CN102539759B

CN102539759B - 符合个体化差异的最适益生菌的筛选方法

Info

Publication number: CN102539759B
Application number: CN201110448545.5A
Authority: CN
Inventors: 许清祥; 吕春美; 李欣桦; 王樱谕; 薛如婷; 赖订颖
Original assignee: Bio Ray Biotech Co ltd
Current assignee: Bio Ray Biotech Co ltd
Priority date: 2010-12-24
Filing date: 2011-12-21
Publication date: 2015-08-05
Anticipated expiration: 2031-12-21
Also published as: CN102539759A; TWI503545B; TW201226901A

Abstract

本发明是有关于一种符合个体化差异的益生菌筛选方法，此筛选方法可用于分析不同免疫调节剂对于人体免疫系统的影响，并快速且大量筛选不同种类的免疫调节剂，得以快速、准确筛选出最能调节个人免疫细胞的免疫调节剂。

Description

符合个体化差异的最适益生菌的筛选方法

技术领域

本发明涉及一种利用免疫学原理来筛选免疫调节剂的方法，特别是指一种用于快速准确筛选出最能调节个人免疫细胞产生的免疫调节剂。

背景技术

人类基因体计划将人类基因进行解码，发现所有人的基因组99.9％的部分都是相同的，但这并不意味着人与人之间基因组的不同之处并不重要。对于不同种族、不同生理状况、不同的疾病反应等，都可能因0.1％的差异所造成的。由于0.1％遗传基因的差异，造成个体化基因的差异，必须为个人量身打造专属的医疗计画，才能真正符合个人健康状态的需求。因个体的差异需选择医疗方式，在现代医疗多是利用分子诊断检验，使病患能使用到较适合自己的药物，以便达到更好的疾病控制。如罗氏药厂，利用其于制药技术与诊断的双重优势，开发尽可能符合病患需求的药物；如乳癌，则以侦测乳癌的生长因子(HER2)是否存在，来鉴别HER2过度表现的病患，以协助医师判断该病患适合的标靶疗法；或针对大肠直肠癌的患者，以「K-RAS基因突变检验」辨识出肿瘤专一性突变，并借此预估大肠直肠癌患者的预后情况等。而类似这样的检验方法可协助医师依据病患的基因突变状态，给予特定病患适当的药物。目前分子生物研究的结果，逐渐了解用药风险乃来自个人基因的差异。

有别于药物利用基因检验的方式，利用免疫调节剂的筛选也可以符合个体差异，因为个人遗传基因背景不同，对于不同的免疫调节剂，会产生不同的免疫反应，且可预期免疫调节剂可能产生的反应，减少副作用的产生。

免疫调节剂筛选平台其适应症包括：如病毒感染、反复感冒、季节流感、肠胃炎、泌尿道感染等因病毒感染索引发的疾病；过敏性疾病，如食物过敏、荨麻疹、过敏性鼻炎等过敏疾病；自体免疫疾病，如类风湿性关节炎、僵直性脊椎炎、红斑性狼疮等因自体免疫系统失衡所导致的疾病；癌症抑制或预防，如大肠癌、胃癌、肝癌等癌症。

