CN102548393A - 脂肪性肝炎-肝癌模型动物 - Google Patents
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Abstract
本发明通过对实验用动物投予脏器炎症诱导剂而引起胰岛素抵抗性、进而使用高脂肪食物进行饲养，从而诱发脂肪肝。结果，对该动物成功地使其患有脂肪性肝炎。该动物显示与人类相类似的病理观察结果。通过使用该模型动物，可以有效地实施疾病的治疗或预防用物质的筛选以及药物的药效评价。
Description
技术领域
本发明涉及脂肪性肝炎和肝癌模型动物以及该动物的利用方法。
背景技术
一直以来，非酒精性脂肪性肝疾病被认为是不会有发展的良性疾病，但是已经清楚了尽管是非嗜酒者也会显示与酒精性肝炎相类似的炎症及肝纤维化的组织图像，是预后不良的疾病。特别是近年来，以肥胖、糖尿病等为背景的代谢综合症备受瞩目，非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholicsteatohepatitis：NASH)是该综合症之一的想法越来越多。但是，其机理并不清楚，仍未确立有效的治疗方法和治疗药剂。其中的一个原因在于由于人的生活习惯病是导致发病的原因、因而还未确立适当的实验动物。
发展成肝硬化、肝癌等致死性疾病的NASH病态的阐明对于有效的治疗方法及治疗药物的开发是必须的。但是，目前作为NASH模型小鼠用于研究的实验动物使用的是瘦素受体缺损小鼠(非专利文献1)、肝细胞特异性Pten缺损小鼠(非专利文献2)、视黄酸受体α的显性负性转基因小鼠(非专利文献3)等单一转基因小鼠或者通过喂食蛋氨酸-胆碱缺乏饲料(非专利文献4)等特殊饲料来诱发疾病的动物，但作为人类的病因，病态并非以如转基因小鼠那样的单一基因突变而发病和发展，而且很难认为是由于仅摄取了特殊的营养成分而导致的。另外，在这些小鼠中无法同时观察到胰岛素抵抗性和肝纤维化，在诱发纤维化的小鼠中在血清生化学分析中成为指标的ALT的上升很轻微，因而为了观察其病态，需要很多的小鼠组织切片，相反地由于ALT的上升显示显著高的值，因而认为与人类的病态是不同的。而且，由于病态在处置后会自然地治愈，药效判定中的试验及评价很难，为了开发NASH治疗方法及治疗药，期待开发符合人类临床病态的实验动物模型。
虽然进行了各种研究，但现状是并不存在显示与人类相类似病态的实验动物、且详细的病因及治疗方法的筛选很难。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Sahai A et al.，Am J Physiol Gastroentest Liver Physiol287：G1035，2004
非专利文献2：Horie Y et al.，J Clin Invest 113：1774，2004
非专利文献3：Yanagitani A et al.，Hepatology 40：366，2004
非专利文献4：Rinella M et al.，Journal ofHepatology 40：47，2004
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题在于提供显示与人类相类似的病理观察结果的脂肪性肝炎模型动物和肝癌模型动物以及该动物的利用方法。更具体地说，本发明的课题在于提供从胰岛素抵抗性变成脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝癌的模型动物的制作技术。
用于解决课题的手段
本发明人为了解决上述课题而进行了深入研究。本发明人通过向小鼠投予脏器炎症诱导剂以引发胰岛素抵抗性、进而使用高脂肪食物进行饲养，从而诱发脂肪肝。结果，成功地使该小鼠患上脂肪性肝炎。对该小鼠详细地进行研究，结果呈现以下的病理观察结果。
