CN102539546B - 体液中游离肉碱或总肉碱含量的检测方法 - Google Patents

体液中游离肉碱或总肉碱含量的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种体液中游离肉碱或总肉碱含量的检测方法。体液中游离肉碱包括的检测方法：标准品和内标溶液混匀，同时待测样本和内标溶液混匀；分别加入基质溶液混匀；再加入有机溶剂，混匀，离心；取上清液，加入有机溶剂或纯水定容混匀，取上清液，经液相色谱-质谱分析，定量体液中游离肉碱的含量。体液中总肉碱含量的检测方法，还包括加入氢氧化钾水解液，加热水解；水解结束后，调节溶液PH≤7，加入有机试剂，混匀，离心的步骤。本发明的体液中游离肉碱或总肉碱含量的检测方法特异性强、准确度和灵敏度高、分析时间短。

Description

体液中游离肉碱或总肉碱含量的检测方法
技术领域
本发明涉及一种体液中游离肉碱或总肉碱含量的检测方法。
背景技术
左旋肉碱(L-carnitine)，又称L-肉碱或音译卡尼丁，是一种促使脂肪转化为能量的维生素，对人体无毒副作用。左旋肉碱最突出的生理功能就是作为脂肪酸运输的载体，以乙酰基左旋肉碱的形式将中长链脂肪酸，从细胞线粒体膜外转移到膜内，在线粒体基质中氧化，产生能量。存在于人体的肝脏和肾中产生，并储存在肌肉、精液、脑和心脏中。左旋肉碱的主要功能如下：增强耐力，有利于心脏和血管的保健，有利于消除脂肪肝，促进疲劳恢复等。
如果肉碱不足，则影响细胞内线粒体内的氧化过程，使细胞代谢失衡，进而引发骨骼肌、心肌和肝脏疾病。在骨骼肌方面，肉碱不足可致肌力下降，严重者走路困难和出现肌肉萎缩；在心肌方面，轻者无明显症状，重者可出现充血性心力衰竭；在肝脏方面，当出现肝功能障碍时，可出现恶心、呕吐、肝脏肿大和肝细胞脂肪蓄积，严重时可出现意识障碍。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性强、准确度和灵敏度高、分析时间短的体液中游离肉碱或总肉碱含量的检测方法。
本发明所提供的体液中游离肉碱含量的检测方法，包括如下步骤：
标准品和内标溶液混匀，同时待测血清样本和内标溶液混匀；分别加入基质溶液；再加入有机溶剂，混匀，离心；取上清液，加入有机溶剂或纯水定容混匀，取上清液，经液相色谱-质谱分析，定量体液中肉碱的含量。
本发明的体液中游离肉碱含量的检测方法，其中：所述内标溶液为二甲双胍水溶液或肉碱的同位素溶液。
本发明的体液中游离肉碱含量的检测方法，其中：所述基质溶液为4％的牛血清蛋白溶液或空白血清溶液。
本发明的体液中游离肉碱含量的检测方法，其中：所述有机溶剂为甲醇或乙腈。
本发明所提供的体液中总肉碱含量的检测方法，包括如下步骤：
标准品和内标溶液混匀，同时待测样本和内标溶液混匀；分别加入基质溶液；加入氢氧化钾水解液，加热水解；水解结束后，调节溶液PH≤7，加入有机溶剂，混匀，离心；取上清液，加入有机溶剂或纯水定容混匀，取上清液，经液相色谱-质谱分析，定量体液中肉碱的含量。
本发明的体液中总肉碱含量的检测方法，其中：所述基质溶液为4％的牛血清蛋白溶液或空白血清溶液。
本发明的体液中总肉碱含量的检测方法，其中：所述氢氧化钾水解液为含0.1-1mol/l氢氧化钾的生理盐水溶液。
本发明的体液中总肉碱含量的检测方法，其中：所述有机溶剂为甲醇或乙腈。
本发明的体液中游离肉碱或总肉碱含量的检测方法，特异性强、准确度和灵敏度高、分析时间短，为临床上诊断由于肉碱缺乏引起的疾病提供可靠的实验依据，为遗传代谢病的筛查、产前诊断及优生优育提供有效地检测手段。本发明的体液中游离肉碱或总肉碱含量的检测方法向用于定量的标准品溶液或质控溶液中加入基质溶液，能够大幅度提高加样回收率，从而大大提高检测结果的准确度，消除系统误差；以二甲双胍或同位素标记物为内标，使得目标化合物的识别更为准确，简单经济，定量结果准确。
附图说明