免疫调节剂可为药物、化合物、蛋白质、酵素、多醣体、益生菌、真菌等材料。「药物」乃指具有疗效，能治疗疾病(或减轻病患的痛苦)，具有有效性且具有安全性，不致使人产生副作用的物质；「化合物」是由不同种类的原子以固定的比例组成的物质，目前多以化学合成进行量产及应用；「蛋白质」是一种含氮、氧、氢、碳、硫的有机化合物，是构成生物体最重要的部分，可促进人体成长与维持健康的物质；另外「酵素」乃指生物体内进行新陈代谢作用所需要的有机催化剂；「多醣体(polysaccharides)」的定义，代表是10个以上的单糖(如葡萄糖，果糖等)所连结而聚合而成的化合物；「益生菌」的定义是对人体健康有帮助的微生物，包括细菌(如乳酸菌、酵母菌)、药用真菌(牛樟芝、北虫草)，根据研究益生菌能够有效刺激免疫系统产生干扰素，直接改变人体免疫能力。利用微生物与人体免疫系统间密切的互动关系，改变人体的免疫系统，让失衡的免疫系统趋于平缓稳定于此筛选方法中最重要的是利用利用不同细胞激素产生的免疫反应作为检测指标，进行不同疾病最适当且符合个体化差异的免疫调节剂的筛选。细胞激素(Cytokines)是一些小分子蛋白或胜肽，其分子量约为8～30kDa，其特征有：1)为低分子量的蛋白质或醣蛋白(glycoproteins)；2)几乎所有的细胞都会产生部分细胞激素；3)单一细胞激素可能会由多种细胞分泌；4)细胞激素的分泌多是由细胞诱发而非由合成的；5)一种细胞激素可能影响多个生物反应；6)多种细胞激素可能产生相同的免疫反应。细胞激素会在细胞感染或组织受损时发挥重要的防御和修复功能，因此细胞激素与免疫力具有关联性。除了调节主动与被动免疫系统之外，细胞激素也会影响细胞的生长、分化、胚胎着床和胎儿发育，甚而影响非免疫系统相关的疾病。当身体有感染、外伤或炎症产生时，会刺激巨噬细胞产生各种细胞激素，如IL-1、TNF-α分泌自组织的巨噬细胞(Macrophages)，又如细菌或病毒会刺激其他细胞，如纤维母细胞(fibtoblasts)和血管内皮细胞(endothelialcell)产生细胞激素。细胞激素包括生长因子(growth factors)、colony stimulating factor、transforming factors、Interleukins(IL)、Interferons(IFNs)、Cytolysins等。利用不同细胞激素具有不同的调控功能来进行免疫调节剂的筛选，如IL-1，可抗感染、抑制癌症细胞增生；IL-2，促使体内B细胞及体外T细胞的分化；IL-4，调控细胞免疫系统对抗癌细胞；IL-6，具有多重功能，如刺激B-cell的生长、造血前驱细胞(Hematopoietic progenitor cells)的成熟及活化T-cell；G-CSF(Granulocyte colony-stimulating factor)刺激并调控嗜中性白血球(neutrophils)及单核白血球(monocytes)的功能；Tumor necrosis factor(TNF-α)，可对抗肿瘤细胞的细胞毒性；干扰素(IFNs)，有免疫调节的功能，可以对抗病毒及抑制癌细胞增值的功能等。

干扰素(INF,Interferon)，是免疫系统中重要的细胞激素，属于先天免疫系统的一环，是身体的第一道防线，当细胞受到病毒入侵即会立即产生干扰素，并借此对其他的细胞发出警讯，做好抵抗病毒入侵的准备；属于多功能性的免疫分子，主要作用为抗病毒感染、抗肿瘤以及调节身体免疫能力。干扰素是免疫系统健康的最佳指标，干扰素的分泌能使免疫系统防线更加健全，如果能调节人体免疫细胞干扰素的分泌，就能够预防或治疗多种疾病。干扰素除了抗病毒外，还具有抑制癌细胞生长、促进细胞分化和增强免疫力的功能。干扰素在病毒入侵时，会伴随着一些被病毒感染后的症状，如发烧反应、发炎现象等。干扰素有三种，为alpha、beta、及gamma。干扰素-alpha&beta(IFN-α、IFN-β)非常相似，在作用机制上相当类似，甚至在细胞壁上也是使用同一个受体。然而，干扰素-gamma(IFN-γ)就不同了，它有一个属于自己的专用受体，除了可以立即抵抗病毒活性外，还与免疫系统中许多相当重要的活化作用有关，比如说抗原呈现的步骤。而抗原呈现则可让免疫系统针对单一病原体(如病毒或致病菌)产生专一性性抗体，并激发免疫细胞去吞噬或摧毁病毒或致病菌。干扰素-γ(IFN-γ)，也称为免疫或II型干扰素，是一种亲多组织的细胞激素(pleiotropic cytokine)，可调控所有的免疫及发炎反应，包括激活、生长和分化T细胞(T-cell)、B细胞(B-cell)、巨噬细胞(Macrophage)，NK细胞(NK-cell)和其他类型的细胞，如血管内皮细胞和纤维母细胞。IFN-γ的产生可使Th1细胞分化。相对于I型干扰素，干扰素-γ是被视为是比抗病毒药剂更重要的免疫调节剂，能增强细胞毒性T细胞活性、巨噬细胞和自然杀手细胞，并具有抗增殖作用。另外干扰素-γ(Interferon-γ)，也是调控先天免疫和后天免疫对病毒或细菌感染细胞及肿瘤的控制最关键的因素之一。干扰素-γ分泌的异常将造成自体免疫疾病及免疫系统失衡的疾病。IFN-γ在免疫系统的重要性源自于它能够直接抑制病毒复制，更重要的是，其免疫刺激和免疫调节的作用机转。

