CN102526170B

CN102526170B - 抗结核杆菌的儿茶提取物组合物、其制备方法及含有它们的药物制剂和应用

Info

Publication number: CN102526170B
Application number: CN201110456939.5A
Authority: CN
Inventors: 许学志
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-12-31
Filing date: 2011-12-31
Publication date: 2015-04-29
Anticipated expiration: 2031-12-31
Also published as: CN102526170A

Abstract

本发明公开了一种抗结核杆菌的儿茶提取物组合物、其制备方法及含有它们的药物制剂和应用，所述儿茶提取物组合物含有纯度50％以上的以儿茶素和/或表儿茶素为主要成分的黄烷类化合物，所述黄烷类化合物的结构式主要为(I)和(II)：其中，R₁，R₂，R₃，R₄，R₅各自独立地选自：氢、C1-C6烷基、β-D-吡喃葡萄糖基、SO₃或PO₃。本发明的儿茶提取物组合物采用色谱方法精制和纯化有效含量高，可以达到99.5％，该儿茶提取物组合物和其药物组合物在制备改善或治疗肺结核病、治疗溃疡性骨结核、爱滋病并发结核病以及治疗耐药结核病，尤其对耐药结核病和爱滋病并发结核病中有极好的治疗效果。

Description

抗结核杆菌的儿茶提取物组合物、其制备方法及含有它们的药物制剂和应用

技术领域

本发明涉及天然药物技术领域，尤其涉及一种抗结核杆菌的儿茶提取物组合物、其制备方法及含有它们的药物制剂和应用。

背景技术

儿茶(catechu)为豆科金合欢属植物儿茶树[Acacia catechu(L.)Willd.]的干枝加水煎汁浓缩而成的干浸膏。在《饮膳正要》、《本草纲目》、《本草求真》、《本草正义》等古籍以及历版《中国药典》中均有记载，具有清上隔热，化痰生津，涂金疮一切诸疮，生肌定痛，止血收湿等功效。用于溃疡不敛，湿疹，口疮，跌扑伤痛，外伤出血等疾病的治疗。

儿茶的现代研究表明其中的主要含有儿茶鞣酸、儿茶素、表儿茶素、赭朴鞣质、非瑟素、槲皮素、槲皮万寿菊素、原儿茶鞣质和焦性没食子酚鞣质、儿茶鞣质、儿茶荧光素、没食子酸、鞣花酸、儿茶酚、儿茶红等，还得到儿茶钩藤碱A～E以及钩藤碱、异钩藤碱、圆叶帽木碱、二氢柯楠因碱等化学成分。实验研究表明与许多中药相似，儿茶的药理活性多种多样，主要有抗菌、抗病毒、调血脂、降血糖、抗癌、抗血小板等药理作用；同时，对心血管和肾脏也有一定影响。有关儿茶化学成及其药理方面的研究可参见井玥，赵余庆，倪春雷，儿茶的化学、药理与临床研究，中草药，2005，36(5)，790-792；尹志萍张古英王建军，儿茶及儿茶素的研究进展，河北医药，2008，30(3)，360-361；李杏翠，王洪庆，刘超，陈若芸，儿茶化学成分研究，中国中药杂志，2010，35(11)，1425-1427。以上文献引入作为参考。

尽管文献报道了通过正相和反相硅胶进行反复多次色谱分离，从包括儿茶的多种植物中得到儿茶素和表儿茶素等单体化合物的方法，但是由于儿茶中化学成分复杂，而儿茶素和表儿茶素等黄烷类化合物结构中存在多个酚羟基，利用适合工业化生产的单次色谱分离技术富集高含量，总含量大于50％，儿茶素和表儿茶素有较大难度，到目前止从未发现儿茶素和表儿茶素的儿茶植物提取物或者儿茶素和表儿茶素单体化合物或混合物具有抗结核杆菌，特别是抗临床耐药结核杆菌的文献报道。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供抗结核杆菌的儿茶提取物组合物、其制备方法及含有它们的药物组合物，获得了有效部位含量为50％以上的提取物，并将其应用于治疗和辅助治疗结核病，尤其肺结核病和爱滋病并发结核病等疾病的药物中的用途，特别是在治疗临床耐药结核病中。

