CN109152350A - 呈现出由蛋白质凝聚引起的退行性症状的非人动物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种模型动物，其用于建立对于以阿尔茨海默病等为代表的蛋白质凝聚性疾病的有效治疗。更具体而言，本发明提供以下内容。(A)一种非人动物，其呈现出由蛋白质凝聚引起的退行性症状，其中，由蛋白质凝聚引起的退行性症状是由蛋白质的错误折叠而诱导的，并且所述退行性症状得到了促进；以及(B)一种制备呈现出由蛋白质凝聚引起的退行性症状的非人动物的方法，其包括以下(1)和(2)：(1)在非人动物中，对蛋白质的错误折叠进行诱导，并在非人动物中发生由蛋白质凝聚引起的退行性症状；以及，(2)对非人动物进行由蛋白质凝聚引起的退行性症状的促进措施。

Description

呈现出由蛋白质凝聚引起的退行性症状的非人动物
技术领域
本发明涉及呈现出由蛋白质凝聚引起的退行性症状的非人动物等。
背景技术
蛋白质凝聚性疾病(Protein aggregation disease:PAD)已知是一种疾病概念，其主要表现为由淀粉样蛋白等病变蛋白质的异常积蓄引起的退行性疾病，该病变源于基于突变(mutation)从而蛋白质错误折叠。然而，近年来，它已被公认为广泛的疾病概念，不仅是突变，其还包含基于对细胞的毒性刺激和衰老引起的错误折叠而产生的蛋白质的异常凝聚，并且它甚至被认为是在老龄化社会中极其重要的综合症。
公开了可能与PAD相关的知识的现有技术可列举如下。
非专利文献1公开了2-氨基-1-甲基-6-苯基-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶(PhIP)在大鼠原代培养细胞中显示出多巴胺神经选择性毒性。
非专利文献2公开了脑室内(icv)-链球菌(STZ)模型作为糖尿病样背景型的阿尔茨海默型痴呆的模型动物。
非专利文献3公开了阿霉素肾病模型(AN)作为慢性肾病的模型。
非专利文献4公开了多柔比星(doxorubicin)诱导性模型作为心纤维化模型。
非专利文献5公开了二乙基亚硝胺(DEN)-四氯化碳(CCL4)诱导模型作为肝癌模型。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Griggs A.M.Et al.,Toxicological Science,2014,140(1):179-189.
非专利文献2:Singh,Birdavinder,et al.,Journal of Renin-Angiotensin-Aldosterone System 14.2(2013):124-136.
非专利文献3:Resolvin D1Protects Podocytes in Adriamycin-inducedNephropathy through Modulation of 14-3-3βAcetylation,Xueming Zhang,et al,Plosone_2013,8_1-17
非专利文献4:Hagir B.Suliman et al.,J Clin Invest.,2007,117,12,3730-3741
非专利文献5:Takeki Uehara,et al,Curr.Protoc.Pharmacol,_2015,30_1-10
发明内容
发明所解决的技术问题
然而，目前尚未建立对于以阿尔茨海默氏病等为代表的PAD的有效治疗，而对于该疾病模型的研究是重要的。传统的疾病模型主流为增加引起细胞内突变的基因操作的模型，而尚未建立充分的治疗。此外，没有能够充分分析细胞外凝聚的模型，因此难以对于与老龄化社会相对应的新PAD开发新药。
本发明的发明人对于上述技术问题进行了深刻研究，结果发现：在非人动物中，对蛋白质的错误折叠进行诱导，并在非人动物中引起由蛋白质凝聚引起的退行性症状，并且，对非人动物进行措施使得由蛋白质凝聚引起的退行性症状得到促进，可以由此制备PAD良好的模型动物，完成了本发明。
解决技术问题的技术手段
即，本发明如下所述。
[1]一种非人动物，其呈现出由蛋白质凝聚引起的退行性症状，其中，
由蛋白质凝聚引起的退行性症状是由蛋白质的错误折叠而诱导的，并且所述退行性症状得到了促进。
[2]根据[1]所述的非人动物，其中，
由蛋白质凝聚引起的退行性症状基于具有细胞毒性的化学物质而被诱导。
[3]根据[2]所述的非人动物，其中，
具有细胞毒性的化学物质为：(1)二乙基亚硝胺和四氯化碳的组合、(2)2-氨基-1-甲基-6-苯基-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶、(3)链脲佐菌素、(4)阿霉素、或(5)多柔比星。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的非人动物，其中，
所述退行性症状的促进通过诱导过氧化脂质的产生来进行。
[5]根据[4]所述的非人动物，其中，
所述诱导过氧化脂质的产生通过喂食高脂肪食物来进行。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的非人动物，其中，
所述非人动物是由蛋白质凝聚引起的退行性疾病的模型动物，所述退行性疾病选自(1)肝癌、(2)帕金森病、(3)阿尔茨海默病、(4)慢性肾病、以及(5)心纤维化。
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的非人动物，其中，
所述非人动物是选自下述动物的、由蛋白质凝聚引起的退行性疾病的模型动物：
(1)由于二乙基亚硝胺和四氯化碳的组合、以及喂食高脂肪食物而产生肝癌的模型动物；
(2)由于2-氨基-1-甲基-6-苯基-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶、并喂食高脂肪食物而产生帕金森病的模型动物；
(3)由于链脲佐菌素、并喂食高脂肪食物而产生阿尔茨海默病的模型动物；
(4)由于阿霉素、并喂食高脂肪食物而产生慢性肾病的模型动物；
(5)由于多柔比星、并喂食高脂肪食物而产生心纤维化的模型动物。
[8]根据[1]～[7]中任一项所述的非人动物，其中，
所述非人动物是啮齿类动物。
[9]根据[8]所述的非人动物，其中，
所述啮齿类动物是小鼠。
[10]一种制备呈现出由蛋白质凝聚引起的退行性症状的非人动物的方法，其包括以下(1)和(2)：
(1)在非人动物中，诱导蛋白质的错误折叠，并在非人动物中引发生由蛋白质凝聚引起的退行性症状；以及，
(2)对非人动物进行由蛋白质凝聚引起的退行性症状的促进措施。
[11]一种呈现出由蛋白质凝聚引起的退行性症状的非人动物，其进行了2-氨基-1-甲基-6-苯基-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶给药。
[12]一种呈现出由蛋白质凝聚引起的退行性症状的非人动物的制备方法，其包括进行2-氨基-1-甲基-6-苯基-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶给药。
