CN102526799A - 一种引导牙种植体周围骨再生的几丁糖胶原膜 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种引导牙种植体周围骨再生的几丁糖胶原膜，由I型胶原水溶液与几丁糖乙酸液以体积比1∶2混合冻干而成，膜强度：抗张强度0.532±0.1736MPa，平均孔隙率：90.95%，膜厚度：0.30mm-0.50mm，平均孔径为1.5642万nm，弹性模量20.0±3.29N/mm2，屈服强度0.828±0.0763MPa，断裂伸长率5.4±1.2%。本发明采用自然界来源丰富的几丁糖和生物相容性优良的胶原，经实验证实，本发明对成骨细胞生长无影响，兔背部埋置区无明显炎症反应，生物相容性良好，是一种生物相容性优良、降解时间、强度等理化性能满足引导骨再生的可吸收膜。
Description
技术领域
本发明属牙科生物材料领域，涉及一种引导牙种植体周围骨再生的几丁糖胶原膜，可提高牙科种植体周围骨缺损的再生和种植成功率。
技术背景
引导骨再生技术(GBR, Guided Bone Regeneration) 的使用，使局部骨量不足的患者牙种植成为可能。牙种植技术近年来在我国发展很快，但国内采用种植牙方式修复牙缺损的比例远比欧洲、日本、韩国等低，其中成本高是制约牙种植技术在国内广泛开展的重要因素之一。目前使用的进口可吸收引导骨再生膜(bio-guide)价格昂贵，每一种植单位使用的可吸收膜都在一千元以上，和种植体本身价格相近，这使许多患者难以接受种植修复。几丁糖（学名为β-1,4-聚-葡萄糖胺，Amino-β-1,4-polyglucose;β-(1,4)-2-Amino-2-deoxy-D-glucose，分子式：(C6H11O4N)n ）原料来源丰富、生物相容性优良，将几丁糖与胶原复合研制可吸收生物膜，可解决国产膜强度差和吸收快两大问题，也能减轻患者经济负担。
发明内容
本发明的目的是提供一种引导牙种植体周围骨再生的几丁糖胶原膜，由I型胶原水溶液与几丁糖乙酸液以体积比1：2混合冻干而成，膜强度：抗张强度0.532±0.1736 (MPa)，平均孔隙率：90.95%，膜厚度：0.30mm-0.50mm，平均孔径为1.5642万nm，弹性模量20.0±3.29 (N/mm2)，屈服强度0.828±0.0763MPa，断裂伸长率5.4±1.2 (%)。
本发明的几丁糖胶原膜通过以下步骤制备获得：
（1）几丁糖乙酸液配置：将5g几丁糖（脱乙酰化程度75-85%，粘度200-800厘泊）加入250mL浓度为1%的乙酸溶液混合搅拌24小时，得几丁糖乙酸液；
胶原溶液配置：将生物低抗原性I型胶原（牛皮肤，Sigma-Aldrich公司，美国，产品编号C3511）和双蒸水按1:2比例混合搅拌2小时，得胶原水溶液；
（2）将几丁糖乙酸液与胶原水溶液按体积比2：1混合，搅拌2小时；
（3）用1%的NaOH水溶液调整混合液至中性；
（4）搅拌2小时后高速离心10分钟；
（5）将混合液30ml流注于洁净的玻璃培养皿，在4 oC环境下放置2h，在-20 oC环境下放置12h，在 -80 oC环境下放置2h；
（6）最后将膜材料置于冷冻干燥机内，真空-80 oC条件下冻干24h成型。
本发明特点：（1）采用自然界来源丰富的几丁糖和生物相容性优良的胶原，经细胞培养实验、兔背部肌肉埋植实验，结果显示，本发明对成骨细胞生长无影响，兔背部埋置区无明显炎症反应，生物相容性良好；（2）本发明弹性模量20.0±3.29 (N/mm2)，屈服强度0.828±0.0763MPa，抗张强度0.532±0.1736 (MPa)，与国际常用的Bio-Gide膜平均抗张强度（0.3±0.02MPa）接近，断裂伸长率5.4±1.2 (%)，表面富含孔隙，孔隙分布相对较均匀平均孔隙率为90.95%；（3）本发明生物降解时间满足引导骨再生的要求；（4）表面较平整，厚度在0.30mm-0.50mm之间，与Bio-Gide膜相近。一种生物相容性优良、降解时间、强度等理化性能满足引导骨再生的可吸收膜。