本发明所要解决的问题是通过以下技术方案来实现的：

一种抗结核杆菌的儿茶提取物，该提取物是从中药儿茶膏或其基源植物儿茶中提取含量50％以上的有效部位，有效部位是以儿茶素和/或表儿茶素为主要成分的黄烷类化合物，所述黄烷类化合物的结构式为(I)和(II)：

其中，R₁，R₂，R₃，R₄，R₅各自独立地选自：氢、C1-C6烷基、β-D-吡喃葡萄糖基、SO₃或PO₃。

所述的C1-C6烷基为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基或异丁基。

所述儿茶素和/或表儿茶素的含量为60％-99.5％。

优选所述儿茶素和/或表儿茶素的含量为95％-99.5％。

所述的儿茶提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将中药儿茶即儿茶膏或其基源植物或同属其他植物粉碎，然后用水或50-95％的C1-C6烷醇的水溶液作为溶剂，在0℃至溶剂回流的温度下提取，得到提取液，提取液经常压或减压浓缩得浸膏，或经冷冻干燥得到粉末；

(2)将上述提取得到的浸膏或粉末用色谱方法精制，先用洗脱溶剂洗脱，收集富含有效成分的流份，浓缩、过滤、干燥、检测并收集有效成分为含量50％以上的提取物；

其中所述的色谱方法为大孔吸附树脂柱色谱、正相硅胶、反相硅胶色谱或者其组合。

所述步骤(2)中提取物用凝胶色谱进一步纯化，得到有效成分为大于70％的儿茶提取物。

所述洗脱溶剂为水，C1-C6烷基醇、卤代烃、醚类溶剂、酮类溶剂、酯类溶剂或上述溶剂组成的混合溶剂。所述洗脱溶剂为水，C1-C6烷基醇，如：甲醇、乙醇、异丙醇或正丁醇等，卤代烃，如：二氯甲烷、三氯甲烷等，醚类溶剂，如：石油醚、乙醚、甲基叔丁醚等，酮类溶剂，如：丙酮、2-丁酮等，酯类溶剂，如：乙酸乙酯、甲酸乙酯等，以及由上述溶剂组成的混合溶剂，其中优选的洗脱溶剂为氯仿、乙酸乙酯、乙醇、甲醇和水中的一种或数种混合溶剂。

当用苯乙烯型大孔吸附树脂精制时，洗脱溶剂为水或10-75％的乙醇或甲醇水溶液；当用反相硅胶色谱精制时，洗脱溶剂为水或10-50％的乙醇或甲醇水溶液；当用正相硅胶精制时，洗脱溶剂为石油醚或乙酸乙酯和90-100％乙醇水溶液或甲醇组成的混合溶剂，所述的乙酸乙酯和90-100％乙醇水溶液或甲醇比例为5∶1-2∶1。

其中所述制备方法中，富含儿茶素和表儿茶素衍生物的流份是通过薄层色谱(TLC)和高压液相色谱(HPLC)等方法检测的，其中优选HPLC检测方法。

用以上提取和精制方法制备的儿茶提取物，其中有效成分-儿茶素和表儿茶素衍生物在提取物中的含量可达50％以上。其中大孔吸附树脂法精制更适合于工业化生产。

药物组合物，其中含有上述的儿茶提取物组合物作为有效成分，并含有常规药用载体的载体。

利用本发明方法得到的儿茶提取物可以与药物上可接受的载体一起制成药物制剂，例如：片剂、胶囊、口服液、滴丸或注射剂等。利用本发明方法得到的儿茶提取物制备所需药物的各种剂型时，可以按照药学领域的常规生产方法制备。优选本发明的这类药物制剂可以被口服、肠胃外给药。优选制剂是口服或静脉内给药的。