[13]一种蛋白质凝聚性疾病的预防或治疗药物的筛选方法，其包含以下(a)～(c)：
(a)将试验物质向[1]～[9]以及[11]中任一项所述的非人动物进行给药；
(b)评价试验物质是否对由蛋白质凝聚引起的退行性症状具有改善作用；以及
(c)将对由蛋白质凝聚引起的退行性症状具有改善作用的试验物质选择为作为蛋白质凝聚性疾病的预防或治疗药物。
[14]一种评价试验药物的副作用的方法，其包括以下(a)和(b)：
(a)将试验药物向[1]～[9]以及[11]中任一项所述的非人动物进行给药；
(b)评价试验药物是否对由蛋白质凝聚引起的退行性症状具有作用。
[15]一种生物样品，其由[1]～[9]以及[11]中任一项所述的非人动物制备而得到，其包含由蛋白质凝聚引起的退行性部位。
发明的效果
本发明的非人动物可以作为蛋白质凝聚性疾病的模型动物，用于各种治疗药物的临床前试验。此外，本发明还可用于药物开发、和作为治疗靶点的靶标的探索。
附图说明
图1-1是显示(1)空白对照(Vehicle)组、(2)PhIP组、以及(3)PhIP+HFD(高脂肪食物)组中的脑的TH阳性细胞数目的图。
图1-2是显示(1)空白对照组、(2)PhIP组、以及(3)PhIP+HFD组中的脑的TH免疫染色的照片。
图2是显示(1)空白对照组、(2)PhIP组、以及(3)PhIP+HFD组中的脑的路易体的照片。
图3是显示(1)空白(Sham)对照组、(2)STZ组、以及(3)STZ+HFD组中的Y迷宫的结果(变换率(Alternation rate)(％))的图。
图4是显示在(1)空白(Sham)对照组、(2)脑室内(icv)STZ组、以及(3)脑室内STZ+HFD组中的脑的IV型胶原蛋白免疫染色的结果的照片。
图5-1是显示(1)正常组、(2)阿霉素(Adriamycin)组、以及(3)阿霉素(Adriamycin)+HFD组中的肾脏切片的天狼星红染色阳性面积率(％)的图。
图5-2是显示(1)正常组、(2)阿霉素(Adriamycin)组、以及(3)阿霉素(Adriamycin)+HFD组中的肾脏切片的天狼星红染色的照片。
图6-1是显示(1)正常组、(2)阿霉素(Adriamycin)组、以及(3)阿霉素(Adriamycin)+HFD组中，肾脏切片的免疫染色阳性面积率(％)的图。
图6-2是显示(1)正常组、(2)阿霉素(Adriamycin)组、以及(3)阿霉素(Adriamycin)+HFD组中，肾脏切片的F4/80免疫染色的照片。
图7-1是显示(1)空白对照组、(2)空白对照+HFD组、(3)多柔比星组、以及(4)多柔比星+HFD组中的心脏的天狼星红染色阳性面积率(％)的图。
图7-2是显示(1)空白对照组、(2)空白对照+HFD组、(3)多柔比星组、以及(4)多柔比星+HFD组的心脏的天狼星红染色的照片。
图8-1是显示(1)正常组、(2)DEN-CCl4组、以及(3)DEN-CCl4+HFD组的肝脏的肿瘤数目的图。
图8-2是显示(1)正常组、(2)DEN-CCl4组、以及(3)DEN-CCl4+HFD组中的肝脏的肿瘤尺寸的图。
图9-1是显示(1)正常组、(2)DEN-CCl4组、以及(3)DEN-CCl4+HFD组中的肝脏切片的天狼星红染色阳性面积率(％)的图。
图9-2是显示(1)正常组、(2)DEN-CCl4组、以及(3)DEN-CCl4+HFD组中的肝脏切片的天狼星红染色的照片。
图10-1是显示(1)正常组、(2)DEN-CCl4组、以及(3)DEN-CCl4+HFD组中的肝脏切片的免疫染色阳性面积率(％)的图。
图10-2是显示(1)正常组、(2)DEN-CCl4组、以及(3)DEN-CCl4+HFD组中的肝脏切片的p53免疫染色的照片。
具体实施方式
本发明提供一种呈现出由蛋白质凝聚引起的退行性症状的非人动物。就本发明的非人动物而言，由蛋白质凝聚引起的退行性症状是由蛋白质的错误折叠而诱导的，并且所述退行性症状得到了促进。
用于本发明的非人动物，只要是通常用作实验动物的动物即可，没有特别限制，优选是脊椎动物。作为脊椎动物，可举出鸟类(例如鸡)和哺乳动物，优选哺乳动物。作为哺乳动物，可举出啮齿类动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔)、灵长类动物(例如猴子、黑猩猩)、狗、猫、猪、牛、羊。用于制备本发明的非人动物的动物的遗传性背景没有特别限制，可以使用具有任何遗传性背景的动物。通常，可以适当地使用野生型动物。
本发明的非人类动物，可用作蛋白质凝聚性疾病(Protein aggregationdisease:PAD)的模型动物。作为PAD，例如可举出神经退化性疾病(例如，阿尔茨海默氏病、帕金森氏病)、肾脏疾病(例如，慢性肾脏病)、心脏疾病(例如，心纤维化)、肝脏疾病(例如，肝癌)、肺疾病(例如，COPD)、眼疾病(例如，视网膜色素变性症、白内障、角膜淀粉样变性、角膜退行性、青光眼、眼咽型肌退行性症)、肌肉疾病(例如，包涵体肌炎)、毛发疾病(例如，头皮脱发症)、血管疾病(例如，动脉粥样硬化)、消化道疾病(例如，先天性巨结肠症)、皮肤疾病(例如，皮肤淀粉样变性)、末梢神经病变(例如，腓骨肌萎缩症)、垂体疾病(例如，垂体由于老化而激素异常)、更年期障碍、癌症，纤维化、胰脏疾病(例如，II型糖尿病)。
作为所述PAD中的凝聚蛋白，例如可举出α-突触核蛋白、β-淀粉样蛋白、tau蛋白、胶原蛋白、p53、SP-C、视紫红质、晶状体蛋白、乳铁蛋白、角蛋白、PAPB2、APP、Aβ、Corneodesmosin、ApoB100/LDL、RET、髓鞘蛋白22/0、催乳素、P53。
作为凝聚蛋白的沉积部位，例如可举出脑(例如，黑质致密部、腹侧被盖区、海马、大脑皮质)、肾脏(例如，间质)、心脏(例如，心室内膜)、肝脏、肺、眼(如视网膜、晶状体、角膜、房水、眼咽部肌肉)、肌肉、毛囊、血管、消化道(如胃、小肠、大肠)、皮肤、末梢神经、垂体、胰腺。作为凝聚蛋白的沉积部位，例如还可举出细胞内部位(例如，核内、胞质内)、和细胞外部位。
作为检测本发明的非人动物中的凝聚蛋白质的方法，例如可举出抗体染色、天狼星红染色等任选染色法。
本发明的非人动物可以通过以下(1)和(2)来制备：
(1)在非人动物中，诱导蛋白质的错误折叠，并在非人动物中引发由蛋白质凝聚引起的退行性症状；以及，
(2)对非人动物进行由蛋白质凝聚引起的退行性症状的促进措施。
在本发明的非人动物中，可以通过给药能够诱导蛋白质错误折叠的物质，并引起由蛋白质凝聚引起的退行性症状。作为能够诱导蛋白质错误折叠的物质，例如可举出引起蛋白质错误折叠的物质、和对使错误折叠的蛋白质凝聚除去或减少的因子进行作用的物质。具体而言，作为这样物质的实例，可举出具有细胞毒性的化学物质、伴侣蛋白抑制剂、自噬抑制剂、和内质网相关的降解抑制物质。
作为具有细胞毒性的化学物质，例如可举出2-氨基-1-甲基-6-苯基-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶、链脲佐菌素、多柔比星、阿霉素、二乙基亚硝胺、四氯化碳。