附图说明
图1为本发明的制备工艺流程图。
图2为几丁糖胶原膜成品图。
图3为兔背部肌肉埋植实验。
图4为细胞毒性试验。
图5为几丁糖-胶原膜扫描电镜观察（×50）。
图6为膜结合可注射骨在上颌窦提升牙种植中的作用。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1
参见图1，本发明的几丁糖胶原膜制备方法如下：
（1）将5g几丁糖加入250mL浓度为1%的乙酸溶液混合搅拌24小时，得几丁糖乙酸液；将生物低抗原性I型胶原和双蒸水按1:2比例混合搅拌2小时，得胶原水溶液；
（2）将几丁糖乙酸液与胶原水溶液按体积比2：1混合，搅拌2小时；
（3）用1%的NaOH水溶液调整混合液至中性；
（4）搅拌2小时后高速离心10分钟；
（5）将混合液30ml流注于洁净的玻璃培养皿，在4 oC环境下放置2h，在-20 oC环境下放置12h，在 -80 oC环境下放置2h；
（6）最后将膜材料置于冷冻干燥机内，真空-80 oC条件下冻干24h成型。
获得的膜材料的膜强度：抗张强度0.532±0.1736 (MPa)，平均孔隙率：90.95%，膜厚度：0.30mm-0.50mm，平均孔径为1.5642万nm，弹性模量20.0±3.29 (N/mm2)，屈服强度0.828±0.0763MPa，断裂伸长率5.4±1.2 (%)。
实施例2 兔背部肌肉埋植实验
参见图3，新西兰大白兔36只，体重4kg左右。埋植实验：兔12只，于背部肌肉内埋植几丁糖胶原膜，术后2个月、3个月及5个月各处死4只，取材做HE染色组织学观察。降解实验：兔24只，在背部肌肉内埋植膜材料。植入后1、2、3、4、5、6月，各处死4只，测膜降解率。
图3A是几丁糖胶原膜家兔背部肌肉埋植术后2月，取材时可见肌肉表层缝线；图3B是膜植入后3月局部未见炎症，膜基本完整；图3C是膜植入5月HE染色实验（HE×200），可见膜吸收明显）。
膜生物降解结果参见表1：
表1 几丁糖胶原膜降解吸收率(mean ± S.D, % )
| 1月 | 2月 | 3月 | 4月 | 5月 | 6月 | |
| 几丁糖-胶原膜 | 5.47±0.38 | 5.61±0.32 | 17.31±2.41 | 25.36±3.55 | 30.58±5.31 | ** |
不同时间点比较，1月与2月间吸收率无显著差异( p> 0.05, Independent sample t-tests)，其它组间均有显著差异。每种膜的试件数=12，
* 本组膜材料破碎严重，收集不全。
结论：本发明几丁糖胶原膜材料具有良好的生物相容性，体内能降解吸收，降解过程满足引导骨再生要求。
实施例3 细胞培养实验
参见图4，膜片裁成1×1cm2大小，紫外线消毒备用。浸提介质为DMEM+10%FCS，浸提时使用无菌操作技术，取膜片各30个分别置于细胞培养瓶中，加入浸提液10mL,材料表面积与浸提介质体积之比为6cm2/mL，置于细胞培养箱内（37℃、48h）。
取生长状态良好的犬骨髓基质干细胞用0.25%胰酶消化后，配制成1×104/mL的细胞悬液，分注入96孔细胞培养板中，每孔100μL，置于细胞培养箱（37℃、5%CO2+95％空气）培养。24h后，弃去原培养基，用PBS液洗涤两次，实验组加入膜浸提掖，每孔加入100μL膜材料浸提液；阳性对照组加入100μL纯铅浸提液；阴性对照组每孔加入100μL培养液；空白对照组不接种细胞，加入100μL培养液，以校正OD值。共接种3块培养板。放入上述的培养环境中继续培养，第三天更换培养液一次。
图4A是细胞毒性实验是膜浸提液培养犬骨髓基质干细胞7天（×200），图4B是膜上犬骨髓基质干细胞生长5天(HE×200)。倒置相差显微镜下可见，膜上细胞生长良好，细胞呈圆形或梭形，含单个核，核分裂相多见，第7天基本长满培养板底部。
结论：膜材料对犬骨髓基质干细胞无毒性。