本发明药物组合物可以按任意口服可接受的剂型口服给药，包括但不限于胶囊剂、片剂、水性混悬剂或溶液剂。在口用片剂的情况下，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还加入润滑剂，例如硬脂酸镁。就按胶囊剂型口服给药而言，有用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当口用需要水性混悬剂时，活性成分是与乳化和悬浮剂联用的。如果需要的话，还可以加入某些甜味剂、矫味剂或着色剂。

本发明药物组合物的无菌可注射形式可以是水性或油性混悬剂。这些混悬剂可以按照本领域已知的技术、利用适合的分散或润湿剂和悬浮剂加以配制。无菌的可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液剂或混悬剂，例如在1，3-丁二醇中的溶液。可以采用的可接受的载体和溶剂有水、林格氏溶液和等渗的氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发油也经常被用作溶剂或悬浮介质。为此，可以采用任何温和的不挥发油，包括合成的单-或二-甘油酯。脂肪酸、例如油酸及其甘油酯衍生物可用于制备注射剂，它们是天然的药学上可接受的油，例如橄榄油或蓖麻油，尤其是它们的聚氧乙基化形式。这些油溶液剂或混悬剂还可以含有长链醇稀释剂或分散剂，例如羧甲基纤维素或相似的分散剂，它们普遍用于配制药学上可接受的剂型，包括乳剂和混悬剂。出于制剂的目的，还可以使用其他常用的表面活性剂，例如吐温类、司盘类，和其他乳化剂或生物利用度增强剂，它们普遍用在药学上可接受的固体、液体或其他剂型的制造中。

所述的儿茶提取物和药物组合物在制备改善或治疗各种结核病的药物中的应用。

所述的儿茶提取物药物组合物在制备改善或治疗肺结核病、治疗溃疡性骨结核、爱滋病并发结核病中的应用以及治疗临床耐药结核病中的应用；还可以外用治疗肛门肛瘘。

如果必要的话，一旦患者的条件有所改善，可以给以本发明化合物、组合物或组合的维持剂量。随后，可以根据症状减少给药的剂量或频率或者剂量与频率至已改善的条件得以保留的水平，当症状已经减轻至所需水平，应当停止治疗。不过，一旦疾病症状有任何复发，患者可能需要在长期基础上接受间歇性治疗。本发明的药物制剂中还可以包含其他用于治疗结核病的活性剂或与其他治疗结核病的药物一起或顺序给药。

本发明的儿茶提取物组合物采用色谱方法精制和纯化有效含量高，可以达到99.5％，该儿茶提取物组合物和其药物组合物在制备改善或治疗肺结核病、治疗溃疡性骨结核、爱滋病并发结核以及治疗耐药结核病，尤其对耐药结核病和爱滋病并发结核有极好的治疗效果，儿茶素和/或表儿茶素的含量越高疗效越好，尤其含量在95％以上时，治疗效果明显提高。

具体实施方式

实施例1：

1.提取：中药儿茶20g，粉碎后加入50％乙醇浸泡提取3次，每次24小时。合并提取液，回收乙醇并浓缩至稠浸膏，加入蒸馏水加热溶解，过滤得澄清滤液。

2.精制：上述滤液通过经处理的HPD-100型大孔吸附树脂，用水和10％、20％、30％、40％、50％、75％的乙醇梯度洗脱，HPLC检测，收集富含儿茶素和表儿茶素衍生物的流份，合并，减压浓缩，冷冻干燥即得提取物9.9g。按照《中华人民共和国药典》标准方法，经过高效液相外标法测定，其中主要有效成分包括儿茶素和表儿茶素的总含量为53.2％。儿茶素和表儿茶素用HPLC方法与化学对照品对照进行鉴定，具体情况见实施例12，下同。