作为伴侣蛋白抑制剂，例如可举出衣霉素(tunicamycin)、ETB、二硫苏糖醇(dithiothreitol)、β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)、毒胡萝卜素(thapsigargin)。
作为自噬抑制剂，例如可举出巴弗洛霉素A1(Bafilomycin A1)、氯喹(Chloroquine)、E-64d、LY-294002、LY 303511、胃蛋白酶抑制剂A、(+)-渥曼青霉素(Wortmannin)。
作为内质网相关的降解抑制物质，例如可举出硼替佐尼(Bortezonib)、MG-132、卡非佐米(Carfilzomib)、MLN 9708、伊沙佐米(Ixazomib)、PI-1840、ONX-0914、Oprozomib、CEP-18770、萘莫司他(Nafamostat)、阿司匹林(Aspirin)、加贝酯(Gabexate)、PR-619、P5091、IU1、TCID、LDN-57444、Degrasyn、ML323、P22077、p97抑制剂(p97Inhibitors)、NMS-873、DBeQ、MNS、NSC697923、BAY 11-7082、PYR-41、沙利度胺(Thalidomide)、TAME、RITA、Tenovin-1、E3连接酶激活剂(E3Ligase Activators)、(-)-小白菊内酯(Parthenolide)、NSC 207895、Nutlin-3、JNJ-26854165。
具有诱导蛋白质错误折叠能力的物质的给药形式，没有特别限制，例如可举出皮下给药(例如，皮下注射)、静脉给药、脑室内给药、口服给药、腹膜内给药等。
具有对蛋白质错误折叠进行诱导的能力的物质，可以根据物质的种类以能够对目的蛋白质的错误折叠进行诱导的量进行给药。
具有对蛋白质错的误折叠进行诱导的能力的物质，可以根据物质及动物的种类对任意年龄(例如，从1日龄到20周龄、15周龄或10周龄之间)的动物进行适当给药。
由蛋白质凝聚引起的退行性症状的促进措施，可以通过与蛋白质的错误折叠的诱导不同的措施来进行。例如，促进措施可以通过诱导过氧化脂质的产生来进行。诱导过氧化脂质的产生，例如可以通过给药诱导过氧化脂质的产生的食物或物质来进行。作为对过氧化脂质的产生进行诱导的食物或物质，例如可举出高脂肪食物、动脉硬化食物、含铁食物、链球菌、四氯化碳、以及它们的组合。
在用于本发明中的情况下，高脂肪食物是指油脂添加量为20％以上(优选30％以上)的脂肪试样。就高脂肪食物而言，源自油脂的热量占总热量的比例约为40％以上(优选约为50％以上)。作为油脂，例如可举出胆固醇、不饱和脂肪酸(例如，亚油酸)、饱和脂肪酸。作为配合于高脂肪食物中的成分，例如可举出粉末牛脂、乳酪蛋白、蛋清粉末、L-胱氨酸、红花油、结晶纤维素、麦芽糊精、乳糖、蔗糖等。就高脂肪食物而言，能够利用一般作为动物用食物市售的各种食物。作为高脂肪食物，例如可举出作为研究用动物饲料市售的High FatDiet32(日本CREA株式会社生产)、D12492(Research Diets株式会社制造)等。
促进措施可以与诱导蛋白质的错误折叠同时进行，或者可以在诱导蛋白质的错误折叠之前、或之后进行。或者，促进措施可以从诱导蛋白质的错误折叠之前或同时开始，进行到诱导之后。
在优选的实施方式中，就本发明的非人动物而言，由α-突触核蛋白凝聚引起的中枢神经系统的退行性症状呈现出α-突触核蛋白凝聚引起的中枢神经系统(黑质致密部、腹侧被盖区)的退行性症状，其是基于2-氨基-1-甲基-6-苯基-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶(PhIP)进行诱导的，并且基于诱导过氧化脂质的产生退行性症状得到了促进。这样的非人动物可用作帕金森病模型。这样的非人动物能够通过如下方式制备，例如：在4～15周龄(优选5～9周龄)时，给药能够引起α-突触核蛋白凝聚的量(例如，0.5～50mg/kg)的PhIP，并且同时或之后诱导过氧化脂质的产生(例如，喂食高脂肪食物)。
在另一个优选的实施方式中，就本发明的非人动物而言，由β-淀粉样蛋白凝聚和/或Tau凝聚引起的中枢神经系统的退行性症状呈现出由β-淀粉样蛋白凝聚和/或Tau凝聚引起的中枢神经系统(海马、大脑皮层)的退行性症状，其基于第一次给药的链脲佐菌素进行诱导，并且在此之后药退行性症状基于链脲佐菌素的给得到了促进。这样的非人类动物可用作阿尔茨海默病模型。这样的非人动物能够通过如下方式制备，例如：在1日～13周龄(优选1日～10周龄)的时期，给药能够引起β-淀粉样蛋白和/或Tau凝聚的量(例如，0.3～30mg/kg)的链脲佐菌素，并在之后给药能够诱导过氧化脂质的产生的量(例如，0.1～10mg/kg)的链脲佐菌素。
在另一个优选的实施方式中，就本发明的非人动物而言，由胶原蛋白凝聚引起的肾脏(间质)的退行性症状，呈现出由胶原蛋白凝聚引起的肾脏(间质)的退行性症状，其基于阿霉素进行诱导，并且退行性症状基于诱导过氧化脂质的产生而得到了促进。这样的非人动物可用作慢性肾病模型。这样的非人动物能够通过如下方式制备，例如：在4～15周龄(优选6～10周龄)的时期，给药能够在肾脏中引起胶原蛋白凝聚的量(例如，1～50mg/kg)的阿霉素进，并在同时或之后诱导过氧化脂质的产生(例如，喂食高脂肪食物)。
在另一个优选的实施方式中，就本发明的非人动物而言，由胶原蛋白凝聚引起的心脏(心室内膜、间质)的退行性症状，呈现出由胶原蛋白凝聚引起的心脏(心室内膜、间质)的退行性症状，其基于多柔比星进行诱导，并且退行性症状基于诱导过氧化脂质的产生而得到了促进。这样的非人动物可用作心纤维化模型。这样的非人动物能够通过如下方式制备，例如：在4～15周龄(优选6～10周龄)的时期，给药能够在心脏中引起胶原蛋白凝聚的量(例如，1～75mg/kg)的多柔比星，并在同时或之后诱导过氧化脂质的产生(例如，喂食高脂肪食物)。
在另一个优选的实施方式中，就本发明的非人动物而言，由肝脏损伤和/或肝纤维化引起的肝癌呈现出由胶原蛋白凝聚引起的肝癌，其基于DEN-CCL4进行诱导，并且诱导过氧化脂质的产生而促进了致癌。这样的非人动物可用作肝癌模型。这样的非人动物能够通过如下方式制备，例如：在1～50周龄的时期，给药能够引起肝癌的量(例如，0.1～10mg/kg)的DEN和(例如，0.02～1mL/kg)CCl4，并在同时或之后诱导过氧化脂质的产生(例如，喂食高脂肪食物)。
在制备本发明的非人动物时，当使用2-氨基-1-甲基-6-苯基-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶作为具有诱导蛋白质错误折叠能力的物质时，可以省略促进措施。本发明还提供通过这种方法制备而得的非人动物。
本发明还提供蛋白质凝聚性疾病的预防或治疗药物的筛选方法。
本发明的筛选方法包括以下(a)～(c)：
(a)向本发明的非人动物，给药试验物质；
(b)评价试验物质是否对由蛋白质凝聚引起的退行性症状具有改善作用；以及
(c)将对由蛋白质凝聚引起的退行性症状具有改善作用的试验物质选择为作为蛋白质凝聚性疾病的预防或治疗药物。
