KR101761078B1 - 지방성 간염-간암 모델 동물 - Google Patents

Abstract

실험용 동물에 장기 염증 유도제를 투여하여 인슐린 저항성을 야기시키고, 또한 고지방식을 이용하여 사육함으로써 지방간을 유발시켰다. 그 결과, 당해 동물에 대하여 지방성 간염을 발증시키는 데에 성공하였다. 상기 동물은 인간과 유사한 병리 소견을 나타낸다. 상기 모델 동물을 사용함으로써, 질환의 치료 또는 예방용 물질의 스크리닝, 및 약물의 약효 평가를 효과적으로 실시할 수 있다.

Description

지방성 간염-간암 모델 동물{STEATOHEPATITIS-LIVER CANCER MODEL ANIMAL}

본 발명은 지방성 간염 및 간암 모델 동물, 및 상기 동물의 이용 방법에 관한 것이다.

종래, 비알코올성 지방성 간질환은 진전되지 않는 양성의 질환이라고 여겨져 왔으나, 비음주가임에도 불구하고 알코올성 간염과 유사한 염증 및 간 섬유화의 조직상을 나타내는 것으로 밝혀졌고, 예후 불량의 질환인 것으로 알려져 있다. 특히 최근 들어, 비만, 당뇨병 등을 배경으로 하는 대사 증후군(Metabolic Syndrome)이 주목을 받아, 비알코올성 지방성 간염(nonalcoholic steatohepatitis: NASH)은 그의 증후군의 하나라는 생각이 퍼지고 있다. 그러나, 그 메카니즘은 불명확하며, 또한 효과적인 치료법·치료 약제가 확립되어 있지 않다. 그의 일단의 원인은 인간의 생활 습관병을 발증의 기반으로 하기 때문에 적당한 실험 동물이 확립되어 있지 않기 때문이다.

간경변, 간암 등 치사성 질환으로 진전되는 NASH의 병태의 해명은 효과적인 치료법 및 치료약의 개발에 필수이다. 그러나 현재 NASH 모델 마우스로서 연구에 이용되고 있는 실험 동물에서는 렙틴 수용체 결손 마우스(비특허문헌 1), 간 세포 특이적 Pten 결손 마우스(비특허문헌 2), 레티노산 수용체 α의 우성 저해형 유전자 개변 마우스(비특허문헌 3) 등의 단일 유전자 개변 마우스나 메티오닌-콜린 결핍식(비특허문헌 4) 등의 특수한 먹이를 제공함으로써 유발되는 것이 이용되고 있지만, 인간의 병인으로서는 유전자 개변 마우스와 같은 단일 유전자 변이로 병태가 발증 진행하는 것은 아니고, 또한 특수한 영양 성분만을 섭취하고 있기 때문이라고는 생각하기 어렵다. 또한, 이들 마우스에서는 인슐린 저항성 및 간섬유화를 동시에 관찰할 수는 없고, 또한 섬유화를 유발하는 마우스에서는 혈청 생화학적인 해석에 있어서 지표가 되는 ALT의 상승이 경미하기 때문에 그의 병태를 관찰하기 위해서는 다수의 마우스 조직편이 필요하고, 또한 반대로 ALT의 상승이 현저히 높은 값을 나타내기 때문에 인간의 병태와는 다른 것이라고 생각된다. 또한, 병태가 처치 후 자연스럽게 치유되기 때문에, 약효 판정에서의 시험 및 평가가 곤란하고, NASH 치료법 및 치료약의 개발을 위해서는 인간의 임상 병태에 의거한 실험 동물 모델의 개발이 요망된다.

여러가지 연구가 행해지고 있지만, 인간과 유사한 병태를 나타내는 실험 동물이 존재하지 않아, 상세한 병인 및 치료법의 스크리닝이 곤란한 상황이다.

Sahai A et al., Am J Physiol Gastroentest Liver Physiol 287: G1035, 2004 Horie Y et al., J Clin Invest 113: 1774, 2004 Yanagitani A et al., Hepatology 40: 366, 2004 Rinella M et al., Journal of Hepatology 40: 47, 2004

본 발명은 인간과 유사한 병리 소견을 나타내는 지방성 간염 모델 동물, 및 간암 모델 동물, 및 상기 동물의 이용 방법의 제공을 과제로 한다. 보다 구체적으로는, 인슐린 저항성으로부터 지방간, 지방성 간염, 간섬유화, 간경변, 간암이 되는 모델 동물의 제작 기술의 제공을 과제로 한다.

본 발명자는 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 행하였다. 본 발명자는 마우스에 장기 염증 유도제를 투여하여 인슐린 저항성을 야기시키고, 또한 고지방식을 이용하여 사육함으로써 지방간을 유발시켰다. 그 결과, 해당 마우스에 대하여 지방성 간염을 발증시키는 데에 성공하였다. 해당 마우스를 상세히 검토한 바, 이하와 같은 병리 소견을 나타내었다.

(1) 간 세포에서 대수포성(macrovesicular)의 지방 침착이 관찰되고, 간 세포의 풍선 유사 팽화(ballooning)가 관찰되었다.

(2) 염증성 세포 침윤이 보였다.

(3) 중심 정맥을 중심으로 한 섬유화가 관찰되었다.

상기 병리 소견은 인간의 NASH(비알코올성 지방성 간염)에 특징적인 것이다. 즉 본 발명자는 상기 수법에 의해 인간의 NASH와 유사한 병리 소견을 나타내는 마우스의 작출에 처음으로 성공하였다.

본 발명자에 의해 제작된 NASH 모델 동물은 지금까지의 모델 동물과 비교하여 이하와 같은 차이점을 갖는다.

