998) Successful PCR-based reverse genetic screens using na Em-1-mutagenised Arabidopsis thaliana population generated via single-seed descente. Theoretical and Applied Genetics 97:729-734), ckx5-G2 (Line ID 332B10) e ckx7G1 (Line ID 363C02) eram da coleção GABI-KAT (Rosso, M.G., Li, Y., Strizhov, N., Reiss, B., Dekker, K., e Weisshaar, B. (2003) Plant Mol. Biol. 53, 247-259) e ckx7-T1 (SAIL 515 A07) eram do Torrey Mesa Research Institute (agora Syngenta). Para verificar o primer genômico de inserção de T-DNA 1 e primer da borda da esquerda, e encontrar linhagens homozigotas primers 1 e 2 foram usados (Tabela 1). Mutantes duplos foram obtidos através de cruzamento e inserções foram confirmadas através de PCR genômico com primer específicos de gene e de borda de T-DNA (Tabela 1). A linhagem mutante ckx4-Z não foi usada como uma contraparte de cruzamento. As plantas foram cultivadas na estufa em solo a 22°C sob condições de dia longo (16 h de luz/8 horas escuro). Para medição de rendimento de semente as plantas foram cultivadas em câmaras de crescimento (Percival AR66L) em solo a 24°C em ~100 pE e 65% de umidade sob condições de dia longo.

Análise de Expressão de CKX

RNA total foi extraído de mudas de acordo com Verwoerd e outros (Verwoerd e outros, 1989). O RNA foi tratado com DNase I livre de

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RNase (Fermentas, St. Leon-Rot, Alemanha) a 37°C per 30 minutos. Um microlitre de EDTA 25 mM foi adicionado a 65°C por 10 min. RNA (0,5 pg) foi usado para uma reação de RT-PCR. Todos os pares de primer usados atravessavam o respectivo sitio de inserção de T-DNA (Tabela 2). Em todas as reações de RT-PCR, os primers para Actina2 foram usados como controles. RT-PCR foi realizada com o One-Step RT-PCR kit (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. A PCR compreendida 35 ciclos de 30 s a 94°C, 30 s a 57°C e 2 min a 72°C.

Microscopia de Varredura de Elétron

Microscopia de varredura de elétron foi realizada conforme descrito por Krupková e outros (Krupková, E., Immerzeel, P., Pauly, M. e Schmülling, T. (2007) Plant J. 50, 735-750) usando um microscópio LEO 430 (Zeiss, Oberkochen, Alemanha).

Medição de Citocina

As plantas foram cultivadas em solo até que a inflorescência principal fosse de cerca de 10 cm de altura (aproximadamente 30 DAG). Para cada amostra —0,5 g de inflorescência com 15 flores de estágio 1 a estágio 5 (Smyth, D.R., Bowman, J.L. e Meyerowitz, E.M. (1990) Plant Cell 2, 755-767) foram agrupadas e cinco amostras independentes foram coletadas e analisadas quanto a cada genótipo. O teor de citocina foi determinado através de cromatografia líquida de alto desempenho-espectrometria de massa em tandem por eletropulverização (Novak, O., Nauserová, E., Amakorová, P., Dolezal, K., e Strnad, M. (2008) Phytochemistry 69, 2214-2224). Superfície da Pétala

A área das pétalas foi medida a partir de imagens digitais de órgãos dissecados com o programa Scion Image (Scion Corporation, Frederick, Maryland, USA). ---------------------------------------------------------------------------------------------- ----------Determinação da Altura Final da Planta e Parâmetros de Rendimento

A altura final da planta e o número de siliquas no caule principal foram determinados após o término da floração. Para análise de rendimento de semente, as plantas foram postas em bolsas de papel após o término da floração. Após as plantas terem sido mantidas secas por mais três semanas,

57/59 o peso da semente total foi determinado.

Microscopia de Luz

Para contagem e observação de óvulo ginoecias foram limpas e montadas conforme descrito (Malamy e Benfey, 1997). Todas as amostras 5 foram vistas com um microscópio Axioskop 2 plus (Zeiss, Jena, Alemanha).

Contagem e Estaqiamento de Óvulos

Óvulos de tipo selvagem e mutantes de ckx3 ckx5 foram preparados, analisados e estagiados conforme descrito em Schneitz e outros (1995). Desenvolvimento de óvulo do tipo selvagem em Arabidopsis thaliana: 10 um estudo de microscópio de luz de tecido montado integral limpo. Plant J. 7,/31-749.

Parecia que a capacidade do tecido da placenta em iniciar primórdio de óvulo é aumentada em mutantes de ckx3 ckxô comparado com plantas do tipo selvagem, resultando em número e densidade gerais maiores 15 de óvulos e sementes dentro dos carpelos.