细胞介白素或白介素(interleukin)是一种细胞激素。细胞介白素可以由多种细胞产生，如巨噬细胞(macrophages)、辅助型T细胞、肥大细胞(mast cells)、上皮细胞(endothelium)、monocytes、骨髓基质(Bone marrow stroma)及自然杀手细胞(NKcell)。细胞介白素共计33种，在免疫系统的功能占有很大程度的影响，如IL-1，刺激T细胞增生及分化反应，可用在免疫疗法治疗癌症的病人；IL-4，刺激T细胞的增殖(proliferation)，或活化B细胞，为调控过敏反应(IgE)的主要角色的一；IL-10，抑制辅助型T细胞(Th1)产生细胞激素，如IFN-γ、TNF-β及IL-2，维持体内免疫系统的平衡；IL-13，刺激B-Cells生长和分化(IgE),抑制TH1-cells并生成巨噬细胞炎性细胞因子(macrophage inflammatory cytokines)等，由上述数据显示，细胞介白素若有缺陷不足的情形，会导致身体出现自身免疫性疾病或免疫缺陷。科学家最早发现某些乳酸菌菌种与人类单核球或细胞株培养可以增加第一型T细胞素包括珈玛干扰素(IFN-γ)，细胞间白素-12(IL-12)，和细胞间白素-18(IL-18)的分泌，主要的机转在增加细胞内STAT1和STAT3转译分子的磷酸化，增加干扰素的释放。进一步的研究也指出乳酸菌和肠道内皮细胞上的TOLL接受器，尤其是TOLL-2接受器的结合，能活化细胞内的转译蛋白NF-κB移至核内而释放大量细胞素，属于先天免疫(Innate Immunity)的一环。因此某些乳酸菌菌种借由其细胞壁成份(Peptidoglycan)，经由先天免疫系统，确实能活化T细胞的发育。TLR(Toll-like receptor)的功用是协助先天性免疫系统去辨认外来的病原菌，例如TLR3是辨认RNA病毒，TLR4则是辨认革兰氏阴性菌中的脂多醣LPS等，当病原菌入侵人体后，首先由非专一性的树突细胞或巨噬细胞来辨认并迅速引起这些免疫细胞的活化，释放出细胞激素或活化其他细胞(IL-6或IL-12)或造成发炎反应(TNF-α)，此为免疫系统第一道防线的防御；之后，第二道防线由T淋巴球会开始辨认病原菌的蛋白片段以及B淋巴球开始增生并生产专一性的抗体，也借此记忆该病原菌特征，以便再次遭遇时能更快歼灭病原菌。

人体免疫系统中有抑制癌症细胞的机转，就是自然杀手细胞(Nature Killer cell,简称NK细胞)。在1973年美国研究机构发现一群细胞能够有效的杀死癌细胞，而将的命名为自然杀手细胞。自然杀手细胞(NK)存在人体的型态，主要是属于一种大的颗粒型淋巴球，至少70％以上的大颗粒型淋巴球都有自然杀手细胞的活性，而人类体内的大颗粒型淋巴球约占周边血液淋巴球比率的5～8％，周边血液自然杀手细胞所具有的毒杀范围包括(1)黑色素瘤、(2)头颈癌、(3)肺癌、(4)卵巢癌、(5)子宫颈癌、(6)膀胱癌、(7)摄护腺癌、(8)肝癌、(9)胰脏癌、(10)食道癌、(11)乳癌及许多合并的癌症。NK细胞如果数量与功能正常，能够在细胞变异的早期就侦测出异常细胞，并能加以杀灭，就能防止癌症的生成。随着年龄、生活习惯、压力等因素的影响，NK细胞的数量及活性常随之变差，间接或直接导致癌症的发生或恶化，同时在临床上也常观察到癌症病人的NK细胞数量不足或活性下降的现象。一旦人体免疫系统老化，NK细胞的功能下降，产生癌症的机率就会大大的提高。研究指出，癌症病人体内之所以自然杀手细胞较正常人为低的原因：(1)许多癌症病人体内的自然杀手细胞活性比正常的健康人少；(2)肿瘤本身制造一些抑制细胞或抑制因子，导致自然杀手细胞活性降低；(3)晚期癌症病人普遍存在营养不良，亦会导致自然杀手细胞活性降低。