(1)在肝细胞中观察到大脂滴性的脂肪沉积，观察到肝细胞的气球样膨胀。
(2)可见炎症性细胞浸润。
(3)观察到以中央静脉为中心的纤维化。
上述病理观察结果是人类NASH(非酒精性脂肪性肝炎)的特征。即，本发明人通过上述手法首次成功地制作出了显示与人类的NASH相同病理观察结果的小鼠。
由本发明人制作的NASH模型动物与目前的模型动物相比，具有以下的不同点。
(1)肝细胞的脂肪变性、纤维化并非在门静脉周围进行，而是与人类的病理组织同样地以中央静脉为中心进行。
(2)虽然随着病态的发展观察到脂肪沉积、炎症细胞的消失，但还观察到仅在肝纤维化中观察到的人类的被称作“燃尽的NASH(burned-outNASH)”的病理组织图像。
本发明的模型动物可以说在不改变基因即可制成的方面具有特征。另外，本发明的模型动物是以均一的时程100％确实地发生与向人类NASH的发展和预后非常类似的病态的动物，是与人类的病态发展相一致的首个模型动物。而且，本发明的模型动物可以说在能够由胰岛素抵抗性同时观察到脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化的方面也发挥显著有利的效果。
而且，本发明人还首次发现了通过对上述NASH模型动物继续饲养，在肝硬化之后会发生肝癌。这与在人类中确认到的病态变化相同，通过该手法制作的动物作为人的肝癌模型动物是非常有用的。
人类的肝癌中，在肝表面显示隆起，但在投予化学物质制作的现有肝癌模型动物中，呈现的是在肝表面未形成隆起的肝癌。另一方面，本发明的模型动物可以在没有基因改变或药物投予等的情况下即可观察到与人类的肝癌同样的向肝表面的隆起，因而是接近人类肝癌的模型。而且，在化学物质投予中虽然未观察到肝硬化，但本发明的模型动物中呈现块状型的索状肝细胞癌，还观察到炎症性细胞的浸润、排挤正常肝细胞地发育而成的由肝硬化转变的肝癌。而且，成为肝癌发生起源的是显示与人类NASH非常类似的病态的大滴脂性的脂肪肝，由于会经历肝纤维化及肝硬化，因而是在到目前为止的报告中没有的、非常有用的模型动物。
如上所述，本发明人成功地制作出了显示与人类相类似的病理观察结果的脂肪性肝炎模型动物和肝癌模型动物，从而完成了本发明。通过使用这些模型动物，可以有效地实施疾病的治疗或预防用物质的筛选以及药物的药效评价。
本发明涉及由胰岛素抵抗性变成脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝癌的模型动物以及该动物的利用方法，更具体地说提供：
(1)一种脂肪性肝炎模型非人类动物，其是投予脏器炎症诱导剂而制作的；
(2)上述(1)所述的非人类动物，其中，所述脂肪性肝炎为非酒精性脂肪性肝炎；
(3)一种糖尿病模型非人类动物，其是投予脏器炎症诱导剂而制作的；
(4)上述(1)～(3)任一项所述的非人类动物，其中，所述脏器炎症诱导剂是N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷酶抑制剂；
(5)上述(1)～(4)任一项所述的非人类动物，其中，包含通过投予脏器炎症诱导剂并使用高脂肪食物进行饲养来产生脂肪肝的工序；
(6)上述(1)～(5)任一项所述的非人类动物，其中，所述非人类动物是小鼠；
(7)一种脂肪性肝炎模型非人类动物的生产方法，其包含对非人类动物的脏器诱导炎症的工序；
(8)一种脂肪性肝炎的治疗用或预防用物质的筛选方法，其包含以下的工序(a)和(b)：
(a)对上述(1)所述的脂肪性肝炎模型非人类动物投予待测物质的工序、
(b)评价对脂肪性肝炎的改善效果的工序；
(9)一种针对药物对脂肪性肝炎的改善的药效评价方法，其包含以下的工序(a)和(b)：
(a)对上述(1)所述的脂肪性肝炎模型非人类动物投予待测药物的工序、
(b)评价对脂肪性肝炎的改善效果的工序；
(10)一种糖尿病性疾病的治疗用或预防用物质的筛选方法，其包含以下的工序(a)和(b)：