(1) 간 세포의 지방 변성, 섬유화가 문맥 주위가 아닌, 인간의 병리 조직과 마찬가지로 중심 정맥을 중심으로 진행되어 간다.

(2) 병태의 진행에 따라 지방 침착, 염증 세포의 소실이 관찰되지만, 간섬유화만이 관찰되는 인간의 "burned-out NASH"라 불리는 병리 조직상도 관찰된다.

본 발명의 모델 동물은 유전자 개변하지 않고 제조되는 점에서 특징적인 것이라 할 수 있다. 또한, 본 발명의 모델 동물은 인간의 NASH로의 진행과 예후가 매우 유사한 병태를 균일한 타임 코스로 100％ 확실하게 발증하는 동물이고, 인간의 병태 진행과 일치하는 최초의 모델 동물이다. 또한, 본 발명의 모델 동물은 인슐린 저항성으로부터 지방간, 지방성 간염, 간섬유화, 간경변을 동시에 관찰할 수 있다는 점에서도 현저한 유리한 효과를 발휘한다고 할 수 있다.

또한, 본 발명자는 상기 NASH 모델 동물에 대하여 사육을 더 계속함으로써, 간경변 후에 간암이 발증하는 것을 새롭게 발견하였다. 이것은 인간에서 확인되어 온 병태 변화와 동일한 것으로, 당해 수법에 의해 제작되는 동물은 인간의 간암 모델 동물로서 매우 유용하다.

인간의 간암에서는 간 표면에 융기를 나타내지만, 화학 물질을 투여하여 제작되는 종래의 간암 모델 동물에서는 간 표면에 융기를 형성하지 않는 간암을 나타낸다. 한편, 본 발명의 모델 동물은 유전자 개변이나 약물 투여 등을 하지 않고 인간의 간암과 마찬가지로 간 표면으로의 융기가 관찰되기 때문에, 인간의 간암에 보다 가까운 모델이다. 또한, 화학 물질 투여로는 간경변이 관찰되지 않지만, 본 발명의 모델 동물에서는 괴상형의 삭상 간세포암을 나타내고, 또한 염증성 세포의 침윤, 정상 간 세포를 압배(壓排)하도록 발육한 간경변 유래의 간장암이 관찰된다. 또한, 간암으로의 발생 모지(母地)가 되는 것은 인간의 NASH와 매우 유사한 병태를 나타내는 대수포성의 지방간이고, 간섬유화 및 간경변을 거치기 때문에 지금까지의 보고에는 없는 매우 유용한 모델 동물이다.

상술한 바와 같이 본 발명자는 인간과 유사한 병리 소견을 나타내는 지방성 간염 모델 동물 및 간암 모델 동물의 작출에 성공하여 본 발명을 완성시켰다. 이들 모델 동물을 사용함으로써, 질환의 치료 또는 예방용 물질의 스크리닝 및 약물의 약효 평가를 효과적으로 실시할 수 있다.

본 발명은 인슐린 저항성으로부터 지방간, 지방성 간염, 간섬유화, 간경변, 간암이 되는 모델 동물 및 상기 동물의 이용 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는,

〔1〕 장기 염증 유도제를 투여하여 제작되는 지방성 간염 모델 비인간 동물,

〔2〕 상기 지방성 간염이 비알코올성 지방성 간염인, 〔1〕에 기재된 비인간 동물,

〔3〕 장기 염증 유도제를 투여하여 제작되는 당뇨병 모델 비인간 동물,

〔4〕 상기 장기 염증 유도제가 N-아세틸-β-D-글루코사미니다아제 저해제인, 〔1〕 내지〔3〕 중 어느 한 항에 기재된 비인간 동물,

〔5〕 장기 염증 유도제를 투여하고, 고지방식을 이용하여 사육함으로써 지방간을 생기게 하는 공정을 포함하는, 〔1〕 내지〔4〕 중 어느 한 항에 기재된 비인간 동물,

〔6〕 상기 비인간 동물이 마우스인, 〔1〕 내지〔5〕 중 어느 한 항에 기재된 비인간 동물,

〔7〕 비인간 동물의 장기에 염증을 유도하는 공정을 포함하는, 지방성 간염 모델 비인간 동물의 생산 방법,

〔8〕 이하의 공정 (a) 및 (b)를 포함하는, 지방성 간염의 치료용 또는 예방용 물질의 스크리닝 방법,

(a) 〔1〕에 기재된 지방성 간염 모델 비인간 동물에게 피검 물질을 투여하는 공정

(b) 지방성 간염에 대한 개선 효과를 평가하는 공정

〔9〕 이하의 공정 (a) 및 (b)를 포함하는, 약물의 지방성 간염의 개선에 대한 약효 평가 방법,

(a) 〔1〕에 기재된 지방성 간염 모델 비인간 동물에 피검 약물을 투여하는 공정

(b) 지방성 간염에 대한 개선 효과를 평가하는 공정

〔10〕 이하의 공정 (a) 및 (b)를 포함하는, 당뇨병성 질환의 치료용 또는 예방용 물질의 스크리닝 방법,

(a) 〔3〕에 기재된 당뇨병성 질환 모델 비인간 동물에 피검 물질을 투여하는 공정

(b) 당뇨병성 질환에 대한 개선 효과를 평가하는 공정

〔11〕 이하의 공정 (a) 및 (b)를 포함하는, 약물의 당뇨병성 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제에서의 부작용의 리스크 평가 방법,

