CN102533774A

CN102533774A - 奶牛fgf2基因的单核苷酸多态性序列及其检测方法

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Publication number: CN102533774A
Application number: CN2011104600913A
Authority: CN
Inventors: 王昕�; 张智英; 张婷婷; 李托; 赵志东; 徐华荣
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2011-12-19
Filing date: 2011-12-19
Publication date: 2012-07-04

Abstract

本发明奶牛FGF2基因的单核苷酸多态性序列及其检测方法，属于基因工程技术领域，所述奶牛FGF2基因的单核苷酸多态性序列包括：奶牛FGF2基因第一内含子第11646位为A或G的单核苷酸多态性序列。所述检测方法为以奶牛基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增奶牛FGF2基因；对纯化的PCR产物进行测序，确定奶牛FGF2单核苷酸多态性位点为第11646位A或G。本发明的奶牛FGF2基因的SNP位点与乳脂量和乳脂率、体细胞计数、繁殖力有关；通过对体外受精胚胎的基因型分析，发现该SNP位点与胚胎成活率有关，通过对该基因多态性与性状的关联分析研究，可将该标记位点用于奶牛分子标记辅助育种以及提高体外受精胚胎成活率。

Description

奶牛FGF2基因的单核苷酸多态性序列及其检测方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及奶牛FGF2基因的单核苷酸多态性序列及其检测方法。

背景技术

FGF2是纤维母细胞生长因子家族成员，通过细胞表面的FGF受体(FGFR)调节机体的生长和发育。FGF2诱导的信号转导是正常细胞生长分化所必需的，参与血管新生、胚胎发育、骨骼形成等生理过程。此外，有研究表明，FGF2在某些情况下也可以诱导ES细胞向神经系统分化。成纤维细胞生长因子(FGF)家族调控不同生理时期牛的乳腺发育，而且FGF2在牛发情期和怀孕早期的子宫内膜表达，能够增加滋养外胚层IFN-tau(IFN-τ)的mRNA和蛋白质丰度。IFN-τ是反刍动物怀孕建立的因子，激活子宫内膜腺体中的JAK-STAT通路，是JAK-STAT信号传导途径中的重要一员，在受精和早期胚胎发育中具有重要作用，能够促进反刍动物怀孕的持续，而且多个信号通路都跟IFN-τ的表达有关。

目前国内外对FGF2基因与奶牛的繁殖性状和产奶性状相关性的研究很少。单核苷酸多态性(SNPs)和生产性状间的关联分析表明：FGF2基因与奶牛体细胞数、生产使用年限和胚胎死亡率等性状间存在显著相关，为奶牛的标记辅助选择育种提供理论依据。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供FGF2基因第一内含子中的SNP位点、其确定方法及应用，为提高奶牛的繁殖率和使用年限以及奶牛的分子育种提供理论依据。

本发明的技术方案如下：

奶牛FGF2基因的单核苷酸多态性序列，其中，所述奶牛FGF2基因的单核苷酸多态性序列包括：奶牛FGF2基因第一内含子第11646位为A或G的单核苷酸多态性序列。

一组检测权利要求1所述奶牛FGF2基因的单核苷酸多态性序列的引物，其中，所述引物对的上游引物FGF2-F的序列如序列表3所示，所述引物对的下游引物FGF2-R的序列如序列表4所示。

上述技术方案所述的奶牛FGF2基因的单核苷酸多态性序列的检测方法，包括下述步骤：

以奶牛基因组池DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增奶牛FGF2基因；对纯化的PCR产物进行测序，确定奶牛FGF2单核苷酸多态性位点；

所述的引物对P的上游引物FGF2-In1的序列如序列表1所示，下游引物FGF2-In2的序列如序列表2所示，具体的为：

上游引物FGF2-In1：5’TCAGTCTTCACATCCGTCTCAG 3’，

下游引物FGF2-In2：5’TCATACACTGAAGCCTGAAGC 3’。

上述技术方案所述的奶牛FGF2基因的单核苷酸多态性序列的检测方法，其中，所述检测方法还包括对奶牛FGF2基因单核苷酸多态性序列的鉴定步骤，包括以奶牛FGF2基因为模板，以引物对F为引物，进行PCR扩增；PCR产物用Csp6I限制性内切酶进行酶切后用琼脂糖凝胶电泳进行分离鉴定，根据电泳结果鉴定奶牛FGF2基因第11646位的单核苷酸多态性为：A等位基因为207bp，G等位基因为171bp；