实施例4 几丁糖胶原膜机械特性实验
参见图5，将几丁糖-胶原膜裁剪成标准形状后（ 测试区材料约50mm×4mm），置于万能材料试验机中，进行拉伸测试，测试膜的弹性模量、屈服强度、抗张强度、断裂伸长率。每组测试5个样本，计算平均值。测试条件：20oC，RH:50%，弹性模量测试速度：2mm/min。将几丁糖-胶原膜裁剪成8mm×8mm的方块作为样本，用铝箔固定于样品盘上。将样本表面喷射金粉，用扫描电镜观察膜的表面形貌，孔隙大小及分布。
表2是膜测试结果：弹性模量20.0±3.29 (N/mm2)，屈服强度0.828±0.0763MPa，抗张强度0.532±0.1736 (MPa)，与国际常用的Bio-Gide膜平均抗张强度（0.3±0.02MPa）接近，断裂伸长率5.4±1.2 (%)，表面富含孔隙，孔隙分布相对较均匀平均孔隙率为90.95%；
表2 几丁糖-胶原混合膜拉伸测试结果
| 几丁糖-胶原体积比2：1 | |
| 弹性模量(N/mm2) | 20.0±3.29 |
| 屈服强度(MPa) | 0.828±0.0763 |
| 抗张强度(MPa) | 0.532±0.1736 |
| 断裂伸长率(%) | 5.4±1.2 |
图5显示了所选标本在较高放大倍数（×500）下可见膜的孔隙大小相对较一致，大孔孔径约20.2um，小孔孔径约7.34um。
结论：几丁糖和胶原溶液以2:1体积比制得的膜具有较理想的物理性能，可满足引导骨再生需要。
实施例5 几丁糖胶原膜结合可注射骨在上颌窦提升牙种植中的作用研究
参见图6，6条犬拔除双侧上颌第4前磨牙及第1磨牙，2个月后取髂骨培养成骨细胞。3个月后行双侧上颌窦底提升术，同时每侧植入2枚种植体。上颌窦底及颊侧骨缺损区植入藻酸盐-成骨细胞凝胶，覆盖膜材料做为实验组，不盖膜做为对照。术后2、4、6月取材，X线及免疫组织化学法观察上颌窦底及颊侧骨缺损区骨再生，检验膜及成骨细胞-藻酸盐凝胶的引导骨再生作用。
图6A是种植区覆盖膜材料；图6B是术后2月取标本，颊侧骨缺损愈合，箭头所示为残留膜材料；图6C是实验2个月后，种植体及上颌窦的X线片，可见种植体周围及上颌窦骨密度增高；图6D是术后2月HE染色组织学观察，箭头显示上颌窦底新生骨小梁（HE×40）。
Claims (4)
1.一种引导牙种植体周围骨再生的几丁糖胶原膜，其特征在于，由I型胶原水溶液与几丁糖乙酸液以体积比1：2混合冻干而成，其中膜强度：抗张强度0.532±0.1736 MPa，平均孔隙率：90.95%，膜厚度：0.30mm-0.50mm，平均孔径为1.5642万nm，弹性模量20.0±3.29 N/mm2，屈服强度0.828±0.0763MPa，断裂伸长率5.4±1.2 %。
2.根据权利要求1所述的一种引导牙种植体周围骨再生的几丁糖胶原膜的制备方法，其特征在于通过以下步骤制备获得：
（1）几丁糖乙酸液配置：将5g几丁糖加入250mL浓度为1%的乙酸溶液混合搅拌24小时，得几丁糖乙酸液；
（2）将几丁糖乙酸液与胶原水溶液按体积比2：1混合，搅拌2小时；
（3）用1%的NaOH水溶液调整混合液至中性；
（4）搅拌2小时后高速离心10分钟；
（5）将混合液30ml流注于洁净的玻璃培养皿，在4 oC环境下放置2小时，在-20 oC环境下放置12小时，在 -80 oC环境下放置2小时；
（6）最后将膜材料置于冷冻干燥机内，真空-80 oC条件下冻干24h成型。
3.根据权利要求2所述的一种引导牙种植体周围骨再生的几丁糖胶原膜的制备方法，其特征在于，步骤（1）中几丁糖的脱乙酰度75-85%，粘度200-800厘泊。
4.根据权利要求2所述的一种引导牙种植体周围骨再生的几丁糖胶原膜的制备方法，其特征在于，步骤（2）中胶原溶液配置：将生物低抗原性I型胶原和双蒸水按1:2比例混合搅拌2小时，得胶原水溶液。
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