(a) 〔3〕에 기재된 당뇨병성 질환 모델 비인간 동물에 피검 약제를 투여하는 공정

(b) 당뇨병성 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제의 부작용을 평가하는 공정

〔12〕 〔1〕 내지〔6〕 중 어느 한 항에 기재된 비인간 동물을 더 사육하여 제작되는, 간암 모델 비인간 동물,

〔13〕 이하의 병리학적 형태에 의해 구조적으로 특징지워지는, 〔12〕에 기재된 비인간 동물,

(a) 괴상형의 삭상 간세포암

(b) 염증성 세포의 침윤

(c) 정상 간 세포를 압배하도록 발육한 간경변 유래의 간장암

〔14〕 이하의 공정 (a) 및 (b)를 포함하는, 간암의 치료용 또는 예방용 물질의 스크리닝 방법,

(a) 〔12〕 또는 〔13〕에 기재된 간암 모델 비인간 동물에 피검 물질을 투여하는 공정

(b) 간암에 대한 치료 효과를 평가하는 공정

〔15〕 이하의 공정 (a) 및 (b)를 포함하는, 약물의 간암 치료에 대한 약효 평가 방법,

(a) 〔12〕 또는 〔13〕에 기재된 간암 모델 비인간 동물에 피검 약물을 투여하는 공정

(b) 간암에 대한 치료 효과를 평가하는 공정

을 제공하는 것이다.

인간의 발증 병태와 유사한 실험 동물 제작을 위해, 마우스에 인슐린 저항성을 야기하고, 또한 고지방식을 이용하여 사육함으로써 지방간을 유발하였다.

각 주령 시의 마우스를 도살하여, 간장을 중심으로 각 장기를 병리 조직학적으로 해석하고(HE 염색, 지방 염색, 마크로파지, 섬유 아세포의 면역 염색), NAS (NAFLD Activity Score, 참고 문헌: Kleiner DE et al. Hepatology. 2005 Jun; 41(6): 1313-21.)를 산출하여 병리상을 상세히 검토하였다. 본 발명의 모델 동물은 인간에서 사용되는 NAFLD Activity Score를 이용하여 NASH의 판정을 행하는 것이 가능하고, NASH 모델 동물로서 매우 유용하다.

또한, 혈청 생화학 검사에서는 후지 드라이 켐(DRI-CHEM)을 이용하여 검토하고, 유전자 발현 해석은 타카라(takara) 리얼타임(Real-Time) RT-PCR을 이용하여 검토하였다.

상술한 바와 같이 본 발명자는 인간과 유사한 병리 소견을 나타내는 지방성 간염 모델 동물(예를 들면, NASH 모델 동물) 및 간암 모델 동물의 제작에 성공하였다.

본 발명은 마우스 등의 실험용 동물에 인슐린 저항성을 야기하고, 고지방식 부하를 행함으로써 지방간, 지방성 간염, 간섬유화, 간경변으로 진행되는 인간 NASH와 유사한 병태를 조기부터 발증하면서 상술한 병태 진행에 부수하는 간암을 자연 발증하는 동물을 안정적이고 용이하게 제작하는 기술의 제공이다.

또한, 당해 동물에서는 당뇨병성 질환(당뇨병성 신장염, 망막증, 고지혈증, 동맥 경화증)을 동시에 관찰할 수 있기 때문에, 대사 증후군의 병태도 동시에 관찰할 수 있는 실험 동물 제작의 기술 제공이 되기도 한다.

또한, 현재 NASH 모델로서 범용되고 있는 ob/ob, db/db 마우스 등은 마우스가령에 따른 병태의 형성이 일정하지는 않기 때문에, 정확한 병태의 판정을 위해 마우스의 병태의 모니터링 등이 필요하여, 실험에 이용하기 위한 번잡함이 생겼다. 또한, 병변도 불가역적이라고는 하기 어렵기 때문에, 약효 효과의 판정 등에 곤란함이 생겼다(Horie Y et al., J clin Invest 113: 1774-1783, 2004, Yanagitani A et al., Hepatology 40: 366-375, 2004, Anstee QM et al., Int J Exp Path 87: 1-16, 2006). 그러나, 본 발명의 모델 동물은 병태 완성으로의 발증 기간이 일정하고, 또한 불가역적인 병태 진행을 수반하기 때문에 상기 문제점을 해소할 수 있다.

본 발명의 모델 동물은 다양한 치료약의 전임상적인 시험에 이용하는 것이 가능하고, 또한 약제 개발이나 치료 표적이 되는 타겟의 탐색에 있어서도 매우 유용하다.

도 1은 본 발명의 마우스에서의 혈청의 생화학 검사의 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 마우스에서의 간장의 지방 염색의 결과를 나타내는 사진이다.
도 3은 본 발명의 마우스에서의 간장의 면역 조직 염색의 결과를 나타내는 사진이다.
도 4는 본 발명의 마우스의 20 주령 시의 간장에서의 간장의 HE 염색의 결과를 나타내는 사진이다.
도 5는 C57BL/6J 간장의 HE 염색의 결과를 나타내는 사진, 및 NAFLD Activity Score를 나타내는 그래프이다.
도 6은 C57BL/6J 췌장 및 지방 조직 F4/80의 면역 염색의 결과를 나타내는 사진이다.
도 7은 8 주령 시의 BALB/c 마우스 및 C3H/HeN 마우스에서의, 간장 F4/80 및 ER-TR7 면역 염색의 결과를 나타내는 사진이다.
도 8은 20 주령 시의 C3H/HeN의 간암의 사진이다.
도 9는 다른 고지방식 부하에 의한 NASH 모델 마우스의 재현 결과를 나타내는 사진이다.
도 10은 NASH 모델 마우스를 이용한 약리 효과 시험의 각 결과를 나타내는 사진 및 그래프이다. 1이 조직학적 해석의 결과를 나타내는 사진, 2가 유전자 발현 해석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11은 당뇨병성 합병증의 발증을 나타내는 사진이다. 1이 당뇨병성 신증, 2가 당뇨병성 망막증(신생 혈관의 면역 염색상, CD31)의 사진이다.