在工序(a)中，对试验物质没有特别限制，例如可举出天然化合物、有机化合物、无机化合物、蛋白质、肽等单一化合物等。作为试验物质，还可举出化合物库、基因文库的表达产物、细胞提取物、细胞培养物上清液、发酵微生物产物、海洋生物提取物、植物提取物等。
试验物质的给药方法没有特别限制，例如可以口服、或通过注射等给药。当试验物质是蛋白质时，还可以构建具有编码该蛋白质的基因的病毒载体，并利用其感染性来将该基因导入本发明的非人动物中。
在工序(b)中，例如基于在非人动物中蛋白质凝聚是否被抑制、或由蛋白质凝聚引起的退行性症状是否被缓和，进行对于试验物质是否对由蛋白质凝聚引起的退行性症状具有改善作用的评价。蛋白质凝聚的抑制，例如可以通过抗体染色、天狼星红染色等任意的染色方法来进行评价。由蛋白质凝聚引起的退行性症状的缓和，例如可以根据退行性症状(例如，病理性表现、行为学性表现)来适当地进行评价。
在工序(c)中，作为蛋白质凝聚疾病的预防或治疗药物，对由蛋白质凝聚引起的退行性症状具有改善作用的试验物质进行选择。
本发明还提供了评价试验药物副作用的方法。就本发明的评价方法而言，例如可用于开发具有预定药效的药物(例如，具有降低了的副作用的药物)，其中，不期望对由蛋白质凝聚引起的退行性症状发生作用(例如，副作用)。
本发明的评价方法包括以下(a)和(b)：
(a)将试验药物向本发明的非人动物进行给药；和
(b)评价试验药物是否对由蛋白质凝聚引起的退行性症状具有作用。
在工序(a)中，只要试验药物是显示预定药效的物质(例如，药物、生理活性物质)即可，没有特别限制，例如可以使用所述试验物质。
在工序(b)中，可以以与本发明的筛选方法中的(b)相同的方式，来评价试验药物对由蛋白质凝聚引起的退行性症状是否具有作用。
本发明还提供从本发明的非人动物制备而得的生物样品，其包含由蛋白质凝聚引起的退行性部位。
本发明的生物样品含有由蛋白质凝聚引起的退行性部位。由蛋白质凝聚引起的退行性部位是如上所述的凝聚蛋白质的沉积部位。除了凝聚蛋白质之外，由蛋白质凝聚引起的退行性部位可以包含能够诱导该蛋白质错误折叠的物质，该错误折叠引起蛋白质的凝聚。这样的蛋白质和物质的组合如上所述。作为样品，例如可举出器官整体、器官切片和原代培养细胞。本发明的生物样品例如可用于筛选蛋白质凝聚性疾病的预防或治疗药物。
实施例
在下文中，将参照实施例详细地描述本发明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1：利用2-氨基-1-甲基-6-苯基-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶(PhIP)的多巴胺神经毒性，开发新型帕金森病模型小鼠
[试验目的]
帕金森病是由中枢神经系统中多巴胺能神经的退化引起的，并且是一种神经系统疾病，常常并发有痴呆症以及运动迟缓和不能运动。据说全球的患者数约为1000万，尽管现有药物很多，但在长期使用中存在药物作用时间变短的问题，这一现象也被称为药效渐消(wearing off)(参照参考文献1)。
另一方面，在非临床研究中，使用利用了6-OHDA、MPTP等多巴胺类似物的细胞毒性的化学诱导型帕金森模型，以及被认为是风险基因的Parkin和Pink 1中的基因修饰型模型，但迄今尚未开发出充分反映病理和症状这两方面特征的模型(参照参考文献2)。特别期望的是，具有多巴胺能神经逐渐死亡的病理性特征的模型。
近年，报道了在大鼠原代培养细胞中，2-氨基-1-甲基-6-苯基-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶(PhIP)(2-Amino-1-methyl-6-phenyl-1-H-imidazo[4,5-b]pyridine)显示出多巴胺能神经选择性毒性。PhIP被认为是致癌物质的环胺的一种。熟肉中包含环胺，并且流行病学调查指出肉类摄入与帕金森病之间的关系(参照参考文献3)。
本实施例利用PHIP，作为新型帕金森氏病小鼠模型的制备，并以研究将PHIP给药于小鼠体内带来的影响为目的。将PHIP的给药浓度设为0.4mg/mL(参照参考文献4)，进行尾静脉给药，并在给药28天后处死。此外，为了研究与高脂肪饮食(HFD：High Fat Diet)负荷组合的协同效果，设置进行0.2mg/mL浓度的PHIP给药和HFD负荷的组，在给药28天后处死。通过TH(Tyrosine Hydroxylase)免疫染色和路易小体的观察来进行评价，测定SNc及VTA的多巴胺能细胞数及路易小体数，确认了本模型的多巴胺能神经的伤害性和α-突触核蛋白凝聚性。
[遵守标准和基准指南]
动物福利
“关于动物爱护和管理的法律”
(1973年10月1日法律第105号、2011年8月30日法律第105号最终修订)
“关于实验动物的饲养及保管和疼痛的减轻的标准”
(2006年4月28日环境省告示第88号)
“关于在研究机构等中实施动物实验的基本指南”
(2006年6月1日，文部科学省告示第71号)
需要说明的是，本研究取得了SMC动物实验委员会的批准，并遵循试验设施确立的关于实验动物管理和福利的指南(株式会社SMC动物试验规则)来进行。
[实验材料与方法]
试验物质和溶剂
试验物质
名称：PhIP(2-氨基-1-甲基-6-苯基-1-H-咪唑并[4,5-b]吡啶)(2-Amino-1-methyl-6-phenyl-1-H-imidazo[4,5-b]pyridine)
试验物质的介质
名称：DMSO+0.9％盐水(saline)(20:80v/v)
使用动物
从日本SLC株式会社购入12只雄性7周龄C57BL/6J小鼠，并进行检疫和驯化饲养。驯化饲养后，确认在一般情况下没有问题并进行试验。
饲料
对于HFD负荷组，从购入动物到达日到处死日，自由摄取高脂肪食物(油脂含量约为32％且源自油脂的热量占总热量的比例约为57％的固体饲料)。
分组
在测试开始日(PhIP给药开始日)前一天，将12只雄性小鼠以使得平均体重均等的方式，通过体重分层随机抽取法分成3组。
给药途径、给药时间和给药次数
选择尾静脉给药作为DMSO和各浓度的PhIP的给药途径，并且将第0天的给药次数设定为一次。
组构成
组构成如表1所示。
[表1]
表1.组构成表
一般状态的观察、体重测定以及摄食量测定
在试验期间进行一般状态的观察、体重测定以及摄食量测定。关于试验日的计算如下所述。
PhIP给药开始日：第0天
一般状态的观察
在体重测定之前进行。对于全部个体，观察体表、营养状态、姿势、行为以及排泄物的异常等一般状态。
剖检
在第28天，用异氟烷麻醉所有计划病理解剖动物，然后通过断头处死，并摘取脑。摘取的大脑的靠前部1/3左右，通过冠状切面进行切除。将后部2/3用4％PFA固定，用30％蔗糖溶液置换，并在-80℃下作为OCT包埋冷冻块进行保存。
免疫组织化学染色
冷冻切片制备
使用低温恒温器将冷冻块以10μm厚度进行薄切，并将其粘附在载玻片上。切片设为能同时观察SNc和VTA的剖面。剖面参考ALLEN Brain Atlas进行判断。将冷冻切片进行TH免疫染色。
TH免疫染色和阳性细胞的测定