然而因个人遗传基因的差异，即使具有相同疾病施予同一药物却经常产生不同的副作用反应，而造成医师与病人在用药方面的困扰，使医疗效果大打折扣。以中国台湾为例，依据卫生署数据显示，国人常在用药后，发生严重的药物不良反应与副作用，多是因为遗传基因而引发的不同药物反应所引起。免疫调节剂也是一样会因个人遗传基因背景不同，对于不同的免疫调节剂，会产生不同的免疫反应，如何快速的找出适合个人的免疫调节剂，让免疫调节剂功效达到最佳，应用于个人化医疗，为个人量身订做最适合个人体质的免疫调节剂，以达到预防医学甚至疾病治疗的目的，目前并无任何关于此方面的应用与文献。个人化医疗将成为未来医疗市场上最具有发展潜力的项目之一。且若能依据个体化差异提供适合个人的医疗方式，将能提供更完善的个人化医疗照护。

由此可见，上述现有的符合个体化差异的免疫调节剂筛选方法在方法与使用上，显然仍存在有不便与缺陷，而亟待加以进一步改进。为了解决上述存在的问题，相关厂商莫不费尽心思来谋求解决之道，但长久以来一直未见适用的设计被发展完成，而一般方法又没有适切的方法能够解决上述问题，此显然是相关业者急欲解决的问题。因此如何能创设一种新的符合个体化差异的免疫调节剂筛选方法，实属当前重要研发课题之一，亦成为当前业界极需改进的目标。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种符合个体化差异的益生菌筛选方法，本发明乃应用酵素联结免疫计点法(ELISPOT assay)来进行筛选免疫调节剂，其目的在依据个体选择适当的免疫调节剂，是一种快速筛选的平台，可快速准确筛选出最能调节个人免疫细胞产生的免疫调节剂。

本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本发明提出的一种符合个体化差异的最适益生菌的筛选方法，其特征在于其至少包含下列步骤：提供一受检者检体，将该受检者检体分成多个受检者子检体；提供多个种类的益生菌，所述益生菌是选自细菌及食用真菌所组成的群组；将所述受检者子检体分别与所述多个种类的益生菌以酵素联结免疫计点法进行反应，检出多个免疫素的分泌量；自所述免疫素的分泌量中选出一最大值；以及以该最大值的免疫素推知最适合该受检者的益生菌种类,其中所述免疫素为IL-10。

优选地，该筛选方法利用的是免疫学原理的方法-抗原抗体结合反应。

优选地，该酵素联结免疫计点法为侦测细胞分泌细胞激素反应的检验方法。

优选地，所述多个受检者子检体为人类周边血球细胞。

本发明与现有技术相比具有明显的优点和有益效果。借由上述技术方案，本发明符合个体化差异的免疫调节剂筛选方法至少具有下列优点及有益效果：

本发明筛选平台乃利用免疫学原理-抗原抗体结合的相关方法，如酵素免疫分析法(ELISA assay)、酵素联结免疫计点法(ELISPOT assay)分析不同免疫调节剂对于人体免疫系统的影响。其优势为能够快速而大量筛选不同种类的免疫调节剂。

本发明有别于药物利用基因检验的方式来筛选，利用免疫调节剂的筛选符合个体差异，且可预期免疫调节剂可能产生的反应，减少副作用的产生。

本发明利用不同细胞激素产生的免疫反应作为检测指标，进行不同疾病最适当且符合个体化差异的免疫调节剂的筛选。

另一方面，本发明利用个案毒杀癌细胞试验结果，证实食用免疫调节剂筛选方法所筛选出的免疫调节剂，能加强毒杀癌细胞的能力，确实达到免疫调节能力。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举较佳实施例，并配合附图,详细说明如下。

附图说明

图1为不同年龄层个案使用筛选的免疫调节剂后自觉性改善分布情形示意图；

图2为个案使用筛选的免疫调节剂后自觉性改善的分布情形示意图；以及

图3为个案C检体于使用最适免疫调节剂7天后的毒杀癌细胞能力分布情形示意图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明提出的符合个体化差异的免疫调节剂筛选方法其具体实施方式、方法、步骤、特征及其功效，详细说明如后。