본 발명은 인슐린 저항성을 야기시킴으로써 제작되는 지방성 간염 모델 동물에 관한 것이다.

본 발명의 바람직한 양태로서는 장기 염증 유도제를 투여하여 제작되는 지방성 간염 모델 동물(본 명세서에 있어서 「본 발명의 모델 동물」이라 기재하는 경우 있음)을 제공한다.

본 발명의 모델 동물은 실험용 동물에 장기 염증 유도제를 투여한 후, 바람직하게는 고지방식을 먹이로 이용하여 사육함으로써 제작된다.

본 발명에서 사용하는 동물은 통상적으로 실험 동물로서 일반적으로 사용되는 동물이면 특별히 제한되지 않고, 통상 비인간 동물이고, 바람직하게는 비인간 척추 동물이고, 보다 바람직하게는 비인간 포유 동물이고, 더욱 바람직하게는 설치류이다. 본 발명의 모델 동물의 제작에 사용 가능한 동물로서는, 구체적으로는 마우스, 래트, 래빗, 개, 닭, 원숭이 등을 예시할 수 있다(이들 동물을 단순히 「실험 동물」이라 기재하는 경우 있음).

본 발명의 모델 동물의 제작에 사용하는 동물의 유전적 배경은 특별히 제한되지 않고, 임의의 유전적 배경을 갖는 동물을 이용할 수 있다. 통상적으로는 야생형의 동물을 바람직하게 사용할 수 있다.

본 발명에서의 장기 염증 유도제(본 명세서에 있어서 단순히 「약제」라 기재하는 경우 있음)는 널리 장기로의 염증을 직접적 또는 간접적으로 유도하는 작용을 갖는 약제이면 특별히 제한되지 않다. 염증 유도 대상이 되는 장기로서는, 예를 들면 췌장, 지방 조직, 근조직 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명에서의 장기 염증 유도제에는 말초 조직에 직접적 또는 간접적으로 염증을 유도하는 약제 등이 포함된다.

본 발명에서의 장기 염증 유도제로서는, 바람직하게는 N-아세틸-β-D-글루코사미니다아제 저해제를 들 수 있다.

본 발명의 모델 동물의 바람직한 양태로서는 상기 실험 동물에 N-아세틸-β-D-글루코사미니다아제 저해제를 투여함으로써 제작된다. 상기 저해제로서는, 예를 들면 스트렙토조토신(streptozotocin), 퍼그낵(Pugnac) 등을 들 수 있다.

또한, N-아세틸-β-D-글루코사미니다아제 저해 활성을 갖는 핵산도 또한 본 발명의 약제로서 사용할 수 있다. 구체적으로는, O-GlcNAcase 유전자(GenBank 액세션 번호: NM_023799.3)의 발현을 억제하는 siRNA, 상기 유전자의 안티센스, 또는 상기 유전자를 표적으로 하는 리보자임 등을 예시할 수 있다.

본 발명의 모델 동물의 제작에 있어서, 장기 염증 유도제의 투여 형태는 특별히 제한되지 않다. 예를 들면, 피하 투여(피하 주사 등), 정맥 투여, 경구 투여, 복강 투여 등을 들 수 있다.

투여하는 약제의 양은, 예를 들면 스트렙토조토신의 경우에는 통상 50 내지 500 μg, 바람직하게는 100 내지 300 μg, 보다 바람직하게는 200 μg이지만, 반드시 이들 양으로 제한되는 것은 아니다.

약제를 투여하는 타이밍은 통상, 출생 후 1 내지 5일령(신생자기, 바람직하게는 1 내지 5일, 보다 바람직하게는 2일)이고, 바람직하게는 출생 후 2일령이다.

상술한 바와 같이 약제를 투여함으로써, 인슐린 저항성을 야기할 수 있다. 본 발명의 모델 동물의 제작에 있어서는, 상술한 바와 같이 약제를 투여한 후 사육을 행한다. 통상, 상기 사육은 고지방식을 먹이로 사용하는 것이 바람직하다. 고지방식은 일반적으로 동물용 먹이로서 시판되는 다양한 것을 이용할 수 있다.

상기 고지방식의 주요 성분으로서는, 예를 들면 조지방, 조단백질, 조섬유, 조회분, 가용성 무질소물, 수분을 들 수 있다. 본 발명에서 사용되는 고지방식으로서는 특별히 제한되지 않지만, 조지방 함량이 20％ 이상, 바람직하게는 30％ 이상이고, 총 칼로리에서 차지하는 지방 유래 칼로리의 비율은 통상 50％ 이상, 바람직하게는 60％ 이상이다. 또한, 고지방식에 배합되는 성분은, 예를 들면 분말 우지, 밀크 카제인, 난백 분말, L-시스틴, 홍화유, 결정 셀룰로오스, 말토덱스트린, 유당, 자당 등을 들 수 있지만, 이들 물질은 고지방식 성분의 일례로, 반드시 이들 물질이 함유되어 있지 않아도 좋다.

상기 고지방식은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면 조지방 함량이 통상식보다 높은(예를 들면, 약 30％ 이상 높은) 것을 들 수 있다. 일례를 나타내면, 연구용 동물 사료로서 시판되고 있는 High Fat Diet 32(닛본 클레아사 제조), D12492(리서치 다이어트사 제조) 등을 들 수 있다.

상기 고지방식은, 예를 들면 마우스의 경우에는 통상 2 내지 6주령 시, 바람직하게는 3 내지 5주령 시, 보다 바람직하게는 4주령 시부터 투여를 개시한다. 또한, 1회당의 고지방식의 양은, 예를 들면 마우스의 경우에는 3 내지 6 그램 정도이다. 통상 1주일 이상, 고지방식을 먹이로 이용하여 사육하는 것이 바람직하다. 당업자라면, 사용하는 실험 동물의 종류, 크기, 체중 등을 고려하여 적절히 고지방식의 양을 조정(가감)하는 것이 가능하다. 고지방식을 이용하여 사육함으로써 지방간을 유발시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 양태에 있어서는 장기 염증 유도제를 투여하고, 고지방식을 이용하여 사육함으로써 지방간을 생기게 하는 공정을 포함하는 지방성 간염 모델 동물을 제공한다.