实施例2：

1.提取：中药儿茶20g，粉碎后加入50％乙醇，50℃温浸泡提取3次，每次6小时。合并提取液，回收乙醇并浓缩至稠浸膏，加入蒸馏水加热溶解，过滤得澄清滤液。

2.精制：上述滤液通过经处理的HP-20型大孔吸附树脂，用水和10％、20％、30％、40％、50％、75％的乙醇梯度洗脱，HPLC检测，收集富含儿茶素和表儿茶素衍生物的流份，合并，减压浓缩，冷冻干燥即得提取物8.4g。按照《中华人民共和国药典》标准方法，经过高效液相外标法测定，其中主要有效成分包括儿茶素和表儿茶素的总含量55.6％。

实施例3：

1.提取：中药儿茶20g，粉碎后加入50％乙醇浸泡过夜后，加热回流提取3次，每次3.0小时。合并提取液，回收乙醇并浓缩至稠浸膏，加入蒸馏水加热溶解，过滤得澄清滤液。

2.精制：上述滤液通过经处理的HP-20型大孔吸附树脂，用水、10％、20％、30％、40％、50％和75％浓度的甲醇依次梯度洗，HPLC检测，收集富含儿茶素和表儿茶素衍生物的流份，合并，减压浓缩，冷冻干燥即得植物提取物9.2g。按照《中华人民共和国药典》标准方法，经过高效液相外标法测定，其中主要有效成分包括儿茶素和表儿茶素的总含量54.4％。

实施例4：

1.提取：中药儿茶20g，粉碎后加入75％乙醇浸泡过夜后，加热回流提取3次，每次3.0小时。合并提取液，回收乙醇并浓缩至稠浸膏，加入蒸馏水加热溶解，过滤得澄清滤液。

2.精制：上述滤液通过经处理的HP-20型大孔吸附树脂，用水、10％、20％、30％、40％、50％和75％浓度的甲醇依次梯度洗，HPLC检测，收集富含儿茶素和表儿茶素衍生物的流份，合并，减压浓缩，冷冻干燥即得植物提取物8.6g。按照《中华人民共和国药典》标准方法，经过高效液相外标法测定，其中主要有效成分包括儿茶素和表儿茶素的总含量57.1％。

实施例5：

1.提取：中药儿茶20g，粉碎后加入水浸泡过夜后，加热回流提取3次，每次2.0小时。合并提取液，浓缩至稠浸膏，加入蒸馏水加热溶解，过滤得澄清滤液。

2.精制：上述滤液通过经处理的HP-20型大孔吸附树脂，用水、10％、20％、30％、40％、50％和75％浓度的甲醇依次梯度洗，HPLC检测，收集富含儿茶素和表儿茶素衍生物的流份，合并，减压浓缩，冷冻干燥即得植物提取物10.3g。按照《中华人民共和国药典》标准方法，经过高效液相外标法测定，其中主要有效成分包括儿茶素和表儿茶素的总含量51.8％。

实施例6：

1.提取：中药儿茶20g，粉碎后加入水，加热至60度提取3次，每次3.0小时。合并提取液，浓缩至稠浸膏，加入蒸馏水加热溶解，过滤得澄清滤液。

2.精制：上述滤液通过经处理的HP-20型大孔吸附树脂，用水、10％、20％、30％、40％、50％和75％浓度的甲醇依次梯度洗，HPLC检测，收集富含儿茶素和表儿茶素衍生物的流份，合并，减压浓缩，冷冻干燥即得植物提取物9.8g。按照《中华人民共和国药典》标准方法，经过高效液相外标法测定，其中主要有效成分包括儿茶素和表儿茶素的总含量52.6％。

实施例7：

1.提取：中药儿茶20g，粉碎后加入水，加热至80度提取3次，每次3.0小时。合并提取液，浓缩至稠浸膏，加入蒸馏水加热溶解，过滤得澄清滤液。

2.精制：上述滤液通过经处理的SP-700型大孔吸附树脂，用水、10％、20％、30％、40％、50％和75％浓度的甲醇依次梯度洗，HPLC检测，收集富含儿茶素和表儿茶素衍生物的流份，合并，减压浓缩，冷冻干燥即得植物提取物8.2g。按照《中华人民共和国药典》标准方法，经过高效液相外标法测定，其中主要有效成分包括儿茶素和表儿茶素的总含量60.3％。