所述引物对F的上游引物FGF2-F的序列如序列表3所示，所述引物对F的下游引物FGF2-R的序列如序列表4所示，具体为：

上游引物FGF2-F：5’CATAGTTCTGTAGACTAGAAG 3’，

下游引物FGF2-R：5’CCTCTAAAGAAGGATTAAGTCAAAATGGGGCTGGTA 3’；

在本技术方案中为了引入Csp6I限制性内切酶的识别位点，所述引物对F为突变引物，下游引物FGF2-R的G碱基为突变碱基(A突变为C)。

上述技术方案所述的奶牛FGF2基因的单核苷酸多态性序列的检测方法，其中，所述鉴定步骤中的PCR反应过程为：95℃变性5min，然后94℃ 45s，退火温度63到50℃ 45s，72℃ 45s，32个循环，每个循环降低2℃，然后72℃延伸8min。

上述技术方案所述的奶牛FGF2基因的单核苷酸多态性序列的检测方法，其中，琼脂糖凝胶的浓度为2％。

本发明具有以下有益效果：

本发明的奶牛FGF2基因的单核苷酸多态性位点是首次发现的新位点，通过对2773个个体的基因型与性状间的关联分析表明该SNP位点与乳脂量和乳脂率、体细胞计数、繁殖力有关；通过对4542个个体外受精胚胎的基因型分析，发现该SNP位点与胚胎成活率有关，通过对该基因多态性的研究，可用于奶牛分子标记辅助育种以及提高体外受精胚胎成活率。

附图说明：

1、图1为FGF2 gene 11646位点的A/G突变图；

2、图2为限制性内切酶Csp6I酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式：

为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1：FGF2基因的SNP位点的检测方法与鉴定

(一)本发明FGF2基因的SNP位点(即第一内含子11646位点的A/G突变)确定步骤：

本发明的FGF2基因第一内含子中的SNP位点的确定方法，包括步骤：

(1)采集2773奶牛个体的血液、牛奶和精液，分别从血液、牛奶和精液中提取奶牛的基因组DNA，利用GFX基因组DNA纯化试剂盒提取(操作步骤按照试剂盒的操作说明进行)，奶牛个体样品采集和来源见表1；

表1样品采集及来源

(2)利用Nanodrop对基因组DNA的浓度进行测定，抽取浓度相同的50个个体的基因组DNA(100ng/μL)，每个个体取4μL，总体积为200μL，混匀，制作池DNA；

(3)根据GenBank(No：NC_007304)公布的奶牛FGF2基因的序列利用Clonemanager软件设计引物，引物序列：

上游引物FGF2-In1：5’TCAGTCTTCACATCCGTCTCAG 3’，

下游引物FGF2-In2：5’TCATACACTGAAGCCTGAAGC 3’；

PCR扩增反应体系为25μL，其中池DNA50ng，上下游引物各50ng，dNTP各200μM，2.5μL 10 buffer，0.5单位 Taq DNA聚合酶(Promega)。PCR反应过程为：95℃变性5min，然后94℃ 45s，退火温度63到50℃ 45s(每个循环降低2℃)，72℃ 45s，32个循环，然后72℃延伸8min。PCR扩增产物的片断大小为476bp.将PCR产物进行切胶纯化；

(4)对纯化后的PCR产物进行测序，从而确定SNP位点，FGF2基因的SNP位点如图1所示，得到奶牛FGF2基因的单核苷酸多态性序列。

(二)个体基因型的鉴定步骤：

(1)由于该位点的突变没有限制性内切酶能够识别，因此设计突变引物，将11649位点的A突变为C，从而能够被Csp6I识别(该酶的识别位点为：

5′-G^TAC-3′

3′-CAT^G-5′)

突变引物序列如下：

上游引物FGF2-F：5’CATAGTTCTGTAGACTAGAAG 3’

下游引物FGF2-R：5’CCTCTAAAGAAGGATTAAGTCAAAATGGGGCTGGTA 3’；

(2)以奶牛FGF2基因的单核苷酸多态性序列为模板，进行PCR反应，PCR反应体系见表2，

表2PCR反应在25μL的体系中进行

反应程序采用Touchdown(降落)PCR：95℃变性5min，然后94℃ 45s，退火温度63℃到50℃ 45s，72℃ 45s，共32个循环，每个循环降低2℃，然后72℃延伸8min。

(3)PCR产物利用Csp6I进行酶切，酶切产物在2.0％的琼脂糖凝胶上进行分离鉴定，从而进行个体基因型的鉴定，酶切体系见表3，A等位基因为207bp，G等位基因为171bp。