1.材料制备

1.1免疫调节剂-益生菌菌种的制备

乃由光晟生物科技(股)公司筛选自新生儿粪便检体的菌种，利用革兰氏染色镜检观察并利用16S rDNA部分序列进行比对及API/Biolog鉴定系统，加以鉴定菌种。此案共采用6株分离株进行免疫调节剂的筛选，分别为Lactobacillus paracasei、Bifidobacterium longum、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus rhamnosus、Enterococcus feecium、Lactobacillus reuteri。将该菌种活化放大后，利用冷冻干燥方式进行冻干，冻干菌粉末检测菌数须大于1.0×10¹¹菌落形成单位/克(CFU/g)。进行细胞实验时，取1克(g)菌粉溶于10毫升(ml)无菌水中，充分均匀混合后，以系列稀释方式，将菌粉混合液稀释至1.0×10⁶～1.0×10⁸菌落形成单位/毫升(CFU/ml)，置于摄氏95度(95℃)水浴槽中加热处理5分钟后，置于摄氏4度(4℃)备用。

1.2真菌菌种分离鉴定与多醣体的制备

真菌分离株共计2株，为中国台湾原生种樟芝菌及蛹虫草菌株BCRC32219(购自食品工业发展研究所)，其中中国台湾原生种樟芝菌具超氧歧化酶，菌丝呈白色尔后会转成红色，且利用PCR放大18S核醣体去氧核醣核酸(rDNA)基因序列进行鉴定确认为中国台湾原生种樟芝菌；而蛹虫草菌株，其购自食品工业研究所BCRC32219。将上述菌种活化放大后，利用冷冻干燥方式进行冻干。进行免疫激活剂筛选试验时，取10克真菌冻干粉末加入50毫升(ml)的热水，充分混合均匀使其完全溶解，95％乙醇充分均匀搅拌后，以每分钟13000转(13000rpm)离心20分钟后，去除上方液体，再以每分钟13000转(13000rpm)离心20分钟进行两次离心，以真空干燥方法并将其烘干即可。以烘干的多醣体粉末进行总多醣体浓度分析，以酚-硫酸法进行总多醣体浓度分析，以可见光分光光度计测定葡萄糖标准溶液及样品溶液在490奈米(nm)的吸光值。由葡萄糖标准溶液的浓度与其吸光值制成标准曲线，将实验样品的吸光值换算成相对应的浓度，即可求得各样品的总多醣浓度。以系列稀释方式，将多醣体混合液稀释至多醣体浓度为10～50微克/毫升(ng/ml)，置于摄氏95度(95℃)水浴槽中加热处理5分钟后，置于摄氏4度(4℃)备用。

1.3人类周边血球细胞(PBMC)制备

1.3.1个案血液样本收集

血液检体来自中国台湾某诊所，收集个案包括姓名、性别、年龄及食用所筛选的免疫调节剂的改善情形数据，以SPSS 17.0统计软体进行分析。

个案收集共计52个检体，收集个案血液检体及个案年龄、性别并追踪服用免疫调节剂月数及服用免疫调节剂后自觉性改善情形数据，自觉性服用改善情形分为「有改善」及「没有改善」两类，追踪月数自1个月至6个月。依据个案数据分布分析结果如表1、表2、表3所示，依据上述个案于年龄层分布上有约计70％多属于50岁以上的检体，而服用免疫调节剂月数部分则以连续服用3个月个案较多(53.8％)。

表1 个案年龄分布

表2 个案性别分布

表3 个案服用月数分布

依据不同年龄层进行自觉性改善情形差异分析，在各年龄层的个案进行改善情形分析具有统计上显著差异(P<0.05)，且各年龄使用免疫调节剂均具有改善效果，尤其以30岁以下及60岁以上的个案，改善情形均达100％，分析结果如表4、图1所示。

表4 不同年龄层自觉性改善情形的差异分析

因采集检体及连续使用月数不同，因此依据个案使用月数进行改善情形的差异分析。依据个案自觉性的改善评估结果，结果如表5、图2所示，个案于使用1个月的期间，均无自觉性改善反应，而自第2个月开始，自觉性改善反应逐渐增加，且连续使用月数较多者，其自觉性改善的比率也较高(P<0.05)，故使用利用此平台所筛选出的免疫调节剂具有改善功效，且会依连续使用月数而增强。