实施例8：

2.精制：上述滤液通过经处理的SP-700型大孔吸附树脂，用水、10％、20％、30％、40％、50％和75％浓度的甲醇依次梯度洗，HPLC检测，收集富含儿茶素和表儿茶素衍生物的流份，合并，减压浓缩，冷冻干燥即得植物提取物8.5g。按照《中华人民共和国药典》标准方法，经过高效液相外标法测定，其中主要有效成分包括儿茶素和表儿茶素的总含量57.9％。

实施例9：

1.提取：儿茶基源植物500g，粉碎后加入水，浸泡过夜后加回流提取3次，每次3.0小时。合并提取液，浓缩至稠浸膏，加入蒸馏水加热溶解，过滤得澄清滤液。

2.精制：上述滤液通过经处理的SP-20型大孔吸附树脂，用水、10％、20％、30％、40％、50％和75％浓度的甲醇依次梯度洗，HPLC检测，收集富含儿茶素和表儿茶素衍生物的流份，合并，减压浓缩，冷冻干燥即得提取物28.3g。按照《中华人民共和国药典》标准方法，经过高效液相外标法测定，其中主要有效成分包括儿茶素和表儿茶素的总含量55.6％。

实施例10：

1.提取：中药儿茶基源植物500g，浸泡过夜后加回流提取3次，每次3.0小时。合并提取液，浓缩至稠浸膏，加入蒸馏水加热溶解，过滤得澄清滤液。

2.精制：浓缩液通过反相硅胶柱(C-18)，用水和10％甲醇水溶液洗脱后，再用50％的甲醇水溶液洗脱，HPLC检测，收集富含儿茶素和表儿茶素衍生物的流份，合并，减压浓缩，干燥得提取物1.83g。经过高效液相外标法测定，其中主要有效成分包括儿茶素和表儿茶素的总含量96.7％。

实施例11：

1.提取：中药儿茶20g，浸泡过夜后加回流提取3次，每次3.0小时。合并提取液，浓缩至稠浸膏，加入蒸馏水加热溶解，过滤得澄清滤液。

2.精制：浓缩液通过硅胶柱，用石油醚和乙酸乙酯梯度，HPLC检测，收集富含儿茶素和表儿茶素衍生物的流份，合并减压浓缩，干燥得儿茶提取物1.3g。经过高效液相外标法测定，其中主要有效成分包括儿茶素和表儿茶素的总含量93.7％。

实施例12：

儿茶提取物中主要成分的分离纯化和结构鉴定

上述实施例11中得到的儿茶提取物，用20毫升蒸馏水溶解后，注入中压反相硅胶(C-18)柱色谱，用H₂O-甲醇(1∶0-0∶1)梯度洗脱，根据薄层色谱检查，合并组成成分相似的洗脱液。减压回收溶剂至干燥，得到2个主要分离部位ECE1(0.48g)、ECE2(0.24g)。ECE1和ECE2分别用少量乙酸乙酯加热溶解，室温放置36小时，析出结晶，过滤得到，ECE1和ECE2单体，经HPLC检测岸归一化法积分面积计算，含量分别为98.1％和97.4％。并通过与从中国食品药品检定研究院购置的化学对照品比较，鉴定ECE1和ECE2分别为儿茶素(批号：110877-201102)和表儿茶素(批号：110878-200102)。具体检测条件如下：