(a)对上述(3)所述的糖尿病性疾病模型非人类动物投予待测物质的工序、
(b)评价对糖尿病性疾病的改善效果的工序；
(11)一种药物的用于治疗或预防糖尿病性疾病的药剂的副作用的风险评价方法，其包含以下的工序(a)和(b)：
(a)对上述(3)所述的糖尿病性疾病模型非人类动物投予待测药剂的工序、
(b)评价用于治疗或预防糖尿病性疾病的药剂的副作用的工序；
(12)一种肝癌模型非人类动物，其是进一步对上述(1)～(6)任一项所述的非人类动物进行饲养而制作的；
(13)上述(12)所述的非人类动物，其通过以下的病理学形态而在结构上具有特征：
(a)块状型的索状肝细胞癌
(b)炎症性细胞的浸润
(c)排挤正常肝细胞地发育而成的由肝硬化转变的肝癌
(14)一种肝癌的治疗用或预防用物质的筛选方法，其包含以下的工序(a)和(b)：
(a)对上述(12)或(13)所述的肝癌模型非人类动物投予待测物质的工序、
(b)评价对肝癌的治疗效果的工序；
(15)一种药物对肝癌治疗的药效评价方法，其包含以下的工序(a)和(b)：
(a)对上述(12)或(13)所述的肝癌模型非人类动物投予待测药物的工序、
(b)评价对肝癌的治疗效果的工序。
发明效果
为了制作与人类的发症病态相类似的实验动物，在小鼠中引起胰岛素抵抗性、进而使用高脂肪食物进行饲养，从而诱发脂肪肝。
将各周龄时的小鼠处死，以肝脏为中心，在病理组织学上对各脏器进行解析(HE染色、脂肪染色、巨噬细胞、成纤维细胞的免疫染色)，计算NAS(NAFLD活动度积分(NAFLD Activity Score)，参考文献：Kleiner DEet al.Hepatology.2005 Jun；41(6)：1313-21.)，详细地对病理图像进行研究。本发明的模型动物可以使用对人使用的NAFLD活动度积分进行NASH的判定，作为NASH模型动物是非常有用的。
另外，在血清生化学检查中使用FUJIFILM DRI-CHEM进行研究，基因表达分析使用takara Real-Time RT-PCR进行研究。
如上所述，本发明人成功地制作了显示与人类相同的病理观察结果的脂肪性肝炎模型动物(例如NASH模型动物)和肝癌模型动物。
本发明提供稳定且容易地制作下述动物的技术：通过在小鼠等实验用动物中引起胰岛素抵抗性并进行高脂肪食物负荷，从早期开始产生向脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化发展的与人类NASH相类似的病态，且自然地产生伴随所述病态发展的肝癌。
另外，该动物中由于可同时观察到糖尿病性疾病(糖尿病性肾炎、视网膜病变、高脂血症、动脉硬化症)，因此还提供可同时观察到代谢综合症的病态的实验动物制作技术。
另外，目前作为NASH模型常用的ob/ob、db/db小鼠等由于随着小鼠年龄增加，病态的形成并不恒定，为了判定正确的病态而需要小鼠病态的监测等，会产生为了用于实验的繁琐性。而且，由于病变也很难说是不可逆的，因而在药效效果的判定等中会产生困难(Horie Y et al.，J clin Invest113：1774-1783，2004、Yanagitani A et al.，Hepatology 40：366-375，2004、Anstee QM et al.，Int J Exp Path 87：1-16，2006)。但是，本发明的模型动物在至病态完成的发病期间是恒定的，而且伴随有不可逆的病态发展，因而可以解决上述问题。
本发明的模型动物可用于各种治疗药物的临床前试验，而且在药剂开发或成为治疗标的的靶的探索中也是非常有用的。
附图说明
图1是表示本发明的小鼠的血清的生化学检查结果的图。
图2是表示本发明的小鼠的肝脏的脂肪染色结果的照片。
图3是表示本发明的小鼠的肝脏的免疫组织染色结果的照片。
图4是表示本发明小鼠在20周龄时的肝脏的肝脏HE染色结果的照片。