表5 个案使用最适免疫调节剂的自觉性改善分布差异情形分析

1.3.2人类周边血球细胞分离

抽取病人血液约10毫升(ml)，将病人血液沿管壁缓慢加入含有Ficoll-Hypaque(BD Pharmacia,Cat.No.17-1400-02)的离心管中，以冷冻离心机进行梯度离心，以每分钟3000转、10分钟(3000rpm，10min)来进行全血的血球分离，分界面处为周边血球细胞(PBMC)，沉淀物为红血球。将取出的PBMC置于新的15毫升(ml)离心管，并加入10毫升(ml)1×PBS至离心管中，以离心机进行每分钟1500转、10分钟离心(1500rpm,5min)，除去上清液，留下血球细胞pellet。取10毫升(ml)RPMI-1640培养基(含1％Penicillin-Streptomycin及10％Calf serum)至离心管中，来回吸冲20次并避免气泡产生，使血球细胞均匀分布。取血球细胞悬浮液与trypan blue染剂等体积混合，以血球计数盘进行细胞计数。并以RPMI-1640培养基调整血球细胞悬浮液浓度为1.0×10⁶-1.0×10⁸细胞/毫升(cells/ml)。

2.利用酵素联结免疫计点法(ELISPOT assay)进行免疫调节剂刺激PBMC产生IFN-γ及IL-10的分析

酵素联结免疫计点法(ELISPOT assay)源自酵素联结免疫吸附试验法(ELISA assay)，有别于酵素联结免疫吸附试验法，酵素联结免疫吸附试验法需用呈色反应于测定仪上测定吸光度，并与标准曲线比较后推估细胞激素浓度；而酵素联结免疫计点法也是利用呈色反应，在细胞分泌细胞激素的对应位置上显现可辨的斑点，并可直接在显微镜下人工计数斑点或利用ELISPOT辨识系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，计算出分泌该细胞激素的细胞数量。且酵素联结免疫计点法利用细胞平台进行检测，比酵素联结免疫吸附试验法更灵敏、高亲和力、高特异性，能在2.0～3.0×10⁵细胞/毫升(cells/ml)中即可检出1颗可分泌细胞激素的细胞，且在刺激细胞时，不会影响细胞分泌细胞激素的反应。其检测原理乃是利用96孔盘底部PVDF材质薄膜，用来吸附特殊挑选、且无毒性(不含sodium azide、内毒素endotoxin)的单株抗体。当血液检体经过分离后的取得的PBMC(人类周边血球细胞)细胞被加至96孔盘上，利用抗原刺激后将微孔盘放置于是当温度下培养16～24小时后，记忆型T细胞在受抗原刺激数小时后会开始分泌细胞激素，此时局部(在紧靠分泌细胞的周围)分泌出的细胞激素会被PVDF薄膜上特异抗体捕获。微孔盘中的细胞被移除并清洗后，被捕获的细胞激素可进一步使用生物素(Biotin)标记的二次抗体来标志，其后再以结合酵素的Strept-Avidin与之作用，并加入酵素受质使其呈色，有反应作用的细胞会留下染色斑点。

若以干扰素-γ(IFN-γ)及细胞激素IL-10为例，利用酵素联结免疫计点法(ELISPOT assay)进行反应，其反应步骤如下：

1.在无菌操作台中，将已预先涂有单株抗体1-D1/9D7套组平板(precoated mAb1-D1K/mAb 9D7plate)自摄氏4度(4℃)回温至室温后，以无菌1×PBS洗涤4次(200微升/孔)；

2.加入200微升/孔(μl/well)的培养基RPMI-1640(含10％FBS)在室温下进行阻断(blocking)30分钟；

3.去除培养基，以100微升(μl)1×PBS洗涤一次，在吸水纸上轻拍；

4.加入PBMC(细胞浓度调整为1.0×10⁶～1.0×10⁸cells/ml)及适当浓度的免疫激活剂，最后体积约计150微升/孔(μl/well)，此时正对照组为mAb CD3-2同时加入，试验浓度为100ng/ml；