色谱柱：Grace Previl C18(250×4.6mm，5μm)，流动相A为水，流动相B为甲醇。检测波长280nm.流速0.8ml/min。

时间(min)	A：H2O(％)	B：MeOH(％)
			0	75	25
10	50	50
			25	0	100

在以上检测条件下，儿茶素和表儿茶素的保留时间分别为12.99分钟和9.44分钟。

实施例13：

儿茶分离组分对结核杆菌的药敏试验

通过药理实验观察从儿茶提取物经过分离后的不同组分对培养结核杆菌生长的抑制。

(1)受试药物

①W1，E1，E2，E3，E4：来源为实施例1中滤液通过HPD-100型大孔吸附树脂，用水和10％、30％、50％、70％的乙醇梯度洗脱，得到的各洗脱组分。经HPLC测定W1，E3和E4中含儿茶素和表儿茶素总量小于10％，E1含儿茶素和表儿茶素总量为45.3％，E2含儿茶素和表儿茶素总量为68.4％。ECE为中药儿茶膏，经HPLC测定含儿茶素和表儿茶素总量为34.6％。

②药物配制和剂量设置

用20％DMSO水溶液溶解，每个药物样品测3个浓度：5.0、1.0、0.1mg/mL，每个浓度做3管药敏培养；同时，以含2％DMSO的罗氏培养基为空白(无药)对照。

(2)实验方法

①菌种复苏：取4℃短期储存的罗氏培养管刮取结核分枝杆菌，按照比浊浓度，稀释到10^-4mg/ml，每管接种0.1ml，接种5支试管。37℃，恒温培养约3周。期间需要每周观察一到两次，防止污染。三周后，H37Rv菌种生长良好，即可扩大培养用于药敏实验

②含药培养基制备：20ml玻璃管，参照文献方法制备斜面固体培养基(罗氏培养基或7H11)时，根据药物终浓度要求按比例加入已经溶解的药物。

③药敏分组和接种：取刚复苏扩大培养的结核菌，刮下，根据比浊管浓度稀释菌浓度至约10^-5mg/ml，每管培养基接种10^-5mg/ml菌液0.1ml；涂布均匀。置于37℃培养箱中培养21天。

④药敏结果判断：记录菌落数和观察菌落生长情况：斜面菌落数融合成片(＞500个菌落)标计为++++；菌落数200-500个标记为+++；菌落数100-200个标记为++；菌落数50-100个标记为+；菌落数低于50个给出菌落数；菌落数低于10个标记为-。

(4)实验结果：结果见表1。

表1.儿茶膏分离组分对结核杆菌的药敏试验结果

(5)实验结论：以上实验结果表明，中药儿茶膏ECE及其分离组分E1和E2均对结核杆菌生长有明显抑制作用，而W1，E3和E4无明显抑制作用。

实施例14：

儿茶分离组分对结核杆菌的药敏试验

通过实验观察从儿茶提取物进一步分离后纯化后的不同组分对培养结核杆菌生长的抑制。

(1)受试药物

①C1，C2，C3，C4，C5：来源为实施例13中抑菌活性较好的E2组分，进一步通过凝胶HP-20色谱分离得到的组分。经HPLC测定C1，C2，C3，C4，C5中含儿茶素和表儿茶素总量依次为15.3％，31.6％，44.3％，78.6％和6.1％；E1和E2同实施例13中样品。

②药物配制和剂量设置

用20％DMSO水溶液溶解，每个药物样品测5个浓度：5.0、1.0、0.1、0.02mg/mL，每个浓度做3管药敏培养；同时，设含2％DMSO培养基作为空白(无药)对照。