图1为氢氧化钠水解色谱图。
图2为氢氧化钾水解色谱图。
图3为肉碱质谱特征图。
图4为内标质谱特征图。
图5为血清样本肉碱及内标色谱图。
具体实施方式
(一)检测方法
A游离肉碱含量测定：
(1)用移液器移取标准品和内标溶液，同时平行移取待测样本和内标溶液涡旋混匀。
(2)分别加入基质溶液，基质溶液为4％牛血清蛋白溶液或空白血清溶液。
(3)加入有机试剂(如甲醇、乙腈等)，混合均匀，高速离心。
(4)取部分体积的上清液，加入有机试剂或纯水定容，混合均匀。
(5)取上清液，由液相自动进样器进样，经液相色谱柱的色谱分离，再经质谱分析，最终定量分析体液中游离肉碱的含量。
液相色谱条件：
在Waters Atlantis dC18色谱柱上进行分离，流动相为含0.1％甲酸铵的水(V/V)溶液和含0.1％甲酸铵的甲醇溶液(V/V)，采用梯度或等度洗脱方式，流速为200μl/min。
串联质谱条件：
质谱采用电喷雾离子源(ESI)、正离子模式、选择反应监测(SRM)进行定量分析。离子源为ESI源，设置毛细管电压为1000V；喷雾气压为25psi，干燥气温度250℃，干燥气流速9L/min，扫描方式为SRM。
基质溶液对检测值的影响见表1，牛血清蛋白溶液作为标准曲线溶液的基质，可以大大提高加样回收率，从而提高标准曲线定量的准确性，消除基质干扰对标准溶液和样本溶液的不同程度的影响(即不同的质谱响应值的影响)。
表1.不同的基质溶液对加样回收率的影响
B总肉碱含量测定：
(1)用移液器移取标准品和内标溶液涡旋仪混匀，同时平行移取待测样本和内标溶液涡旋混匀。
(2)分别加入基质溶液，基质为4％牛血清蛋白溶液或空白血清溶液。
(3)加入氢氧化钾水解液(含0.1-1.0mol/l氢氧化钾的生理盐水溶液)，混合均匀，加热水解。
(4)水解结束后，加入酸使溶液PH≤7，混合均匀，加入有机试剂(如甲醇、乙腈等)，混合均匀，高速离心。
(5)取部分体积的上清液，加入有机试剂或纯水定容，混合均匀。
(6)取适量上清液，由液相自动进样器进样，经液相色谱柱的色谱分离，再经质谱分析，最终定量分析体液中总肉碱的含量。
肉碱分子结构式如下所示：
液相色谱条件：
在Waters Atlantis dC18色谱柱上进行分离，流动相为含0.1％甲酸铵的水(V/V)溶液和含0.1％甲酸铵的甲醇溶液(V/V)，采用梯度或等度洗脱方式，流速为200μl/min。
串联质谱条件：
质谱采用电喷雾离子源(ESI)、正离子模式、选择反应监测(SRM)进行定量分析。离子源为ESI源，设置毛细管电压为1000V；喷雾气压为25psi，干燥气温度250℃，干燥气流速9L/min，扫描方式为SRM。
两种水解试剂对检测值的影响如图1和2所示，氢氧化钾水解才能达到完全水解的目的，从而达到检测总肉碱的目的。
(二)检测实例
A游离肉碱含量测定：
(1)用移液器分别移取10μl标准品(0.2-6.4mmol/L)和内标二甲双胍水溶液(0.32mg/ml)于离心管中，涡旋仪混匀；同时平行移取180ul血清样本和内标二甲双胍水溶液(0.32mg/ml)涡旋混匀。
(2)分别加入4％的牛血清蛋白溶液180ul，涡旋混匀。
(3)加入甲醇试剂800ul，混合均匀，高速离心。
(4)取部分体积的上清液，加入甲醇定容，混合均匀。
(5)取适量上清液，由液相自动进样器进样，经液相色谱柱的色谱分离，再经质谱分析，最终定量分析体液中游离肉碱的含量。
B总肉碱含量测定：
(1)用移液器分别移取10μl标准品(0.2-6.4mmol/L)和内标二甲双胍水溶液(0.32mg/ml)于离心管中，涡旋仪混匀；同时平行移取180ul血清样本和内标二甲双胍水溶液(0.32mg/ml)涡旋混匀。
(2)分别加入4％的牛血清蛋白溶液180ul，涡旋混匀
(3)加入氢氧化钾水解液(120ul生理盐水加入1.0mol/l的氢氧化钾溶液)，混合均匀，加热水解。