图5是表示C57BL/6J肝脏的HE染色结果的照片及表示NAFLD活动度积分的曲线。
图6是表示C57BL/6J胰腺及脂肪组织F4/80的免疫染色结果的照片。
图7是表示8周龄时的BALB/c小鼠和C3H/HeN小鼠的肝脏F4/80及ER-TR7免疫染色结果的照片。
图8是20周龄时的C3H/HeN的肝癌的照片。
图9是表示由其他高脂肪食物负荷所产生的NASH模型小鼠的重现结果的照片。
图10是表示使用了NASH模型小鼠的药理效果试验的各结果的照片和曲线。1为表示组织学解析结果的照片、2为表示基因表达解析结果的曲线。
图11是表示糖尿病性并发症的发病的照片。1为糖尿病性肾病、2为糖尿病性视网膜病变(新生血管的免疫染色图像、CD31)的照片。
具体实施方式
本发明涉及通过引起胰岛素抵抗性而制作的脂肪性肝炎模型动物。
作为本发明的优选方式，提供通过投予脏器炎症诱导剂而制作的脂肪性肝炎模型动物(本说明书中有时记为“本发明的模型动物”)。
本发明的模型动物是通过对实验用动物投予脏器炎症诱导剂后、优选使用高脂肪食物作为饲料进行饲养而制作的。
本发明中使用的动物只要是通常作为实验动物使用的动物即可，没有特别限制，通常为非人类动物、优选为非人类脊椎动物、更优选为非人类哺乳动物、进一步优选为啮齿类。作为本发明的模型动物的制作中可使用的动物，具体地可举出小鼠、大鼠、兔子、狗、鸡、猴等(有时将这些动物仅记为“实验动物”)。
本发明的模型动物的制作中所使用的动物的遗传背景并无特别限定，可利用具有任意遗传背景的动物。通常可优选使用野生型的动物。
本发明中的脏器炎症诱导剂(本说明书中有时仅记为“药剂”)只要是具有广泛地直接或间接地对脏器诱导炎症的作用的药剂即可，并无特别限定。作为成为炎症诱导对象的脏器，例如可举出胰腺、脂肪组织、肌肉组织等。另外，本发明的脏器炎症诱导剂中还包含直接或间接地对末梢组织诱导炎症的药剂等。
作为本发明的脏器炎症诱导剂，优选地可举出N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷酶抑制剂。
作为本发明模型动物的优选方式，通过对上述实验动物投予N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷酶抑制剂来制作。作为该抑制剂，例如可举出链脲佐菌素、朋纳克(Pugnac)等。
另外，具有N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷酶抑制活性的核酸也可作为本发明的药剂使用。具体地可以举出抑制O-GlcNAcase基因(GenBank登录号：NM 023799.3)的表达的siRNA、该基因的反义基因或以该基因为靶的核酶等。
在本发明的模型动物的制作中，脏器炎症诱导剂的投予方式并无特别限定。例如可举出皮下投予(皮下注射等)、静脉投予、经口投予、腹腔投予等。
投予的药剂的量在例如为链脲佐菌素时通常为50～500μg、优选为100～300μg、更优选为200μg，但并不限定为这些量。
投予药剂的时机通常在出生后1～5日龄(新生仔期、优选1～5天、更优选2天)、优选是出生后2日龄。
如上所述，通过投予药剂，可以引起胰岛素抵抗性。本发明的模型动物的制作中，优选在如上所述投予药剂后进行饲养。通常该饲养优选使用高脂肪食物作为饲料。高脂肪食物可以利用通常作为动物用饲料市售的各种食物。
作为上述高脂肪食物的主要成分，例如可举出粗脂肪、粗蛋白质、粗纤维、粗灰分、可溶性无氮物、水分。本发明中使用的高脂肪食物并无特别限定，粗脂肪含量为20％以上、优选为30％以上，脂肪来源的卡路里占总卡路里的比例通常为50％以上、优选为60％以上。另外，配合在高脂肪食物中的成分例如可举出粉末牛脂、乳酪蛋白、蛋白粉、L-胱氨酸、红花油、结晶纤维素、麦芽糊精、乳糖、蔗糖等，这些物质是高脂肪食物成分的一例，并非必须含有这些物质。