(2)实验方法

④药敏结果判断：记录菌落数和观察菌落生长情况。

(4)实验结果：结果见表2。

表2.儿茶膏分离组分进一步分离后组分对结核杆菌的药敏试验结果

(5)实验结论：以上实验结果表明，中药儿茶膏分离组分C1，C2，C3和C4以及E1和E2均对结核杆菌生长有一定抑制作用，而C5无明显抑制作用。

实施例15：

儿茶分离组分对10株临床结核菌株杀菌及抑菌作用。通过实验观察从儿茶(膏)提取物分离组分对对10株临床结核菌株杀菌及抑菌作用。

(1)受试药物

①A3，B3，C3，D3，E3，F3：来源为实施例3中滤液通过HPD-100型大孔吸附树脂，用水和10％、20％、30％、50％、75％的乙醇梯度洗脱，得到的各洗脱组分。经HPLC测定A3，B3和C3中含儿茶素和表儿茶素总量小于18％，D3，E3，F3E1含儿茶素和表儿茶素总量分别为46.8％，57.4％和42.1％。Std-1和Std-2分别为从中国食品药品检定研究院购置的化学对照品，儿茶素(批号：110877-201102)和表儿茶素(批号：110878-200102)，经HPLC测定，分面积积分含量分别为94.6％和91.3％。

②药物配制和剂量设置

A3，B3，C3分别用无菌水溶解，经8000rpm离心5分钟后，取上清经millipore pes滤器过滤后使用；D3，E3，F3，STD-1，STD-2用DMSO溶解后，加灭菌水至所需药物浓度，用0.22μm的虑瓶过滤后使用。药物剂量设为0.5，1.0，2.0，4.0，5.0mg/ml五个浓度。

(2)实验方法

①结核菌菌株选取与毒力恢复：选取10株结核分枝杆菌临床分离株，包括4株MDR菌株，3株耐药菌株(除了MDR外的其他耐药形式)，3株全敏感菌株(其中1株为H37RV)。选用健康小鼠(C57)，雌雄各半，尾静脉注射1个麦氏的细菌100ul，4周后取肺脏、脾脏进行细菌培养，动物处死后，1个月后恢复毒力的菌株方可传代保存。

②MIC测定：组分C3，E3，F3的溶液颜色为褐色或黄色，故只选用7H11培养基确定最低抑菌浓度(MIC)，组分A3，B3，D3，std-1，std-2采用MABA和7H11培养基两种方法测定最低抑菌浓度。

③微孔板Alamar blue法(MABA)测定MIC：选取罗氏培养基上生长2-3周的新鲜菌落，磨菌，稀释至浊度为1个McFarland浓度(相当于107CFU/ml)，再以1∶25比例稀释后向无菌96孔板各微孔加入100μl菌液。每只平板均设2个不加药的生长对照孔，每株菌均平行进行两份测试。96孔板于37℃孵育，5d后加入生长对照孔Alamar blue∶5％Tween80(2∶5)70μl，37℃孵育24h，如果颜色从蓝色变为粉色，则在各实验药物孔内加入上述量的Alamarblue/Tween80混合液，37℃孵育24h观察各孔的颜色变化。结果记录：蓝色孔记录为无细菌生长；粉红色孔记录为有细菌生长；若呈现紫红色则需再继续培养24h，颜色变为粉红色则记录为有细菌生长，或颜色虽未变为粉红色，但其相连的蓝色孔仍为蓝色，则记录为有细菌生长。MIC值选定为能阻止颜色变化(从蓝色变为粉红色)的最低药物浓度。由于药物的颜色可能会对结果的判读造成干扰，因此主要作为检测MBC接种浓度的一个初筛，MIC的测定以7H11培养基为准。

④7H11培养基上的MIC：将细菌磨菌比浊至1个麦氏浓度，用灭菌生理盐水稀释至10^-2和10^-4取20ul稀释至10^-2接种于空白7H11培养基作为空白对照，20ul稀释至10^-4于空白7H11培养基(A)，20ul稀释至10^-2于含药7H11培养基(B)。室温过夜无污染后，转入5％二氧化碳的37℃温箱培养孵育4周后观察结果。MIC的定义为抑制99％细菌生长的最低药物浓度。

⑤MBC测定：组分A3，B3，C3设为0.5，1.0，2.0，4.0，5.0和7.5mg/ml六个浓度；D3，E3和F3及std-1和std-2设为0.5，1.0，2.0，4.0，8.0和10.0mg/ml六个浓度。按照③的方法将未加Almar Blue的含不同药物浓度的菌液直接接种100μl于空白7H11培养基中，若可通过MABA法判断的药物，直接加大于等于MIC的药物中的菌液。5％二氧化碳的37℃温箱培养孵育4周后观察结果，菌落数小于5个的最低药物浓度，即为最小杀菌浓度。