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Iniciador da borda esquerda da inserção de T-DNA)	TGGTTCACOTAGTGGGCCATCG (Seq ID N°: 17)	TGGTTCACOTAGTGGGCCATCG (Seq ID N°: 20)	o u f- < U o Q p o CO < OJ 8 z u Q t-- E ^CT 8 ° η ω	GAGCGTCGGTCCCCACACTTCTATAC (Seq ID N°: 26)	TGGTTCACOTAGTGGGCCATCG (Seq ID N°: 29)	ATATTGACCATCATACTCATTGC (Seq ID N°: 32)	TGGTTCACOTAGTGGGCCATCG (Seq ID N°: 35)	ATATTGACCATCATACTCATTGC (Seq ID N°: 38)	GCCTTTTCAGAAATGGATAAATAGCCTTGCTTCC (Seq ID N°: 41)
Iniciador genômico 2	GCGAGCATGTCAACATTTCA (Seq ID N°: 16)_________	p b 8 u < - . r A g cr 8 cd b $2	o < < o < 9 04 §6- 8 - 3 cr ί Φ < co o TL,	CATAAACCCTGGAGCGAAACCTAGAG (Seq ID N°: 25)________	AATGGTATATTGTGATGACAGGTGAGATG (Seq ID N°: 28)	s □ u u u < u co ίοsz ÓQ o — Η ^σ□ Φ H (£.	TGTGGATTCCCCTGCTCCATA (Seq ID N°: 34)	COGAAAATCTACGGATGGTG (Seq ID N°: 37)	TTAGCCGTCCGATCAATCTC (Seq ID N°: 40)________________
Iniciador genômico 1	□ 5 o 5 £ IO O □ t ° < z ° Q CT ΰ Φ € ω	ckxJSI 1CAAAAGCCTCCCAATTGTC (Seq ID N°: 18)	o o u s Q H o t X--> U 8 CM 8 ό· Ú z U Q a cr 4 Φ 4 CO Μ X—z·	ckx4-Z CAAGGTAAAACTCAtACGCCATAACC (Seq ID N°: 24) i___________________	ckxS-SJ TTGTTGCAGCAACGAtCAACCGATAATGA (Seq ID N°: 27) ___________ ____	Q d o c c < o o s c c t Í o < co 8 3 ^H A Φ 4 ω *—	< o J— H O -o- 2 o < < u m , O co 8ÕJ <j Z «Q. *? cr « Φ -B co	o Õ υ μ < Ο j ο □ J CD 3 CO < — ò o — < CT « Φ 2 ω	u t— < u tΌ < O U < < Φ < < Ó < < <5 CD < co · U o Φ z . Q Í· σ <D 1 id

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Iniciador 2	Φ Ε Η < Ο Η ρ co 3 7 Ο Ζ ο Q υ ^—Η* Ο ο Φ < co	AATAGGTGGTTGTAAACGTAGACGCA (Seq ID Ν°: 45)	CAT A AACCCTGGAGCGA AACCTAG AG (Seq ID N°: 47)	CATAAACCCTGGAGCGAAACCTAGAG (Seq ID N°: 49)	CGCTGACGAAGAAGACGAC (Seq ID N°: 51)	AAATTCTTGGACCGGAGCTT (Seq ID N°: 53)	ACCCTGTCCAAGAATGCTTCA (Seq ID N°: 55)	CGGAAAATCTACGGATGGTG (Seq ID N°: 57)	CGGAAAATCTACGGATGGTG ' ----------- (Seq ID N°: 59)	GATTGATCCTCCGATCCAGA (Seq ID N°: 61)
Iniciador 1	ο ίο ό ίο ο F < < ο 0 Η Ο S? s°_z?^e A ST •δ β	ρ ο < <0 Ρ υ < < < < ΰ ο Ο V υ ν — . ^υ ζ ?*·> C Η α> ΐ co	ckx4-Sl CTCTGCCGCTTCTCACGACTTCGGTA (Seq ID N°: 46)	< F O o u F F U o u < u b b o o o O E ⁰⁰b u Q N — 4 cr k φ g co	o u < □ u F F U o U O < LO £ co '*^^z	L> υ < < o υ j — b H < < O CM L> IO < . . U o □ z 3 ~ ®. S CO	F < U o b E □ O o o P á o -j to o . . _ o z ÍM Q -? 5 ct 5 Φ <· CO	p □ r— < p < P Q O 5 u u .-, o CO < LO . . - o Z Λ cr * Φ co	u £ < < P u u —· o u o .-, O co < LO - . . — o Z I P Q b CT 5 Φ ^y co	u o o — o c - -r H O o < 0 o _, < o < co o . . < o -¹ z Q If

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Claims

1. Célula de planta isolada compreendendo um rompimento em pelo menos:

em que os ditos rompimentos inibem expressão e/ou atividade de um produto dos pelo menos dois genes de citocina oxidase/desidrogenase rompidos comparado com uma célula de planta controle correspondente sem tais rompimentos.

2. Planta transgênica compreendendo um rompimento em pelo menos:

em que os ditos rompimentos inibem expressão e/ou atividade de um produto dos pelo menos dois genes de citocina oxidase/desidrogenase rompidos comparado com uma planta controle correspondente sem tais rompimentos.