상기 수법에 의해 제작되는 동물은 지방성 간염의 증상을 나타내어, 지방성 간염 모델 동물로서 유용하다. 본 발명의 모델 동물은 본 발명의 방법에 의해 제작되는 동물에서 관찰되는 병태를 동시에 나타내는 것을 특징으로 하는 것이다. 바람직하게는, 인슐린 저항성 및/또는 간섬유화를 동시에 나타내는 것을 특징으로 하는 것이지만, 반드시 이들 병태로만 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 모델 동물의 바람직한 양태에 있어서는 당뇨병성 질환(당뇨병성 신장염, 망막증, 고지혈증, 동맥 경화증)을 동시에 관찰할 수 있기 때문에, 대사 증후군의 병태도 동시에 관찰할 수 있다는 특징을 갖는다.

또한, 본 발명의 모델 동물은 병태가 자연스럽게 치유되지 않다는 특징을 갖는 점에서, 약효 판정에서의 시험이나 평가에 바람직하게 이용할 수 있다.

본 발명의 모델 동물의 바람직한 양태로서는, 상기 지방성 간염은 비알코올성 간염(NASH)이다. 즉 본 발명은 장기 염증 유도제를 투여하여 제작되는 비알코올성 간염(NASH) 모델 동물을 제공한다. 상기 동물은 인간의 NASH로의 진행과 예후가 매우 유사한 병태를 균일한 타임 코스로 확실하게 발증한다는 특징을 갖는다.

본 발명의 바람직한 양태에서의 비알코올성 간염 모델 동물은 이하의 적어도 하나의 (바람직하게는 모든) 병리 소견을 나타낸다.

(1) 간 세포에서 대수포성의 지방 침착이 관찰되고, 간 세포의 풍선 유사 팽화가 관찰된다.

(2) 염증성 세포 침윤이 보인다.

(3) 중심 정맥을 중심으로 한 섬유화가 관찰된다.

따라서, 본 발명의 모델 동물의 바람직한 양태로서는 상기 병리학적 형태에 의해 구조적으로 특징지워지는 모델 동물이다.

본 발명의 상기 지방성 간염 모델 동물은 그대로 사육을 계속함으로써 간경변, 나아가 간암을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 지방성 간염 모델 동물은, 예를 들면 간경변 또는 간암 모델 동물의 제작용 동물(출발 재료)로서도 유용하다. 즉, 본 발명은 본 발명의 지방성 간염 모델 동물을 포함하여 이루어지는, 간경변 또는 간암 모델 동물 제작용 재료를 제공한다.

상술한 방법에 의해 본 발명의 모델 동물을 제작하는 방법도 또한 본 발명에 포함된다. 본 발명의 바람직한 양태로서는, 비인간 동물에 장기 염증 유도제를 투여하는 공정을 포함하는, 지방성 간염 모델 동물의 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 모델 동물을 이용함으로써, 지방성 간염의 치료 또는 예방용 물질을 스크리닝하는 것이 가능하다. 즉 본 발명은 이하의 공정 (a) 및 (b)를 포함하는, 지방성 간염의 치료용 또는 예방용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

(a) 본 발명의 지방성 간염 모델 동물에 피검 물질을 투여하는 공정

(b) 지방성 간염에 대한 개선 효과를 평가하는 공정

본 방법에 이용하는 피검 물질로서는 특별히 제한은 없다. 예를 들면, 천연 화합물, 유기 화합물, 무기 화합물, 단백질, 펩티드 등의 단일 화합물, 및 화합물라이브러리, 유전자 라이브러리의 발현 산물, 세포 추출물, 세포 배양 상청, 발효 미생물 생산물, 해양 생물 추출물, 식물 추출물 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.

본 발명의 방법에서의 피검 물질 또는 약물의 투여는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면 경구적으로 또는 주사 등에 의해 행할 수 있다. 피검 물질이 단백질인 경우에는, 예를 들면 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 갖는 바이러스 벡터를 구축하고, 그의 감염력을 이용하여 본 발명의 모델 동물에 상기 유전자를 도입하는 것도 가능하다.

공정 (b)에 있어서 개선 효과의 평가는 상기 모델 동물이 나타내는 병리 소견을 검토함으로써, 지방성 간염이 개선되었는지의 여부를 판정할 수 있다.

지방성 간염의 병리 소견은, 예를 들면 상술한 병리 소견(병리학적 형태)을 예시할 수 있다. 본 발명에서의 「개선」이란, 지방성 간염의 증상이 정상적인 상태로 회복되었거나 또는 증상이 완화된 것을 가리킨다. 당업자라면, 본 명세서에 기재된 병리 소견을 지표로, 모델 동물에 대하여 적절히 지방성 간염에 증상이 개선되었는지의 여부를 판정하는 것이 가능하다.

본 발명의 방법에 있어서는, 상기 공정 (b)에 있어서 개선 효과를 나타내는 피검 물질을 지방성 간염의 치료 또는 예방용 물질로서 선택한다.

또한, 본 발명의 모델 동물을 이용함으로써, 약물의 지방성 간염의 개선에 대한 약효 평가를 행하는 것도 가능하다. 즉 본 발명은 이하의 공정 (a) 및 (b)를 포함하는, 약물의 지방성 간염의 개선에 대한 약효 평가 방법을 제공한다.