在常温下用0.03％过氧化氢水溶液对冷冻切片处理10分钟，以抑制内源性过氧化物酶。用PBS洗涤后，用抗TH抗体(Abcam)在4℃下反应一晚。用PBS洗涤，并在常温下用25倍稀释的过氧化物酶标记的抗rabbit抗体(Jackson IR)反应30分钟。用PBS洗涤，在室温下用1％戊二醛溶液固定1分钟。用显色底物(Simple Stain DAB，Nichirei BioScience株式会社)进行显色。显色后，用RO水洗涤，并用1％戊二醛溶液进行固定。将其通过8倍稀释的苏木精1分钟，立即用RO水洗涤，并用Aquatechs(Merck株式会社)进行密封。使用明视野显微镜观察样品。使用CCD相机拍摄SNc和VTA区域的照片。测定各视野中TH阳性细胞的数量，并计算面积对应的TH阳性细胞数的平均值。其结果，在PhIP+HFD组中，与PhIP组相比，发现TH阳性细胞的数量减少，并且观察到由HFD负荷引起的多巴胺神经的减少(图1-1、1-2)。
HE染色和路易小体的测定
用Lily-Meyer苏木精溶液(武藤化学株式会社)浸透冷冻切片10分钟。用RO水冲洗多余的染色溶液，在流水中脱色10分钟，然后浸透到1％曙红Y乙醇水溶液(和光纯药株式会社)中5分钟，并浸透到RO水中。将染色的切片通过70％～100％的醇系列和二甲苯进行脱水、渗透，然后封入Enterellan-new(Merck株式会社)中并用于观察。使用明视野显微镜(Leica Microsystems)观察样品。其结果，在PhIP+HFD组中，与PhIP组相比，确认到路易体的增加，并暗示了由HFD负荷引起的α-突触核蛋白凝聚的增加(图2)。
统计分析的流程
对于各组的平均值之差，使用Prism 6(GraphPad Software，Inc.)并通过Studentt-检验对空白对照(Vehicle)给药组和各浓度的PhIP给药组进行比较。
各组的代表值表示为mean±SD(平均值±SD)，并且测试分别以5％的显著水平进行。
[参考文献]
1.Pahwa R.Et al.,Current medical research and opinion,2009,25(4):841-849.
2.Blesa J.Et al.,NioMed Research Internatinal,2012,2012.
3.Griggs A.M.Et al.,Toxicological Science,2014,140(1):179-189.
4.Teunissen S.F.Et al.,Journal of Chromatography B,2010,878(25):2353-2362.
实施例2：使用了icvSTZ的阿尔茨海默氏病的非临床评价试验
[试验目的]
阿尔茨海默病分为由遗传性因素而发病的家族性阿尔茨海默病，和由环境因素而发病的散发性阿尔茨海默病。据说99％的阿尔茨海默病患者是散发性的，但大多基因修饰型模型小鼠模仿家族性阿尔茨海默病样的病态发作(参照参考文献5)。因此，需要开发不依赖于遗传修饰的散发性阿尔茨海默病的模型动物。此外，流行病学调查显示，大约60％的糖尿病患者并发有痴呆症，阿尔茨海默病也被称为第三糖尿病(参照参考文献6)。
icvSTZ是糖尿病样背景型的阿尔茨海默型痴呆症的模型动物，其通过损害具有糖尿病背景的小鼠脑内的胰岛素信号来产生。与基因修饰型模型相比，icv-STZ单独模型(参照参考文献7)显示出较强的炎症和神经功能障碍，因此其被认为通过与遗传修饰型模型不同的机制导致病态发作与病态发展。然而，没有发现与淀粉样蛋白β和Tau这样的神经元细胞死亡相关的病理性蛋白的凝聚，并且很难说其是临床上接近的模型。在本研究中，通过使用由HFD诱发了糖尿病的小鼠，来再现具有病理性蛋白质的脑组织内沉积的小鼠。通过使用本模型，能够获得通过遗传修饰模型无法充分评价的治疗药物候选物的新发现。
[遵守标准和基准指南]
动物福利
“关于动物爱护和管理的法律”
(1973年10月1日法律第105号、2011年8月30日法律第105号最终修订)
“关于实验动物的饲养及保管和疼痛的减轻的标准”
(2006年4月28日环境省告示第88号)
“关于在研究机构等中实施动物实验的基本指南”
(2006年6月1日，文部科学省告示第71号)
需要说明的是，本研究取得了SMC动物实验委员会的批准，并遵循试验设施确立的关于实验动物管理和福利的指南(株式会社SMC动物试验规则)来进行。
[实验材料与方法]
使用动物
试验动物
从日本SLC公司购入30只雄性6周龄SPF小鼠(C57BL/6J)，并进行检疫和驯化饲养。
分组
将给药开始日前一天的体重作为指标，以使平均体重变得均匀的方式来分成3组(10只/组)。组构成如表2所示。
[表2]
表2.组构成表
试验组 性别 动物数目 动物编号
空白对照组(sham) 雄 2 101-102
icv STZ组 雄 2 201-202
icvSTZ+HFD组 雄 2 301-302
模型小鼠的制备
通过在7周龄的研究开始日(第0天)和第2天将链脲佐菌素(每次3μL)给药到脑室内来诱导模型。在左右两侧的位置各进行一次(从左侧开始)给药。
一般状态的观察、体重测定和摄食量测定
在试验期间实施一般状态的观察、体重测定和摄食量测定。试验日的计算如下所述。
icv-STZ 7周龄给药开始日：0天(第0天)
一般状态的观察
在体重测定之前进行。对于全部个体、观察体外表、营养状态、姿势、行为以及排泄物的异常等一般状态。
行为实验
通过Y迷宫自发交替行为(spontaneous alternation behavior，SAB)的分析(参考文献8)
在实施行为试验24小时前(在第26天的给药完成后)，进行Y迷宫中的适应(habituation)。即，将小鼠放置在迷宫的中心，并使其自由探索5分钟。
在第27天的最终给药完成后，进行1次试验。将小鼠放置在迷宫的中心,使其自由地探索8分钟。在此期间，将小鼠进入臂部的全部次数和进入臂部的顺序全部进行记录。经过8分钟后，将小鼠放回到主笼中，用50％乙醇对Y迷宫进行消毒，进行下一只小鼠的试验。
使用交替率(Alternation rate)(％)作为SAB的指标。通过下述式1计算交替率(Alternation rate)。
100×(连续3次进入不同的臂部的次数)/(进入臂的全部次数-2)…(式1)
其结果，与icv-STZ组相比，在icv-STZ+HFD组中确认到了交替率的减少(图3)。
剖检
在第28天，用生命检测器对全部计划剖检动物的血糖值进行测定，然后用二乙醚麻醉，通过断头处死，并摘取脑。对摘取的脑测定重量，并用矢状面切成两半。将右脑用4％PFA固定(4℃，2h)，并用30％蔗糖溶液进行了置换(4℃，O/N)。第二天进行OCT包埋，并冷冻保存(-80℃)。测定左脑的重量，然后进行快速冷冻而冷冻保存(-80℃)。
免疫组织化学染色
在冷冻切片上进行IV型胶原蛋白的免疫染色。其结果，在icv-STZ+HFD组中，与icv-STZ组相比，在脑血管周围确认到较强的染色，从而确认了IV型胶原蛋白的蓄积亢进(图4)。
切片制备
使用低温恒温器在-20℃下制备厚度为10μm的切片。
[参考文献]
5.Kamboh,M.I.,et al.”Genome-wide association study of Alzheimer'sdisease.”Translational psychiatry 2.5(2012):e117.