(4)实验结果：结果见表3和4。

(5)实验结论：以上实验结果表明，中药儿茶膏分离组分D3、E3和F3以及其中的主要成分儿茶素(std-1)和表儿茶素(std-2)对10株临床结核杆菌均具有抑菌和杀菌作用，MIC在0.5-1.0mg/ml之间，MBC在2-8mg/ml之间。组分A3和B3的作用明显较差。

表3.儿茶膏分离组分对10株临床菌株的最低抑菌浓度(MIC)结果(mg/ml)

MABA：A3和B3为淡黄色，可以通过加入指示剂(Alamar BLue)后颜色的改变来判断MIC。

每200ul中的菌量约为10⁵/ml。

7H11培养基上的MIC：除了A3，B3外，其余药物均颜色较深，无法通过颜色改变来判断MIC。因此采用比例法来确定MIC值，6孔板每孔接种20ul；

空白对照的菌量约为50个，含药培养基接种的菌量约为5000个。

表4.儿茶膏分离组分对10株临床菌株的最小杀菌浓度(MBC)结果

MBC方法采用微孔板Alamar Blue法，不加指示剂，每孔初始菌量为10⁵/ml，孵育7天后直接取100ul涂在7H11平板，4周后观察结果。pfu为0，表示有效杀菌。

实施例16：

儿茶分离组分的急性毒性。通过实验观察从儿茶(膏)分离组分E2的初步急性毒性。

(1)动物：ICR小鼠，雌雄性各半，体重20±0.5g，购自北京维通利华试验动物技术有限公司。动物许可证编号：SCXK(京)2002-0003。

(2)受试药物：E2来源为实施例1中滤液通过HPD-100型大孔吸附树脂，经30％乙醇洗脱得到的分离组分。用水加热溶解为200mg/ml溶液，

(3)实验方法：药物采用10g/kg体重的比例灌胃。ICR小鼠，雌雄性各半，禁食过夜，随机分为2组，即空白对照组和12ml×200mg/ml受试药物剂量组，每组10只。前一天晚上对实验动物禁食禁水，次日上午9时，灌胃给药一次，下午3时灌胃给药一次，每次给体积为0.5ml；给药6个小时后，开始正常喂食进水。每日观察早晚两次，记录异常情况；观察一周后，处死，解剖，观察脾、胃、肝脏和肺部情况。

(4)实验结果：见表5。

表5.单日灌胃E2耐受实验结果

(5)结论：本次试验给药后观察一周，小鼠无死亡，亦无焦躁等异常情况；解剖后观察，脏器均正常，没有异常现象。与对照组动物情况无明显差异。本次采用10g/kg体重的高剂量，从毒性耐受实验结果可见看，E2没有表现出明显的毒副作用。

Claims

1.一种儿茶提取物作为唯一活性成分在制备抗结核杆菌的药物中的应用，其特征是：所述儿茶提取物由以下制备方法制备而得，所述方法包括以下步骤：

(1)将中药儿茶或其儿茶植物粉碎，然后用水或50-95％的C1-C6烷醇的水溶液作为溶剂，在0℃至溶剂回流的温度下提取，得到提取液，提取液经常压或减压浓缩得浸膏，或经冷冻干燥得到粉末；

(2)将上述提取得到的浸膏或粉末用色谱方法精制，先用洗脱溶剂洗脱，收集富含有效成分的流份，浓缩、过滤、干燥、检测并收集有效成分为含量50％以上的提取物；所述有效成分为儿茶素和/或表儿茶素；

其中所述的色谱方法为大孔吸附树脂柱色谱、正相硅胶、反相硅胶色谱或者其组合；所述洗脱溶剂为水、C1-C6烷基醇或上述溶剂组成的混合溶剂。