上述高脂肪食物并无特别限定，例如可举出粗脂肪含量高于通常食物(例如高约30％以上)的食物。举出一例时，可举出作为研究用动物饲料市售的High Fat Diet32(日本CLEA公司制)、D12492(Research Diets公司制)等。
对于上述高脂肪食物，例如为小鼠时，通常在2～6周龄时、优选在3～5周龄时、更优选在4周龄时开始投予。另外，每次高脂肪食物的量例如为小鼠时是3～6克左右。通常优选使用高脂肪食物作为饲料饲养1周以上。本领域技术人员可考虑所使用的实验动物的种类、大小、体重等来适当调整(增减)高脂肪食物的量。通过使用高脂肪食物进行饲养，可以诱发脂肪肝。因而，本发明的优选方式中，提供包含通过投予脏器炎症诱导剂并使用高脂肪食物进行饲养来产生脂肪肝的工序的脂肪性肝炎模型动物。
通过上述手法制作的动物呈现脂肪性肝炎的症状，作为脂肪性肝炎模型动物是有用的。本发明的模型动物的特征在于同时呈现在通过本发明方法制作的动物中所观察到的病态。优选的特征是同时呈现胰岛素抵抗性和/或肝纤维化，但并不仅限定于这些病态。
本发明模型动物的优选方式中，由于可以同时观察到糖尿病性疾病(糖尿病性肾炎、视网膜病变、高脂血症、动脉硬化症)，因而具有还可同时观察到代谢综合症的病态的特征。
另外，本发明的模型动物由于具有病态不会自然被治愈的特征，因而可适合用于药效判定的试验或评价中。
作为本发明模型动物的优选方式，上述脂肪性肝炎为非酒精性肝炎(NASH)。即，本发明提供投予脏器炎症诱导剂而制作的非酒精性肝炎(NASH)模型动物。该动物具有以下特征：以均一的时程确实地发生与向人类NASH的发展和预后非常类似的病态。
本发明优选方式中的非酒精性肝炎模型动物呈现以下中的至少一个(优选全部)的病理观察结果。
(1)肝细胞中观察到大脂滴性的脂肪沉积、观察到肝细胞的气球样膨胀。
(2)可见炎症性细胞浸润。
(3)观察到以中央静脉为中心的纤维化。
因而，作为本发明模型动物的优选方式，是通过上述病理学形态而在结构上带有特征的模型动物。
本发明的上述脂肪性肝炎模型动物通过直接继续进行饲养，呈现肝硬化、进而呈现肝癌。因而，本发明的脂肪性肝炎模型动物例如作为肝硬化或肝癌模型动物的制作用动物(起始材料)也是有用的。即，本发明提供包含本发明脂肪性肝炎模型动物而成的肝硬化或肝癌模型动物制作用材料。
通过上述方法制作本发明模型动物的方法也包含在本发明中。作为本发明的优选方式，提供包含向非人类动物投予脏器炎症诱导剂的工序的脂肪性肝炎模型动物的生产方法。
另外，通过利用本发明的模型动物，还可筛选脂肪性肝炎的治疗或预防用物质。即，本发明提供包含以下的工序(a)和(b)的脂肪性肝炎的治疗用或预防用物质的筛选方法。
(a)对本发明的脂肪性肝炎模型动物投予待测物质的工序
(b)评价对脂肪性肝炎的改善效果的工序
作为本方法中使用的待测物质，并无特别限定。例如可举出天然化合物、有机化合物、无机化合物、蛋白质、肽等单一化合物、以及化合物库、基因库的表达产物、细胞提取物、细胞培养上清、发酵微生物产物、海洋生物提取物、植物提取物等，但并不限定于这些。
本发明方法中的待测物质或药物的投予并无特别限定，例如可通过经口或注射等来进行。当待测物质为蛋白质时，例如还可以构建具有编码该蛋白质的基因的病毒载体、利用其感染力将该基因导入到本发明的模型动物中。
工序(b)中改善效果的评价可以通过研究该模型动物所呈现的病理观察结果来判定脂肪性肝炎是否有所改善。
脂肪性肝炎的病理观察结果例如可举出上述的病理观察结果(病理学形态)。本发明中的“改善”是指脂肪性肝炎的症状恢复到正常的状态或者症状有所缓和。本领域技术人员可以以本说明书所记载的病理观察结果为指标，对模型动物适当判定脂肪性肝炎的症状是否有所改善。
本发明的方法中，选择在上述工序(b)中显示改善效果的待测物质作为脂肪性肝炎的治疗或预防用物质。