表3酶切体系

实施例2：FGF2基因的单核苷酸多态性序列基因型与性状间的关联分析

本发明的FGF2基因第一内含子11646位点的A/G SNP位点，通过对3个不同的荷斯坦奶牛群体共2773个个体基因型鉴定后，利用下列模型进行基因型与性状间的关联分析：

y_ijkl＝μ+s_i+mgs_j+d_ijkτ+f_l+ε_ijkl

式中，y_ijkl为j公畜第i个儿子的第k个女儿的乳蛋白产量和乳蛋白率、乳脂肪含量和乳脂肪率以及生产使用年限；mgs_j为j公畜的随机效应；τ表示副结核分枝杆菌感染效应；d_ijk是假定感染牛和未感染牛分别用数值0或1表示的一个变异指标；f_l表示FGF2基因三种基因型的效应；ε_ijkl表示环境效应。

分析过程利用R程序(2.5.1版本)中的NLME软件包进行分析(http://www.r-project.org)。

(1)最小二乘法分析FGF2基因11646 SNP位点AA，AG和GG基因型与加性效应、显性效应和完全显性的关联分析，在美国UW群体中的分析结果见表4，

表4在美国UW群体中基因型与性状关联分析结果

注：

*P 0.05.

从表4中可以看出，在UW群体中，AG和GG基因型在乳脂量、乳脂率以及使用年限上显著的高于AA基因型个体。

(2)最小二乘法分析FGF2基因11646 SNP位点AA，AG和GG基因型与加性效应、显性效应和完全显性的关联分析，在以色列奶牛群体中的分析结果见表5：

表5在以色列奶牛群体中基因型与性状关联分析结果

从表5中可以看出，在以色列群体中，AG和GG基因型在乳脂量、乳脂率以及体细胞计数上显著的高于AA基因型个体。

(3)另外，对FGF2基因的23SNP和11646SNP两个SNP位点间进行了联合分析，结果见表6：

表6FGF2基因的两个SNP与受精率和胚胎存活率的关系

从表6中可以看出，FGF2基因的两个SNP与受精率和胚胎存活率都有关。

通过对2773个个体的基因型与性状间的关联分析，结果表明该SNP位点与乳脂量和乳脂率、体细胞计数、繁殖力有关。通过对4542个体外受精胚胎的基因型鉴定，发现该SNP位点与胚胎成活率有关。因此，通过对该基因多态的研究开发，可用于奶牛分子标记辅助选择育种以及提高奶牛体外受精的胚胎成活率。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims

1.奶牛FGF2基因的单核苷酸多态性序列，其特征在于：所述奶牛FGF2基因的单核苷酸多态性序列包括：

奶牛FGF2基因第一内含子第11646位为A或G的单核苷酸多态性序列。

2.一组检测权利要求1所述奶牛FGF2基因的单核苷酸多态性序列的引物对，其特征在于：所述引物对的上游引物FGF2-F的序列如序列表3所示，所述引物对的下游引物FGF2-R的序列如序列表4所示。

3.权利要求1所述的奶牛FGF2基因的单核苷酸多态性序列的检测方法，包括下述步骤：

以奶牛基因组池DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增奶牛FGF2基因；对纯化的PCR产物进行测序，确定奶牛FGF2单核苷酸多态性位点为第11646位A或G；

所述的引物对P的上游引物FGF2-In1的序列如序列表1所示，下游引物FGF2-In2的序列如序列表2所示。

4.根据权利要求3所述的奶牛FGF2基因的单核苷酸多态性序列的检测方法，其特征在于：所述检测方法还包括对奶牛FGF2基因单核苷酸多态性序列的鉴定步骤，包括以奶牛基因组为模板，以引物对F为引物，进行PCR扩增，其中引物对F的上游引物FGF2-F的序列如序列表3所示，所述引物对F的下游引物FGF2-R的序列如序列表4所示；PCR产物用Csp6I限制性内切酶进行酶切后用2％琼脂糖凝胶电泳进行分离鉴定，根据电泳结果鉴定奶牛FGF2基因第11646位的单核苷酸多态性为：A等位基因为207bp，G等位基因为171bp。

5.根据权利要求4所述的奶牛FGF2基因的单核苷酸多态性序列的检测方法，其特征在于：所述鉴定步骤中的PCR反应过程为：95℃变性5min，然后94℃ 45s，退火温度63℃到50℃ 45s，72℃ 45s，共32个循环，每个循环降低2℃，然后72℃延伸8min。

6.根据权利要求4或5所述的奶牛FGF2基因的单核苷酸多态性序列的检测方法，其特征在于：琼脂糖凝胶的浓度为2％。