5.将平板(plate)置于摄氏37度5％二氧化碳(37℃5％CO₂)培养箱中反应12～48小时。

6.去除细胞悬浮液，加入200微升/孔(μl/well)1×PBS洗涤五次；

7.稀释侦测抗体7-b6-1-biotin/12-G8-biotin至浓度1微克/毫升(μg/ml)于1×PBS-0.5％FBS(1×PBS含0.5％胎牛血清)，加入100微升/孔(μl/well)稀释的抗体，在室温下反应2小时；

8.去除上清液，加入200微升/孔(μl/well)1×PBS洗涤五次；

9.稀释Streptavidin-ALP(1:1000)于1×PBS-0.5％FBS(1×PBS含0.5％胎牛血清)，加入100微升/孔(μl/well)于室温下反应1小时；

10.去除上清液，加入200微升/孔(μl/well)1×PBS洗涤五次；

11.将呈色剂BCIT/NBT以0.45微米(μm)滤膜进行过滤并加入100微升/孔(μl/well)，至于室温下直到斑点呈现为止；

12.完全显色后，将上清液加入相应的盘中，以蒸馏水充分洗涤膜的两边。吸水纸上轻拍，使膜干燥。保存时，将板倒置以免残留的液体流回膜上一旦膜干燥后，利用显微镜或判读系统即可读取斑点数。将平板(plate)置于室温下避光保存。

本案利用八株益生菌及真菌作为试验，利用酵素联结免疫计点法方法进行个案血液检体免疫调节剂筛选试验，侦测标的为IFN-γ共计52个个案，由IFN-γ筛选结果可发现，个案对于所筛选出最适免疫调节剂的分布情形结果如表6所示，显示52个个案检体对于不同免疫调节剂的反应并不相同，另提供A.B.C三个个案利用此免疫调节剂筛选平台对于不同免疫调节剂的免疫素IFN-γ分泌量分布情形均不相同，且最适的免疫调节剂种类亦不相同，如表7所示，此结果证实利用此平台筛选的免疫激活剂会因个体具有差异性。另利用侦测标的为IL-10共计12个个案，由IL-10筛选结果可发现，个案对于所筛选出最适免疫调节剂的分布情形结果如表8所示，显示12个个案检体对于不同免疫调节剂的反应并不相同；另提供D.E.F三个个案利用此免疫调节剂筛选平台对于不同免疫调节剂的免疫素IL-10分泌量分布情形均不相同，且最适的免疫调节剂种类亦不相同，如表9所示，此结果证实利用此平台筛选的免疫调节剂会因个体具有差异性。

表6 个案检验最适免疫调节剂的分析结果(IFN-γ)分布情形

表7 个案A～C进行免疫调节剂筛选(免疫素IFN-γ)的斑点(ELISPOT)分布

表8 个案检验最适免疫调节剂的分析结果(IL-10)分布情形

表9 个案D～F进行免疫调节剂筛选(免疫素IL-10)的斑点(ELISPOT)分布

3、利用乳酸脱氢酶检验(LDH assay)进行个案血样毒杀癌细胞能力分析

利用CytoNon-Radioactive Cytotoxicity Assay比色的方法，定量侦测细胞死亡时所释出的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase；LDH)，以检视细胞死亡的细胞毒性测试法。利用含四唑盐(tetrazoliumsalt；INT)的基质混合(Substrate Mix)加入培养上清液(culture supernatants)中与乳酸脱氢酶(LDH)反应，产生红色的甲臜(formazan)，以96孔盘读取波长为490奈米(nm)的吸光值，利用红色产物量与死细胞的数量成正比的关系估算毒杀癌细胞能力。利用此方法可侦测经细胞或其他细菌、病毒、蛋白质、化学物质等因素造成的细胞死亡。

其操作步骤为：

1.将含有肝素(Heparine)抗凝剂的采血管以70％酒精擦拭后，置于无菌操作台中，将血液缓慢加入至15ml的离心管中；

2.加入1×PBS buffer与血液进行1:1比例混合均匀后，将混合液缓慢加入装有Ficoll-Hypaque(BD Pharmacia,Cat.No.17-1400-02)的离心管中；以每分钟1500转(1500rpm)的转速离心20分钟；