3. Célula de planta isolada, de acordo com a reivindicação 1, ou uma planta transgênica, de acordo com a reivindicação 2, compreendendo um rompimento em pelo menos:

i) um gene de CKX3 endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo

2/6 idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:1 ou um ortólogo do mesmo;

e ii) em pelo menos um gene endógeno adicional sendo:

a) um gene de CKX1 codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com SEQ ID Ν°Ί3 ou um ortólogo do mesmo;

b) um gene de CKX2 codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com SEQ ID N°:2 ou um ortólogo do mesmo;

c) um gene de CKX4 codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com SEQ ID N°:3 ou um ortólogo do mesmo;

d) um gene de CKX5 codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com SEQ ID N°:4 ou um ortólogo do mesmo;

e) um gene de CKX6 codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com SEQ ID N°:5 ou um ortólogo do mesmo;

ou

f) um gene de CKX7 codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com SEQ ID N°:6 ou um ortólogo do mesmo.

4. Célula de planta isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2 ou a planta transgênica de qualquer uma das reivindicações 2 e 3, em que pelo menos:

3/6

i) um gene de CKX3 endógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com SEQ ID N°:7 ou um ortólogo do mesmo;

e ii) pelo menos um gene endógeno adicional sendo:

a) um gene de CKX1 compreendendo uma sequência de ácido nucleico sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com SEQ ID N°:14 ou um ortólogo do mesmo;

b) um gene de CKX2 compreendendo uma sequência de ácido nucleico sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com SEQ ID N°:8 ou um ortólogo do mesmo;

c) um gene de CKX4 compreendendo uma sequência de ácido nucleico sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com SEQ ID N°:9 ou um ortólogo do mesmo;

d) um gene de CKX5 compreendendo uma sequência de ácido nucleico sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com SEQ ID N°:10 ou um ortólogo do mesmo;

e) um gene de CKX6 compreendendo uma sequência de ácido nucleico sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com SEQ ID N°:11 ou um ortólogo do mesmo;

ou

f) um gene de CKX7 compreendendo uma sequência de ácido nucleico sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com SEQ ID N°:12 ou um ortólogo do mesmo;

são rompidos.

5. Célula de planta isolada, de acordo com a reivindicação 1, ou a planta transgênica, de acordo com a reivindicação 2, em que:

i) pelo menos um gene de CKX3 endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:1 ou um ortólogo do mesmo;

e

4/6 ii) um gene de CKX5 endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:4 ou um ortólogo do mesmo, são rompidos.

6. Célula de planta isolada, de acordo com a reivindicação 4, ou a planta transgênica, de acordo com a reivindicação 4, em que:

i) um gene de CKX3 endógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:7 ou um ortólogo do mesmo;

e ii) um gene de CKX5 endógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:10 ou um ortólogo do mesmo;

são rompidos.

7. Célula de planta isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3, 4, 5, 6 ou a planta transgênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 3, 4, 5, 6, em que um, mais de um ou todos os rompimentos são facilitados pelo rompimento estrutural, supressão de gene de polinucleotídeo de antissentido, silenciamento de gene induzido por RNA de filamento duplo, técnicas de ribozima, rompimentos genômicos, tilling e/ou recombinação homóloga.

8. Célula de planta isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3, 4, 5, 6 e 7 ou a planta transgênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 3, 4, 5, 6 e 7, em que um, mais de um ou todos os rompimentos são rompimentos homozigotos.

9. Planta transgênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8, em que a planta é selecionada da família Brassicaceae, preferivelmente do gênero Brassica e Arabidopsis.

10. Célula, órgão, tecido ou material de propagação transgênico derivado da planta transgênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9.

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11. Método de aumento do rendimento de uma semente em uma planta e/ou aumento da altura da planta e/ou aumento da espessura do caule com relação a uma planta controle correspondente, o método compreendendo introdução em uma planta de um rompimento em pelo menos;

em que os ditos rompimentos inibem expressão e/ou atividade de um produto dos pelo menos dois genes de citocina oxidase/desidrogenase comparado com uma planta controle correspondente sem tais rompimentos.

12. Método para produção de uma planta com um rendimento de semente e/ou altura de planta aumentado com relação a uma planta controle correspondente compreendendo rompimento em uma planta de pelo menos:

e

ü) um gene endógeno adicional codificando uma citocina oxidase/desidrogenase e sendo diferente do gene definido em i);

em que os ditos rompimentos inibem expressão e/ou atividade de um produto dos pelomenos dois genes de cítocína oxídase/desidrogenase rompidos comparado com uma planta controle correspondente sem tais rompimentos.

13. Método, de acordo com a reivindicação 11, ou método de acordo com a reivindicação 12, em que pelo menos:

i) um gene de CKX3 endógeno codificando uma citocina oxi

6/6 dase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:1 ou um ortólogo do mesmo;

e ii) um gene de CKX5 endógeno codificando uma citocina oxidase/desidrogenase compreendendo uma sequência de polipeptídeo sendo idêntica a ou tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°:4 ou um ortólogo do mesmo, são rompidos.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, em que um, mais de um ou todos os rompimentos são rompimentos homozigotos.

15. Planta transgênica obtenível ou obtida através de qualquer um dos métodos 11 a 14.