(4)水解结束后，加入盐酸使溶液PH≤7，混合均匀，加入600ul甲醇，混合均匀，高速离心。
(5)取部分体积的上清液，加入甲醇定容，混合均匀。
(6)取适量上清液，由液相自动进样器进样，经液相色谱柱的色谱分离，再经质谱分析，最终定量分析体液中总肉碱的含量。
液相色谱条件：
在Waters Atlantis dC18色谱柱上进行分离，流动相为含0.1％甲酸铵的水(V/V)溶液和含0.1％甲酸铵的甲醇溶液(V/V)，采用梯度或等度洗脱方式，流速为200μl/min。
串联质谱条件：
质谱采用电喷雾离子源(ESI)、正离子模式、选择反应监测(SRM)进行定量分析。离子源为ESI源，设置毛细管电压为1000V；喷雾气压为25psi，干燥气温度250℃，干燥气流速9L/min，扫描方式为SRM。
肉碱标准品及其内标的质荷比特征图如图3和4：
血清样本及其内标的色谱图如图5所示，表明该方法的特异性强、准确度和灵敏度高。
以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (2)

1.一种体液中游离肉碱含量的检测方法，包括如下步骤：
(1)用移液器分别移取10μl标准品和10μl内标二甲双胍水溶液于离心管中，涡旋仪混匀；同时平行移取180ul血清样本和180ul内标二甲双胍水溶液涡旋混匀；所述标准品的浓度为0.2-6.4mmol/L，所述内标二甲双胍水溶液浓度为0.32mg/ml；
(2)向含有标准品溶液的离心管中加入4％的牛血清蛋白溶液180ul，涡旋混匀；
(3)向两个离心管中分别加入甲醇试剂800ul,混合均匀，高速离心；
(4)分别取部分体积的上清液，加入甲醇定容，混合均匀；
(5)再分别取适量上清液，由液相自动进样器进样，经液相色谱柱的色谱分离，再经质谱分析，最终定量分析体液中游离肉碱的含量；
液相色谱条件：
在Waters Atlantis dC18色谱柱上进行分离，流动相为含体积比0.1％甲酸铵的水溶液和含体积比0.1％甲酸铵的甲醇溶液，采用梯度或等度洗脱方式，流速为200μl/min；
串联质谱条件：
质谱采用电喷雾离子源ESI、正离子模式、选择反应监测SRM进行定量分析；离子源为ESI源，设置毛细管电压为1000V；喷雾气压为25psi，干燥气温度250℃，干燥气流速9L/min，扫描方式为SRM。
2.一种体液中总肉碱含量的检测方法，包括如下步骤：
(1)用移液器分别移取10μl标准品和10μl内标二甲双胍水溶液于离心管中，涡旋仪混匀；同时平行移取180ul血清样本和180ul内标二甲双胍水溶液涡旋混匀；所述标准品的浓度为0.2-6.4mmol/L，所述内标二甲双胍水溶液浓度为0.32mg/ml；
(2)向含有标准品溶液的离心管中加入4％的牛血清蛋白溶液180ul，涡旋混匀；
(3)向两个离心管中分别加入氢氧化钾水解液，混合均匀，加热水解；所述氢氧化钾水解液为120ul生理盐水加入1.0mol/l的氢氧化钾溶液；
(4)水解结束后，分别加入盐酸使溶液PH≤7，混合均匀，加入600ul甲醇，混合均匀，高速离心；
(5)分别取部分体积的上清液，加入甲醇定容，混合均匀；
(6)再分别取适量上清液，由液相自动进样器进样，经液相色谱柱的色谱分离，再经质谱分析，最终定量分析体液中总肉碱的含量；
液相色谱条件：
在Waters Atlantis dC18色谱柱上进行分离，流动相为含体积比0.1％甲酸铵的水溶液和含体积比0.1％甲酸铵的甲醇溶液，采用梯度或等度洗脱方式，流速为200μl/min；
串联质谱条件：
质谱采用电喷雾离子源ESI、正离子模式、选择反应监测SRM进行定量分析；离子源为ESI源，设置毛细管电压为1000V；喷雾气压为25psi，干燥气温度250℃，干燥气流速9L/min，扫描方式为SRM。
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