3.另将细胞株-K562(白血病细胞株)、COLO205(大肠癌细胞株)及HepG2(人类肝癌细胞株)以PRMI-1640medium(含5％胎牛血清，FBS)调整细胞浓度至2×10⁵细胞/毫升(cells/ml)备用。由于COLO205细胞株及HepG细胞株属于贴附型细胞株，故需将培养基移除后，加入1.5毫升(ml)0.25％1×Trypsin-EDTA(GIBCO,Cat No.25200)作用5～10分钟，待细胞漂浮起来后，再加入新鲜的RPMI-1640培养基(medium)至75T flask中，即可进行离心3分钟(每分钟1500转)。

4.将含有血液的离心管小心取出，小心将上层血清层吸取出来后丢弃，接着将白色细胞层取出(即为PBMC)，移至另一支15毫升(ml)的无菌的离心管中，加入1×PBS buffer至体积15毫升(ml)，混合均匀后，每分钟1500转(1500rpm)离心5分钟。

5.去除上清液，加入1毫升(ml)RPMI-1640(含5％FBS)培养基，混合均匀后进行细胞计数。

6.调整PBMC细胞的浓度至2～4×10⁶细胞/毫升(cells/ml)，并各加入100ul的PBMC与细胞株至U型底的酵素联结免疫平板(ELISA plate)中。

7.当细胞均加入至反应槽后，以每分钟1000转(1000rpm)离心4分钟。

8.将平板(plate)包覆铝箔纸放至摄氏37度5％二氧化碳(37℃5％CO₂)的培养箱中，培养4小时。

9.在反应结束前45分钟，加入20微升(μl)的裂解缓冲液(lysis buffer)。

10.以每分钟1000转(1000rpm)离心4分钟，取出50微升(μl)上清液至酵素联结免疫平板(ELISA plate)中，加入50微升(μl)的基質(substrate)混和，室温下避光培养30分钟。

11.反应结束后，加入50微升(μl)的終止溶液(Stop solution)至反应盘中，去除气泡后，以OD₄₉₂进行读值(Infinite M 200,TECAN)分析。

利用个案毒杀癌细胞试验结果，证实使用免疫调节剂筛选方法所筛选出的免疫调节剂，能加强毒杀癌细胞的能力，确实达到免疫调节能力，结果如图3所示，个案C血液检体分离的PBMC与细胞株K562进行共同培养，在使用免疫调节剂前的毒杀癌细胞能力为6.34％，而在其使用最适的免疫调节剂7天后，其毒杀癌细胞能力增加为8.89％，其结果显示使用免疫调节剂筛选平台找出最适免疫调节剂确实能提高毒杀癌细胞能力，达到免疫调节的效果。

另一方面，本发明也提供一种最佳免疫调节剂的筛选方法，可适用于病毒感染、自体免疫疾病、免疫疾病及癌症，其至少包含下列步骤，提供一受检者检体，将该受检者检体分成多个受检者子检体，提供多个种类的免疫调节剂，将该些受检者子检体与该些种类的免疫调节剂以酵素联结免疫计点法检出多个免疫素，自该些免疫素选出一最大值的免疫素，以及以该最大值的免疫素推知该最佳免疫调节剂。其中，该些免疫素可为IFN-γ或IL-10。多个受检子检体为人类周边血球细胞。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内,当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims

1.一种符合个体化差异的最适益生菌的筛选方法，其特征在于其至少包含下列步骤：

提供一受检者检体，将该受检者检体分成多个受检者子检体；

提供多个种类的益生菌，所述益生菌是选自细菌及食用真菌所组成的群组；

将所述受检者子检体分别与所述多个种类的益生菌以酵素联结免疫计点法进行反应，检出多个免疫素的分泌量；

自所述免疫素的分泌量中选出一最大值；以及

以该最大值的免疫素推知最适合该受检者的益生菌种类,其中所述免疫素为IL-10。

2.根据权利要求1所述的符合个体化差异的最适益生菌的筛选方法，其特征在于其中该筛选方法利用的是免疫学原理的方法-抗原抗体结合反应。

3.根据权利要求1所述的符合个体化差异的最适益生菌的筛选方法，其特征在于其中该酵素联结免疫计点法为侦测细胞分泌细胞激素反应的检验方法。

4.根据权利要求1所述的符合个体化差异的最适益生菌的筛选方法，其特征在于其中所述多个受检者子检体为人类周边血球细胞。