(a) 본 발명의 지방성 간염 모델 동물에 피검 약물을 투여하는 공정

(b) 지방성 간염에 대한 개선 효과를 평가하는 공정

상기 방법에 의해 약효의 평가가 가능한 약물의 종류는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 공지된 다양한 약제(저분자 화합물, 단백질, 핵산 등)를 들 수 있다.

피검 약물에 대하여, 지방성 간염에 대한 개선 효과가 보인 경우에, 상기 약물은 지방성 간염에 대하여 치료 효과를 갖는 것으로 판정된다.

또한, 본 발명의 모델 동물은 지방성 간염과 동시에 합병증으로서 생기는 당뇨병성 질환(당뇨병성 신장염, 망막증 등)을 나타내는 특징을 갖는다. 따라서, 본 발명의 모델 동물은 당뇨병 모델 동물로서 유용하다.

즉, 본 발명은 장기 염증 유도제를 투여하여 제작되는 당뇨병 모델 비인간 동물을 제공한다. 본 발명의 당뇨병 모델 동물을 이용하여 당뇨병의 합병증(당뇨병성 신장염, 망막증 등)에 대한 치료 또는 예방약의 개발을 행하는 것이 가능하다. 예를 들면, 본 발명의 당뇨병 모델 동물에 피검 물질을 투여하고, 당뇨병성 질환의 개선 효과를 검토함으로써, 당뇨병성 질환의 치료 또는 예방을 위한 후보 화합물을 스크리닝하는 것이 가능하다.

본 발명의 바람직한 양태로서는 이하의 공정 (a) 및 (b)를 포함하는, 당뇨병성 질환의 치료용 또는 예방용 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

(a) 본 발명의 당뇨병성 질환 모델 비인간 동물에 피검 물질을 투여하는 공정

(b) 당뇨병성 질환에 대한 개선 효과를 평가하는 공정

NASH 환자에는 당뇨병 환자가 많아, 다양한 합병증을 갖고 있다고 생각된다. 본 발명의 모델 동물은 당뇨병성 합병증을 발증한다는 점에서, 임상 치험에서 발각되는 바와 같은 부작용 등의 리스크를 조기에 판단 가능한 모델 동물로서 매우 유용하다.

즉, 본 발명은 본 발명의 당뇨병 모델 동물을 이용한, 의약품의 부작용의 리스크 평가 방법을 제공한다.

본 발명의 방법의 바람직한 양태로서는 이하의 공정 (a) 및 (b)를 포함하는, 약물의 당뇨병성 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제에서의 부작용의 리스크 평가 방법에 관한 것이다.

(a) 본 발명의 당뇨병성 질환 모델 비인간 동물에 피검 약제를 투여하는 공정

(b) 당뇨병성 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제의 부작용을 평가하는 공정

또한, 본 발명의 상기 지방성 간염 모델 동물은 그대로 사육을 계속함으로써 간경변을 거친 후, 추가로 간암을 나타내는 것이 본 발명자에 의해 처음으로 발견되었다. 따라서, 본 발명은 상기 지방성 간염 모델 동물을 더 사육하여 제작되는, 간경변 또는 간암 모델 동물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 양태로서는 장기 염증 유도제를 투여하여 제작되는 지방성 간염 모델 동물을 더 사육하여 제작되는 간암 모델 동물에 관한 것이다.

본 발명의 상기 지방성 간염 모델 동물은 그 후 간경변을 나타내지만, 그대로 더 사육을 계속함으로써 간암 모델 동물을 제작할 수 있다. 상기 모델 동물의 제작에 있어서, 간경변 후에 사육하는 기간은, 예를 들면 실험 동물이 마우스인 경우를 예로 들면, 통상 2 내지 20주일 이상, 바람직하게는 10주일 이상이다.

본 발명의 간암 모델 동물은, 예를 들면 이하로부터 선택되는 적어도 하나의 (바람직하게는 모든) 병리 소견(병리학적 형태)에 의해 구조적으로 특징지워진다.

(a) 괴상형의 삭상 간세포암

(b) 염증성 세포의 침윤

(c) 정상 간 세포를 압배하도록 발육한 간경변 유래의 간장암

상기 특징을 갖는 간암 모델 동물은 종래의 화학 물질(발암 물질)을 투여하여 제작된 간암 모델 동물과는 상기 병리학적 형태를 나타내는 점에서 구조적으로 구별된다.

본 발명의 상기 간암 모델 동물을 이용함으로써, 간암의 치료용 또는 예방용 물질의 스크리닝을 실시할 수 있다.

본 발명의 상기 방법의 바람직한 양태로서는 이하의 공정 (a) 및 (b)를 포함하는, 간암의 치료용 또는 예방용 물질의 스크리닝 방법을 들 수 있다.

(a) 본 발명의 간암 모델 동물에 피검 물질을 투여하는 공정

(b) 간암에 대한 치료 효과를 평가하는 공정

상기 방법에 있어서 치료 효과의 평가는, 예를 들면 상기 간암의 병리 소견을 지표로 적절히 실시할 수 있다. 예를 들면, 피검 물질이 투여된 본 발명의 모델 동물에 있어서, 괴상형의 삭상 간세포암이 소실되어 있는 경우에는 피검 물질은 간암 치료 효과를 갖는 것으로 판정된다.

또한, 본 발명은 본 발명의 간암 모델 동물을 이용함으로써, 약물의 간암 치료에 대한 약효 평가를 행할 수 있다. 상기 방법의 바람직한 양태로서는, 예를 들면 이하의 공정 (a) 및 (b)를 포함하는 방법을 들 수 있다.

(a) 본 발명의 간암 모델 동물에 피검 약물을 투여하는 공정

(b) 간암에 대한 치료 효과를 평가하는 공정

또한, 본 명세서에서 인용된 모든 선행기술문헌은 참조로서 본 명세서에 도입된다.