另外，通过利用本发明的模型动物，还可进行针对药物对脂肪性肝炎的改善的药效评价。即，本发明提供包含以下的工序(a)和(b)的针对药物对脂肪性肝炎的改善的药效评价方法。
(a)向本发明的脂肪性肝炎模型动物投予待测药物的工序
(b)评价对脂肪性肝炎的改善效果的工序
可通过上述方法进行药效评价的药物的种类并无特别限定，例如可举出公知的各种药剂(低分子化合物、蛋白质、核酸等)。
对于待测药物，当可见对脂肪性肝炎的改善效果时，则判定该药物对脂肪性肝炎具有治疗效果。
另外，本发明的模型动物具有以下特征：在呈现脂肪性肝炎的同时还呈现作为并发症产生的糖尿病性疾病(糖尿病性肾炎、视网膜病变等)。因而，本发明的模型动物作为糖尿病模型动物是有用的。
即，本发明提供投予脏器炎症诱导剂而制作的糖尿病模型非人类动物。使用本发明的糖尿病模型动物，可以进行对糖尿病并发症(糖尿病性肾炎、视网膜病变等)的治疗或预防药的开发。例如，通过向本发明的糖尿病模型动物投予待测物质，探讨糖尿病性疾病的改善效果，从而能够筛选用于糖尿病性疾病的治疗或预防的候选化合物。
作为本发明的优选方式，涉及含有以下的工序(a)和(b)的糖尿病性疾病的治疗用或预防用物质的筛选方法。
(a)向本发明的糖尿病性疾病模型非人类动物投予待测物质的工序
(b)评价对糖尿病性疾病的改善效果的工序
NASH患者中糖尿病患者很多，具有各种并发症。本发明的模型动物由于患有糖尿病性并发症，因而作为能够早期判断在临床治验中发觉的副作用等风险的模型动物是非常有用的。
即，本发明提供使用了本发明糖尿病模型动物的药品的副作用的风险评价方法。
作为本发明方法的优选方式，涉及包含以下的工序(a)和(b)的药物的用于治疗或预防糖尿病性疾病的药剂的副作用的风险评价方法。
(a)向本发明的糖尿病性疾病模型非人类动物投予待测药剂的工序
(b)评价用于治疗或预防糖尿病性疾病的药剂的副作用的工序
另外，由本发明人首次发现了本发明的上述脂肪性肝炎模型动物通过直接继续进行饲养，在经历肝硬化后进一步呈现肝癌。因而，本发明提供进一步对上述脂肪性肝炎模型动物进行饲养而制作的肝硬化或肝癌模型动物。
作为本发明的优选方式，涉及对投予脏器炎症诱导剂制作的脂肪性肝炎模型动物进一步进行饲养而制作的肝癌模型动物。
本发明的上述脂肪性肝炎模型动物在之后呈现肝硬化，通过直接进一步继续饲养，可以制作肝癌模型动物。该模型动物的制作中，肝硬化后进行饲养的期间例如以实验动物为小鼠时为例，通常为2-20周以上、优选为10周以上。
本发明的肝癌模型动物例如通过选自以下中的至少一个(优选全部)的病理观察结果(病理学形态)而在结构上带有特征。
(a)块状型的索状肝细胞癌
(b)炎症性细胞的浸润
(c)排挤正常肝细胞地发育而成的由肝硬化转变的肝癌
具有上述特征的肝癌模型动物与现有的投予化学物质(致癌物质)制作的肝癌模型动物在显示上述病理学形态的方面，结构上有所不同。
通过利用本发明的上述肝癌模型动物，可以实施肝癌的治疗用或预防用物质的筛选。
作为本发明上述方法的优选方式，可举出包含以下的工序(a)和(b)的肝癌的治疗用或预防用物质的筛选方法。
(a)向本发明的肝癌模型动物投予待测物质的工序
(b)评价对肝癌的治疗效果的工序
上述方法中治疗效果的评价例如可以以上述肝癌的病理观察结果为指标来适当实施。例如在投予了待测物质的本发明的模型动物中，当块状型的索状肝细胞癌消失时，则判定待测物质具有肝癌治疗效果。
另外，本发明通过利用本发明的肝癌模型动物，可以进行药物对肝癌治疗的药效评价。作为该方法的优选方式，例如可举出包含以下的工序(a)和(b)的方法。
(a)向本发明的肝癌模型动物投予待测药物的工序
(b)评价对肝癌的治疗效果的工序
此外，本说明书中所引用的所有现有技术文献作为参考纳入本说明书中。
实施例
以下通过实施例具体地说明本发明，但本发明并不限定于这些实施例。
(实施例1)NASH模型动物和肝癌模型动物的制作
(a)NASH模型小鼠的制作