6.Arvanitakis,Zoe,et al.”Diabetes mellitus and risk of Alzheimerdisease and decline in cognitive function.”Archives of neurology 61.5(2004):661-666.
7.Mehan,Sidharth,et al.Dementia-A Complete Literature Review onVarious Mechanisms Involves in Pathogenesis and an IntracerebroventricularStreptozotocin Induced Alzheimer's Disease.,INTECH Open Access Publisher,2012.
8.Gorrie,George H.,Et al.”Dendritic spinopathy in transgenic miceexpressing ALS/dementia-linked mutant UBQLN 2.”Proceedings of the NationalAcademy of Sciences 111.40(2014):14524-14529.
实施例3：对于慢性肾病的模型动物的开发
[试验目的]
慢性肾脏病(CKD)是由于糖尿病或高血压等原始疾病而引发慢性肾脏功能降低的病理状况的总称，并且会成为末期肾功能不全或心血管疾病的风险(参照参考文献9)。CKD的患者数量逐年增加，需要人工透析的末期肾功能不全患者数量也在增加(参照参考文献9)。目前尚无对于CKD的根本性的治疗药物，已知抑制各种原始疾病发展中所共同表现出的蛋白尿、肾小球高血压、肾小球疾病、肾小管间质疾病这样的进行性肾病，在CKD的治疗中是重要的(参照参考文献10)。
作为慢性肾脏病的模型，有输尿管结扎模型(UUO)、5/6肾切除模型(5/6Nx)、阿霉素肾病模型(AN)。各模型的特征、可评价项目如表3所示，但两者均难以说是反映临床的模型。作为用于开发针对CKD的治疗药物的新模型动物，进行了AN给药小鼠模型的研究。另外，为了研究与高脂肪饮食(与实施例1中相同)负荷组合的协同效果，设定进行AN给药和HFD负荷的组，同样地饲养和处死。
[表3]
表3.各模型动物的比较
[遵守标准和基准指南]
动物福利
“关于动物爱护和管理的法律”
(1973年10月1日法律第105号、2011年8月30日法律第105号最终修订)
“关于实验动物的饲养及保管和疼痛的减轻的标准”
(2006年4月28日环境省告示第88号)
“关于在研究机构等中实施动物实验的基本指南”
(2006年6月1日，文部科学省告示第71号)
需要说明的是，本研究取得了SMC动物实验委员会的批准，并遵循试验设施确立的关于实验动物管理和福利的指南(株式会社SMC动物试验规则)来进行。
[实验材料与方法]
试剂
阿霉素(盐酸多柔比星)(Adriamycin(Doxorubicin hydrochloride))
名称：盐酸多柔比星
制造商：和光纯药工业
使用动物
物种(系统)：C57BL/6
性别：雄
收货时周龄：8周龄
周龄设定根据：基于制备了AN模型的参考文献13进行设定。
规格：SPF
供应商：日本SLC株式会社。
组构成
组构成如表4所示。
[表4]
表4.组构成表
试验组 阿霉素给药浓度 性别 动物数量
正常组 - 雄 4
阿霉素组 25mg/kg 雄 10
阿霉素+HFD组 25mg/kg 雄 2
模型小鼠的制备
将试验动物保持在保持器中，将阿霉素溶于生理盐水(0.9％盐水)中，以使其具有表4中所示的浓度，并以10mL/kg进行尾静脉给药。将生理盐水以10mL/kg对正常组进行尾静脉给药。制备方法，参考制备AN模型的参考文献13。
一般状态的观察、体重测定
在试验期间实施一般状态的观察、体重测定。发现死亡动物时立即进行剖检。试验日的计算如下所述。
阿霉素给药日：0天(第0天)
一般状态的观察
在体重测定之前进行。对于全部个，观察体外表、营养状态、姿势、行为以及排泄物的异常等一般状态。
剖检
通过心脏取血处死各剖检动物并摘取肾脏。将摘取的肾脏浸入Bouin固定液(Sigma-Aldrich Japan)中，在室温下固定24小时，然后进行石蜡包埋。将中心片在液氮中冷冻并用于基因分析，将下部片用4％多聚甲醛(paraformaldehyde)-PBS固定5小时，然后浸入20％蔗糖(sucrose)-PBS中，包埋在OCT-化合物中，并通过液氮冷冻后在-80℃下保存。
肾脏组织分析
天狼星红染色
将石蜡切片进行脱石蜡-亲水性化之后，浸渍于0.03％Picro-天狼星红溶液(天狼星红：Waldeck株式会社)60分钟。通过0.5％乙酸溶液和RO水后，将其封入Enterellan-new(Merck株式会社)中。使用明视野显微镜(Leica Microsystems)观察样品。基于使用CCD相机(Leica Microsystems)拍摄的图像，使用ImageJ软件(National Institute ofHealth)，测定每个视野中的拍摄面积、及天狼星红阳性面积。其结果，与阿霉素+HFD组相比，在阿霉素组中显示出天狼红染色阳性面积比的显著增加，并且观察到由HFD负载引起的胶原蛋白积蓄的增加(图5-1、5-2)。
F4/80免疫染色
用丙酮固定由冷冻块制得的冷冻切片，在0.03％过氧化氢水溶液中进行内源性过氧化酶的抑制。将封闭液(Blockace,DSpharmabiomedical)在常温下反应10分钟后，将200倍稀释的F4/80抗体(BMAbiomedical)在4℃下反应一晚。在用PBS洗涤后，将25倍稀释的过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体(Invitrogen)在常温下反应30分钟。通过发色基质(SimpleStain DAB，Nichirei Bioscience)使其发色，并用Aquatechs(Merck株式会社)来密封。使用明视野显微镜(Leica Microsystems)观察样品。基于使用CCD相机(LeicaMicrosystems)拍摄肾小球而取得的图像，使用ImageJ软件(National Institute ofHealth)，测定拍摄面积、及F4/80阳性面积。其结果，与阿霉素组相比，阿霉素+HFD组中显示出F4/80免疫染色阳性面积比的显着增加，并且观察到由HFD负荷引起的炎症细胞向肾小球内浸润的亢进(图6-1、6-2)。
基于使用明视野显微镜拍摄而得的图像，使用ImageJ计算F4/80阳性面积比(炎症面积)(Inflammation area)(％)。
统计分析的流程
对于各组的平均值之差，使用Prism4(GraphPad Software，Inc.)并通过T检验(Student t-test)对正常组和阿霉素给药组、阿霉素给药组和阿霉素+HFD组进行比较。
每组的平均值表示为mean±SD，并且分别以5％的显着性水平进行测定。
[参考文献]
9.CKD诊断指南2009日本肾脏学会编东机医学社
10.大鼠和小鼠肾功能低下模型的简便制备方法，高山纯二，日本药理志_2008,131_37-42
11.Models of chronic kidney disease,Hai-chun yang,et al,Drug discovToday Dis models_2010,7_13-19
12.Model of robust induction glomerulosclerosis in mice:Importance ofgenetic background,Li-jun Ma,et al,Kidney International 2003,64_350-355
13.Resolvin D1 Protects Podocytes in Adriamycin-induced Nephropathythrough Modulation of 14-4-4βAcetylation,Xueming Zhang,et al,Plos one 2013,8_1-17
实施例4：使用了高脂肪饮食负荷心纤维化模型的纤维化评价试验
[试验背景和目的]
心脏炎症、纤维化与心力衰竭、心肌梗塞密切相关(参照参考文献14)。对于心脏病尚未确立有效的治疗，期望阐明心脏炎症和纤维化的机制，并开发治疗药物。
已报道多柔比星诱导性模型作为心纤维化模型(参照参考文献15)。本次，使多柔比星诱导性模型负荷有高脂肪饮食，并研究其对心纤维化进行的影响。
[遵守标准和基准指南]
动物福利
“关于动物爱护和管理的法律”
(1973年10月1日法律第105号、2011年8月30日法律第105号最终修订)
“关于实验动物的饲养及保管和疼痛的减轻的标准”
(2006年4月28日环境省告示第88号)
“关于在研究机构等中实施动物实验的基本指南”
(2006年6月1日，文部科学省告示第71号)
需要说明的是，本研究取得了SMC动物实验委员会的批准，并遵循试验设施确立的关于实验动物管理和福利的指南(株式会社SMC动物试验规则)来进行。
[实验材料与方法]
试验物质
名称：多柔比星(盐酸多柔比星，Sigma-Aldrich)(Doxorubicin(Doxorubicinhydrochloride、Sigma-Aldrich))
储存方式：冷藏(2-8℃)
给药溶液的制备
多柔比星给药溶液的制备
制备方法：将多柔比星溶于生理盐水中并使得浓度为3mg/mL。
制备频率：在使用前使用时制备
保存方法：室温
使用动物
试验动物
物种(系统)：C57BL/6
性别：雄
收货时周龄：9周龄
周龄设定根据：基于制备了心纤维化模型的参考文献15进行设定。
规格：SPF
供应商：日本SLC株式会社.