<실시예>

이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만 본 발명은 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

〔실시예 1〕 NASH 모델 동물 및 간암 모델 동물의 제작

(a) NASH 모델 마우스의 제작

임신 C57BL6J/JJcl, C3H/HeNJcl, BALB/cByJJcl(닛본 클레아사 제조), C57BL6J/NCrlCrlj(닛본 찰즈 리버사 제조)를 사육, 출산시켰다. 출생 후 2일령의 C57BL6J/JcL, BALB/cByJJcl, C3H/HeNJcl 마우스 수컷(닛본 클레아사 제조)의 각각의 췌장 β 세포의 N-아세틸-β-D-글루코사미니다아제(N-Acetyl-beta-D-glucosaminidase; O-GlcNAcase)에 특이적으로 세포 독성을 제공하고(예를 들면 streptozotocin 10 mg/mL(시그마(SIGMA)사 제조)를 20 μL/head를 피하 주사하는 등), 췌장에 염증을 제공하여, 말초 조직에 직접적 또는 간접적으로 염증을 야기하여 인슐린 저항성을 야기하였다. 4주령까지 CE-2(닛본 클레아사 제조)의 사료, 멸균수를 제공하며 사육하여 만 4주령에 이유시킨 후부터 조지방 함량이 통상식보다 높은(또는 약 30％ 이상인) High Fat Diet식(닛본 클레아사 제조) 또는 D12492(리서치 다이어트사 제조), 멸균수를 제공하며 20주령까지 사육하였다.

(b) 조직학적 검토

각 주령에서 마우스를 24시간 절식시킨 후, 에테르 마취 하에서 도살, 채혈을 행하고, 각 장기를 OCT compound(사쿠라 파인 테크니컬(sakura fine technical)사 제조)로 동결한 후, 절편화하여 병리학적 해석을 행하였다. 본 모델에서는 혈청 생화학적 검사에 있어서는 정상 개체군에 비해 공복시 혈당, 알라닌아미노트랜스퍼라아제(Alanine aminotransferase; ALT) 및 중성 지방의 값은 높아, 인슐린 저항성 및 고지혈증을 발증하였다(도 1). 조직학적으로는 5주령 시에 간 세포의 팽화를 수반하는 현저한 지방간이 관찰되었고, 8주령 시에는 간장 내의 지방은 거의 소실하여, 인간의 burned-out NASH와 유사한 조직학적 병태 진행을 나타내었다(도 2). 6주령 시에는 간장 내에 마크로파지를 비롯한 염증성 세포의 침윤과 집족이 관찰되고, 간장의 중심 정맥을 중심으로 섬유화가 진행되었다. 경시적인 변화를 더 관찰한 결과, 8주령 시에는 중심 동맥을 연결하도록 섬유화가 진행되고, 10주령 시에는 재생 결절의 형성을 나타내고, 간경변 상태가 되었다(도 3). 또한, 병리 조직상으로부터 NAS를 산출한 결과, NASH기에는 평균치 5가 되고, 이 값의 변화에 의해 약리 효과 판정도 가능해졌다(도 5).

또한, 본 마우스에서의 NASH 발증 메카니즘은 췌장에서의 염증을 계기로, 말초 조직인 간장이나 지방 조직에서의 만성적인 염증이 유발되고, 인슐린 저항성을 나타내고, 전신적인 염증의 지속에 의해 지방간에 이르렀다(도 6). 그 후, 마우스 가령에 따라 재생 결절은 비대화하여, 20주령 시에는 염증성 세포의 침윤, 이형 간 세포의 증가 및 정상 간 세포를 압배하도록 발육한 암이 관찰되었다(도 4). 또한, 다른 계통 마우스에서도, 조직학적으로 NASH 병변-간암을 발증시키는 것이 가능하고(도 7, 8), 사용할 수 있는 고지방식을 바꾸더라도 NASH 병변을 재현하는 것이 가능하였다(도 9).

또한, 본 모델을 이용하여 고혈압 치료약인 안지오텐신 수용체 길항제(ARB)를 2주일 경구 투여하여 NASH 치료를 시도하였다. 그 결과, 임상에서의 보고와 일치하였고(Georgescu E. F. et al., 15: 942), ARB 투여군에서는 미치료군과 비교하여 간장의 조직학적인 개선 및 유전자 검사에서의 염증 및 섬유화의 개선 효과가 관찰되어, 임상과의 높은 상동성을 나타내었다(도 10).

또한, 본 모델 마우스에서는 지방 조직에서의 염증도 동시에 야기되기 때문에 인슐린 저항성이 보다 강해져, 만성적인 고혈당의 지속에 의해, 세소혈관 장해 등에 의한 당뇨병 질환의 합병증(당뇨병성 신증, 망막증, 신경 장애)을 나타낸다. 따라서, 다른 장기에서의 병변에 대하여 상세히 검토한 바, 10주령 시에는 신사구체 내 및 주위로의 염증성 마크로파지 및 섬유 아세포의 집적을 특징으로 하는 사구체섬유화 및 간질성 섬유화가 관찰되어, 당뇨병성 신증을 발증하였다(도 11). 또한, 20주령 시의 눈에서 CD31 항체를 이용하여 신생혈관의 형성을 검토한 바, 본 모델 마우스에서는 망막에서 이들의 과형성이 관찰되어, 당뇨병성 망막증을 나타내었다(도 11).

이상으로부터, 본 발명에 의해 지방간으로부터 간암에 이르는 NASH 모델 동물이 제공된다. 이들 동물에 의해 인간의 NASH의 병인 및 병태 해석, 및 그의 치료 기술, 치료약 등의 개발이 촉진된다.