对妊娠C57BL6J/JJcl、C3H/HeNJcl、BALB/cByJJcl(日本CLEA公司制)、C57BL6J/NCrlCrlj(日本Charles River公司制)进行饲养、使其生产。对出生后2日龄的C57BL6J/JcL、BALB/cByJJcl、C3H/HeNJcl小鼠雄性(日本CLEA公司制)的各个胰腺β细胞的N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷酶(O-GlcNAcase)特异性地赋予细胞毒性(例如以20μL/只皮下注射链脲佐菌素10mg/mL(SIGMA公司制)等)，对胰腺赋予炎症，直接或间接地对末梢组织引起炎症，从而引起胰岛素抵抗性。给予CE-2(日本CLEA公司制)的饲料、灭菌水进行饲养直至4周龄，满4周龄时断奶后，给予粗脂肪含量高于通常食物(或高约30％以上的)High Fat Diet食物(日本CLEA公司制)或D12492(Research Diets公司制)、灭菌水，饲养至20周龄。
(b)组织学研究
在各周龄下，使小鼠禁食24小时后，在乙醚麻醉下处死、采血，使用OCT化合物(sakura fine technical公司制)将各脏器冷冻后切片，进行病理学解析。本模型中，在血清生化学的检查中，与正常个体群相比，空腹时血糖、丙氨酸转氨酶(ALT)及中性脂肪的值高，患有胰岛素抵抗性及高脂血症(图1)。组织学上，在5周龄时观察到伴随肝细胞膨胀的明显的脂肪肝，在8周龄时肝脏内的脂肪基本消失，显示与人的燃尽的NASH相同的组织学病态发展(图2)。在6周龄时，在肝脏内观察到以巨噬细胞为代表的炎症性细胞的浸润和集簇，纤维化以肝脏的中央静脉为中心发展。进而，当观察经时变化时，8周龄时纤维化以将中心动脉连接的方式发展、10周龄时显示再生结节的形成、成为肝硬化状态(图3)。另外，由病理组织图像计算NAS的结果是NASH期的平均值为5，由该值的变化还可判定药理效果(图5)。
而且，本小鼠的NASH发病机理是以胰腺中的炎症为诱因，诱发作为末梢组织的肝脏或脂肪组织中的慢性炎症，显示胰岛素抵抗性，通过全身性炎症的持续而达到脂肪肝(图6)。之后，随着小鼠年龄的增长，再生结节肥大化，在20周龄时观察到炎症性细胞的浸润、异形肝细胞的增加及排挤正常肝细胞地发育而成的癌(图4)。另外，在其他体系小鼠中也可在组织学上使NASH病变-肝癌发病(图7、8)，即便改变可具有的高脂肪食物也可重现NASH病变(图9)。
另外，使用本模型，将作为高血压治疗药的血管紧张素受体拮抗剂(ARB)经口投予2周，尝试NASH治疗。结果，与临床上的报告相一致(Georgescu E.F.et al.，15：942)，ARB投予组与未治疗组相比，观察到肝脏的组织学上的改善及基因检查中的炎症及纤维化的改善效果，显示与临床很高的相同性(图10)。
进而，由于在本模型小鼠中还同时引起了脂肪组织中的炎症，因而胰岛素抵抗性进一步增强，通过慢性的高血糖的持续，呈现由于细小血管障碍等所导致的糖尿病疾病的并发症(糖尿病性肾病、视网膜病变、神经障碍)。因而，对于其他脏器中的病变详细地进行探讨时，在10周龄时观察到以炎症性巨噬细胞及成纤维细胞在肾小球体内及周围的集聚为特征的肾小球纤维化及间质性纤维化，发生了糖尿病性肾病(图11)。另外，在20周龄时的眼中使用CD31抗体探讨新生血管的形成时，本模型小鼠中在视网膜中观察到它们的过形成，呈现糖尿病性视网膜病变(图11)。
由以上可知，通过本发明，可以提供从脂肪肝至肝癌的NASH模型动物。通过这些动物，可以促进人类NASH的病因和病态解析以及其治疗技术、治疗药物等的开发。
产业上的可利用性