分组
将给药开始日前一天的体重作为指标，以使平均体重变得均匀的方式来分成4组(6只/组)。组构成如表5所示。
[表5]
表5.组成分表
心纤维化模型小鼠的制备
用生理盐水将多柔比星制成5mg/mL的浓度，并且使用微量注射器以5mL/kg对10周龄C57BL/6小鼠进行腹腔内给药。将生理盐水以5mL/kg对空白对照组进行腹腔内给药。制备方法基于制备了心纤维化模型小鼠的参考文献16进行设定。
在试验期间，空白对照组(Vehicle)+HFD组和多柔比星+HFD组可自由地摄取高脂肪饮食(与实施例1相同)。
一般状态的观察和体重测定
在试验期间进行一般状态的观察、体重测定。当发现死亡动物时，立即进行剖检。试验日的计算如下所述。
心纤维化模型小鼠制备开始日：0天(第0天)
一般状态的观察
在体重测定之前进行。对于全部个体，观察体外表、营养状态、姿势、行为和排泄物的异常等一般状态。
剖检
在第28天，通过腹部主动脉放血处死所有计划剖检动物，并摘取心脏。将摘取的心脏用横截面分成两份，将两片浸入10％福尔马林固定溶液(和光纯药株式会社)中，在室温下固定24小时后，用70％乙醇平衡化。之后，用乙醇进行脱水，用二甲苯进行渗透，并进行石蜡包埋。
病理组织学性检查
天狼星红染色
将石蜡切片进行脱石蜡-亲水化，然后浸入0.03％Picro-天狼星红溶液(天狼星红：Waldeck株式会社)中60分钟。脱水-渗透后，将其密封在Enterellan-new(Merck株式会社)中。其结果，与多柔比星组相比，多柔比星+HFD组显示出天狼星红染色阳性面积比的显着增加，并且观察到由HFD负荷引起的胶原蛋白积蓄的增加(图7-1、7-2)。
基于使用明视野显微镜(Leica Microsystems)拍摄的图像，使用ImageJ计算胶原蛋白阳性面积比(纤维化面积)(Fibrosis area)(％)。
统计分析的流程
对于各组的平均值之差，使用Prism6(GraphPad Software，Inc.)并通过Studentt-检验对下述1)～3)的组合进行分析。
1)空白对照(Vehicle)组vs.空白对照(Vehicle)+HFD组
2)空白对照(Vehicle)组vs.多柔比星组
3)空白对照(Vehicle)组vs.多柔比星+HFD组。
各组的平均值表示为平均值±SD(mean±SD)，并且分别以5％的显着性水平进行测定。
[参考资料]
14.Edgley AJ et al,Cardiovasc Ther.,2012,30,1,e30-40
15.Hagir B.Suliman et al.,J Clin Invest.,2007,117,12,3730-3741
实施例5：对于肝癌的模型动物的开发
[试验目的]
在抗肿瘤药物的评价中，已经开发了许多实验模型用于药效评价试验。在许多癌模型小鼠中，已经使用了使用人的癌细胞的异种移植模型(xenograft)，但是存在对于癌发展过程和包含微环境的癌组织结构的再现性较低的问题。另一方面，虽然化学致癌模型被认为是更接近临床病态的模型，但是存在缺乏便利性或评价时间这样的问题。
本次，作为用于针对肝癌开发治疗药物的模型动物，将对没有糖尿病背景的、DEN-CCl4给药的小鼠模型进行研究(参照参考文献16)。另外，为了研究与高脂肪饮食(与实施例1相同)负荷组合的协同效果，设定进行DEN-CCl4给药和HFD负荷的组，并同样地饲养147天并处死。
[遵守标准和基准指南]
动物福利
“关于动物爱护和管理的法律”
(1973年10月1日法律第105号、2011年8月30日法律第105号最终修订)
“关于实验动物的饲养及保管和疼痛的减轻的标准”
(2006年4月28日环境省告示第88号)
“关于在研究机构等中实施动物实验的基本指南”
(2006年6月1日，文部科学省告示第71号)
需要说明的是，本研究取得了SMC动物实验委员会的批准，并遵循试验设施确立的关于实验动物管理和福利的指南(株式会社SMC动物试验规则)来进行。
[实验材料与方法]
使用动物
试验动物
购入在妊娠14日的20只雌性SPF小鼠(B6C3F1/S1，日本SLC株式会社)，并进行检疫、驯化饲养。使所有动物自然分娩，并将出生的雄性用于模型动物制备。需要说明的是，出生4周龄后断奶。
组构成
组构成如表6所示。
[表6]
表6.组成分表
试验组 性别 动物数量
正常组 雄 5
DEN-CCL4组 雄 12
DEN-CCL4+HFD组 雄 10
模型小鼠的制备
用PBS将DEN(N-亚硝基二乙胺(N-nitrosodiethylamine)，Sigma-Aldrich Japan株式会社)调整为0.2mg/mL浓度，并以50μL/只(0.01mg/只)对2周龄的雄性进行一次腹腔内给药。之后，使其被母动物哺育直至断奶，在出生后28±2天断奶。
用橄榄油(Sigma Aldrich Japan株式会社)将CCl4(四氯化碳，Sigma-AldrichJapan株式会社)调整为5％v/v浓度，并从8周龄开始以100μL/只，每周两次进行腹腔内给药。同样地将橄榄油给药于PBS组和DEN组。
一般状态的观察、体重测定以及摄食量测定
在试验期间实施一般状态的观察、体重测定以及摄食量测定。当发现死亡动物时，立即进行剖检。试验日的计算如下所述。
心纤维化模型小鼠制备开始日：0天(第0天)
8周龄CCl4给药开始日：0天(第0天)
一般状态的观察
在体重测定之前进行。对于所有个体，观察体外表、营养状态、姿势、行为和排泄物的异常等一般状态。
剖检
在第147天，对所有剖检动物，在异氟烷麻醉下使用肝素作为抗凝血剂从心脏采集血液。采血后，摘取肝脏。对于肝脏，肉眼测定肝脏表面的最大直径为2mm以上的肿瘤或结节的数量和直径，并记录。其结果，与DEN-CCl4组相比，DEN-CCl4+HFD组中显示出肿瘤的尺寸和肿瘤的数量显着增加，并且观察到由HFD负荷引起的致癌的促进(图8-1、8-2)。
就摘取的肝脏而言，将左外叶分成六等份，并将两片浸入Bouin固定液(Sigma-Aldrich Japan株式会社)中，在室温下固定24小时，然后进行石蜡包埋以制备石蜡块。将其他两片包埋于装满O.C.T.化合物(Sakura Finetek Japan株式会社)的cryodish(株式会社硝英制作所)中，立即在液氮中冷冻，并保存于-80℃下。冷冻保存其他肝脏片。
天狼星红染色