간장에 지방이 축적되는 원인으로서는 알코올, 비만, 당뇨병, 지질 대사 이상, 약제, 고도의 영양 장애 등을 들 수 있지만, 크게 알코올성과 비알코올성으로 분류된다. 이 알코올성 지방간은 간염, 간섬유증, 간경변으로 진행되지만, 비알코올성은 지방간에 머무르고 병태는 진행되지 않는다고 생각되어 왔다. 그러나, 1990년대 후반이 되어 구미에서는 비만 인구의 증가와 질환 개념의 보급과 함께, C형 간염, 알코올성 간염에 이은 빈도가 높은 질환인 것으로 밝혀졌고, 그 병태도 간경변, 나아가 간암으로 진행하는 것도 보고되어 주목받기에 이르렀다. 일본에서도 유전적인 인슐린 분비 부족을 배경으로 하여, 식생활의 구미화, 운동 부족에 의해 비만 인구는 증가 일로를 걷는 동시에 NASH로 진단되는 환자수도 증가 경향이 있다. 그 때문에, NASH 치료법 및 치료 약제를 조속히 정비·확립할 필요가 있다.

본 발명은 인간의 NASH 병태와의 진행 상태가 매우 유사하고, 또한 인슐린 저항성, 지방간, 지방성 간염, 간섬유, 간경변 페이즈와 치료 대상에 맞춰 해석하는 시기를 결정할 수 있다. 또한, 각 페이즈로부터의 진행에 관여하는 병인의 탐색에 의해, 인간 NASH 및 간섬유화, 간경변에서의 완전히 신규한 치료법·치료 약제, 바이오마커의 개발에도 공헌할 수 있고, NASH 병변에서의 약물 동태의 검토에 사용할 수 있는 것도 가능해진다. 또한, 더 최종적으로는 간암까지 진행되기 때문에 암 억제 등의 약제, 간암 발증 기구, 간암 성립으로의 표적 분자 의약의 탐색에 대해서도 검토하는 것이 가능해진다.

또한 상기에 더하여, 당뇨병성 질환도 동시에 해석하는 것이 가능하기 때문에, 간장만이 아닌 생물 개체로서 전신적인 병변의 관련성 및 그의 치료법·치료 약제, 바이오마커의 개발 등에도 크게 공헌할 수 있다고 생각된다.

Claims (16)

1. 장기 염증 유도제로서 N-아세틸-β-D-글루코사미니다아제 저해제를 투여하여 제작되는 지방성 간염 모델 비인간 동물.
2. 제1항에 있어서, 상기 지방성 간염이 비알코올성 지방성 간염인 비인간 동물.
3. 제1항에 있어서, 당뇨병성 질환을 합병증으로서 발증하고 있는 비인간 동물.
4. 제2항에 있어서, 당뇨병성 질환을 합병증으로서 발증하고 있는 비인간 동물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 고지방식을 이용하여 사육함으로써 지방간을 생기게 하는 공정을 포함하는 비인간 동물.
6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비인간 동물이 마우스인 비인간 동물.
7. 제5항에 있어서, 상기 비인간 동물이 마우스인 비인간 동물.
8. 비인간 동물에 N-아세틸-β-D-글루코사미니다아제 저해제를 투여하는 공정을 포함하는, 지방성 간염 모델 비인간 동물의 생산 방법.
9. 이하의 공정 (a) 및 (b)를 포함하는, 지방성 간염의 치료용 또는 예방용 물질의 스크리닝 방법.
   (a) 제1항 또는 제2항에 기재된 지방성 간염 모델 비인간 동물에 피검 물질을 투여하는 공정
   (b) 지방성 간염에 대한 개선 효과를 평가하는 공정
10. 이하의 공정 (a) 및 (b)를 포함하는, 약물의 지방성 간염의 개선에 대한 약효 평가 방법.
    (a) 제1항 또는 제2항에 기재된 지방성 간염 모델 비인간 동물에 피검 약물을 투여하는 공정
    (b) 지방성 간염에 대한 개선 효과를 평가하는 공정
11. 이하의 공정 (a) 및 (b)를 포함하는, 당뇨병성 질환의 치료용 또는 예방용 물질의 스크리닝 방법.
    (a) 제3항 또는 제4항에 기재된 비인간 동물에 피검 물질을 투여하는 공정
    (b) 당뇨병성 질환에 대한 개선 효과를 평가하는 공정
12. 이하의 공정 (a) 및 (b)를 포함하는, 약물의 당뇨병성 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제에서의 부작용의 리스크 평가 방법.
    (a) 제3항 또는 제4항에 기재된 비인간 동물에 피검 약제를 투여하는 공정
    (b) 당뇨병성 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제의 부작용을 평가하는 공정
13. 제5항에 기재된 비인간 동물을 더 사육하여 제작되는 간암 모델 비인간 동물.
14. 제13항에 있어서, 이하의 병리학적 형태에 의해 구조적으로 특징지워지는 비인간 동물.
    (a) 괴상형의 삭상 간세포암
    (b) 염증성 세포의 침윤
    (c) 정상 간 세포를 압배하도록 발육한 간경변 유래의 간장암
15. 이하의 공정 (a) 및 (b)를 포함하는, 간암의 치료용 또는 예방용 물질의 스크리닝 방법.
    (a) 제13항에 기재된 간암 모델 비인간 동물에 피검 물질을 투여하는 공정
    (b) 간암에 대한 치료 효과를 평가하는 공정
16. 이하의 공정 (a) 및 (b)를 포함하는, 약물의 간암 치료에 대한 약효 평가 방법.
    (a) 제13항에 기재된 간암 모델 비인간 동물에 피검 약물을 투여하는 공정
    (b) 간암에 대한 치료 효과를 평가하는 공정

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