作为脂肪蓄积在肝脏上的原因，可举出酒精、肥胖、糖尿病、脂质代谢异常、药剂、高度的营养不良等，大致可分类为酒精性及非酒精性。认为该酒精性脂肪肝会发展成肝炎、肝纤维症、肝硬化，而非酒精性则停留于脂肪肝、病态不会发展。但是，在90年代后半期，在欧美国家随着肥胖人口的增加和疾病概念的普及，成为继C型肝炎、酒精性肝炎之后的频率很高的疾病，据报道该病态也会进一步发展成肝硬化、进而肝癌，因而备受关注。在日本，以遗传性的胰岛素分泌不足为背景，由于饮食生活的欧美化、运动不足，肥胖人口有所增加，同时被诊断为NASH的患者数也有增加的倾向。因此需要尽早准备并确立NASH治疗方法及治疗药剂。
本发明与人类的NASH病态的发展状态非常类似，还可以依据治疗对象决定对胰岛素抵抗性、脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纤维、肝硬化阶段进行解析的时期。另外，通过探索与由各阶段发展相关的病因，对人类NASH及肝纤维化、肝硬化的全新的治疗方法和治疗药剂、生物标记物的开发也可以作出贡献，还可以探讨NASH病变中的药物动力学。另外，由于最终会发展成肝癌，因而还可探讨抑制癌等药剂、肝癌发病机理、肝癌确立过程中的靶分子药物的探索。
而且，除了上述之外，由于还可同时解析糖尿病性疾病，因而不仅对肝脏、对作为生物个体的全身性病变的关联性及其治疗方法和治疗药剂、生物标记物的开发等也可作出很大贡献。
Claims (15)
1.一种脂肪性肝炎模型非人类动物，其是投予脏器炎症诱导剂而制作的。
2.根据权利要求1所述的非人类动物，其中，所述脂肪性肝炎为非酒精性脂肪性肝炎。
3.一种糖尿病模型非人类动物，其是投予脏器炎症诱导剂而制作的。
4.根据权利要求1～3任一项所述的非人类动物，其中，所述脏器炎症诱导剂为N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷酶抑制剂。
5.根据权利要求1～4任一项所述的非人类动物，其中，包含通过投予脏器炎症诱导剂并使用高脂肪食物进行饲养来产生脂肪肝的工序。
6.根据权利要求1～5任一项所述的非人类动物，其中，所述非人类动物为小鼠。
7.一种脂肪性肝炎模型非人类动物的生产方法，其包含对非人类动物的脏器诱导炎症的工序。
8.一种脂肪性肝炎的治疗用或预防用物质的筛选方法，其包含以下的工序(a)和(b)：
(a)向权利要求1所述的脂肪性肝炎模型非人类动物投予待测物质的工序；
(b)评价对脂肪性肝炎的改善效果的工序。
9.一种针对药物对脂肪性肝炎的改善的药效评价方法，其包含以下的工序(a)和(b)：
(a)向权利要求1所述的脂肪性肝炎模型非人类动物投予待测药物的工序；
(b)评价对脂肪性肝炎的改善效果的工序。
10.一种糖尿病性疾病的治疗用或预防用物质的筛选方法，其包含以下的工序(a)和(b)：
(a)向权利要求3所述的糖尿病性疾病模型非人类动物投予待测物质的工序；
(b)评价对糖尿病性疾病的改善效果的工序。
11.一种药物的用于治疗或预防糖尿病性疾病的药剂的副作用的风险评价方法，其包含以下的工序(a)和(b)：
(a)向权利要求3所述的糖尿病性疾病模型非人类动物投予待测药剂的工序；
(b)评价用于糖尿病性疾病的治疗或预防的药剂的副作用的工序。
12.一种肝癌模型非人类动物，其是对权利要求1～6任一项所述的非人类动物进一步进行饲养而制作的。
13.根据权利要求12所述的非人类动物，其通过以下的病理学形态而在结构上带有特征：
(a)块状型的索状肝细胞癌、
(b)炎症性细胞的浸润、
(c)排挤正常肝细胞地发育而成的由肝硬化转变的肝癌。
14.一种肝癌的治疗用或预防用物质的筛选方法，其包含以下的工序(a)和(b)：
(a)向权利要求12或13所述的肝癌模型非人类动物投予待测物质的工序；
(b)评价对肝癌的治疗效果的工序。
15.一种针对药物对肝癌治疗的药效评价方法，其包含以下的工序(a)和(b)：
(a)向权利要求12或13所述的肝癌模型非人类动物投予待测药物的工序；
(b)评价对肝癌的治疗效果的工序。
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