将石蜡切片进行脱石蜡-亲水化，然后浸入0.03％Picro-天狼星红溶液(天狼星红：Waldeck株式会社)60分钟。通过0.5％乙酸溶液和RO水后，将其密封在Enterellan-new(Merck株式会社)中。使用明视野显微镜(Leica Microsystems)观察样品。使用CCD相机(Leica Microsystems)在100倍的视野下，每个切片拍摄5个视野的照片。基于拍摄的图像，使用ImageJ软件(National Insititute of Health)测定各视野中的拍摄面积、天狼星红染色阳性面积。其结果，与DEN-CCl4组相比，DEN-CCl4+HFD组中显示出天狼红染色阳性面积比的显著增加，并且观察到由HFD负荷引起的胶原蛋白积蓄的增加(图9-1、9-2)。
p53免疫染色
用丙酮固定由冷冻块制得的冷冻切片，在0.03％过氧化氢水溶液中进行内源性过氧化酶的抑制。将封闭液(Blockace,DSpharmabiomedical)在常温下反应10分钟后，将100倍稀释的抗p53抗体(abcam)在4℃下反应一晚。在用PBS洗涤后，将25倍稀释的过氧化物酶标记的抗兔IgG山羊抗体(Vector)在常温下反应30分钟。通过发色基质(Simple StainDAB，Nichirei Bioscience)使其发色，并用Aquatechs(Merck株式会社)来密封。使用明视野显微镜(Leica Microsystems)观察样品。使用CCD相机(Leica Microsystems)在以中央静脉为中心的200倍的视野下，每个切片拍摄5个视野的照片。基于拍摄的图像，使用ImageJ软件(National Institute of Health)测定各视野下的拍摄面积、p53阳性面积。其结果，与DEN-CCl4组相比，DEN-CCl4+HFD组中显示出p53染色阳性面积比的显著增加，并且观察到由HFD负荷引起的p53蛋白质积蓄的增加(图10-1、10-2)。在正常小鼠的肝脏切片中，未检测到p53阳性区域(图10-1、10-2)。
统计分析的流程
对于各组的平均值之差的测定，使用Prism6(GraphPad Software，Inc.)并通过T检测(Student t-test)对正常组和DEN-CCl4组、DEN-CCl4组和DEN-CCl4+HFD组进行比较。
每组的平均值表示为平均值(mean±SD)，并且分别以5％的显着性水平进行测定。
[参考文献]
16.The DEN and CCl 4-model of fibrosis and inflammation-associatedhepatocellular carcinoma,Takeki Uehara,et al,Curr.Protoc.Pharmacol,_2015,30_1-10
产业实用性
本发明的呈现出蛋白质凝聚性病变的非人动物，可用于筛选疾病的预防或治疗药物，和用于评价药物的副作用等。

Claims (15)

1.一种非人动物，其呈现出由蛋白质凝聚引起的退行性症状，其中，
由蛋白质凝聚引起的退行性症状是由蛋白质的错误折叠而诱导的，并且所述退行性症状得到了促进。
2.根据权利要求1所述的非人动物，其中，
由蛋白质凝聚引起的退行性症状基于具有细胞毒性的化学物质而被诱导。
3.根据权利要求2所述的非人动物，其中，
具有细胞毒性的化学物质为：
(1)二乙基亚硝胺和四氯化碳的组合、
(2)2-氨基-1-甲基-6-苯基-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶、
(3)链脲佐菌素、
(4)阿霉素、或
(5)多柔比星。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的非人动物，其中，
所述退行性症状的促进通过诱导过氧化脂质的产生来进行。
5.根据权利要求4所述的非人动物，其中，
所述诱导过氧化脂质的产生通过喂食高脂肪食物来进行。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的非人动物，其中，
所述非人动物是由蛋白质凝聚引起的退行性疾病的模型动物，所述退行性疾病选自(1)肝癌、(2)帕金森病、(3)阿尔茨海默病、(4)慢性肾病、以及(5)心纤维化。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的非人动物，其中，
所述非人动物是选自下述动物中的、由蛋白质凝聚引起的退行性疾病的模型动物：
(1)由于二乙基亚硝胺和四氯化碳的组合、以及喂食高脂肪食物而产生肝癌的模型动物；
(2)由于2-氨基-1-甲基-6-苯基-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶、并喂食高脂肪食物而产生帕金森病的模型动物；
(3)由于链脲佐菌素、并喂食高脂肪食物而产生阿尔茨海默病的模型动物；
(4)由于阿霉素、并喂食高脂肪食物而产生慢性肾病的模型动物；
(5)由于多柔比星、并喂食高脂肪食物而产生心纤维化的模型动物。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的非人动物，其中，
所述非人动物是啮齿类动物。
9.根据权利要求8所述的非人动物，其中，
所述啮齿类动物是小鼠。
10.一种制备呈现出由蛋白质凝聚引起的退行性症状的非人动物的方法，其包括以下(1)和(2)：
(1)在非人动物中，诱导蛋白质的错误折叠，并在非人动物中引发由蛋白质凝聚引起的退行性症状；以及，
(2)对非人动物进行由蛋白质凝聚引起的退行性症状的促进措施。
11.一种呈现出由蛋白质凝聚引起的退行性症状的非人动物，其进行了2-氨基-1-甲基-6-苯基-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶给药。
12.一种呈现出由蛋白质凝聚引起的退行性症状的非人动物的制备方法，其包括进行2-氨基-1-甲基-6-苯基-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶给药。
13.一种蛋白质凝聚性疾病的预防或治疗药物的筛选方法，其包含以下(a)～(c)：
(a)将试验物质向权利要求1～9以及11中任一项所述的非人动物进行给药；
(b)评价试验物质是否对由蛋白质凝聚引起的退行性症状具有改善作用；以及
(c)将对由蛋白质凝聚引起的退行性症状具有改善作用的试验物质选择为作为蛋白质凝聚性疾病的预防或治疗药物。
14.一种评价试验药物的副作用的方法，其包括以下(a)和(b)：
(a)将试验药物向权利要求1～9以及11中任一项所述的非人动物进行给药；
(b)评价试验药物是否对由蛋白质凝聚引起的退行性症状具有作用。
15.一种生物样品，其由权利要求1～9以及11中任一项所述的非人动物制备而得到，其包含由蛋白质凝聚引起的退行性部位。
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